Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов: фундаментальные и прикладные аспекты
На правах рукописи
ЕФРЕМЕНКО ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ:
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ 03.00.02 – биофизика 03.00.23 – биотехнология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва - 2009
Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
Научный консультант: Варфоломеев Сергей Дмитриевич, доктор химических наук, профессор член- корреспондент РАН
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Ревин Виктор Васильевич доктор химических наук, профессор Розанцев Эдуард Григорьевич доктор технических наук, профессор Гернет Марина Васильевна
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН
Защита состоится 14 октября 2009 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Косыгина, д. 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ВАК РФ http://vak.ed.gov.ru Автореферат разослан _ 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук М.А. Смотряева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Биотехнологические процессы, реализуемые при использовании гетерогенных биокатализаторов (ГБК) в виде иммобилизованных клеток (ИмК) микроорганизмов, позволяют получать целевые продукты как результат сложных многостадийных биохимических превращений исходных субстратов. Иммобилизация клеток, означающая любое ограничение свободы их физического движения в пространстве, давно обсуждается как эффективный подход к решению задач по интенсификации и повышению экономической привлекательности современных биотехнологических процессов, основанных на применении различных микроорганизмов.
ГБК на основе ИмК обеспечивают возможность создания биотехнологических процессов, в которых клетки длительно используются с высоким выходом целевых продуктов, при этом техническое решение таких процессов существенно упрощено по сравнению с процессами на основе свободных (суспензионных) клеток. Вместе с тем, широкомасштабная реализация биотехнологических процессов, основанных на применении ИмК, сегодня сдерживается несколькими основными причинами:
- существованием традиционных подходов к проведению процессов;
- отсутствием адекватных и экспрессных методов контроля биокаталитической активности ИмК микроорганизмов в составе ГБК;
- коротким перечнем ГБК, производство и применение которых можно масштабировать и осуществить в промышленных условиях;
- недостатком научных фундаментальных знаний о биокаталитических системах на основе ИмК и кинетических закономерностях, лежащих в основе их функционирования. Объективность существования этих причин подтверждается тем огромным научным и практическим интересом, который существует уже несколько десятилетий по отношению к ГБК на основе ИмК микроорганизмов и находит свое выражение в числе публикаций, которое с каждым годом растет, и рост этот носит экспоненциальный характер.
Проведенный анализ динамики развития исследований ГБК, которые ведутся во всем мире, показал, что в начале 21 века произошло резкое увеличение числа научных изысканий в этой области, которые преимущественно оказались связанными с изучением ИмК бактерий, причем включенных в ГБК нативно, то есть самоиммобилизованных в природных условиях, как правило, в биопленки.
Известно, что иммобилизация клеток – это широко распространенный в природе феномен, который играет особую роль в стратегии выживания и сохранения максимального числа каталитических функций у клеток. Формирующиеся при этом ГБК в виде биопленок с включенными в них клетками оказались суперэффективными катализаторами различных негативных процессов (биокоррозия металлических конструкций, возникновение воспалительных процессов, деструкция пластиковых материалов и др.). Попытки исследователей биопленок применить к своим объектам информацию о закономерностях функционирования искусственно создаваемых в течение многих лет ГБК на основе ИмК микроорганизмов ярко высветили существующие пробелы в знаниях об этих биокаталитических системах, способах их контроля и управления ими.
Сложилась парадоксальная ситуация с ГБК на основе ИмК, когда понимание существующих преимуществ этих систем (высокая операционная стабильность, резистентность к воздействию негативных факторов, продолжительные временные периоды активного биокаталитического действия, высокие выходы целевых продуктов) перед свободными клетками, традиционно используемыми в биотехнологических процессах, стимулировало на протяжении многих лет развитие исследований, направленных на внедрение их в промышленность (конструирование биореакторов, организация непрерывных процессов и др.), на фоне недостатка фундаментальных знаний о причинах существования этих преимуществ, а также о биофизических (кинетических) принципах, лежащих в основе функционирования ГБК с такими преимуществами. В связи с этим, исследования, позволяющие сократить пробелы на информационном поле в отношении ГБК, основу которых составляют ИмК микроорганизмов, являются крайне актуальными и имеют большое научно-практическое значение.
Целью данной работы было решение комплекса научно-практических задач, связанных с разработкой подходов к получению высокоэффективных ГБК на основе ИмК микроорганизмов, способных обеспечить реализацию различных биотехнологических процессах, а также исследование их биохимических свойств и основных кинетических закономерностей функционирования.
В рамках этой работы были поставлены следующие основные задачи:
- разработать научно-методологический подход, базирующийся на использовании биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного аденозин-5'-трифосфата (АТФ) в ИмК различных микроорганизмов, к адекватной оценке эффективности их каталитического действия и установить возможность использования данного биофизического метода исследования на разных стадиях изучения (получение, применение и хранение) иммобилизованных ГБК в качестве одного из главных аналитических инструментов;
- исследовать возможность создания полифункциональных ГБК на основе ИмК различных микроорганизмов, определить факторы, позволяющие направленно регулировать каталитические характеристики иммобилизованных ГБК в процессе их получения;
- провести критический сравнительный анализ биохимических и каталитических характеристик свободных и иммобилизованных клеток, позволяющий обобщить характерные особенности действия ГБК, и на основе результатов аналитического обобщения составить гипотезу о фундаментальных принципах, лежащих в основе закономерностей функционирования биокаталитических систем на основе ИмК;
- разработать новые ГБК на основе ИмК природных и рекомбинантных штаммов микроорганизмов с использованием криогеля поливинилового спирта (ПВС) в качестве носителя и исследовать возможность их эффективного применения в различных биотехнологических процессах с целью создания научно практических основ для реализации инновационных технических решений уже существующих процессов или организации принципиально новых биотехнологий.
Научная новизна работы состоит в том, что:
- широко апробирован биолюминесцентный метод анализа внутриклеточной концентрации АТФ для осуществления направленного получения высокоактивных ГБК на основе ИмК микроорганизмов, являющихся продуцентами различных целевых продуктов. Многочисленные экспериментальные данные в совокупности формируют научно-методологический подход к исследованию ГБК, базирующийся на выборе наиболее благоприятных условий подготовки клеток к иммобилизации и получения ГБК с использованием концентрации внутриклеточного АТФ в качестве критерия такого выбора. Данный биофизический подход позволяет выявить и обосновать основные закономерности изменения характеристик ИмК и может быть рекомендован для широкого применения в исследованиях ГБК на основе ИмК различных микроорганизмов в качестве эффективного аналитического инструмента;
- впервые показана возможность использования биолюминесцентного метода определения АТФ для исследования влияния различных факторов на кинетику развития смешанных культур в составе ГБК;
установлены кинетические характеристики и закономерности формирования коррозионно-опасных биопленок (КОБ) в проточных системах;
разработан подход к оценке биоцидной активности ингибиторов коррозии по отношению к различным КОБ на основе биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ;
установлено, что эффективность применения биоцидов с целью подавления развития КОБ зависит от их стадии роста;
- впервые установлено влияние условий формирования ГБК, а также условий и длительности их функционирования в периодическом режиме на прочностные характеристики ГБК, разработанных на основе ИмК мицелиальных грибов.
Показана возможность создания полифункциональных ГБК с использованием общих подходов, базирующихся на варьировании условий формирования иммобилизованного мицелия при исходной иммобилизации спор одной и той же культуры;
- показана возможность создания полифункциональных ГБК на основе клеток дрожжей. Установлено, что использование оптимизированного способа получения ГБК для клеток рода Saccharomyces, позволяет получить ИмК, применение которых возможно в разнообразных биотехнологических процессах, базирующихся на конверсии моносахаридов в этанол (шампанизация вина, получение образцов красного и белого вина, повышение качества некондиционной винной продукции, получение этанола из различных отходов сельского хозяйства и промышленности);
- впервые установлена возможность трансформации клеток в иммобилизованном состоянии плазмидной ДНК. Показано, что компетентные ИмК могут быть использованы для получения полифункциональных ГБК путем их трансформации новыми генетическими конструкциями;
- впервые выдвинута гипотеза о том, что в основе стабильного и длительного функционирования клеток в составе ГБК, разрабатываемых на основе ИмК, лежит система глобальной регуляции экспрессии генов, чувствительная к концентрации клеток. Иммобилизация клеток в высоких концентрациях активирует проявления генетически запрограммированного ответа клеток, приводящего к изменению их генетического и биохимического статуса. Научная гипотеза, основана на экспериментальных данных и расширяет представления о фундаментальных принципах, лежащих в основе закономерностей функционирования биокаталитических систем на основе ИмК, а также о подходах, которые могут быть применены на стадии получения ГБК и регулирования эффективности их действия в биотехнологических процессах;
- исследованы каталитические и физико-химические свойства новых белков – генетически модифицированных аналогов органофосфатгидролазы (ОРН).
Впервые показана высокая эффективность разложения фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ), катализируемая ферментом His6-OPH. Разработаны новые ГБК на основе ИмК, содержащих ферменты с ОРН-активностью, и показана высокая эффективность их каталитического действия в реакциях разложения фосфорорганических соединений;
- разработано 25 новых ГБК на основе ИмК микроорганизмов для разнообразных процессов. Новизна и оригинальность этих разработок подтверждена 14 Патентами РФ и 2 Авторскими свидетельствами СССР на изобретения. Показано превосходство данных ГБК по своим характеристикам над известными аналогами или установлено, что аналоги отсутствуют.
