Филогения и таксономический статус близкородственных видов кровососущих комаров р.р. anopheles meigen и culex linnaeus фауны россии и сопредельных территорий

На правах рукописи

Сибатаев Ануарбек Каримович Филогения и таксономический статус близкородственных видов кровососущих комаров р.р. Anopheles Meigen и Culex Linnaeus фауны России и сопредельных территорий Специальность: 03.00.08 – зоология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ТОМСК – 2007

Работа выполнена в НИИ биологии и биофизики ГОУ ВПО «Томский государственный университет» Научный консультант доктор биологических наук, профессор Стегний Владимир Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Бабенко Андрей Сергеевич, кафедра защиты растений, Томский государственный университет доктор биологических наук, профессор Бугров Александр Геннадиевич, факультет естественных наук, Новосибирский государственный университет доктор биологических наук, Комарова Людмила Алексеевна, кафедра биологии и химии, Бийский педагогический государственный университет

Ведущая организация:

Институт экологии растений и животных УрО РАН

Защита состоится «_15_» ноября 2007 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.267.09 в ГОУ ВПО «Томский государственный университет» по адресу: 634050, г.Томск, пр. Ленина

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Томского государственного университета Автореферат разослан «09» октября 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета В.П.Середина доктор биологических наук Актуальность темы. Кровососущие комары семейства Culicidae являются одной из наиболее интенсивно изучаемых групп насекомых в связи с их эпидемиологической значимостью как переносчиков малярии, желтой лихорадки, лихорадки Денге, энцефалитов и других трансмиссивных болезней.

На примере многих видовых комплексов показано, что даже близкородственные виды кровососущих комаров обладают различной способностью к переносу поражающих человека трансмиссивных болезней, различной антропофильностью, различной широтой ареала и численностью, что придаёт им разную эпидемическую значимость. Точная идентификация видов является важной как для фундаментальных, так и для прикладных исследований. Это особенно необходимо для переносчиков заболеваний при проведении широких кампаний по регуляции их численности. Проблемы в классической таксономии близкородственных видов заключаются не только в сильном морфологическом сходстве между ними, но также и в выраженной морфологической изменчивости в пределах вида.

Решение сложных таксономических ситуаций требует комплексного подхода, который включает морфологические, молекулярные, цитогенетические и экологические исследования. Известно, что виды-двойники комплексов часто отличаются по способности переносить опасные болезни, поэтому идентификация видов этих комплексов важна для прогнозирования распространения заболеваний.

Особый интерес представляют виды-двойники малярийных комаров, объединяемых в комплекс "Anopheles maculipennis". Этот комплекс занимает огромную территорию Голарктики и является интересным объектом для решения вопросов филогенеза, видообразования и таксономии (Кitzmiller et al., 1967, Стегний, 1991). Комары комплекса «Culex pipiens» также представляют большой научный и практический интерес. Высокая экологическая пластичность, сложная таксономическая структура и характер взаимоотношений между членами комплекса привлекают постоянное внимание исследователей (Laven, 1967;

Виноградова, 1997).

Hесмотpя на достаточно хорошую моpфо-экологическую (Беклемишев, 1944;

Мончадский, 1951) и цитогенетическую изученность (Frizzi, 1947, 1953;

Kitzmiller et al., 1967;

Стегний, и др., 1976;

Стегний, 1979), виды комплекса “maculipennis” можно идентифицировать в основном по стpуктуpе политенных хромосом или морфологии яиц, а также по молекулярным данным, что затрудняет решение научных и практических вопросов. Виды и формы комплекса Culex pipiens трудно идентифицировать по структуре политенных хромосом: их диагностика возможна только молекулярными методами. По личинкам C. torrentium и C. p. pipiens не различимы, определение ведется только по самцам, диагностическое значение имеют особенности строения гипопигия (Service, 1968;

Виноградова, 1997).

Определение видов-двойников должно основываться на комплексе признаков:

морфологических, экологических, этологических, генетических, что предполагает необходимость комплексных исследований. Комплексный подход особенно актуален применительно к близкородственным видам для оценки эколого-генетических принципов адаптации популяций и видов к условиям обитания. Обычная идентификация видов на основе фенотипа (морфотипа) является самым дешевым, быстрым и простым методом (White, 1977).

Цель работы: Анализ филогенеза и характера морфо – физиологической адаптации и эволюции видов на основе исследования морфологической, цитогенетической и молекулярно-генетической дифференциации близкородственных видов комплексов «Anopheles maculipennis» и «Culex pipiens».

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить фенотипическую изменчивость в природных популяциях кровососущих комаров близкородственных видов комплексов «Anopheles maculipennis» и «Culex pipiens».

2. Провести морфологическое описание близкородственных видов и составить определительные таблицы.

3. Выявить морфологические признаки для идентификации видов в онтогенезе в соответствии с хромосомной структурой видов.

4. Выяснить молекулярно-генетическую дифференциацию видовых популяций в комплексах «Anopheles maculipennis» и «Culex pipiens» с помощью метода таксонопринта путём сравнительного анализа повторов геномной ДНК.

5. Осуществить поиск молекулярно – генетических маркеров для идентификации представителей комплекса «Culex pipiens» и оценки их внутри – и межвидовой изменчивости.

6. Выявить молекулярно-генетическую внутри- и межвидовую изменчивость и дивергенцию у членов комплекса «Culex pipiens».

7. Выяснить адаптационные признаки по физиологическим параметрам у малярийных комаров.

8. Провести анализ филогенетических связей в комплексе «Anopheles maculipennis» на основе хромосомных, молекулярных и морфологических показателей.

Научная новизна. Выявлена фенотипическая изменчивость в географически удаленных популяциях кровососущих комаров р.р. Anopheles и Culex. Впервые показано, что фенотипическая изменчивость коррелирует со степенью хромосомной изменчивости. Впервые проведено морфологическое описание комаров An.beklemishevi и An.artemievi, выявленных ранее цитогенетическими и молекулярными методами. Проведен сравнительный морфологический анализ видов двойников р. Anopheles.

По результатам анализа спектров повторяющихся последовательностей ДНК у кровососущих комаров получены новые данные о межвидовой и межродовой изменчивости геномов Anopheles, Culex по составу семейств повторяющихся ДНК.

Выявлены различия в чувствительности к патогену Bti у личинок комаров An.messeae и An.beklemishevi с различными фенотипическими, физиологическими, весовыми и размерными параметрами и показано, что чувствительность комаров к патогену существенно различается в зависимости от вариаций этих параметров.

Изучена генетическая детерминация физиологического параметра - скорости поглощения пищи личинками. Показано, что особи с разными хромосомными вариантами имеют различия по этим физиологическим параметрам.

Впервые проведенное изучение ряда близкородственных видов комплекса “maculipennis” по многим морфологическим признакам позволило провести реконструкцию филогенеза и установить соответствие характера эволюции морфологических признаков с ранее полученными данными по хромосомному и гибридологическому анализу (Стегний, 1991).

Практическая значимость. Впервые уточнен видовой состав малярийных комаров России, Средней Азии и Казахстана. Составлены определительные таблицы на различных стадиях развития малярийных комаров в азиатской части России и сопредельных территориях, что важно для практических энтомологов. Впервые были найдены видоспецифичные RAPD – маркеры для идентификации Culex torrentium.

Определена нуклеотидная последовательность RAPD – праймеров. Показано, что ПЦР с использованием SCAR – праймеров является простым, быстрым и надежным методом идентификации C. torrentium. Полученные данные по пищевому поведению личинок необходимы при обработке биопрепаратами с целью регулирования численности комаров. Полученные результаты по фенотипической изменчивости дают информацию для различных биомониторинговых и других экологических исследований.

Апробация результатов. Материалы работы представлены: на конференции «Проблемы экологии Томской области», Томск, апрель 1992 г.;

на региональной научно-практической конференции (Томск, 1994);

на I съезде ВОГиС, декабрь, 1994, г. Саратов;

на 10 th. European SOVE Meeting, (Strasbourg, 1996);

на XX International Congress of Entomology (Firence, Italy, 1996);

на I научной конференции Новосибирского отделения Паразитологического общества РАН «Паразиты и паразитарные болезни в Западной Сибири» (Новосибирск. 1996);

на II En Gebi Conference on bacterial control of agricultural insect pests and vectors of human diseases (Shoresh, Israel, 1996);

на I международном симпозиуме «Эволюция жизни на земле» (Томск, 1997);

на XI энтомологическом съезде (Санкт-Петербург, 1997);

на конференции «Проблемы эволюционной цитогенетики, селекции и интpодукции» (Томск, 1997);

на VI Всероссийском диптерологическом симпозиуме «Место и роль двукрылых насекомых в экосистемах» (Санкт-Петербург, 1997);

на научной конференции «Проблемы энтомологии в России» научной конференции «Биологическое разнообразие животных Сибири» (Томск, 1998);

на I Международной конференции «Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии» (Новосибирск, 2000);

на I, II и III Международных конференциях «Проблема вида и видообразование», Томск (2000, 2001, 2004);

на I Международной Школе-семинаре «Кровососущие насекомые – переносчики трансмиссивных заболеваний и проблемы генетической безопасности» (Москва, 2002);

на XII Съезде Русского энтомологического общества (2002);

на III Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва (2004);

VII Межрегиональном совещании энтомологов Сибири и Дальнего Востока «Энтомологические исследования в Северной Азии» (Новосибирск, 2006);

на I Всероссийском совещании по кровососущим насекомым (Санкт-Петербург, 2006);

XIII съезде Русского энтомологического общества (Краснодар, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 48 работы (среди них 19 статей, из которых 17 в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК).

Положения, выносимые на защиту:

1. Фенотипическая изменчивость характерна для разных видов кровососущих комаров. Большей фенотипической изменчивостью отличаются полиморфные по хромосомному составу виды кровососущих комаров по сравнению с мономорфными видами. Флуктуирующая асимметрия количественных признаков малярийных комаров варьирует под действием неблагоприятных факторов (патогеная микрофлора) и зависит от хромосомной структуры популяции.

2. В популяциях C. p. pipiens L. 1758,, C. p. molestus Fors., 1775 и C. torrentium Mart., 1924 умеренных широт существует генетическая дифференциация по геномной ДНК. В природных популяциях видов комплекса «C.pipiens» отсутствуют гибридные формы. В зонах симпатрии природных популяций между C. p. pipiens, C. p. molestus и C. torrentium отсутствует гибридизация. Личинки комаров C. p. pipiens и C. torrentium, обитающих совместно в открытых водоемах, имеют большее морфологическое сходство между собой, чем с C. p. molestus, обитающим в основном в закрытых помещениях.