Практическая значимость результатов работы:
- установлены удельные концентрации внутриклеточного АТФ, характерные для большого числа клеток микроорганизмов, а также пределы варьирования этого параметра среди различных культур. Разработан ряд методик, адаптирующих применение биолюминесцентного метода к анализу ИмК разных микроорганизмов, показана адекватность оценки каталитических характеристик ГБК на основе результатов, получаемых при использовании этого биофизического метода, представлена корреляции полученных значений концентраций внутриклеточного АТФ в ИмК с другими их биохимическими характеристиками. Разработан дифференцированный метод анализа концентрации ИмК в составе ГБК, полученных на основе смешанных культур;
- разработан общий подход к получению ГБК на основе клеток мицелиальных грибов, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта;
показана возможность получения различных гидролитических ферментов с использованием разработанных ГБК в течение длительного времени, а также продемонстрирована эффективность применения таких ГБК для снижения уровня ХПК сточных вод предприятий пищевой промышленности при использовании их в качестве сред для культивирования ИмК;
- показано, что разработанный ГБК на основе клеток дрожжей рода Saccharomyces перспективен как объективная альтернатива свободным клеткам, традиционно используемым в промышленных условиях, и может служить основой для разработки новых биотехнологий, способных заменить существующие в области этанольного конверсии сахаров;
- показана возможность получения иммобилизованных компетентных клеток с пролонгированным сроком хранения и создания на их основе ГБК с новыми свойствами, в частности, с ОРН-активностью. На основе полученных результатов обоснованы рекомендации о проведении процессов c ГБК на основе ИмК в асептических условиях с целью обеспечения генетической неизменности используемых штаммов-продуцентов;
- впервые определены минимальные ингибирующие концентрации (МИК) для широкого ряда ингибиторов коррозии (ИК), обладающих биоцидным действием в отношении биопленок разного микробного состава. Полученные данные могут быть рекомендованы к использованию в антикоррозионных программах, составляющих основу мониторинга и применения ИК и биоцидов на практике;
- созданы генетические конструкции и рекомбинантные штаммы E.coli, обеспечивающие цитоплазматический биосинтез ОРН и ее генетически модифицированных аналогов, оптимизированы условия их получения в растворимой и каталитически активной форме. Показана целесообразность их использования в иммобилизованном виде для биосенсорного определения фосфорорганических нейротоксинов или для разложения фосфорорганических пестицидов.
Практическое применение результатов работы, в том числе разработанных ГБК и процессов с их участием, может быть реализовано в биотехнологической (производство гидролитических ферментов, молочной кислоты), нефтяной (для устранения коррозионных ситуаций, развитие которых провоцируют КОБ), химической и биотопливной промышленности (получение этанола), в разных отраслях пищевой промышленности с целью получения различных целевых продуктов (пробиотических продуктов питания, продукции винодельческой промышленности, глюкозо-фруктозных сиропов), при решении различных экологических задач в сельском хозяйстве, на предприятиях оборонного комплекса МО РФ и пищевой промышленности (очистка сточных вод, разложение пестицидов, утилизация целлюлозо- и лактозосодержащих отходов), для решения вопросов, связанных с выполнением международных обязательств РФ по уничтожению химического оружия (биоразложение реакционных масс различного химического состава, полученных после химической ликвидации ФОВ).
Основные положения, выносимые на зищиту - общий научно-методологический подход, основанный на оценке энергетического статуса ИмК по концентрации внутриклеточного АТФ, определяемой биолюминесцентным методом, может быть применен к получению новых ГБК на основе ИмК разных микроорганизмов, установлению оптимальных условий их функционирования и хранения, а также к мониторингу каталитической эффективности их действия в различных биотехнологических процессах;
- биолюминесцентный метод определения АТФ может быть эффективно использован как аналитический инструмент при создании ГБК на основе иммобилизованных смешанных культур и исследовании кинетики их функционирования;
- на основе общих принципов, но индивидуальных подходов к получению ГБК с использованием ИмК разных микроорганизмов (дрожжей, мицелиальных грибов, бактерий), могут быть созданы полифункциональные биокатализаторы;
- целесообразно конструирование и использование рекомбинантных штаммов бактерий для получения ГБК на основе ИмК с моноферментной целевой активностью;
- в основе стабильного и длительного функционирования клеток в составе искусственно полученных ГБК лежит система регуляции экспрессии генов, чувствительная к концентрации клеток;
- разработанные образцы ГБК на основе ИмК различных микроорганизмов могут найти высокоэффективное применение в качестве инновационных элементов в уже существующих процессах, а также могут быть использованы при реализации новых биотехнологических процессов.
Связь работы с крупными научными программами и проектами.
Представленные результаты были получены в ходе исследований, проводившихся в 1987-2009 гг. в рамках следующих научных программ и проектов, участником и руководителем которых была соискатель: ФЦНТП “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения” направление «Инженерная энзимология» (1994-1997, 1998-1999);
ФЦНТП “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники», направление «Технологии живых систем» (2002-2004), НАТО грант LG 941411 “Разработка новых биокатализаторов на основе криоиммобилизованной фосфотриэстеразы” (1994-1995);
НАТО грант LG 96-54378 «Разработка микробного консорциума для полной минерализации фосфорорганических соединений» (1996 1997);
Грант CRDF RP-359 «Биотехнологические подходы к детекции и детоксикации нейротоксичных пестицидов сельскохозяйственного и коммунального применения» (1997-1998);
Грант CRDF RP1-359 Y/S «Биотехнологические системы на основе нативных и иммобилизованных клеток для детоксикации нейротоксичных соединений» (1998-1999);
Грант IPP 325732-A G2 “Разработка дискриминационной биосенсорной системы для анализа фосфорорганических соединений и карбаматов” в рамках Международного проекта 43.073.1.1.2505 «Предотвращение угрозы распространения оружия массового поражения» (2000-2002);
Госконтракт № 43.073.1.1.2505 с Министерством науки и технологии РФ «Биокаталитические технологии для химического синтеза, аналитических систем и медицины» (2002-2004);
НАТО грант LST.CLG. “Конверсия отходов пищевой промышленности в ценные химические продукты” (2001);
НАТО грант LST.CLG.979437 “Постгеномный структурный анализ фторсодержащих белков”(2001-2003);
Грант IUPAC 2001-005-1-300 “Постгеномная химия”(2001-2003);
ФЦНТП “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники», направление №5 «Технологии живых систем», проект «Биокаталитические технологии» (2000-2001);
Госконтракты с Федеральным управлением по безопасному хранению и уничтожению химического оружия МО РФ «Обоснование способов биотехнологической очистки продуктов детоксикации ФОВ при различных технологиях уничтожения (утилизации)», шифр «Локус» (1998-1999);
«Исследование возможности использования метода биодеградации для переработки реакционных масс, образующихся при уничтожении отравляющих веществ», шифр «Богема» (2004-2006);
«Оптимизация технологических параметров процесса переработки реакционных масс, образующихся при уничтожении фосфорорганических отравляющих веществ, методом биодеградации», шифр «Биозащита» (2007-2008);
Проект НШ-1776.2003. «Химическая энзимология (Ведущая научная школа) (2003-2005);
Грант РФФИ 02 04-48981 «Исследование факторов, определяющих каталитическую активность и конформационную стабильность органофосфатгидролазы, методами белковой инженерии» (2002-2004), Грант МНТЦ 2245р “Исследование, диагностика и защита от микробиологически индуцированной коррозии в российской нефтяной и газовой промышленности (2002-2005);
Госконтракты с Федеральным агентством по науке и инновациям - №02.447.11.3001 (ЖС-22.4/005) «Ферменты и биокаталитические системы для ремедиации окружающей среды» (2005-2006) и № 02.434.11. (ЖС-12.4/005) «Биосинтез мономеров для полимерной химии» (2005-2006);
гранты РФФИ - 05-04-0818-офи-а «Новые высокоэффективные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток мицелиальных грибов, продуцирующих секретируемые ферменты» (2005-2007) и 08-04-12050-офи «Новый тип высокоэффективных биокатализаторов для обнаружения и обезвреживания фосфорорганических токсикантов» (2008-2009);
НАТО грант CBP.NRCLG 981752 «Химерные белки для разложения фосфорорганических нейротоксинов» (2005-2007);
Проекты программ Фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные проблемы энергетики» (2006-2007) и «Химические аспекты энергетики»(2009-2010).
Апробация работы. Результаты диссертации представлялись и обсуждались на Международных конгрессах по биосенсорам (Новый Орлеан, США, 1994;
Сан Диего, США, 2000), по биокаталитической деградации химических боевых материалов (Эджевуд, США, 1995);
по биокатализу (Пущино, 1998;
Москва, 2000;
2002, Москва-Санкт-Петербург, 2007);
VI Европейском конгрессе по биотехнологии (Фиренце, Италия, 1993), Международных конференциях НАТО «Химические и биологические технологии для определения, деструкции и деконтаминации боевых отравляющих веществ» (Москва, 1996), «Ферменты в гетероатомной химии: «зеленое» решение химических проблем» (Наймеген, Нидерланды, 1999);
“Золь-гелевые материалы для контроля загрязнений, очистки воды и ремедиации почв» (Киев, Украина, 2007);
1ом, 2ом, 3ем, 4ом, 5ом Московских Международных конгрессах “Биотехнология – состояние и перспективы развития” (Москва, 2002, 2003, 2005, 2007, 2009);
V, VI, IX, X и XI Международных симпозиумах по биоинкапсулированию (Потсдам, Германия, 1996;
Барселона, Испания, 1997;
Варшава, Польша, 2001;
Витория, Испания, 2004;
Кингстон, Канада, 2005;
Лозанна, Швейцария, 2006;
Вена, Австрия, 2007);
Международной конференции «Применение ферментов для химической и биологической защиты» (Майами, США, 2001);
Международной конференции «Энзимология, молекулярная биология и биогеохимия термофилов» (Петропавловск-Камчатский, 2000);
Международном симпозиуме по научным разработкам в области выполнения конвенции по химическому оружию (Берген, Норвегия, 2002);
на 7ой, 8ой, 9ой, 10ой, 11ой и 12ой Пущинских конференциях «Биология – наука ХХI века» (2003, 2004;
2005, 2006, 2007, 2008);
Международной конференции «От фундаментальной науки – к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Тверь, 2002);
7ом Международном симпозиуме по биоорганической химии (Торонто, Канада, 2002);
Международной конференции «Биотехнология микробов» (Москва, 2004), Международной конференции «Прогресс в биотехнологии и нейробиологии» (Хургада, Египет, 2004);
XVIII Международном химическом конгрессе (Карс, Турция, 2004), Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005);
6ой Международной конференции ICEP по загрязнению окружающей среды (Пермь-Казань, 2005), 6ой Бакинской Международной Мамедалиевской конференции по Нефтехимии (Баку, Азербайджан, 2005);
Международном конгрессе по биопроцессам в пищевой промышленности (Патрас, Греция, 2006), 1ом Международном конгрессе «Экологический биокатализ: от ремедиации с ферментами к новым «зеленым» процессам (Кордоба, Испания, 2006), ХVIII Менделеевском конгрессе по общей и прикладной химии (Москва, 2007), Международном конгрессе «Молекулярные и наноразмерные системы для конверсии энергии» (Москва, 2007), 1ой и 2ой Международных конференциях “Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине” (Ростов-на-Дону, 2007, 2008) и др..
Личный вклад автора. Автору принадлежит формулирование проблемы, постановка целей и задач проведенных исследований, планирование экспериментов, непосредственное участие в них или руководство ими, анализ и обобщение результатов, подготовка научных публикаций и патентов.
Публикации. Материалы диссертации отражены в 225 печатных работах, в том числе в 9 обзорах, 44 экспериментальных статьях, опубликованных в международных и российских изданиях, из них 38 – в журналах, включенных в список ВАК, а также в 14 Патентах РФ и 2 Авторских свидетельствах СССР на изобретения.
Структура работы и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 425 страницах, состоит из введения, шести глав, обобщающего заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 606 ссылок, и приложения в виде списка публикаций автора. Работа содержит 118 таблиц и 136 рисунков.
В главе 1 изложена обобщающая информация о методах, используемых при исследовании ГБК на основе ИмК микроорганизмов, и показана эффективность применения биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ на разных стадиях работы с ГБК. В главе продемонстрированы подходы к получению полифункциональных ГБК на основе ИмК различных микроорганизмов (дрожжей, бактерий, мицелиальных грибов), обсуждается научная новизна и практическая значимость полученных результатов.
В главе 3 дан анализ причин существующих различий в характеристиках свободных клеток и ИмК микроорганизмов. Глава 4 посвящена ГБК на основе ИмК с моноферментной активностью, подходам к их получению и анализу их каталитических характеристик. В главе 5 представлены разработанные оригинальные ГБК и процессы на их основе. В главе 6 суммированы основные экспериментальные методы, использованные в работе.
ГЛАВА I. ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ АТФ - КЛЮЧЕВОЙ ПАРАМЕТР ПРИ РАЗРАБОТКЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИИ ГЕТЕРОГЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК Использование экспрессных методов, позволяющих в реальном времени проводить анализ состояния ИмК, является ключевым моментом при разработке любых новых ГБК и необходимым условием для обеспечения их высоко эффективного применения. Основным требованием к анализу ГБК на основе ИмК является его проведение без обработки объектов исследования, способной искажать получаемый результат. Этому требованию отвечает биофизический метод определения внутриклеточной концентрации АТФ, основанный на регистрации интенсивности биолюминесценции, возникающей в результате высокоспецифичной ферментативной АТФ-зависимой реакции окисления люциферина люциферазой светляков (ЕС 1.13.12.5). При образовании каждой молекулы продукта этой реакции выделяется один квант света.
Известно, что АТФ присутствует только в живых клетках и является основным связующим звеном между процессами, протекающими с потреблением энергии, и процессами, сопровождающимися выделением и накоплением энергии. Изменение интегральной концентрации внутриклеточного АТФ в биомассе клеток, например, в 1 мг, относительно установленного контрольного значения позволяет судить об их жизнеспособности и метаболической активности. В этой связи было проведено всестороннее изучение возможности использования биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ на разных стадиях работы с ГБК на основе ИмК.
Для выявления и лучшего понимания существующих общих закономерностей в получении ГБК с определенными характеристиками и закономерностей в функционировании ИмК различных микроорганизмов в работе в большинстве случаев использовался один и тот же способ и носитель для иммобилизации клеток – включение их в гелевую матрицу, в качестве которой применялся макропористый криогель поливинилового спирта (ПВС) [Лозинский В.И., 1998]. Иммобилизация клеток бактерий и дрожжей в этот носитель происходила в результате приготовления их суспензии в концентрированном растворе полимера, последующего ее замораживания, выдерживания при температуре замораживания в течение времени, необходимого для формирования прочной матрицы носителя, и последующего размораживания системы.
Первоначально для различных микроорганизмов (всего 45 разных культур бактерий, дрожжей, микроскопических грибов и микроводорослей), являвшихся объектами исследования в этой работе, были установлены (впервые для подавляющего большинства культур) удельные концентрации внутриклеточного АТФ в тех условиях и средах, в которых далее предполагалось использовать ИмК.
Для разных микроорганизмов были оптимизированы условия (агенты, экстрагирующие АТФ из клеток, их соотношение с биомассой клеток, длительность обработки клеток экстрагирующими агентами, температура процесса), обеспечивающие максимальную экстракцию АТФ из анализируемых образцов. Результаты, полученные при работе со свободными клетками, послужили основой для разработки методик, предназначенных для анализа клеток, искусственно иммобилизованных в ГБК и самоиммобилизующихся в биопленки.
С использованием биолюминесцентного метода определения АТФ было установлено влияние ряда факторов на эффективность действия получаемых ГБК на основе ИмК различных микроорганизмов (бактерий и дрожжей), при этом для подтверждения значимости выводов, сделанных на основе АТФ-метрии, были проанализированы изменения других биохимических параметров клеток (состава жирных кислот в липидах клеток, концентрации трегалозы, ферментативных активностей клеток и др.). Согласно полученным данным, следующие факторы могут служить инструментом для направленного регулирования характеристик разрабатываемых ГБК на основе ИмК:
- условия подготовки клеток к иммобилизации (фаза роста клеток, условия культивирования - состав и рН среды, температура). На примере 5-ти штаммов дрожжей Saccharomyces сerevisiae показано, что разница в выборе клеток для иммобилизации, взятых в конце логарифмической фазы роста (максимальная удельная концентрация АТФ в клетках) и в начале стационарной фазы роста (максимум накопления биомассы клеток), обеспечивает для разных штаммов 25 45% разницу в функциональных характеристиках получаемых ГБК (табл.1).
На примере разных бактериальных культур (Zymomonas mobilis-113 и Escherichia coli DH5) также было показано, что определенная фаза роста клеток с характерным для этой фазы энергетическим статусом, определяемым концентрацией внутриклеточного АТФ, является важнейшим критерием для их отбора с целью иммобилизации и предопределяет свойства получаемых ГБК.
Таблица 1. Результаты анализа кинетики накопления основных метаболитов в реакторах с клетками дрожжей S. сerevisiae, иммобилизованными в криогель ПВС, в процессе шампанизации вина (для получения ГБК исходно взяты клетки с разной концентрацией внутриклеточного АТФ).
ГБК, Удельная Уровень Выход этонола Начальная Начальная полученный на концентрация накопления от теоретически скорость скорость основе клеток, АТФ биомассы возможного накопления накопления выращенных в свободных свободных после 28 сут. этанола при СО2 в в течение клетках перед их клеток в среде ведения процесса использовании реакторе с указанного иммобилизацией, в момент их с использованием ГБК, ГБК времени моль/мг клеток использования, ГБК, % г/л/сут кПа/сут г/л 8,25 х 10- Cremanti, 19 ч 4,0 98,2 1,26 45, - Cremanti, 22 ч 4,35 х 10 4,6 97,2 0,87 30, Fermivin 7,40 х 10- PDM, 21 ч 5,0 98,4 2,30 70, Fermivin 3,80 х 10- PDM, 24 ч 5,5 97,3 1,90 55, - условия проведения самой иммобилизации (температуры и длительности процесса, концентрации полимера, формирующего носитель, концентрации клеток, вводимой в носитель и др.). Так, на примере клеток Zymomonas mobilis- продемонстрировано влияние скорости замораживания суспензии клеток в растворе ПВС на метаболические характеристики получаемого ГБК в процессах получения этанола. Для клеток E. coli DH5, содержащих фермент органофосфатгидролазу (ОРН) в периплазме и иммобилизованных в криогель ПВС, установлено существенное влияние скорости размораживания клеток после их иммобилизации на уровень их жизнеспособности и целевую ферментативную активность (табл.2).