3. У кровососущих комаров комплексов «An.maculipennis» и «C.pipiens» спектры повторяющихся последовательностей ДНК отличаются разнообразием в организации повторов и низким содержанием общих фракций.

4. Близкородственные виды комаров комплекса «An.maculipennis» имеют разную степень сходства по морфологическим признакам. Виды, находящиеся в одной филетической линии ближе по морфологии, чем в разных линиях. Характер эволюции морфологических признаков у видов комплекса «maculipennis» соответствует филогенетической схеме, предложенной ранее на основе гибридологического и хромосомного анализов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения выводов. Текст диссертации изложен на 284 страницах и включает 39 таблиц и рисунков. Список литературы содержит 441 источников, из которых 258 на иностранном языке.

Благодарности. Выражаю искреннюю благодарность всем соавторам публикаций, сотрудникам НИИББ ТГУ за помощь и поддержку при выполнении данной работы.

Особую признательность выражаю научному консультанту проф. В. Н. Стегнию за всестороннюю помощь и поддержку.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Современное состояние исследования кровососущих комаров семейства Culicidae В данной главе приведены сведения о комарах комплексов «Anopheles maculipennis» и «Culex pipiens». Подробно проанализированы публикации, касающиеся изучения таксономического статуса, морфологии и фенотипической изменчивости, экологии, молекулярной и цитогенетической диагностики кровососущих комаров.

ГЛАВА 2. Материал и методика исследований Материалом для морфологического анализа послужили выборки личинок и имаго кровососущих комаров комплексов «maculipennis» и «Culex pipiens», собранных в разных частях бывшего СССР. Морфологию личинок малярийных комаров изучали параллельно с определением кариотипа. Морфометрические измерение личинок проводили с помощью миллиметровой шкалы на МБС-10. Давленые препараты политенных хромосом готовили по лактоацеторсеиновой методике (Кабанова и др., 1972). В основу настоящего исследования положен материал как собранный лично автором в 1988-2005 годах, так и предоставленный коллегами. Проанализировано 14957 личинок малярийных комаров и 980 имаго малярийных комаров, 2100 личинок комаров комплекса “Culex pipiens”.

Личинок комаров комплекса «Culex pipiens» изучали параллельно с молекулярной идентификацией (Crampton, 1994;

Hoy, 2003).

Достоверность частных коэффициентов корреляции определена путём сравнения их с критическим значением при уровне значимости 0,05. Определение уровня значимости для парных коэффициентов осуществлено в пакете Statistica 7.0. В данном случае достоверными считали коэффициенты с р0,05.

ГЛАВА 3. Фенотипическая изменчивость кровососущих комаров Варьирование морфологических признаков у личинок кровососущих комаров связано с разнообразием экологических условий их местообитаний и генетической изменчивостью. Изучение морфологической неоднородности преимагинальных фаз развития комаров имеет важное значение для диагностики видов, поскольку для низших двукрылых характерно наличие многочисленных видов-двойников, плохо различимых по внешним признакам. У личинок комаров отмечена обширная вариабельность количественных и качественных морфологических признаков (Беклемишев, 1944;

Мончадский, 1951;

Маслов, 1967;

Пестрякова, 1971;

Dahl et al., 1988;

Сибатаев, Гоpдеев, 1993;

Гордеев, Сибатаев, 1995, 1996;

Бурлак, Сибатаев, 1995;

Виноградова, 1997;

Бурлак, Сибатаев, 1998;

Сибатаев, Бурлак, 2000). В главе рассматривается взаимосвязь фенотипического и генетического полиморфизмов. В комплексе «maculipennis» самым полиморфным видом является – An.messeae, а в комплексе «C.pipiens» – C.pipiens. Сравнение этих видов с мономорфными видами позволило определить влияние генетической компоненты на фенотипический полиморфизм.

3.1 Изменчивость фенотипа stripe у личинок малярийных комаров в природных водоемах. Изучена частота встречаемости фенотипа stripe (Benedict et al., 1996) у личинок малярийных комаров из природных водоемов. Фенотип stripe хорошо заметен невооруженным глазом. Проявляется в виде рисунка (полосы, пятен или их комбинации) белого цвета, реже – красного цвета на спинной стороне груди и брюшка. Наличие полосы обусловлено отложениями мочевой кислоты в амебоидных клетках жирового тела, сходных с уроцитами. Предполагается, что пигмент имеет адаптивное значение, предохраняя окрашенных личинок от избыточной инсоляции.

Частота фенотопа stripe (st) в популяциях малярийных комаров довольно значительна. В течение 4 лет обследовано свыше 10 тыс. личинок малярийных комаров (An. messeae, An. beklemishevi. An. maculipennis, An. sinensis) из более чем водоемов Западной Сибири, Среднего Урала, Алтая, Северного Казахстана, Дальнего Востока и Подмосковья. Фенотип stripe имеет значительную изменчивость.

Доля пигментированных личинок варьировала от 13,5 до 57, 3 % в различных водоемах и увеличивалась на юг и запад. В одновременных выборках с участков одного водоема различий в концентрации пигментированных особей не обнаружено.

В разных водоемах одного местообитания частота окрашенных особей достоверно варьировала. По межсезонной динамике частоты фенотипа stripe у личинок малярийных комаров водоемы делились на "стабильные" и "лабильные".

3.2. Изменчивость количественных признаков личинок Для оценки внутри- и межпопуляционной фенотипической изменчивости использовали один из самых вариабельных морфологических признаков - количество зубцов гребней стигмальной пластинки (Мончадский, 1951). Личинки малярийных комаров 4-го возраста имеют на каждом из двух гребней по 5 - 11 больших зубцов, между которыми помещается от 0 до 11 более мелких. Суммы зубцов на правом и левом гребнях одной и той же личинки могут не совпадать (явление асимметрии, которое демонстрирует вариативность выражения признака в ходе онтогенеза). В связи с этим подсчитывалось количество зубцов на обоих гребнях.

Исследование проводили на выборках личинок малярийных комаров из Средней Азии и Сибири. Число зубцов было просчитано у 785 личинок An.beklemishevi и личинок An. messeae.

При сравнительном анализе всех популяций (г. Томск, пос. Тегульдет, пос.

Киреевск и Коларово) двух видов выяснилось, что количество зубцов на гребне у An.beklemishevi выше, чем у An.messeae (Рисунок 1). Анализ этого признака по полу показывает, что количество зубцов на гребне самок больше у обоих видов.

Сравнение количества больших и малых зубцов стигмальной пластинки личинок выявило, что во всех популяциях больше зубцов у особей с хромосомной инверсией 2R00, чем у личинок с инверсией 2R11 (Рисунок 2). Сравнительный анализ личинок из разных местообитаний показал, что число малых зубцов закономерно увеличивается в направлении с юга на север (Сибатаев, Гордеев, 1996;

Сибатаев, Бурлак, 1996).

53, 52, 52, количество зубцов 51, 51, 50, 50, 49, 49, 0 1 2 Рисунок 1 – Количество больших и малых зубцов гребней стигмальной пластинки 0- самцы An.beklemishevi, 1 – самки An.beklemishevi, 2- самцы An.messeae, 3 - самки An.messeae. Указан 95% доверительный интервал.

Ряд Ряд количество зубцов Ряд 54 Ряд 2Rb 2R00 2R01 2R Рисунок 2 – Количество зубцов гребней стигмальной пластинки Ряд 1 – г. Томск, ряд 2 – пос. Тегульдет, ряд 3 – пос. Коларово, ряд 4 – пос.

Киреевск. 2Rb- An.beklemishevi, 2R00,2R01, 2R11 – An. messeae.

Указан 95 % доверительный интервал В Киргизии и на юге Казахстана среднее число зубцов не превышает 33,50;

в пос.

Науалы возрастает до 33,73 и в пос. Коларово достигает 36,83 (p 0,001).

Изменчивость морфологических признаков видов комплекса C.pipiens. В изученных популяциях представителей комплекса «C.pipiens» в искусственных открытых водоемах чаще встречаются комары вида C.torrentium и иногда C.p.pipiens.

В искусственных закрытых водоемах со 100% частотой встречается комар C.pipiens molestus. Многие исследователи, изучающие виды этого комплекса, отмечают, что большинство морфологических различий между ними носит количественный характер, что для идентификации в симпатрических популяциях не всегда удобно.

7, 7, сифональный индекс 6, 6, 5, 5, 4, 4, 3, 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0 - mol x tor, 1-1 - molestus, 2 30 - torrentium, 31 - culex 4 0 Рисунок 3 – Сифональный индекс личинок. 1-13 – выборки из подвальных помещений г. Томска, 20 – пос. Белоусово Томской области (ТО), 21, 27-30 – Керамический завод, 22, 23, 26 – пос. Белоусово, 31 – г. Томск (открытый водоем);

24 – пос. Аксаковка (Казахстан), 25 – г. Алматы (Казахстан).

Указан 95 % доверительный интервал 7, 6, сифональный индекс 6, 5, 5, 4, 4, 3, mol x tor molestus torrentium pipiens Рисунок 4 – Сифональный индекс личинок комаров по видам и подвидам.

mol x tor – гибриды F1: C. p. molestus x C. torrentium.

Указан 95 % доверительный интервал.

Отмечено, что величина сифонального индекса косвенно связана с добыванием пищи. Зубцы ментума связаны непосредственно с пищевым поведением личинок.

Морфологические структуры, имеющие большую функциональную нагрузку, характеризуют дивергенцию популяций (Ивницкий и др., 2006). Исследование сифонального индекса у личинок комаров выявило различие между выборками (Рисунок 3). Наименьший сифональный индекс оказался у гибридов комаров (выборка № 0, Рисунок 3). Наибольший сифональный индекс оказался у личинок комаров C.p.pipiens и C.torrentium.

При объединении и сравнении сифонального индекса личинок по видам и группам выявлены интересные результаты (Рисунок 4). Дисперсионный анализ по данному признаку показал четкие различия (SS= 288,7, df=3, p0.01). Использование метода критерия наименьшей значимой разности обнаружило различие по сифональному индексу между выборками (p0.01).

Важным признаком, позволяющим идентифицировать виды и подвиды комплекса «Culex pipiens», является количество зубцов на ментуме. По данному признаку выявляется две группировки: molestus и torrentium – pipiens.

Среднее число зубцов на ментуме 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0 - mol x tor, 1-1 - molestus, 2 30 - torrentium,31 - culex 4 0 Рисунок 5 – Количество зубцов на ментуме у личинок.