На примере клеток пурпурных фотобактерий Rhodobacter capsulatus В10, иммобилизованных в криогель ПВС и продуцирующих водород, было показано влияние исходной концентрации биомассы клеток, вводимой в состав ГБК, на его функциональные характеристики (табл.3). Оптимальной оказалась 4,75% (масс.) концентрация клеток в гранулах ГБК, которая обеспечивала максимальную скорость накопления целевого продукта (3870 мл Н2/ч/л матрицы) и длительность функционирования ГБК (до 550 сут), существенно превосходящие те же характеристики известных аналогов. Новизна и высокие показатели функциональной активности этого ГБК послужили основанием для получения Патента РФ на изобретение № 2323975 (2008).
Таблица 2. Влияние скорости размораживания гранул ГБК с клетками E. coli DH5, содержащими фермент органофосфатгидролазу (ОРН) в периплазме и иммобилизованными в криогель ПВС, на их каталитическую активность и концентрацию внутриклеточного АТФ.
Скорость размораживания гранул ГБК с иммобилизованными клетками, оС/мин Исследуемые образцы ГБК с ИмК после размораживания гранул 0,20 0,025 0,20 0, от -20оС до +4оС ОРН-активность, АТФ, х10-10 моль/мг клеток ед/г клеток - сразу после размораживания гранул 4,0 ± 0,4 8,6 ± 1,2 0,13 ± 0,03 0,67 ± 0, - через 24 ч в питательной среде после размораживания гранул 3,4 ± 0,3 25,6 ± 3,1 0,18 ± 0,02 1,41 ± 0, Таблица 3. Показатели, характеризующие процесс продуцирования водорода клетками Rhodobacter capsulatus В10, иммобилизованными в криогель ПВС, в периодических условиях.
Концентрация Максимальная Максимальная [АТФ], х10-11 моль/мг ГБК иммобилизо- продуктивность удельная ванных клеток в процесса, продуктивность сразу после после 450 ч гранулах ГБК мл Н2/ч/л среды ГБК, приготовления использования ГБК масс.% мл Н2/ч/л матрицы* образца ГБК для получения Н 1,25 0,6 1765 0,18 ± 0,01 0,25 ± 0, 2,50 1,5 2205 0,46 ± 0,03 0,53 ± 0, 4,75 5,1 3870 0,95 ± 0,05 1,63 ± 0, 10,00 5,5 3900 1,15 ± 0,08 1,77 ± 0, *Объем носителя с ИмК, используемый для получения водорода.
Впервые была показана возможность использования биолюминесцентной АТФ-метрии для мониторинга состояния ИмК различных микроорганизмов в составе ГБК при их длительном хранении, а также возможность использования данного метода для выбора наиболее благоприятных условий хранения ИмК– температуры, среды, исходной концентрации клеток, иммобилизованных в носителе и др.. При этом впервые было проведено длительное хранение (24 месяца) при –180С различных микроорганизмов (всего – 6 культур грамположительных и грамотрицательных бактерий, природных и рекомбинантных клеток, дрожжей и мицелиальных грибов), иммобилизованных в криогель ПВС. Исследовалось влияние условий хранения на выживаемость, репродуктивную способность и функциональную активность ИмК.
Мониторинг концентрации АТФ в клетках различных микроорганизмов, хранившихся в иммобилизованном и замороженном состоянии, позволил установить наличие слабых изменений в величине исследуемого параметра по сравнению с исходным уровнем во всех анализируемых образцах (рис.1). Был установлен высокий уровень метаболической активности у суспензионных клеток (Streptomyces anulatus, Rhyzopus oryzae, Escherichia coli, продуцирующих, соответственно, антибиотик аурантина, L(+)-молочную кислоту и рекомбинантный фермент ОРН), нарастающих в среде при использовании ИмК разного срока хранения в качестве инокулята. Для ИмК дрожжей впервые было установлено появление аскоспор в составе ГБК при его длительном хранении. В целом для большинства культур исследования показали возможность длительного хранения ГБК (как минимум 2 года) перед их использованием в биотехнологических процессах. Эти результаты могут составить научный и практический интерес для держателей коллекций микроорганизмов, сохраняющих длительное время различные культуры с помощью различных методов.
Рис.1. Изменение концентрации внутриклеточного АТФ в гранулах криогеля поливинилового спирта с иммобилизованными клетками различных микроорганизмов исходно составлявших 10,4% масс. (светлые символы) и 30% масс. (черные символы) в составе ГБК, от продолжительности их хранения в замороженном состоянии:
Rhodococcus erhytropolis (, ), Streptomyces anulatus (, ), Pseudomonas putida (, ).
С использованием биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ были установлены наиболее благоприятные условия применения ряда разработанных ГБК. Были установлены условия эффективного использования ГБК на основе криогеля ПВС и термофильных клеток бактерии Clostridium thermocellum, осуществляющих секрецию эндо-1,4--глюканазы (EC 3.2.1.4) при 60оС, с целью длительного (в течение 6 месяцев) получения фермента в периодических условиях (рабочий период -3-3,5 сут.). При этом было показано, что периодическое снижение концентрации АТФ в ИмК четко скоррелировано с процессом синтеза секретируемого целевого фермента.
Аналогичные тенденции в изменении концентрации внутриклеточного АТФ были установлены для ИмК E.coli, в которых также наблюдалось снижение АТФ на стадии интенсивного синтеза внутриклеточного фермента ОРН. Эти результаты позволили заключить, что снижение концентрации АТФ в 3-6 раз в ИмК бактерий, может быть «маркером» активных биосинтетических процессов.
Метод АТФ-метрии был успешно применен при исследовании возможности длительного использования ГБК на основе клеток бактерии Alcaligenes xylosoxidans subsp. xylosoxidans (SH91), иммобилизованных в криогель ПВС и способных утилизировать в качестве единственного источника углерода тиодигликоль (ТДГ), являющийся продуктом разложения иприта (отравляющего вещества кожно нарывного действия). Было установлено, что применение ГБК на основе ИмК позволяет увеличить скорость разложения ТДГ в 5,5 раз по сравнению со свободными клетками и ввести в среду для биодеградации концентрацию ТДГ в 1, раза превышающую ту, которая может быть использована для обработки суспензионной культурой (рис.2).
Разработанный ГБК непрерывно использовался в реакторе периодического действия в течение 276 ч для разложения максимальной концентрации ТДГ (145 мМ) которая может присутствовать в реакционных массах, получаемых после химического уничтожения иприта в щелочных средах. При этом было показано, что адекватная оценка метаболической активности ИмК, а также прогнозирование их деградации потенциальных возможностей при Рис.2. Зависимость скорости тиодигликоля от его исходной концентрации в длительном использовании в среде. Концентрация гранул ГБК с целевом процессе могут быть иммобилизованными клетками в среде - 200 г/л.
сделаны на основе результатов биолюминесцентного анализа концентрации внутриклеточного АТФ.
При изучении многокомпонентных ГБК, содержащих одновременно ИмК различных микроорганизмов, которые целенаправленно создаются и используются в биотехнологических процессах или самопроизвольно формируются в природных условиях, был разработан способ дифференцированного определения концентраций разных бактерий в смешанных культурах, находящихся в составе ГБК на основе ИмК, с использованием преимуществ биолюминесцентного метода определения АТФ. Способ реализовался за счет применения комбинированного подхода, сочетающего в себе микробиологические приемы работы с клетками микроорганизмов, основанные на использовании селективных питательных сред для культивирования клеток, биолюминесцентный метод анализа концентрации внутриклеточного АТФ, позволяющий достоверно оценить концентрации клеток в образцах и получать информацию о кинетике роста клеток, а также стандартные математические методы обработки данных по кинетике роста микроорганизмов, позволяющие установить начальную концентрацию клеток в образце (рис.3).
Применение селективных сред, предназначенных для культивирования определенных клеток, позволяло осуществлять их дифференциацию в процессе культивирования образца смешанных культур. При этом культивирование ИмК, входящих в состав ГБК, проводилось в условиях, оптимальных для клеток, принадлежащих к дифференцируемой группе бактерий. Культивирование ИмК осуществлялось до достижения свободными клетками, являющимися потомственными генерациями ИмК, конца логарифмической фазы роста. Таким образом, ИмК, введенные в среду культивирования, служили инокулятом. В процессе роста свободных клеток производился отбор проб культуральной жидкости, начиная с момента посева анализируемых проб, в которых определялась концентрация АТФ. Применение АТФ-метрии для определения концентрации клеток и построения кривых роста обеспечило оперативность и точность определения, а также сократило время, необходимое для количественного анализа.
Участки кривых роста, соответствующие экспоненциальной фазе роста свободных клеток, линеаризовались в полулогарифмических координатах с целью определения начальных концентраций клеток в образцах смешанных культур. В качестве контроля в этих исследованиях использовался классический микробиологический метод. Результаты двух методов характеризовались высокой степенью тождественности (табл.4). Такой комбинированный подход, который был предложен и впервые применен в этой работе для дифференцированного определения численности бактериальных клеток в составе смешанных культур, присутствующих в составах различных ГБК на основе ИмК микроорганизмов, является оригинальным, и это было подтверждено Патентом РФ №2263148 (2005).