Обозначение в рисунке 3. Указан 95 % доверительный интервал.

mol x tor - гибриды F1: C. p. molestus x C. torrentium.

Наибольшее количество зубцов на ментуме у личинок C. p. molestus, наименьшее – у C.torrentium и C.p. pipiens (Рисунок 5). Использование данного признака в сочетании с сифональным индексом позволяет идентифицировать комаров C.p.molestus от других видов комплекса. Полученные различия по количеству зубцов ментума, по-видимому, связаны с различиями поведенческих актов в добывании пищи личинками комаров комплекса «C. pipiens».

3.3 Изменчивость морфологии класпет гипопигиев самцов малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis Исследовано вооружение класпет гипопигиев восьми палеарктических видов малярийных комаров комплекса «Anopheles maculipennis»: An.beklemishevi, An.messeae, An maculipennis, An melanoon, An.artemievi, An.sacharovi, An. martinius, An.atroparvus. Сравнительные данные показывают, что наибольшей изменчивости подвержены дорсальные шипы класпет. Изменчивость морфологических признаков класпет весьма значительна в пределах одного вида. По всей видимости, в процессе видообразования, у видов – двойников комплекса «maculipennis» не происходило значительной дивергенции по данному признаку.

Таким образом, анализ изменчивости морфологических признаков на разных стадиях развития позволяет сделать предположение, что наличие внутривидовых группировок в популяциях полиморфных видов C.pipiens и An.messeae повышает экологическую пластичность этих популяций. Полиморфные виды комаров с различными адаптивными комплексами сосуществуют в условиях динамического равновесия и успешно конкурируют с другими видами.

Глава 4. Морфология малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis на территории России Подробный морфологический анализ, сопровождаемый кариотипическими и молекулярными данными, позволил оценить и выявить ряд морфологических показателей для идентификации видов-двойников в комплексе An.maculipennis.

Представлены морфологические описания видов, открытых на основе цитогенетических и молекулярных исследований (Стегний, Кабанова, 1976;

Гордеев и др., 2005). В данной главе дается описание представителей комплекса “maculipennis” и определительные таблицы для различных стадий развития.

4.1. Anopheles beklemishevi Stegniy and Kabanova, Яйца. Рисунок экзохориона яиц An.beklemishevi схож с рисунком An.maculipennis. На поверхности, ближе к концам, имеются две темные поперечные полосы, более широкие у яиц An.beklemishevi (Стегний, Кабанова, 1976). Воздушные камеры хорошо развиты, поверхность межреберной перепонки морщинистая.

Личинка IV стадии. Внутренние волоски наличника 2, прикрепляющиеся к бугоркам, сближены своими основаниями. Эти волоски в основном бывают в следующих вариациях: простых или разделяющихся на вершине на 2 ветки.

Наружные волоски наличника 3 дихотомически разветвлены.

Три срединных волоска переднегруди включают: внутренний (1) – короткий, который может ветвиться на конце;

средний (2) – длинный перистый;

наружный (3) - короткий простой. Переднегрудная плевральная группа состоит из длинных простых волосков 9, 10, 12, и короткого простого волоска 11. Волоски 10 и 12 одинаковой длины и длиннее волоска 9. Среднегрудная плевральная группа образована двумя длинными простыми волосками 9, 10 и короткими волосками 11 и 12. Заднегрудная плевральная группа включает длинные простые волоски 9 и 10, короткий простой волосок 11. Волосок 12 короткий, простой или разделяющийся на две ветви.

Заднегрудной волосок 6 простой, иногда раздвоенный.

Основными отличиями в морфологии личинок An.beklemishevi от других членов комплекса An.maculipennis являются следующие: 1. Внутренние волоски наличника простые или разделяющиеся на вершине на 2 ветки;

2. Переднегрудная плевральная группа состоит из длинных простых волосков 9, 10, 12 и короткого простого волоска 11, волоски 10 и 12 одинаковой длины и длиннее волоска 9.

Куколка. Интегумент светлый, желтоватый. Дорзальный апотом со слегка вогнутой или плоской верхушкой подобен откидной створке без апикального выступа. Передний угол скутума широкий, около 90° (в 80%), переходящий в короткую прямолинейную лопасть. Медиальный киль со слабо выраженными поперечными полосами. Латеральная линия медиального киля длинная, продлевается от волоска 4-СТ за волосок 8-СТ (в 78 %), в остальных случаях не доходит до основания волоска 8-СТ.

Труба. Angusticorn типа, простая, с глубокой расселиной, листок ее коричневого цвета. Длина трубы 0,8-1,1 мм, в среднем 0,94 мм, ширина 0,1-0.15 мм, в среднем 0.11мм, индекс 6.2-10.0, в среднем 7.75. Длина листочка составляет 0.47-0.56, в среднем 0.52 от длины трубы.

Имаго. Общая окраска по большей части тела серовато-бурая. Голова с боков с темно-серыми чешуйками, на макушке с такими же чешуйками чисто белого цвета;

лоб с торчащим вперед пучком серебристых чешуек и волосков. Хоботок и щупики одноцветно темно-серые. Усики серые, у основания члеников с розетками довольно длинных бурых волосков;

первые 5-7 члеников усиков со светлыми кольцами в местах соединения.

Крылья самок и самцов различаются по длине (соответственно 6,7±0,21 мм и 6,3±0,21 мм, p0.005). Ширина крыла самок превышает ширину крыла самцов (соответственно 1,5±0,01 мм, и 1,2±0,02 мм, p0.001).

По сравнению с An. beklemishevi, особи An. messeae более крупные. Общий окрас тела – рыжевато-коричневый. Отличается размер и расположение апикального пятна:

оно меньше по величине, образовано золотисто-желтыми чешуйками и расположено от ветвления радиальной жилки- R1 до R4+5 (Рисунок 6). Пятно менее контрастно по отношению к общей окраске крыла, встречаются особи без явно выраженного апикального пятна. Величина и расположение пятна на верхушке крыльев у самок An.messeae и An.beklemishevi может считаться систематическим признаком.

Рисунок 6 – Крыло комара An. beklemishevi. На схеме сплошными стрелками указаны границы апикального пятна An. beklemishevi;

прерывистыми - An. messeae. Жилки: С – костальная, R1, R2, R3, R4+5 – радиальные, M1, M2 – медиальные.

4.2. An. artemievi Gordeev et al., Яйца. На поверхности экзохориона яиц An. artemievi отсутствует какой-либо рисунок, поверхность одноцветная светло-серая. Яйца имеют форму лодки с легким расширением на переднем конце. При рассмотрении сбоку видно, что дорзальная поверхность слегка вогнута, а боковые части более выпуклые. В срединной части каждого яйца воздушные поплавки не развиты, присутствует только оторочка. На каждом боковом конце яйца имеются 3–4 крупных розетковидных воздушных пузырька с 5-7 боковыми лепестками, окруженных склеротизированной каймой.

Остальная поверхность покрыта более мелкими колбовидными пузырьками.

Пузырьки хориона на наружных боковых поверхностях располагаются отдельно друг от друга, имеют уплощенную, сглаженную поверхность и полностью закрыты тонким мембрановидным слоем – пластроном, составленным из пяти - шестиугольных ячеек.

Личинка IV стадии. (обозначения по Рейнерту (Reinert et al., 1997)) Личинки в основном светлые, серого или желтоватого цвета. Обитают в хорошо прогреваемых стоячих или слабо текучих водоемах с густой растительностью. Длина тела в среднем 6.3±0.6 мм.

Голова. Длина головы в среднем 0.77±0.007 мм;

ширина – 0.75±0.007 мм;

индекс головы 1.1. Внутренние волоски наличника 2, прикрепляющиеся к бугоркам, сближены своими основаниями. Эти волоски бывают простые или разделяющиеся на вершине на 2 ветки. Наружные волоски наличника 3 дихотомически разветвлены и, по сравнению с An. messeae Falleroni, 1926, имеют меньшее количество ветвлений (рис. 7). Эти волоски у An. martinius Shingarev, 1926, An. sacharovi Favre, 1903 также характеризуются небольшим количеством ветвлений. У видов An. artemievi, An.

martinius, An. sacharovi наружные волоски наличника заходят за края боковых лопастей верхней губы, в отличие от других палеарктических видов комплекса maculipennis.

Антенны покрыты шипиками, дистальные участки антенн слегка пигментированы.

Длина антенны – 0,34±0,01 мм. Волосок 1 антенны ветвится от 2 до 7 раз. Волосок на антенне короче, чем у An. messeae.

Грудь. Переднегрудная плевральная группа состоит из длинных простых волосков 10, 12 и короткого простого волоска 11. Волоски 10 и 12 одинаковой длины и длиннее волоска 9, который ветвится 2–5 (3) раз. Среднегрудная плевральная группа образована двумя длинными простыми волосками 9, 10 и короткими волосками 11 и 12.

Рисунок 7 – А – стигмальная пластинка и гребень стигмальной пластинки An.

аrtemievi. Б - гребень стигмальной пластинки An. аrtemievi. An. messeae. Обозначения:

СТ– стигмальная пластинка;

СГ – срединная грануляция;

ПЛ – передняя лопасть;

БЗ – большие зубцы;

МЗ – малые зубцы.

Заднегрудная плевральная группа включает длинные волоски 9 и 10, короткий простой волосок 11. Волосок 6 короткий, ветвится 1–3 раза, чаще раздвоен. Волосок 12 обычно с 1–3 (2) ветвлениями.

Хитиновые части стигмальной пластинки достаточно сильно пигментированы.

Основание передней лопасти пигментировано в большей степени, вся остальная ее часть окрашена значительно светлее. Передний отросток своим основанием доходит до границы между передним и средним отделами. В среднем отделе имеется срединная грануляция, проходящая полосой между средним и задним отделами.

Гребень на боковых пластинках VIII сегмента брюшка состоит из 5–10 (7) больших зубцов, между которыми помещаются 0–5 более мелких зубцов. Маленькие зубцы копьевидной формы, сближены своими основаниями. Внутренняя их поверхность покрыта шипиками.

Куколка. Обозначения по Рейнерту (Reinert et al., 1997).

Головогрудь. Интегумент светлый, желтоватый. Дорзальный апотом со слегка вогнутой или плоской верхушкой подобен откидной створке без апикального выступа.