Исследование I II III кинетики роста ключевой культуры в Селективная каждой селективной среда ln[ATФ] среде Смешанные Селективная [АТФ] культуры среда микроорганизмов …….
ln[АТФ0] Селективная Время среда n В р емя Рис.3. Принципиальная схема дифференцированного анализа концентрации клеток отдельных культур в составе ГБК на основе иммобилизованных смешанных культур: I - использование образцов иммобилизованных смешанных культур в качестве инокулята для накопления биомассы свободных клеток в селективных средах (число «n» сред соответствует числу определяемых культур в смеси);
II- исследование кинетики роста свободных клеток в селективных средах биолюминесцентным методом;
III – математическая обработка кинетических данных и определение исходной концентрации клеток каждой культуры через известную удельную концентрацию АТФ, характерную для каждой культуры в применяемых условиях культивирования.
Показана эффективность применение биолюминесцентного метода определения АТФ для разработки и анализа биокаталитических систем, искусственно создаваемых на основе ИмК смешанных бактериальных культур. Так с использованием дифференцированного метода определения концентрации клеток отдельных культур в составе ГБК на основе смешанных культур был разработан способ получения пробиотических желированных мясных продуктов, содержащих ИмК пробиотиков, в основу которого была положена технология производства мясных изделий в желе (ТУ 9213-049-13160604-00).
Способ введения молочно-кислых бактерий (МКБ) в мясные продукты предполагал использование природного полимера (желатин, агар), образующего термотропный гель, который, с одной стороны, служил желирующей основой для функциональных мясных продуктов, а с другой стороны – выполнял функцию носителя для МКБ, соиммобилизация которых осуществлялась включением клеток смешанных культур (Lactobacillus acidophilus и Streptococcus thermophilus) в гелевую матрицу. Биолюминесцентный метод определения концентрации внутриклеточного АТФ был использован для оценки влияния условий иммобилизации смешанной культуры на остаточную концентрацию МКБ в составе получаемых ГБК, которая составила не менее 107 кл/г (табл. 4) и не изменялась после их хранении при 8оС в течение 120 ч, что в 2,5 раза превышало требуемый срок хранения. Результаты исследований были отражены в Патенте РФ № (2004), согласно которому ГБК, разработанные в виде желированных пробиотических продуктов, предназначены для профилактического питания в той группе населения, которая характеризуется наличием лактазного дефицита.
Таблица 4. Начальные концентрации различных клеток, присутствовавших в составе биопленок, полученных на основе самоиммобилизованных клеток смешанных культур, а также в составе ГБК с ИмК смешанных культур, определение которых проводилось микробиологическим и биолюминесцентным (дифференцированным) методами анализа.
Начальная концентрация клеток, кл/см № ГБК на основе ИмК смешанных культур Микробиологи- Биолюминесцент ческий метод ный метод 1 Коррозионно-опасные биопленки на основе смешанных культур:
(1,6±0,1)х106 (1,4±0,1)x Pseudomonas putida (7,2±0,3)x Desulfovibrio vulgaris (5,5±0,4)x Pseudomonas putida (4,3±0,2)х (4,2±0,1)x Desulfovibrio vulgaris (1,3±0,1)х102 (1,9±0,2)x Pseudomonas putida (5,4±0,2)x Desulfovibrio vulgaris (7,5±0,3)x Pseudomonas putida (6,9±0,5)х (2,2±0,2)x Desulfovibrio vulgaris Начальная концентрация клеток, кл/г 2 ГБК для биодеградации фософорорганических пестицидов (3,3±0,7)x103 (4,6±0,4)x Escherichia coli (4,4±0,8)x106 (5,2±0,5)x Pseudomonas putida 3 ГБК для введения в пищевые функциональные продукты (1,5±0,2)x107 (2,5±0,3)x Lactobacillus acidophilus (2,9±0,6)x107 (4,0±0,3)x Streptococcus thermophilus Показана высокая эффективность использования биолюминесцентной АТФ-метрии в исследованиях природных биокаталитических систем на основе самоиммобилизующихся клеток в виде биопленок. Для исследования кинетики роста коррозионно-опасные биопленок (КОБ) впервые в рамках данной работы использовался биолюминесцентный метод определения концентрации АТФ, и проводился дифференцированный анализ микробного состава биопленок.
Определено, что в формировании КОБ основную роль играют сульфат восстанавливающие бактрии (СВБ). На всех стадиях роста состав КОБ имеет гетерогенный микробный состав, а присутствие аэробных гетеротрофных бактерий (ГБ) существенно ускоряет формирование КОБ.
Помимо влияния микробного состава планктонной смешанной культуры в среде, где идет формирование КОБ, выявлена зависимость скорости формирования КОБ от следующих факторов:
- присутствие осадка сульфида железа на металлических поверхностях, где формируются КОБ;
- присутствие нефти в среде роста КОБ;
- тип функционирования системы (стационарная или проточная, замкнутая или открытая), в которой происходит формирование биопленок.
Различия в величинах удельных скоростей роста КОБ в стационарной (0,063 ч-1), замкнутой проточной (0,16 ч-1) и открытой проточной (0,30 ч-1) системах свидетельствуют о том, что в условиях открытых проточных систем, к числу которых относится большинство всех трубопроводов, величина этого параметра является максимальной. Показано, что сформировавшиеся КОБ характеризуются повышенной скоростью коррозии металла, вызываемой ими, в сравнении с еще только формирующимися КОБ, при этом коррозия металла сопровождается активным накоплением сульфида железа в составе самой КОБ (рис.4).
Рис.4. Изменение контролируемых параметров в процессе роста коррозионно опасных биопленок:
- массового показателя коррозии, мг/см2, - lg [конц.клеток в биопленке, кл/см2], - концентрации сульфида железа в составе биопленки, мкг/см2.
Была показана возможность использования АТФ-метрии для оценки действия ингибиторов коррозии (ИК), использующихся на практике, как биоцидов по отношению к разным бактериальным клеткам, участвующим в формировании КОБ.
В связи с этим было проведено определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) разных ИК, которые обеспечивали снижение численности клеток в анализируемых образцах до недетектируемого уровня (табл.5). Показано, что МИК, определенные для ИК биолюминесцентным методом, отражали концентрации, являющиеся действительно биоцидными по отношению к клеткам, тогда как микробиологический метод позволял определить лишь бактериостатические концентрации веществ, вызывающие переход клеток в некультивируемое состояние. Установлено, что для подавления роста и коррозионной активности клеток в составе КОБ требуются в 3-6 раз более высокие концентрации ИК, проявляющих свойства биоцидов, по сравнению с суспензионными клетками (табл.5). Биопленки, сформированные смешанными культурами, более устойчивы к воздействию биоцидов, при этом биоцидная активность ИК по отношению к КОБ бала заметно выше на начальной стадии их формирования (табл.6).
Таблица 5. Минимальные ингибирующие концентрации ИК для КОБ и планктонных клеток, участвующих в их формировании.
МИК для разных ИК, мг/л КОБ и планктонные клетки, участвующих в их формировании Катон Хазар Нитро-1 ВФИКС- Суспензионные клетки:
- Pseudomonas putida 117 55 57 - Desulfovibrio vulgaris 229 174 169 Биопленка, сформированная на основе:
- монокультуры СВБ (D. vulgaris) 750 1000 800 - природной ассоциации клеток 800 1000 900 Таблица 6. Удельные скорости роста (µ) КОБ, определенные при внесении ИК (Катона) в среду на разных стадиях их формирования.
µ, ч-1 (при внесении µ, ч-1 (при внесении Концентрация Снижение Снижение Катона, Катона в среду до удельной Катона в среду в удельной мг/л начала формирования скорости экспоненциальной скорости биопленок) роста, % фазе роста биопленок) роста, % 0 0,086 контроль 0,070 контроль 50 0,060 30 0,061 100 0,045 48 0,049 150 0,031 65 0,038 Следует отметить, что ранее подобных исследований не проводилось, поскольку это было связано с существующими ограничениями микробиологического метода анализа, который мог быть применен для подобного рода исследований.
ГЛАВА 2. ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ГЕТЕРОГЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК РАЗЛИЧНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ 2.1. Разработка многоцелевых ГБК на основе клеток дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС Дрожжи как объект исследования вызывают большой интерес, поскольку являются основными катализаторами процессов этанольного брожения и, с точки зрения биотехнологического применения этих микроорганизмов в свободном и иммобилизованном виде, неоспоримое преимущество по объемам потребления таких ГБК и разнообразию условий их применения имеет винодельческая и спиртовая, а в последнее время и топливная промышленность.
Первоначально был разработан способ получения ГБК на основе клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса Шампанская-39, включенных в криогель ПВС. С использованием биолюминесцентного метода определения АТФ были оптимизированы условия подготовки клеток к иммобилизации (состав среды культивирования, температурный режим и фаза роста клеток), установлен оптимальный компонентный состав ГБК, а также условия формирования криогеля ПВС как носителя. Этот споб получения ГБК и его последующее применение гарантировало получение конечного продукта (шампанского) самого высокого качества (по биохимическим и органолептическим характеристикам) при сокращении длительности процесса (с 28 до 21 сут.) в сравнении с его классическим вариантом, основанным на использовании свободных клеток. Ввиду оригинальности разработанного способа получения этого ГБК и его характеристик, он был запатентован (Патент РФ № 2322499, 2008), и была исследована возможность применения этого способа для получения ГБК с использованием различных штаммов дрожжей рода Saccharomyces (S. vini 47K, S. vini Бордо 20, S.
vini Кокур 3, S. vini-Ленинградская, S. vini Каберне 5, S. vini Массандра 3, S. vini Кислотопонижающая раса, S. cerevisiae ph. v. bayanus (Zymasil killer), S. cerevisiae Red fruit, S. cerevisiae Vintage white, S. cerevisiae(bayanus) 8906 Fermivin PDM, S.
cerevisia(bayanus) AD-906 France Champagne Premium, S. cerevisiae Killer (bayanus) IOC 18-2007, S. baynus Cremanti), катализирующих биотехнологические процессы, в основе которых лежит конверсия моносахаридов в этанол (получение белых и красных столовых вин, устранение недобродов с целью получения кондиционной продукции). В каждой разновидности тестируемого биотехнологического процесса использовался для исследований не один, а несколько штаммов. Таким образом, определялась универсальность того подхода, который был положен в основу способа получения ГБК на основе клеток, иммобилизованных в криогель ПВС, а, следовательно, и полифункциональность того ГБК, который мог быть получен при замене всего одной единственной составляющей – штамма клеток рода Saccharomyces. Следует отметить, что подобная научная задача решалась впервые.
Проведенный биохимический и органолептический анализ образцов вина, полученных с использованием приготовленных ГБК на основе ИмК разных штаммов, выявил наличие общих тенденций в изменении концентраций отдельных компонентов сред, накапливающихся в процессе этанольного брожения, по сравнению с образцами сред, приготовленных с применением свободных клеток тех же штаммов дрожжей. Так, по сравнению со свободными клетками в средах с ИмК регулярно отмечалась более высокая (на 6-12%) концентрация этанола и меньшая остаточная концентрация сахарозы (в 1,5-2 раза), что свидетельствовало о большей степени потребления исходного субстрата ИмК и более полной его конверсии в основной продукт метаболизма (этанол). Для ИмК было отмечено заметное снижение концентраций ряда метаболитов: глицерина – на 30%, этилацетата - в 2-17 раз, молочной кислоты - в 1,2-2,3 раза, различных спиртов (метанола, пропанола, изобутанола, изоамилового спирта) - в 2-5 раз, уксусной кислоты - в 1,25-3,0 раза (табл.7, табл.8). Эти результаты свидетельствовали о преимущественной конверсии потребленного субстрата в основной продукт гликолиза – этанол. При этом во всех образцах сред, полученных с использованием ИмК, наблюдалось 25-33%-ное увеличение концентрации яблочной кислоты по сравнению с теми винами, где применялись свободные клетки дрожжей.
Таблица 7. Концентрация органических кислот в белом столовом вине, полученном с использованием свободных и иммобилизованных клеток разных штаммов дрожжей S. vini.
Органические кислоты*, мг/л Штамм дрожжей S. vini 1 2 3 4 5 6 7 47 K Свободные клетки 3566 83 1820 27 1709 11 736 Иммобилизованные 3326 66 1512 19 1875 16 535 Кокур Свободные клетки 3387 64 1256 29 1729 18 620 Иммобилизованные 3355 54 1255 26 1842 13 534 Ленинградская Свободные клетки 3332 61 1410 27 1513 16 1288 Иммобилизованные 3330 60 1276 27 1896 13 575 Kислотопонижающая Свободные клетки 3483 73 1160 26 1617 11 527 Иммобилизованные 3438 64 1137 23 2139 14 525 Mассандра Свободные клетки 3494 57 1483 25 1841 15 463 Иммобилизованные 3264 57 1252 27 1939 16 467 *1 - винная (4343 мг/л), 2 - лимонная (105 мг/л), 3 - янтарная (230 мг/л), 4 - фумаровая (6 мг/л), 5 - яблочная (1454 мг/л), 6 - пировиноградная (16 мг/л), 7 - молочная (0 мг/л), 8 - уксусная (0 мг/л) кислоты. В скобках указаны начальные концентрации органических кислот, исходно присутствовавшие в виноградном соке.
Совокупность проанализированных характеристик продуктов различных биотехнологических процессов подтвердила, что применение ГБК на основе клеток дрожжей, иммобилизованных согласно разработанному способу, обеспечило приготовление шампанского, красного и белого вина, превосходящих по качеству (по всем основным физико-химическим и органолептическим характеристикам) образцы вина, полученного с использованием свободных клеток дрожжей тех же тестированных коммерческих и промышленных штаммов.
Также впервые была продемонстрирована высокая эффективность использования ГБК на основе ИмК дрожжей, полученных по разработанному способу, для устранения винных недобродов, представляющих собой виноматериалы, содержащие высокую остаточную концентрацию сахарозы, не соответствующую требованиям, предъявляемым к качественной продукции.
Доведение подобных виноматериалов до необходимого уровня качества является трудно решаемой задачей, так как в таких средах уже содержатся довольно высокие концентрации накопившегося этанола, выступающего ингибитором метаболической активности свободных клеток дрожжей. В данной работе обработка виноматериалов с исходно высокой концентрацией этанола (82,8 г/л и 106,5 г/л) полученным ГБК на основе ИмК S. cerevisiae phv bayanus в течение сут. позволила заметно (в сравнении со свободными клетками) улучшить их качество (рис. 5), повысив содержание в них этанола.
Таблица 8. Содержание различных ароматических веществ в столовом красном вине, приготовленном с использованием свободных и иммобилизованных клеток различных штаммов винных дрожжей S. vini Контролируемые Клетки разных штаммов дрожжей S. vivi вещества, мг/л 47 К Каберне-5 Массандра- Свобод. Иммоб. Свобод. Иммоб. Свобод. Иммоб.
Ацетальдегид 14,8 14,8 23,4 13,5 19,7 16, Этилацетат 18,3 18,2 24,8 13,0 18,9 18, Метанол 29,0 28,6 52,4 27,0 48,6 46, Пропанол 37,9 34,6 31,3 9,7 38,9 37, Изобутанол 37,6 32,1 37,0 6,8 37,1 34, Изоамиловый спирт 166,0 146,5 329,3 158,7 289,8 166, Уксусная кислота 125,0 91,0 315,0 104,0 216,0 100, Бутиленгликоль 150,8 166,3 149,3 168,6 161,0 175, Фенилэтиловый спирт 31,1 33,2 43,2 31,1 41,0 32, Глицерин 11000 10500 10700 10300 11000 Изоамилацетат 2,34 2,85 2,44 2,25 2,72 1, *Дегустационная оценка 7,8 7,9 7,7 7,8 7,6 7, *Дегустационная оценка по 8-ми бальной системе проводилась комиссией профессиональных экспертов отдела химии и биохимии вина Национального института винограда и вина «Магарач» (г. Ялта, Украина).
Рис. 5. Кинетика накопления этанола (устранения некондиционности виноматериалов) в средах, уже содержащих разную концентрацию этанола, под действием свободных и иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей S. cerevisiae phv bayanus.
Свободные и иммобилизованные клетки дрожжей обозначены черными и белыми символами, соответственно. Средам с исходной концентрацией этанола 82,8 г/л и 106,5 г/л соответствуют круглые и треугольные символы.
Таким образом, на основе клеток дрожжей рода Saccharomyces, включенных в криогель ПВС, была установлена универсальность разработанного способа иммобилизации клеток, а также показана полифункциональность ГБК, получаемого таким способом и имеющего высокую эффективность действия в различных процессах, связанных с конверсией сахаров в этанол.
2.2. Установление общих закономерностей в формировании гетерогенных ГБК на основе иммобилизованных клеток мицелиальных грибов, создание полифункциональных биокатализаторов и исследование их характеристик При получении различных образцов ГБК на основе иммобилизованных клеток мицелиальных грибов, включенных в матрицу криогеля ПВС, в данной работе была применена одна и та же общая схема эксперимента, состоящая из следующих основных стадий: 1 – включение спор мицелиальных грибов в криогель ПВС;
2 - проращивание иммобилизованных спор в питательной среде определенного состава с целью накопления метаболически активного мицелия в объеме носителя и формирование, таким образом, целевого ГБК.
На основе предварительного скрининга продуцентов для создания ГБК на основе ИмК, предназначенных для применения в биотехнологических процессах с разными целевыми продуктами, был отобран штамм Rhizopus oryzae F-814, обладавший способностью к продуцированию различных целевых продуктов (липолитических и амилолитических ферментов, а также молочной кислоты). Была исследована возможность создания полифункциональных ГБК на основе этого штамма при использовании одних и тех же иммобилизованных спор, но с проведением формирования иммобилизованного мицелия в питательных средах разного состава, содержащими индукторы, необходимые для приобретения ИмК определенных каталитических свойств, например, амилолитической или липолитической активности. Подобные исследования были проведены впервые.
При формировании всех разрабатываемых ГБК подбирались условия (состав питательной среды, длительность процесса, концентрация гранул ГБК в среде и др.), обеспечивающие получение за минимальное время готовых ГБК с максимальной метаболической активностью иммобилизованного мицелия. В результате было обнаружено, что при использовании одинаковых исходных спор, включенных в криогель ПВС, и сред определенного состава может быть сформирован высоко активный иммобилизованный мицелий, продуцирующий:
L(+)-молочную кислоту (МК) – при его формировании в среде, содержащей глюкозу как основной источник углерода (рис.6);
- амилолитические ферменты – при его формировании в среде, содержащей крахмал (рис.7);
- липолитические ферменты - при его формировании в среде, содержащей триацилглицериды (табл.9). Таким образом, впервые была продемонстрирована возможность получения полифункциональных ГБК на основе клеток мицелиальных грибов.
Рис. 6. Кинетика процесса формирования ГБК на основе иммобилизованного в криогель ПВС мицелия Rhizopus oryzae F-814 при использовании глюкозосодержащей питательной среды:
- биомасса в составе гранул ГБК, - концентрация АТФ, - молочная кислота (МК), глюкоза.