Труба. Angusticorn типа (Reid et al., 1961), простая, с глубокой расселиной, листок ее коричневого цвета. Длина трубы 1.02–1.20 мм, в среднем 1.09±0.03 мм, ширина 0.098–0.13 мм, в среднем 0.11±0,005 мм, индекс 8.67–10.86, в среднем 9.59. Длина листочка составляет 0.55–0.62 мм, в среднем 0.58±0,01 от длины трубы.

Имаго: Комар светлой окраски. Голова с боков с темно-серыми чешуйками, на макушке с такими же чешуйками чисто белого цвета;

лоб с торчащим вперед пучком серебристых чешуек и волосков. Хоботок и щупики одноцветно темно-серые. Усики серые, у основания члеников с розетками довольно длинных бурых волосков;

первые 5–7 члеников усиков со светлыми кольцами в местах соединения.

Среднеспинка золотисто-желтая. Cрединная полоса выражена слегка. Спереди, у головы, близ средней линии, с пучком белых чешуек. Срединная и боковые области среднеспинки густо покрыты короткими белыми и золотистыми волосками. На верхней части боков имеются светло-коричневые и коричневые волоски, в нижней части – длинные черные волоски.

Длина крыла 4.2–4.5 мм, в среднем 4.4 мм, ширина 0.95–1.2 мм, в среднем 1.07 мм.

Чешуйки на жилках узкие, длинные, серые. У основания крыла короткие, с зазубренным краем. Пятна на крыловой пластине и апикальное пятно выражены слабо. Пятно на апексе крыла образовано светло-желтыми чешуйками. Оно начинается чуть ниже ветвления радиальной жилки R1 и заканчивается посредине между жилками R4+5 и разветвлением медиальной жилки – М1 (Рисунок 8).

Рисунок 8 – Схема крыла. А – схема крыла An. messeae, В – схема крыла An.

аrtemievi. Обозначения: пунктирные стрелки – границы апикального пятна An.

messeae сплошные стрелки– границы апикального пятна An. аrtemievi. Жилки крыла – C– костальная;

R1, R2, R3, R4+5 – радиальные;

М1, M2, M3+4 – медиальные.

По морфологии личинки и имаго An. artemievi является видом – двойником An.

martinius и An. sacharovi. (Гордеев и др., 2005). Имаго имеют светлую окраску тела, срединная матовая полоса среднеспинки не выражена. Пятна темных чешуек на их крыльях хорошо различимы, бахромка у вершины крыла одноцветно темная. На стадии яйца описано отсутствие воздушных камер, наличие только оторочки и отсутствие рисунка на поверхности.

Сравнивая наши данные по An. artemievi с данными Седагата (Sedaghat et al., 2003) по An. sacharovi, можно отметить отличия (в основном, количественного характера) видов друг от друга. Так, у личинок An. artemievi более округлая голова, внутренний волосок наличника 2 ветвится 1-3 (2) раза, тогда как у An. sacharovi 2–5 (4) раза. Волосок 1 переднегруди у An. artemievi ветвится 3-7 (5) раз, у An. sacharovi 1–5 (4) раза, волосок 9 переднегруди у An. sacharovi никогда не бывает простым, у An. artemievi подобный вариант встречается. Волосок 2 на V сегменте у An. artemievi имеет 1-4 (3) разветвления, у An. sacharovi – 6-11 (6) разветвлений. Количество ветвлений волоска 7 на VII сегменте у An. artemievi составляет 5-8 (5), у An. sacharovi 3–5 (5). Для куколок An.

artemievi характерны более крупные размеры тела, а также отсутствие дополнительных волосков 8, 10, 11 на II сегменте. Волосок 2 на III сегменте у An. artemievi имеет 7-9 (7) ветвлений, у An. sacharovi – 4-6 (5) ветвлений. Волосок 1 пятого брюшного сегмента у An. artemievi ветвится 3–6 (5) раз, у An. sacharovi 1–5 (3) раза. Количество ветвлений волоска 5 на VI и VII сегментах у An. artemievi составляет 4–8 (5) и 3–5 (3), у An.

sacharovi 1-3 (3) и 1-3 (2) соответственно. Волосок 1 плавника у An. artemievi всегда простой, у An. sacharovi ветвится 2-5 (4) раза. Имаго An. sacharovi отличается от An.artemievi отсутствием срединной матовой полосы на среднеспинке и апикального пятна на крыловой пластине (Sedaghat et al., 2003). По характеристикам имаго An.

artemievi занимает промежуточное положение между An. sacharovi и An. maculipennis.

Имаго An.sacharovi имеют светлую окраску тела, невыраженную срединную полосу среднеспинки, одноцветную бахромку у вершины крыла (Гуцевич, Дубицкий, 1981).

У комаров An. maculipennis имаго тело по большей части рыжевато-коричневые, с четкой матовой полосой на среднеспинке и контрастно светлым пятном на апексе крыла.

Нами отмечены некоторые отличительные признаки личинки IV возрастной стадии An. martinius – еще одного вида-двойника An. artemievi. Спинные пластинки брюшка немного темнее остального покрова. Гребень на боковых пластинках VIII сегмента брюшка состоит из 4–8 (6) больших зубцов, между которыми помещаются 0–5 более мелких зубцов. Маленькие зубцы сосулевидной формы, основания их отстают друг от друга. На их внутренней поверхности в небольшом количестве имеются слабо выраженные шипики. Из количественных признаков можно выделить следующие:

волосок 1 переднегруди у An. artemievi ветвится 3–7 (5) раз, у An. martinius 1-3 (2) раза;

волосок 2 на V сегменте у An. artemievi разветвляется 1–4 (3) раза, у An. martinius – 3-8 (5) разветвлений;

на X брюшном сегменте волосок 2 у An. artemievi разветвляется 14-25 (17) раз, у An. martinius – 3-14 (10) раз.

На территории Кыргызстана An. sacharovi и An. martinius не встречаются (Гордеев, Сибатаев, 1996). Там, возможно, происходит перекрывание ареалов An. artemievi с An.

messeae – также морфологически сходных представителей комплекса maculipennis. На стадии яйца эти виды четко отличаются наличием воздушных камер и рисунка на экзохорионе у An. messeae.

При анализе морфологических признаков на личиночной стадии развития выявлено, что длина антенны и волоска на ней варьируют у обоих видов. Для личинок An. artemievi характерно меньшее расстояние между основанием антенны до волоска 1А, в отличие от An. messeae (соответственно 0.67±0.02 и 0.94±0.05 нм, р 0,001). Этот признак может применяться для определения этих видов при помощи статистических данных (Сибатаев, Шабанова, 2007).

Наиболее интересный результат выявлен при изучении морфологии и числа зубцов стигмальной пластинки. У личинок An. artemievi структура малых зубцов отличается от An. messeae более утолщенной, копьевидной формой и слабо выраженными шипиками на них. Малые зубцы на гребнях An. artemievi сближены своими основаниями (Рисунок 7Б), тогда как для An. messeae характерно почти параллельное их расположение относительно друг друга и сильно развитые шипы на зубцах. Число малых зубцов обоих гребней стигмальной пластинки у личинок An.

artemievi меньше, чем у An. messeae. Имеется еще один признак – спинные пластинки брюшка An. artemievi такого же цвета, что и весь покров, у An. messeae эти пластинки от темно-коричневого до черного цвета (Сибатаев, Шабанова, 2007).

У куколки An. messeae волосок 12– СТ ветвится 1–3 (2) раз, у An. artemievi 3–5 (4) раз.

На крыльях имаго An. messeae скопления чешуек образуют четыре темных пятна, хорошо различимых даже невооруженным глазом. Апикальное пятно образовано золотисто-желтыми чешуйками и расположено от ветвления радиальной жилки – R почти до R4+5 (Рисунок 8 А) (Шабанова, Сибатаев, 2004). У An. artemievi пятна на крыловой пластине слабо выражены, апикальное пятно менее контрастно и располагается ниже, чем у An. messeae, – оно начинается чуть ниже ветвления радиальной жилки R и заканчивается посредине между жилками R4+5 и разветвлением медиальной жилки – М1 (Рисунок 8 Б).

Выявленные морфологические и цитогенетические признаки позволяют идентифицировать An. artemievi среди изученных палеарктических видов, что важно для практических энтомологов и эпидемиологов в связи с проблемами регуляции численности опасных переносчиков малярии.

При составлении ключей был использован собственные и литературные данные, на основе которых составлены определительные таблицы (Гуцевич и др., 1970;

Дубицкий, 1970;

Данилов, 1985;

Гуцевич, Дубицкий, 1981;

Glick, 1992;

Darsie, Samanidou-Voyadjoglou, 1997;

Amerasinghe et al., 2002).

4.3. Определительные ключи комаров комплекса «maculipennis» на стадии яйц 1 Яйца с хорошо выраженными поплавками ………… – Поплавки отсутствуют, или имеются слабо выраженные, рудиментарные поплавки ……..…… 2(1) Экзохорион яйца с рисунком из темных пятен и полос …..…… – Рисунок экзохориона представлен двумя темными полосами на уровне концов поплавков ……...…… 3(2) Поверхность экзохориона с темными поперечными полосами, между которыми имеются темные пятна. Межреберная перепонка морщинистая …………………………An.messeae Falleroni – Поверхность межреберной перепонки гладкая или слегка морщинистая … 4(3) Окраска экзохориона одноцветно темная или более светлая, с поперечными полосами и темными пятнами между ними (контрастный рисунок на светлом фоне).

……………………..An.melanoon Hack.

– Рисунок на поверхности яиц образован темными пятнами, отходящими от краев и суживающимися к середине …………………..An.atroparvus Van Thiel 5(2) Ширина верхней поверхности яйца в его средней части между поплавками составляет 17±1% от длины яйца. Поверхность яйца шероховатая ………………….An.maculipennis Meig.

– Ширина верхней поверхности яйца в его средней части между поплавками составляет 12±1% от длины яйца. Поверхность яйца гладкая ………………….An.beklemishevi Steg. et Kab.

6(1) Поверхность экзохориона однородно серая ……………………..An.sacharovi Favre Определительные ключи малярийных комаров по личинке IV стадии:

1 Сифон отсутствует, на сегментах брюшка имеются хитинизированные тергальные пластинки и пальмовидные волоски (подсем. Anophelinae, род Anopheles) ……… 2(1) Внутренние волоски наличника 2 сближены своими основаниями.... – Основания внутренних волосков наличника 2 сильно удалены друг от друга 3(2) Наружные волоски наличника 3 простые или слабо ветвящиеся на концах или с середины. Передняя лопасть стигмальной пластинки полностью пигментирована …………… – Наружные волоски наличника 3 древовидно ветвящиеся. Передняя лопасть стигмальной пластинки пигментирована наполовину ……… 4(3) Лобные волоски 5, 6, 7 короткие и простые. Боковые волоски на IV VI сегментах брюшка длинные, перистые …………An.plumbeus Steph.