Независимо от типа использованной среды были выявлены общие закономерности в формировании ГБК: отмечено равномерное прорастание мицелия по всему объему гранул криогеля ПВС и увеличение массы и размеров гранул ГБК за счет нарастающего мицелия. Установлено снижение влажности гранул ГБК с до 85%, связанное с увеличением плотности упаковки мицелия внутри гранул по мере роста клеток. Определение суммарной концентрации внутриклеточного АТФ в гранулах ГБК выявило ее корреляцию с накоплением биомассы, определяемой по изменению сухого веса гранул. Вместе с этим были установлены явные различия в морфологии иммобилизованного мицелия одного и того же гриба, сформированного в разных средах, что отражалось не только на внешнем виде гранул ГБК (рис.8), но и на их прочностных характеристиках (табл.10).
Рис. 7. Амилазная активность, накапливающаяся в среде при использовании ГБК на основе иммобилизованного в криогель ПВС мицелия гриба R. oryzae в периодическом процессе для получения амилолитических ферментов в среде с разными концентрациями крахмала (концентрация ГБК в среде – 65 г/л. Длительность одного рабочего цикла ГБК -40 ч).
Таблица 9. Характеристики процесса формирования ГБК на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток гриба R. oryzae в результате роста мицелия в гранулах носителя Основной источник, Сmах, Qc*, Qлип* Алип мах, УАлип *, ч- углерода г/л г им.биом./л/ч Ед/ л/ч Ед/л Ед/г им.биомассы Концентрация основного источника углерода – 10 г/л Рапсовое масло ** 0,41 48 0,41 51 5750 Подсолнечное масло ** 0,25 29 0,25 32 3600 Оливковое масло 0,22 43 0,41 46 4650 Оливковое масло ** 0,27 35 0,31 70 7100 Кукурузное масло 0,33 48 0,47 65 6000 Кукурузное масло ** 0,26 47 0,44 67 6300 Маргарин 0,64 78 0,65 84 9200 Маргарин ** 0,53 71 0,67 116 9800 Концентрация основного источника углерода – 20 г/л Маргарин ** 0,60 72 0,67 136 10000 Маргарин *** 0,65 74 0,70 138 11000 Маргарин **** 0,23 90 0,84 200 21000 * - указано среднее значение за 100 ч;
** - с добавками в питательную среду твина 20 (10 г/л) *** - с добавками в питательную среду фосфолипидов (10 г/л) **** - с добавками в питательную среду твина 20 (10 г/л) и фосфолипидов (10 г/л) - удельная скорость роста мицелия, Qс - продуктивность процесса по биомассе, Qлип - продуктивность процесса по липолитической активности, УАлип - удельная внеклеточная липолитическая активность, Сmax (концентрация биомассы) и Алип мах (внеклеточная липолитическая активность), максимально полученные за время проведения эксперимента. Все данные приведены относительно сухого веса мицелия.
1 мм 1 мм а б в г Рис. 8. Фотографии поверхности гранул криогеля ПВС с включенными в него спорами гриба Rhizopus oryzae F-814 (а), использованные для формирования ГБК на основе иммобилизованного мицелия в среде с триацилглицеридами (б) и в глюкозосодержащей среде (в, г).
Таблица 10. Модуль упругости (кПа) гранул ГБК на основе мицелия гриба Rhizopus oryzae, формирующегося в средах с разным основным источником углерода.
Основной источник Время формирования ГБК, ч углерода 0 24 48 72 Глюкоза 55,6±3,1 69,8±6,6 80,2±9,1 77,6±7,0 78,9±3, Крахмал 55,6±3,1 76,3±2,3 69,2±6,4 77,1±6,1 79,6±3, Маргарин 54,8±7,1 57,5±4,5 34,6±4,8 32,5±7,5 30,9±3, *Условно-мгновенный модуль упругости полученных образцов ГБКК определяли при 21±1оС методом одноосного сжатия при постоянной нагрузке 4,910-3 Н.
В средах, содержащих различные сахара или полисахариды (крахмал, пектин) наблюдалось упрочнение гранул ГБК, а в жиросодержащих средах, наоборот, отмечалось снижение модуля упругости гранул. Анализ этой же характеристики у гранул ГБК после их длительного использования в соответствующих процессах показал, что она практически не изменяется, оставаясь на постоянном уровне.
В целом в работе на основе клеток мицелиальных грибов, иммобилизованных в криогель ПВС, было получено 4 новых иммобилизованных ГБК, предназначенных для получения липолитических и амилолитических ферментов (Rhizopus oryzae), пектиназ (Aspergillus foetidus), а также щелочных протеаз (Heleococcum alkalinum). Новизна этих разработок отражена в двух Патентах РФ:
№ 2253677 (2005) и № 2315102 (2007). Впервые было показано, что сочетание таких компонентов, как криогель ПВС и клетки мицелиальных грибов в составе ГБК обеспечивает получение биокаталитических систем, характеризующихся длительным и стабильным биосинтезом различных гидролитических ферментов вне зависимости от используемого штамма-продуцента (рис.7 и рис.9). Кроме того, в данной работе впервые было установлено наличие у недавно выделенного и охарактеризованного галоалкалофильного гриба Heleococcum alkalinum [Козлова М.В., 2006] высокой протеолитической активности, проявляемой им в широком диапазоне рН и сохраняемой в иммобилизованном виде (рис.9). Уровень протеолитической активности (10000 Ед/л) разработанного ГБК в 5 раз превышал известный уровень одного из лучших продуцентов внеклеточных протеаз – мицелиального гриба Aspergillus niger ATCC 13496 [Papagianni M, 2002].
Рис. 9. Многократное использование ГБК на основе клеток гриба H.alkalinum, иммобилизованных в криогель ПВС, для получения внеклеточной протеолитической активности в среде с 1% крахмалом (рН 10). Концентрация ГБК в среде – 90 г/л. Протеолитическая активность определялась при рН 7,5 –, рН 9,0 –, рН10,0 –.
Сравнительный анализ ферментативных комплексов, синтезируемых свободными и иммобилизованными клетками грибов (рис.10), позволил установить расширение спектра внеклеточных липолитических ферментов, а также констатировать увеличение концентрации белков (на 25-35%) в каждой фракции, полученной при хроматографическом разделении белков с липолитической активностью. Общий хроматографический анализ белков, присутствовавших в культуральной жидкости ИмК и отобранных в градиенте 0-0,07 М NaCl, показал наличие 3-х фракций (0,042, 0,049 и 0,066 М NaCl), полностью отсутствовавших в препарате свободных клеток, которые характеризовались относительно высоким по сравнению с суммарно-нанесенным на колонку содержанием белка (1%, 0,7% и 1%, соответственно).
Рис. 10. Характеристики фракций с липолитической активностью, полученных при хроматографическом разделении белков, содержавшихся в культуральной жидкости свободных (столбцы белого цвета) и иммобилизованных (столбцы серого цвета) клеток гриба R.oryzae.
Таким образом, было установлено, что комплексы внеклеточных ферментов свободных клеток и ИмК гриба R. oryzae имеют отличия. ИмК секретируют более широкий спектр белков или большее количество их изоформ. Эти различия в ферментативных комплексах свободных клеток и ИмК были выявлены впервые и имеют фундаментальное значение.
2.3. Гетерогенные биокатализаторы, полученные в результате трансформации компетентных иммобилизованных клеток бактерий Было проведено исследование возможности трансформации ИмК бактерий.
Помимо ответа на фундаментальный вопрос, связанный с расширением представлений о свойствах ИмК и о возможности изменения ими генетического статуса в результате восприятия чужеродной ДНК, это исследование открывало путь к решению практических задач, например, к получению полифункциональных ГБК на основе одних и тех же ИмК с использованием для трансформации различных генетических конструкций.
Использованный в работе подход к получению ГБК на основе иммобилизованных рекомбинантных клеток включал четыре основные стадии:
1 – приготовление компетентных клеток, способных воспринять чужеродную ДНК;
2 – иммобилизация компетентных клеток в криогель ПВС;
3 - трансформация иммобилизованных компетентных клеток;
4 - культивирование иммобилизованных трансформантов. Таким образом, иммобилизовались не заранее полученные рекомбинантные клетки, а трансформация клеток проводилась уже после их иммобилизации. Подобные исследования были проведены впервые.
Как правило, свободные компетентные клетки получают в достаточном количестве в различных лабораториях, где они применяются, их хранят в замороженном состоянии при -70°С до момента использования с целью получения трансформантов. Хотя компетентные клетки могут храниться в указанных условиях весьма длительное время, эффективность их трансформации со временем снижается, так как в процессе хранения уменьшается концентрация живых клеток, способных к восприятию чужеродной ДНК и к пролиферации, а, значит, при использовании таких компетентных клеток для трансформации резко снижается выход числа трансформантов. Применение криогеля ПВС как носителя для ИмК могло позволить решить ряд практических задач, например, заметно повысить температуру хранения компетентных клеток (от -70оС для свободных клеток до 20°С (температура образования криогеля ПВС), улучшив экономическую сторону процесса, а также продлить период хранения иммобилизованных компетентных клеток по сравнению со свободными.
В этой части работы использовалась для трансформации ИмК специально сконструированная плазмида рОРf1, которая содержала ген устойчивости к ампициллину и ген, кодирующий синтез органофосфатгидролазы (ОРН), катализирующей гидролиз фосфоорганических соединений (ФОС). Выбор фермента был обусловлен его чрезвычайно высокой каталитической активностью в реакции гидролиза субстрата Параоксона, а факт накопления p-нитрофенолят-иона, как продукта этой реакции, легко контролировался спектрофотометрически (= нм, рН 9,0). Таким образом, трансформированные иммобилизованные компетентные клетки обладали антибиотикоустойчивостью и ОРН-активностью. В предварительных экспериментах было показано, что ОРН-активность клеток E. coli C600, включенных в гранулы криогеля ПВС, пропорциональна количеству ИмК, содержащих плазмиду с геном, кодирующим синтез ОРН. В этой связи ОРН активность, обнаруживаемая в ИмК, была выбрана в качестве критерия, характеризующего эффективность произошедшей трансформации ИмК.
Процесс трансформации клеток состоит из двух ключевых стадий: 1– это адсорбция молекул ДНК на поверхности клеток (обратимый процесс);
2 проникновение генетического материала в клетки (необратимый процесс) при их прогреве при 42°С, в результате, так называемого, термошока.
Установлено, что иммобилизованные компетентные клетки могут быть успешно трансформированы даже очень низкими концентрациями плазмидной ДНК (рис.11). При этом иммобилизованное состояние клеток не является тому препятствием, а наоборот оказывает позитивное влияние, которое было показано при варьировании температуры проведения термошока (табл.11).
Рис.11. Влияние концентрации плазмидной ДНК, взятой для трансформации иммобилизованных компетентных клеток, на органофосфатгидролазную активность получаемых трансформантов, определяемую через 2,5 ч после трансформации.
Таблица 11. Влияние температуры теплового шока, применяемого в процессе трансформации клеток E.coli C600, на ОРН-активность получаемых иммобилизованных трансформантов.
Температура ОРН-активность иммобилизованных Снижение термошока трансформантов, ед/ г ГБК эффективности (через 2,5 ч после трансформации) трансформации, % 42оС 0,62 ± 0,010 Контроль 47оС 0,51 ± 0,008 18 ± 1, 52оС 0,35 ± 0,015 45 ± 2, Было обнаружено, что при повышении температуры этой процедуры на 10оС наблюдается всего лишь 45%-ное снижение эффективности трансформации ИмК.
При этом для свободных клеток в тех же условиях не было получено ни одного трансформанта. Иммобилизованные компетентные клетки E.coli, включённые в гранулы криогеля ПВС, сохраняли способность к трансформации как одно-, так и двухцепочечной плазмидной ДНК, то есть молекулами ДНК с разной структурой.
Также была показана возможность использования для трансформации иммобилизованных компетентных клеток после их хранения в замороженном состоянии в течение 12 месяцев при температуре -20оС всего с 15%-снижением эффективности трансформации.
Таким образом, впервые была показана возможность генетической модификации ИмК бактерий. Полученные в работе результаты аргументируют в пользу проведения процессов c ГБК на основе ИмК в асептических условиях с целью обеспечения генетической неизменности используемых штаммов продуцентов.
ГЛАВА 3. БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ: ОБЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ И ХАРАКТЕРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ Биокаталитические системы на основе ИмК, как известно, обладают рядом преимуществ перед свободными, а именно, повышенной устойчивостью к воздействию негативных факторов (рН, температуры, компонентов среды культивирования, и др.), а также длительным сохранением метаболической активности при их многократном использовании в биотехнологических процессах при отсутствии заметного лизиса клеток. Отсутствие четкого понимания причин, лежащих в основе подобных изменений характеристик ИмК в сравнении со свободными клетками, не позволяет осознанно управлять ими и не стимулирует использование ГБК в промышленных процессах. К тому же за последние 10 лет накопилась новая информация о свойствах ИмК, которая вошла в противоречие с ранее существовавшими общими научными представлениями о ИмК и закономерностях их функционирования. Так в противовес общепринятой концепции об отсутствии роста у ИмК, было установлено, в том числе и в данной работе (табл.12), что ИмК сохраняют пролиферативную функцию, причем как непосредственно после иммобилизации, так и после длительного их использования в биотехнологических процессах. При этом кинетические характеристики роста (удельная скорость роста и время удвоения) ИмК не существенно отличаются от аналогичных характеристик свободных клеток. Отмеченные тенденции в изменении кинетических характеристик клеток при их иммобилизации оказываются общими для разных микроорганизмов (бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов), и в целом отсутствует зависимость этих тенденций от носителей и методов, используемых для иммобилизации клеток.
Таблица 12. Удельные скорости роста свободных (свк) и иммобилизованных (имк) в криогель ПВС клеток различных микроорганизмов.
свк = 0,110 ч-1 имк = 0,081ч- Rhodococcus erhytropolis свк = 0,21 ч-1 имк = 0,19 ч- Pseudomonas putida - имк = 0,0076 ч- свк = 0,010 ч Streptomyces anulatus - имк = 0,079 ч- свк = 0,093 ч Rhizopus oryzae - имк = 0,307 ч- свк = 0,368 ч Aspergillus foetidus - имк = 0,144 ч- свк = 0,150 ч Heleococcum alkalinum Другой важной характеристикой ИмК, отличающей их от свободных клеток, является их длительная функциональная активность, в качестве объяснения которой существует предположение о том, что носитель играет роль защитного барьера для ИмК, «экранируя» их от негативного воздействия метаболитов и препятствуя их проникновению в матрицу [Nedovi V., 2004]. Но, согласно ранее изложенным в этой работе результатам по трансформации ИмК (п.2.3), матрица носителя не является препятствием для проникновения в клетки даже столь высокомолекулярных соединений, как ДНК. Также длительная операционная стабильность ГБК на основе клеток, иммобилизованных адсорбционно на поверхности носителей, не может быть объяснена защитными характеристиками носителя.
Анализ собственных и литературных данных позволил говорить об изменении биохимического статуса разных ИмК в сравнении со свободными, выражающемся в увеличении уровня синтеза ферментов основного метаболизма в 2-3,5 раза.
Сопоставление полученных данных и результатов, опубликованных разными авторами, по характеристикам ИмК дрожжей, позволило заключить, что в ИмК увеличивается в 2-3 раза концентрация гексокиназы, пируваткиназы и алкогольдегидрогеназы, при этом происходит снижение уровня синтеза пируватдегидрогеназы и ацетальдегидрогеназы. При реализации реакций гликолиза увеличение в ИмК гексокиназной активности за счет увеличения концентрации этого фермента обеспечивало более высокую скорость потребления субстрата (глюкозы) и ее меньшую остаточную концентрацию в среде под конец процесса брожения в сравнении со свободными клетками, что многократно наблюдалось в этой работе на разных штаммах дрожжей рода Saccharomyces (п.2.1).
Для ИмК оказалось характерным увеличенное в 3 раза содержание 3-фосфоглицеринового альдегида, накопление которого в ИмК наблюдалось на фоне уменьшения (в сравнении со свободными клетками) его трансформации в глицерин (табл. 8). Фосфоенолпируват, образующийся из 3-фосфоглицеринового альдегида, который мог быть использован ИмК для биосинтеза ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина и триптофана), превращался в пируват под действием пируваткиназы, чей повышенный синтез в ИмК был подтвержден.
Таким образом, ИмК, ускоряя на этой стадии процесс превращения фосфоенолпирувата в пируват, очевидно, избегали ненужного клеткам при их высокой концентрации в ГБК синтеза аминокислот и, следовательно, белков для увеличения собственной биомассы.
На следующих стадиях возможной трансформации пирувата у ИмК был установлен уменьшенный уровень синтеза пируватдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы. Сниженный уровень синтеза лактатдегидрогеназы приводил к уменьшению концентрации МК, продуцируемой ИмК дрожжей, что уже отмечалось ранее, а сниженный уровень синтеза пируватдегидрогеназы, в свою очередь, замедлял трансформацию пирувата в ацетил-коферментА, регулируя, таким образом, интенсивность функционирования цикла трикарбоновых кислот у ИмК. Видимо, именно эта стадия является «узким местом» в гликолизе у ИмК и способствует накоплению 3-фосфоглицеринового альдегида на ранней стадии.
Таким образом, «вход» в цикл трикарбоновых кислот у ИмК оказывается ограниченным, и интенсивность его функционирования ниже по сравнению со свободными клетками, что было подтверждено многократно экспериментально в этой работе (см. табл. 7 и 8). Показано, что концентрации лимонной и янтарной кислот, накапливающиеся в среде с ИмК, меньше (табл.7), чем в средах со свободными клетками, тогда как концентрация яблочной кислоты у ИмК, наоборот, существенно увеличена. Очевидно, ИмК, стараясь избежать необходимости использования оксалоацетата, образующегося из малата, на биосинтез аминокислот (аспарагина, аргинина, метионина, треонина, изолейцина), выводят существенную часть яблочной кислоты из цикла Кребса. Таким образом, в ИмК регулируется концентрация образующегося оксалоацетата, а, следовательно, и аминокислот для синтеза белков, которые клеткам при их высокой плотности в иммобилизванном состоянии и низкой удельной скорости роста, очевидно, не нужны в том же количестве, что и для свободных клеток.
В связи с изложенным, основное количество пирувата в ИмК должно превращаться в ацетальдегид, а поскольку установлена активация синтеза алкогольдегидрогеназы и снижение уровня синтеза ацетальдегидрогеназы, то последующая трансформация ацетальдегида происходит со снижением уровня накопления ацетата в среде с ИмК (табл. 7) и повышением уровня накопления этанола в среде по сравнению со свободными клетками, что также подтверждено результатами этой работы.