– Лобные волоски 5, 6, 7 длинные и перистые. Боковые волоски на IV-VI сегментах брюшка не перистые, а делятся на несколько ветвей недалеко от основания ………………….. 5(4) Внутренние волоски наличника 2, начиная с середины или концевой трети, несут тонкую вторичную перистость. Лепестки звездчатых волосков длинные и узкие …………..An.algeriensis Theob.

– Внутренние волоски наличника 2 гладкие, без вторичной перистости 6(5) Лепестки звездчатых волосков брюшка без вытянутой концевой нити, с гладкими или слегка зазубренными краями …………An.claviger Meig.

7(3) Волосок на антенне короткий, не превышает ширины последней и отходит недалеко от основания ………………. – Волосок на антенне длинный, около половины длины последней, отходит от ее середины …………………. 8(7) Волоски 9-12 переднегрудной плевральной группы простые Ареал комара - Дальний Восток …………….An. sinensis Weid.

– Ареал комара - европейская часть России …………………..An.hyrcanus Pall.

9(7) Волосок 9 переднегрудной плевральной группы всегда простой и примерно одинаковой длины с волосками 10 и ………………. An beklemishevi Steg. et Kab.

– Волосок 9 переднегрудной плевральной группы ветвится и короче волосков 10 и 10(9) Наружные волоски наличника и волосок на антенне относительно длинные, наружные волоски наличника обычно заходят за края боковых лопастей верхней губы ………………….An.sacharovi Favre – Наружные волоски наличника и волосок на антенне короче, чем у A.sacharovi, наружные волоски наличника обычно не доходят до края боковых лопастей верхней губы …………………… 11(10) Волоски 2 IV, V сегментов брюшка в сумме в среднем ветвятся 10.8, стандартное отклонение 1.62, в диапазоне 7- …………………….An.atroparvus Van Thiel – Волоски 2 IV, V сегментов брюшка в сумме в среднем ветвятся более 10.8 ……………………………... 12(11) Волоски 2 IV, V сегментов брюшка в сумме в среднем ветвятся 13.5, стандартное отклонение 1.35, в диапазоне 10- ……………………………. An.maculipennis Meig.

– Волоски 2 IV, V сегментов брюшка в сумме в среднем ветвятся более 13.5 …………………………. 13(12) Волоски 2 IV, V сегментов брюшка в сумме в среднем ветвятся 14.82;

стандартное отклонение 2.40;

в диапазоне 11- …………………………..An. messeae Fall.

– Волоски 2 IV, V сегментов брюшка в сумме в среднем ветвятся 24.49, стандартное отклонение 3.30, в диапазоне 16- ………………………An.melanoon Hack.

14(3) Наружный волосок 3 и задний волосок 4 наличника простые ……………………..An.superpictus Grassi 4.2.3. Определительные ключи по имаго малярийных комаров.

1 Максиллярные пальпы примерно такой же длины, как хоботок Щиток цельнокрайний (род Anopheles) ………………………………….. 2(1) Крылья преимущественно темно-чешуйчатые ………………... – Крылья с контрастными темными и светлыми пятнами …………… 3(2) Пучок узких белых чешуек на лбу отсутствует. Среднеспинка коричнево-желтая, одноцветная, с довольно длинными темно-бурыми волосками, фронтальный пучок темный …………………An.algeriensis Theob.

– Пучок белых чешуек на лбу явственно развит. Среднеспинка бурая или коричневая, посредине с широкой матовой полосой. Фронтальный пучок светлый …………………………….. 4(3) Крылья с очевидными пятнами темных чешуек на жилках и их разветвлениях. На апексе крыла имеется светлое пятно (подрод Anopheles) ……………………………………….. – Чешуйки на крыльях равномерно распределены, не образуют темных пятен …………………………………. 5(4) Крылья с перьевидными узкими чешуйками на радиальной жилке (R), постепенно сужающимися к концу (верхушке) ……………………….An.atroparvus Van Thiel – Крылья с широкими перьевидными чешуйками на радиальной жилке (R) ………………………… 6(5) Крылья с перьевидными чешуйками на радиальной жилке (R), остро сужающимися к верхушке ………………………………An.melanoon Hack.

– Крылья с перьевидными чешуйками на радиальной жилке (R) шире, чем у A.melanoon, менее остро сужающимися к верхушке ……………. 7(6) Апикальное пятно на бахромке крыла контрастное, начинается от костальной жилки (С) и заканчивается близко к разветвлению медиальной жилки – М 1+ ………………………An.beklemishevi Steg. et Kab.

– Апикальное пятно менее контрастно, меньше по размерам 8(7) Апикальное пятно на бахромке крыла расположено от ветвления радиальной жилки- R1 до R4+ ……………………………….An.messeae Fall.

– Границы апикального пятна шире …………………..... 9(8) Апикальное пятно на бахромке крыла начинается на 2-3 чешуйки выше ветвления радиальной жилки- R1 и заканчивается на 2-3 чешуйки ниже R4+ ………………………..An.maculipennis Meig.

– Апикальное пятно отсутствует. Темные пятна на крыльях выражены слабо. Среднеспинка светло-коричневая …………………………An.sacharovi Favr.

10(4) Преобладающая окраска желто-бурая или сероватая. Фронтальный пучок имеет желтоватый оттенок. Срединная полоса среднеспинки с очень узкими светлыми волоскообразными чешуйками. Длина пальпомера 5 не превышает 0,5 длины пальпомера 4. Нижние волоски проэпистернума имеются ……………………………An.claviger Meig.

– Преобладающая окраска черно-серая со свинцовым отливом.

Фронтальный пучок чисто белого цвета. Срединная полоса среднеспинки покрыта светлыми чешуйками от узких до умеренно широких. Длина пальпомера 5 превышает 0,5 длины пальпомера 4.

Нижние волоски проэпистернума отсутствуют ……………………………An.plumbeus Steph 11(2) На переднем крае крыла менее 4 темных пятен, включающих жилки костальную (С), радиальную (R) и R1 ……………………………………… – Передний край крыла с 4 и более темными пятнами, включающими жилки костальную (С), радиальную (R) и R1 (подрод Cellia) ………… 12(11) Костальная (С) жилка с двумя светлыми пятнами. IV членик задних лапок белый, иногда белая окраска распространяется и на часть V членика. Ареал комара - Дальний Восток An. sinensis Weid.

– IV членик задних лапок темный, с узким светлым кольцом у вершины, иногда у основания. Ареал комара - европейская часть России An.hyrcanus Pall.

13(11) Срединная полоса среднеспинки покрыта светлыми широкими чешуйками. Отсутствуют верхние волоски проэпистернума. Анальная (А) жилка крыла с двумя темными пятнами, дистальное пятно длиннее An.superpictus Grassi Глава 5. Молекулярный анализ комаров комплексов «Anopheles maculipennis» и «Culex pipiens» 5.1. Сравнение спектров повторяющихся последовательностей ДНК у комаров методом таксонопринта Наши исследования были проведены на представителях кровососущих комаров родов Anopheles и Culex. В серии опытов показана воспроизводимость картин распределения ДНК-фракций в геле. Длина фрагментов повторяющихся последовательностей на таксонопринтах комаров варьировала примерно от 30 до п.н. Сравнение таксонопринтов разных видов позволило выявить как сходство, так и различия в спектрах повторов.

Рисунок. 9 – Таксонопринты видов комаров: А – таксонопринты видов комплекса «maculipennis»: sc - An. sacharovi, bk - An. beklemishevi, ms - An. messeae, mc - An.

maculipennis, sb - An. melanoon, at - An. atroparvus, lb - An. labranchiae по рестриктазам HindIII, SfeI;

В, C – таксонопринты видов рода Culex: pip - C. p. pipiens, mol - C.

pipiens f. molestus, tor - C. torrentium, qui - C. pipiens quinquefasciatus, mod - C.

modestus, ter - C. territans по рестриктазам BglII, HindIII.

У семи видов-сиблингов малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis был проведен анализ таксонопринтов по рестриктазам HindIII, SfeI, (Рисунок 9А).

Повторяющиеся последовательности были выявлены по всем использованным рестриктазам. Большинство фракций повторов у видов Anopheles являлись видоспецифичными или общими для нескольких видов. Одна общая фракция, представляющая собой яркую полосу размером около 450 п.н. в BglII таксонопринтах, была обнаружена у всех видов. Кроме того, в EcoRI-таксонопринтах выявлена общая фракция размером около 55 п.н., однако для каждого вида имелись значительные вариации по интенсивности и наличию одинарных или двойных полос.

Таксонопринты гомосеквентных видов малярийных комаров - An. maculipennis и An.

melanoon, An. labranchiae и An. atroparvus – также имели четкие отличия. Следует отметить наличие у Anopheles большого количества полос высокой интенсивности, характерных для нескольких, но чаще для одного вида. Наименьшее число фракций повторов выявлено для An. sacharovi. Таксонопринтный анализ позволяет дискриминировать практически на любой стадии развития все виды комплекса, в том числе гомосеквентные – идентичные по структуре политенных хромосом.

Для комаров рода Culex были получены таксонопринты по следующим рестриктазам: BglII, HindIII, (Рисунок 9B, 9C). Число фракций повторов по каждой отдельной рестриктазе варьировало от 1 до 12. У трех представителей комплекса Culex pipiens - C. p. pipiens, C. p. f. molestus, C. p. quinquefasciatus и вида C. torrentium, относящихся к подроду Culex, различий по картине распределения фрагментов не было обнаружено ни по одной из рестриктаз. Таксонопринты C. modestus (подрод Barraudius) и C. territans (подрод Neoculex) видоспецифичны по каждой из использованных рестриктаз. Фракции, общей для всех шести видов, не выявлено.

Можно предположить, что различия таксонопринтов между двумя группами видов рода Culex, возможно, связаны с наличием двух типов интерсперсии внутри одного рода или с промежуточным типом организации повторов у ряда видов.

5.2.1. RAPD – маркеры.

Скрининг RAPD – праймеров показал, что для идентификации C. torrentium и C. p.

pipiens можно использовать фрагменты ДНК, амплифицирующиеся RAPD – праймерами OPB – 02 и OPA– 11.

Рисунок 10 – Результаты амплификации ДНК с использованием RAPD – праймеров OPB – 02 (A) и OPA – 11 (B) Примечание. Специфичные для C. torrentium фрагменты ДНК обозначены стрелками. Дорожки 2 – 9 – C. torrentium Дорожки 11 – 13 – C. p. pipiens;

дорожки – 18 – C. p. molestus. Дорожки 1, 10, 19 ДНК маркеры: 1kb (10, 8, 6, 5, 4, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25 т.п.н.) (A), 100bp + 1,5kb (1.5, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0. т.п.н.) (B) В спектре фрагментов ДНК, амплифицированных праймером OPB – 02 (5' – TGATCCCTGC – 3'), был выявлен мономорфный бэнд, размером 1183 п.н. (по данным секвенирования), идентифицирующий C. torrentium (Рисунок 10A).

На рисунке 10B представлены результаты амплификации с использованием праймера OPA – 11 (5' – CAATCGCCGT – 3'). В паттерне C. torrentium четко выявляется специфичный фрагмент ДНК, размером 680 п.н. (по данным секвенирования), отсутствующий в спектре амплифицированных фрагментов ДНК C.

p. pipiens и C. p. molestus.

Использование RAPD – маркеров позволяет надежно идентифицировать особей C.

torrentium. Маркеры не подвержены внутри – и межпопуляционной изменчивости, они представлены в спектрах RAPD – фрагментов у всех особей C. torrentium всех изученных популяций, но отсутствуют в спектрах амплифицированных фрагментов ДНК C. p. pipiens и C. p. molestus, т.е., присутствие RAPD – маркера среди продуктов амплификации характеризует особей C. torrentium, а его отсутствие – особей C. p.

pipiens и C. p. molestus.

5.2.2. SCAR – маркеры.

Специфичные RAPD – бэнды были клонированы и секвенированы. Определение последовательности нуклеотидов позволило подобрать специфичные SCAR – праймеры. Праймеры SCARcp1 и SCARcp2 (Таблица 1) были созданы на основе нуклеотидной последовательности фрагмента, размером 1183 п.н., амплифицированного RAPD – праймером OPB – 02. Праймеры SCARcp3 и SCARcp (Таблица 1) – на основе последовательности RAPD – фрагмента, размером 680 п.н.

(RAPD – праймер OPA – 11). Результатом использования SCAR – праймеров является амплификация одного специфичного фрагмента ДНК (SCAR – маркера).

В ходе SCAR – ПЦР с праймерами SCARcp1 и SCARcp2 у особей C. torrentium и гибридов между C. p. molestus и C. torrentium амплифицируется фрагмент ДНК, размером 1093 п.н.;

особи C.p.pipiens и C.p.molestus характеризуются отсутствием амплификации фрагмента ДНК соответствующего размера (Рисунок 11A).

Рисунок 11 – Результаты амплификации ДНК с использованием праймеров SCARcp1 и SCARcp2 (A), SCARcp3 и SCARcp4 (B) Примечание. Дорожки 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 – C. torrentium;

дорожки 3, 5, 7 – C. p.

pipiens;

дорожки 9, 12, 14, 16, 18 – C. p. molestus;

дорожки 19 – 21 – F1: C. p.

molestus x C. torrentium. Дорожка 23 – негативный контроль, дорожки 1, 10, 22 – ДНК маркеры: 1,5 kb + 100 bp (A) и 100 bp (1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 п.н.) (B) Использование праймеров SCARcp3 и SCARcp4 приводит к амплификации фрагмента ДНК, размером 474 п.н. у особей C. torrentium и гибридов между C. p.

molestus и C. torrentium;

у особей C. p. pipiens и C. p. molestus данный фрагмент ДНК не амплифицируется (Рисунок 11B).

SCAR – маркеры являются специфичными, т.к. не подвержены внутри – и межпопуляционной изменчивости. Применение SCAR – маркеров позволяет усовершенствовать метод RAPD – идентификации C. torrentium, сделать его доступным широкому кругу исследователей, т.к. в случае использования SCAR – маркеров отпадает необходимость в анализе набора фрагментов ДНК разных размеров. Однако, эти маркеры не позволяют идентифицировать гибриды, т.к.

гибридные особи от скрещивания C. p. molestus x C. torrentium идентичны по SCAR – маркерам особям C. torrentium.

Таблица 1 – Праймеры, использованные в работе Последовательность праймера, 5' 3' Праймер Продукт амплификации SCARcp1 CCCTTACGCACGGAGAAA Специфичный RAPD – фрагмент SCARcp2 CTAACAAAGTACTCCCTCAA (SCAR – маркер) SCARcp3 ATTTGGATTGGACTTTCTATTTA Специфичный RAPD – фрагмент SCARcp4 TTGAATTTTGACATGACGGTTTTT (SCAR – маркер) UEA9 GTAAACCTAACATTTTTTCCTCAACA Участок митохондриального гена субединицы I UEA10 TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA цитохромоксидазы с 5.8S TGTGAACTGCAGGACACATG 28S ATGCTTAAATTTAGGGGGTA ITS2 регион рДНК 5.8Sa ATCACTCGGCTCGTGGATCGAT ACEpip GGAAACAACGACGTATGTACT ACEtorr TGCCTGTGCTACCAGTGATGTT Участок второго интрона гена ацетилхолинэстеразы B1246s TGGAGCCTCCTCTTCACGG 5.2.3. ITS2 регионы рибосомальной ДНК.

По данным Виноградовой и Шайкевич (2005), размер ПЦР фрагментов ДНК C.

torrentium и C. p. molestus, полученных в результате амплификации с праймерами, фланкирующими ITS2 регион, составляет приблизительно 410 п.н. и 460 п.н.

соответственно, т.е. различие между ними достигает 50 п.н. На рисунке представлены результаты амплификации ITS2 регионов рДНК с использованием праймеров 5.8S и 28S (Таблица 2). Размеры амплификатов равны около 410 п.н. у C.

torrentium и около 460 п.н. у C. p. pipiens и C. p. molestus. В рДНК гибридных особей от скрещивания C. p. molestus x C. torrentium представлены оба варианта (материнский и отцовский) ITS2 регионов (Рисунок 12).

Использование праймеров, фланкирующих ITS2 регионы, позволяет идентифицировать особей C. torrentium и C. p. pipiens или C. p. molestus, а также гибриды от скрещивания C. p. molestus x C. torrentium. К сожалению, не удалось изучить наследование молекулярно – генетических маркеров у гибридных особей от скрещивания C. torrentium и C. p. molestus, т.к. не было получено потомков от такого типа скрещивания.

Рисунок 12 – Результаты амплификации ITS2 регионов рДНК с использованием праймеров 5.8S и 28S Примечание. Специфичные продукты амплификации обозначены стрелками.

Дорожки 2 – 9 – C. torrentium;

дорожки 10 – 12 – F1: C. p. molestus x C.

torrentium;

дорожки 14 – 16 – C. p. pipiens;

дорожки 17 – 21 – C. p. molestus;

дорожка 23 – негативный контроль;

дорожки 1, 13, 22 – 100 bp ДНК маркер Однако можно предположить, что у этих гибридов, так же, как у гибридов от скрещивания C. p. pipiens и C. torrentium, будут представлены два типа ITS регионов.

5.2.4. Участок гена субъединицы I цитохромоксидазы с.

Анализ последовательностей участка митохондриального гена субъединицы I цитохромоксидазы с (COI) C. torrentium и C. p. molestus, заключается в обработке рестриктазой SspI амплифицированного участка гена COI, размером 311 п.н.

(Виноградова, Шайкевич, 2005).

Для амплификации участка гена COI использовали праймеры UEA9 и UEA (Otranto, Traversa, Guida et al., 2003) (Таблица 1). Амплифицированный участок ДНК, размером 311 п.н., после обработки рестриктазой SspI у C. torrentium оставался неизмененным, в то время как у C. p. pipiens и C. p. molestus он разрезался рестриктазой на два фрагмента, размером 220 и 90 п.н. (Рисунок 13), т.е., особи C. p.

pipiens и C. p. molestus идентичны по этому маркеру, но отличаются от особей C.

torrentium. У гибридных особей от скрещивания C. p. molestus x C. torrentium амплифицированный участок митохондриального гена COI расщепляется на два фрагмента так же, как у материнской формы (Рисунок 13).

Рисунок 13 – Результаты рестрикции амплифицированного участка гена COI рестриктазой SspI Примечание. Дорожки 2 – 7, 9, 10 – C. torrentium;

дорожки 11 – 13 – C. p. pipiens;

дорожки 14, 15 – F1: C. p. molestus x C. torrentium;

дорожки 17 – 22 – C. p.

molestus. Дорожки 1, 23 – ДНК маркер pUC19 / MspI (501 (489), 404, 331, 242, 190, 147, 110 (111), 67, 34 п.н.);

дорожки 8, 23 – 100 bp ДНК маркер Было проведено секвенирование участка гена COI у особей C. p. pipiens и C. p.

molestus. Сравнение нуклеотидных последовательностей участка гена COI C. p.

pipiens и C. p. molestus показало, что они идентичны между собой и соответствуют последовательности C. p. molestus, представленной в работе Шайкевич и Виноградовой (2004).

5.2.5. Второй интрон гена ацетилхолинэстеразы 2.

Анализ последовательностей второго интрона гена ацетилхолинэстеразы 2 (ACE2), проведенный Смит и Фонсекой (Smith, Fonseca, 2004), позволил создать видоспецифичные праймеры для идентификации нескольких представителей рода Culex, включая C. torrentium и C. pipiens.

В результате мультипраймерной ПЦР с использованием праймеров ACEpip, ACEtorr и B1246s (Таблица 2) у особей C. torrentium амплифицируется фрагмент ДНК, размером 416 п.н., у особей C. p. pipiens и C. p. molestus – 610 п.н.;

у гибридных особей от скрещивания C. p. molestus x C. torrentium амплифицируются оба фрагмента (Рисунок 14).

Рисунок 14 – Результаты амплификации ДНК с использованием праймеров ACEpip, ACEtorr и B1246s Примечание. Дорожки 2 – 9 – C. torrentium;

дорожки 10 – 12 – F1: C. p. molestus x C. torrentium;

дорожки 14 – 17 – C. p. molestus;

дорожки 18 – 20 – C. p. pipiens;

дорожки 1, 13, 21 – 100 bp ДНК маркер Эти маркеры позволяют легко идентифицировать особей C. torrentium от C. p.

pipiens и C. p. molestus в выборках из любых природных популяций, включая смешанные. Кроме этого, данные маркеры применимы и для идентификации гибридных особей. Учитывая характер наследования, следует ожидать, что использование праймеров ACEpip, ACEtorr и B1246s позволит выявлять гибридных особей от любого направления скрещивания C. p. molestus и C. torrentium, а также C.

p. pipiens и C. torrentium.

Секвенирование и сравнение нуклеотидных последовательностей участка второго интрона гена ACE2 у особей C. p. pipiens и C. p. molestus показало, что они идентичны между собой.

В таблице 2 представлены все молекулярно – генетические маркеры, изученные в настоящей работе (полученные самостоятельно и предложенные другими авторами).

Выявлено соответствие результатов при использовании различных типов маркеров.

Как следует из таблицы 2, все типы маркеров, рассмотренные в работе, позволяют надежно идентифицировать особей C. torrentium. Эти маркеры применимы к любой стадии развития организма. Особи C. p. pipiens и C. p. molestus идентичны по всем изученным молекулярно – генетическим маркерам. Это свидетельствует о большей генетической близости C. p. pipiens и C. p. molestus и отдаленности от них C.

torrentium, что соответствует существующим представлениям о степени филогенетического родства представителей комплекса C. pipiens (Miller, Crabtree, Savage, 1996;

Виноградова, 1997).

Таблица 2 – Молекулярно – генетические маркеры для идентификации представителей комплекса Culex pipiens Размер продукта амплификации / рестрикции, п.н.

Праймер C. C. p. pipiens C. p. molestus F1: C. p. molestus x torrentium C. torrentium OPB - 02 1183 нет нет OPA - 11 680 нет нет SCARcp SCARcp2 1093 нет нет SCARcp SCARcp4 474 нет нет 5.8S 28S 410 460 460 410, 5.8Sa 28S 460 510 510 460, UEA UEA10 311 220, 90 220, 90 220, + рестрикция SspI ACEpip ACEtorr 416 610 610 416, B1246s Примечание. Нет – отсутствие амплификации Однако, учитывая значительное сходство C. p. pipiens и C. p. molestus по этим участкам ДНК, мы считаем, что наиболее быстрым способом получения молекулярно – генетических маркеров для идентификации C. p. pipiens и C. p. molestus является поиск специфичных RAPD – маркеров и создание на их основе SCAR – маркеров.

Гибридных особей от скрещивания C. torrentium и C. p. molestus можно выявить как в ходе анализа размеров ПЦР – фрагментов ITS2 регионов, так и при использовании праймеров ACEpip, ACEtorr и B1246s.

5.2.3. Генетическая дифференциация популяций C.p.pipiens, C.p.molestus и C.torrentium умеренных широт. Полиморфизм по RAPD – маркерам был изучен в десяти популяциях C.torrentium, пяти популяциях C.p.molestus и трех популяциях C.p.pipiens из г. Томска, Томской области (ТО) и Республики Казахстан (РК). Для оценки генетической изменчивости использовался RAPD – праймер OPA – 01, амплифицирующий наибольшее число полиморфных фрагментов ДНК.

Генетическую дифференциацию популяций оценивали, используя величину генетического расстояния по Нею (DNei) (Nei, 1978), которая отражает среднее число замен аллелей в каждом локусе, произошедших за время раздельной эволюции двух популяций. Величина DNei варьирует от нуля (максимальное сходство) до бесконечности (максимальное различие).

Средние значения генетических расстояний ( D Nei) между популяциями C.p.pipiens и C.p.molestus (г) больше D Nei между популяциями C.p.pipiens (а) и между популяциями C.p.molestus (б). D Nei между популяциями C.p.pipiens и C.torrentium (д) больше, чем средние значения генетических расстояний между популяциями C.p.pipiens (а) и между популяциями C.torrentium (в) (Рисунок 15) Средние значения генетических расстояний между популяциями C.p.molestus и C.torrentium (е) значительно превышают генетические расстояния между популяциями C.p.molestus (б) и между популяциями C.torrentium (в).

Рисунок 15 – Средние значения генетических расстояний между популяциями C.p.pipiens, C.p.molestus, C.torrentium Средние значения генетических расстояний между популяциями: а) C.p.pipiens;

б) C.p.molestus;

в) C.torrentium;

г) C.p.pipiens и C.p.molestus;

д) C.p.pipiens и C.torrentium;

е) C.p.molestus и C.torrentium. Указан 95% доверительный интервал.

UPGMA – дендрограмма, основанная на коэффициентах генетического сходства по Нею (1978) показывает, что все изученные популяции разделяются на три отчетливых кластера: в одном представлены популяции C.p.molestus, в другом – C.p.pipiens, в третьем – C.torrentium (Рисунок.16).

Анализ генетического полиморфизма RAPD – маркеров позволяет сделать вывод о значительной дифференциации популяций C. p. pipiens, C. p. molestus и C. torrentium в районе проведенных исследований.

Вывод базируется на следующих положениях: 1) генетические расстояния (DNei) между популяциями разных подвидов или вида достоверно превышают генетические расстояния между популяциями в пределах одного подвида или вида, 2) дендрограмма генетического сходства показывает, что все изученные популяции разделяются на три отчетливых кластера: в одном представлены популяции C. p.

molestus, в другом – C. p. pipiens, в третьем – C. torrentium, 3) не получены прямые или косвенные подтверждения, свидетельствующие о существовании природной гибридизации между C. p. pipiens и C. torrentium или между C. p. molestus и C.

torrentium;

гибридные особи не выявлены ни в одной из изученных популяций, включая смешанные выборки. По всей видимости, генетическая дифференциация, наблюдаемая между популяциями C. p. pipiens, C. p. molestus и C. torrentium умеренного климата, обусловлена как пре– так и постзиготическими механизмами репродуктивной изоляции. К ним относятся отличия, касающиеся жизненных циклов, полового поведения, а также разобщенность местообитаний и цитоплазматическая несовместимость.

Рисунок 16 – Дендрограмма генетического сходства популяций C.torrentium, C.p.pipiens и C.p.molestus, построенная с использованием метода иерархического кластерного анализа (UPGMA) по результатам RAPD – анализа (RAPD – праймер OPA – 01) Популяции: A – с. Моряковский Затон, ТО (2003г.);

B – г. Алматы, РК (1999г.);

С – г. Семипалатинск, РК (2004 г.);

D – г. Томск, ул. Короленко, 15 (2004 г.);

E – г. Томск, ул. Тимакова, 3 (2003г.);

F – г. Томск, ул. Алтайская, 78/2 (2004 г.);

G – г. Томск, ул.

Иркутский тр., 104 (2004 г.);

H – г. Сарышаган, РК (2005 г.);

I – с. Моряковский Затон, ТО (2003 г.);

J – Керамический завод, ТО (2003 г.);

K – Керамический завод, ТО ( г.);

L – г. Алматы, РК (1999 г.);

M – с. Науалы, РК (2003 г.);

N – с. Аксаковка, РК (2003 г.);

O – г. Алматы 1, РК (2004 г.);

P – г. Алматы 2, РК (2004 г.);

Q – г. Томск, ул.

Короленко, 15 (2005 г.);

R – г. Томск, ул. Короленко, 15 (2004 г.) Глава 6. Пищевое поведение личинок и его взаимосвязь с морфологическими и генетическими параметрами Питание насекомых - один из важнейших параметров экологии (внутри- и межвидовые отношения), физиологии (скорость обмена веществ и развития особи) и патологии (вероятность быть инфицированным). Пищевое поведение кровососущих двукрылых в течение длительного времени исследуется не только на имагинальной, но и на личиночной стадии (Беклемишев, 1944;

Ивницкий и др., 1984;

Николаева, 1986;

Dadd, 1970;

Nilsson, 1987;

Dahl et al, 1988;

Merritt et al., 1992). Проведенные наблюдения и эксперименты свидетельствуют о том, что пищевое поведение насекомых адаптивно и отражает особенности занимаемой ими экологической ниши.

Для выяснения этих вопросов был проведен анализ биотопической изменчивости морфологических параметров головной капсулы и антенны у двух видов малярийных комаров An.beklemishevi и An.messeae.

Изученные выборки различались соотношением видов An.messeae и An.beklemishevi. An.beklemishevi встречался в водоемах Томского региона (г.Томск, пос. Тегульдет, пос. Киреевск) и не встречался в Средней Азии (окр. г. Бишкека),пос.

Кант, пос. Сокулук, пос. Кенес). Соотношение видов в пределах тегульдетской популяции варьировало от 9:1 до 1:4, несмотря на незначительную удаленность водоемов друг от друга.

Средние размеры головы оказались выше у личинок An.messeae. При этом изменение средних длины (ДГ) и ширины (ШГ) головы по водоемам, как правило, происходило синхронно у обоих видов. Головной индекс (ГИ) у An.messeae, как правило, превышал таковой у An.beklemishevi из той же выборки. Приведенные данные указывают на широкую вариабельность экологических условий в пределах одного местообитания. Суммированные данные показывают, что ГИ An.messeae возрастал на юге ареала вида (в Средней Азии), хотя ДГ и ШГ при этом уменьшались.

Для исследования скорости поглощения пищи личинками 4-го возраста симпатрических видов малярийных комаров An. messeae и An.beklemishevi и ее связи с длиной тела, шириной головы и груди, числом зубцов гребня стигмальной пластинки и их асимметрией использовали графит.

Соотношение видов в двух водоемах диаметрально различалось: доля An.beklemishevi в первом водоеме составила 13.1 ± 1.95%, во втором -80.1 ± 2.31%.

Поэтому в эксперименте идентифицировано 311 личинок An.messeae и 275 An.beklemishevi. Личинки An.messeae достигали большей длины, чем An.beklemishevi (Таблица 3).

Таблица 3 – Морфометрические показатели личинок двух видов малярийных комаров, отобранных в эксперимент Показатель сравнения Вид An.messeae An.beklemishevi Длина тела, мм 3.3-7.95 3.5-7. Ширина груди, мм 1.319± 0.010 (0.9-1.8) 1.269 ±0.010**(0.9-1.65) Ширина головы, мм 0.8125 ±0.0013 (0.74-0.87) 0.7734 ±0.0014**(0.71-0.84) Головной индекс 0.9745 + 0.0018 0.9639 ± 0.0022* Число зубцов (М ± sm) 49.6 ±0.03 51.4 ±0.02** у самок 50.4 ±0.04 51.7 ±0.03** у самцов 48.6 ±0.06 51.1 ±0.04** Асимметрия -0.152 ±0.014 +0.111 ±0.008** у самцов -0.029 ±0.027 -0.146 ±0.019* у самок -0.247 ±0.028 +0.298 ±0.013** Примечание: *p0,05;

**p0. Заполнение кишечника у личинок обоих видов также уменьшалось с увеличением ширины груди. Максимальная ширина груди оказалась больше у An. messeae;

распределение особей двух видов по этому показателю также различалось (Таблица 3).

Скорость поглощения графита у личинок обоих видов обратно коррелировала с длиной тела: чем длиннее были особи, тем медленнее они заполняли свой кишечник.

Снижение скорости заполнения оказалось неодинаковым для обоих видов: для An.messeae эта величина уменьшалась с 26 до 14% (в 1.9 раза), для An.beklemishevi с 37 до 14% (в 2.7 раза). Различия в скорости заполнения кишечника касались только начала 4-го возраста, когда личинки имели длину тела 3.5-5 мм (р 0.05).

Ширина головы (ШГ) и головной индекс у An.messeae в среднем превышали аналогичные показатели у An.beklemishevi (Таблица 3). Распределение исследованных особей по ШГ также различалось. Построение линий регрессии показало, что скорость заполнения кишечника оставалась неизменной у особей An.beklemishevi и возрастала с увеличением ШГ у An.messeae.

Скорость заполнения кишечника у самцов и самок каждого из видов оказалась неодинаковой. Статистические различия обнаружены между всеми четырьмя группами особей (Рисунок 17А).

Рисунок 17 – Заполнение графитом кишечника личинок комаров.

А -заполнение кишечника личинок у самцов (1, 3) и самок (2, 4) An.beklemishevi (1, 2) и An.messeae (3, 4). Б - заполнения кишечника у личинок An.beklemishevi с разными инверсионными вариантами половой хромосомы. 1 - самцы, 2 - самки гомозиготные, 3 - самки гетерозиготные. Указан 95%-ный доверительный интервал.

Число зубцов гребня стигмальной пластинки в среднем оказалось выше у личинок An.beklemishevi. По этому признаку также отмечены внутривидовые различия по полу (р 0.001). С увеличением числа зубцов у личинок An.messeae скорость заполнения кишечника уменьшалась, у An.beklemishevi - не изменялась.

Неодинаковой оказалась флуктуирующая асимметрия по числу зубцов стигмальной пластинки по видам и у каждого из видов у особей обоих полов (р0.001;

Таблица 3). Линии регрессии заполнения кишечника в зависимости от асимметрии показали, что изменения у видов противоположны.

Личинки с разными инверсионными генотипами An.messeae и An.beklemishevi заполняли кишечник с неодинаковой скоростью.

Комары An.beklemishevi имели полиморфизм только по хромосоме XL: наряду с гомозиготными по хромосомной последовательности самками встречались также гетерозиготные;

гомозиготные по инверсии самцы и самки отсутствовали. Оказалось, что самцы поглощали пищу быстрее самок с обоими инверсионными генотипами, а гетерозиготные самки - быстрее гомозиготных (Рисунок 17Б).

У личинок An.messeae из популяции пос. Тегульдет полиморфизм наблюдался по четырем плечам трех хромосом. При этом корреляции скорости заполнения кишечника с частотой генотипа не наблюдалось (Таблица 4).

Скорость заполнения кишечника оказалась неодинаковой у личинок с разными инверсионными генотипами. Наиболее быстро заполняли кишечник самцы XL1, XL и самки XL11 и XL22, наименее - самцы XL0 и самки XL00. Скорость фильтрации также различалась для особей с различными вариантами аутосом.

Таблица 4 – Скорость поглощения графита особями An. messeae с разными инверсионными генотипами Вариант Частота Заполнение Ширина, мм Длина хромосомы f ± sf, % кишечника, мм тела, мм груди головы (n = 309) Самцы XL0 2.9 ± 0.96 0.72 ± 0.058 1.43 ± 0.018 0.787 ± 0.0023 6.78 ± 0. XL1 29.1 ± 2.58 0.87 ± 0.008 1.34 ± 0.002 0.815 ± 0.0003 6.31 ± 0. XL2 6.8 ± 1.43 0.93 ± 0.034 1.41 ± 0.007 0.821 ± 0.0013 6.76 ± 0. Самки XL00 1.9 ± 0.78 0.38 ± 0.062 1.32 ± 0.026 0.810 ± 0.0045 6.53 ± 0. XL01 2.9 ± 0.96 0.64 ± 0.054 1.31 ± 0.016 0.807 ± 0.0028 6.34 ± 0. XL11 39.5 ± 2.78 0.86 ± 0.005 1.29 ± 0.001 0.812 ± 0.0002 6.20 ± 0. XL12 15.5 ± 2.06 0.69 ± 0.013 1.30 ± 0.004 0.810 ± 0.0004 6.20 ± 0. XL22 1.3 ± 0.64 0.95 ± 0.189 1.41 ± 0.030 0.816 ± 0.0072 6.86 ± 0. Самцы + самки 2R00 15.5 ± 2.06 0.67 ± 0.011 1.31 ± 0.003 0.797 ± 0.0005 6.33 ± 0. 2R01 2.3 ± 0.85 0.84 ± 0.110 1.29 ± 0.028 0.808 ± 0.0015 6.21 ± 0. 2R11 82.2 ± 2.18 0.85 ± 0.003 1.32 ± 0.001 0.816 ± 0.0001 6.30 ± 0. 3R00 28.2 ± 2.56 0.75 ± 0.008 1.35 ± 0.002 0.810 ± 0.0003 6.47 ± 0. 3R01 52.1 ± 2.84 0.82 ± 0.004 1.31 ± 0.001 0.814 ± 0.0002 6.23 ± 0. 3R11 19.7 ± 2.26 0.93 ± 0.011 1.30 ± 0.003 0.813 ± 0.0004 6.27 ± 0. 3L00 83.2 ± 2.13 0.84 ± 0.003 1.31 ± 0.001 0.812 ± 0.0001 6.27 ± 0. 3L01(11) 16.8 ± 2.13 0.75 ± 0.012 1.36 ± 0.003 0.818 ± 0.0004 6.45 ± 0. Предполагается, что последовательность XL1 адаптирована к условиям резко континентального климата, XL0 – умеренного (Стегний, 1991). Вероятно, уменьшенные размеры и более высокая скорость поглощения пищи у самцов XL1 и самок XL11 также являются следствием этой адаптации.

Различие в скорости поглощения графита выявлено у особей при взаимодействии вариантов плеча 3R с гомозиготой 2R11, тогда как при взаимодействии с генотипом 2R00 такой дифференциации не оказалось (Рисунок 18А).

Чтобы проверить существование обратной связи между инверсионными генотипами и скоростью заполнения кишечника, совершили обратную операцию:

всех личинок поделили на три группы по скорости поглощения графита и сравнили их хромосомный состав – группу 1 составили особи с максимальной скоростью поглощения, группу 3 – с минимальной, группу 2 – с промежуточной. Различия обнаружены между группами 1 и 2 по частоте аутосомных гомозигот 3L00 (2=7.2, fd=1, p0.01), гетерозигот 3L01 (2=5.64, fd=1, p0.05), комбинацией 2R11-3L (2=5.48, fd=1, p0.05), инверсией 3L1 (2=7.97, fd=1, p0.01). Группы 1 и различались частотой последовательностей половой хромосомы XL0 (2=4.5, fd=1, p0.05), XL1 (2=4.44, fd=1, p0.05), аутосом 2R (2=4.05, fd=1, p0.05) и 3R (2=4.53, fd=1, p0.05;

Рисунок 18 Б). Различий между группами 2 и 3 не оказалось.

Рисунок 18 – Скорость заполнения кишечника у личинок An.messeae А – личинки An.messeae по комбинациям 2R-3R. 1 – 2R00-3R00, 2 – 2R01-3R01, 3 – 2R11 3R00, 4 – 2R11-3R01, 5 – 2R11-3R11. Б – частота хромосомных последовательностей в группах личинок An.messeae с различной скоростью заполнения кишечника: а – XL0, 2R0, 3L0;

b – XL1, 2R1, 3L1;

c – XL2 Указан 95% доверительный интервал.

Результаты проведенного нами эксперимента показывают, что личинки с инверсиями в генотипе по всем трем хромосомам имели различия в скорости поглощения пищи. Из этого мы можем заключить, что регуляция скорости фильтрации у личинок An.messeae связана со всеми тремя хромосомами.

Плечо 2R у An.beklemishevi сходно по структуре дисков с гомозиготой 2R полиморфной инверсии у An.messeae. Это, вероятно, свидетельствует о том, что регуляция скорости поглощения пищи достигалась у обоих видов одним и тем же способом. Последовательность XL1 у An.messeae адаптирована к условиям резкоконтинентального климата, XL0 - умеренного (Стегний, 1991). Это позволяет рассматривать перестройку XL2 как элемент генетической адаптации в условиях конкуренции с An.beklemishevi.

Состав хромосомных последовательностей в популяциях широко варьировал по частоте. Различия по концентрации инверсий отмечены у личинок из разных водоемов тегульдетской популяции. Частота инверсий неоднозначно коррелировала с долей An.beklemishevi. В частности, в восьми выборках из киреевской и тегульдетской популяций последняя слабо положительно коррелировала с частотой инверсий An.messeae XL0, XL1, 2R0, 3R0, слабо отрицательно – с частотой инверсии XL2, не коррелировала с частотой 3L0. Эти данные подтверждают ранее сделанные выводы о конкурентном взаимодействии данных видов в зонах симпатрии (Стегний, 1991).

Выявлена положительная взаимосвязь длины головы с долей инверсии 2R1, отрицательная – c частотой инверсий XL1, 3R1, 3L1 (Рисунок 19).

Особи гомозиготные по 2R11 наполняли кишечник быстрее гомозигот 2R00 на протяжении всей 4-ой стадий, что, вероятно, указывает на повышенные темпы развития особей с генотипом 2R11, а также раскрывает один из механизмов дифференцированной чувствительности An.messeae к Bti. Личинки An.beklemishevi имели сниженную относительную восприимчивость к Bti, несмотря на более высокую скорость фильтрации (Бурлак, Сибатаев, 1995;

Бурлак, Сибатаев, 1998).

Таким образом, изучение детерминации физиологического параметра – скорости поглощения пищи личинками показало, что особи с разными хромосомными вариантами имеют различия по этим физиологическим параметрам. В популяциях личинок малярийных комаров обоих видов скорость фильтрации у самцов выше, чем у самок.

Рисунок 19 – Зависимость длины головы от инверсионного состава популяций An.messeae. А – XL1, Б – 2R1, В – 3R1, Г – 3L1. Приведены линии регрессий.