Государственное научное учреждение институт микробиологии удк 579.222.25:577.121.3+573.6.086.835 максимова наталья павловна метаболизм ароматических соединений у метилотрофных бактерий
доктор биологических наук Самсонова А.С., заведующая лабораторией экологии микроорганизмов ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси» доктор биологических наук, профессор Мелентьев А.И., директор Института биологии Уфимского научного центра РАН (г. Уфа, Россия) доктор биологических наук, профессор Воскобоев А.И.
профессор кафедры ботаники УО «Гродненский государственный университет имени Янки Купалы» Оппонирующая организация – ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН» (г. Москва, Россия) Защита состоится 24 июня 2005 г. в 13 часов на заседании совета по защите диссертаций Д 01.34.01 при ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси» по адресу: 220141, Минск, ул. акад. В.Ф. Купревича, 2.
Тел. (017) 263 50 51, факс (017) 264 47 66, е-mail: [email protected] С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси» Автореферат разослан «_»_2005 г.
Ученый секретарь совета по защите диссертаций, кандидат биологических наук Т.С. Гвоздкова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы диссертации. Метилотрофные бактерии, способные утилизировать метанол и другие восстановленные С1-соединения, в течение ря да лет привлекают внимание не только особенностями своей биологии, но и ре альными перспективами использования в биотехнологических целях. Успешно му решению этой проблемы может способствовать глубокое и всестороннее ис следование у них генетических и биохимических основ метаболизма, а также разработка новых подходов применения их биосинтетического потенциала.
Особенно перспективным является использование метилотрофных бакте рий для получения уникальных микробных метаболитов, химический синтез которых является чрезвычайно трудоемким либо практически невозможным. К их числу относится большинство соединений ароматического ряда: аминокис лоты, витамины, пигменты, антибиотики, алкалоиды и др. Предпочтительное использование метилотрофных бактерий (в частности, облигатно потребляю щих метанол) для микробиологического синтеза аргументируется возможным существованием у них тесной связи между начальными этапами ароматического пути и ассимиляционной ветвью С1-соединений. Исследование этой проблемы представляет существенный интерес не только в плане выявления новых, ранее не известных связей между отдельными звеньями клеточного метаболизма, но и для определения биосинтетического потенциала метилотрофных бактерий, создания новых рычагов управления их ароматическим метаболизмом и повы шения продуктивности.
Учитывая, что природные штаммы микроорганизмов, как правило, не спо собны к сверхсинтезу клеточных метаболитов, продуценты на их основе могут быть получены только путем внесения определенных генетических изменений в регуляторные механизмы клеток. В связи с этим исследование у метилотрофных бактерий путей синтеза ароматических соединений, особенностей регуляции и организации генетического аппарата, контролирующего биосинтетические процессы, является необходимым условием целенаправленного конструирова ния штаммов-продуцентов и разработки подходов их практического использо вания.
Исследование у метилотрофных бактерий метаболизма ароматических со единений является важным и в общебиологическом плане, поскольку данная группа микроорганизмов в этом отношении практически не охарактеризована.
Всестороннее изучение этого вопроса позволит существенно расширить наши представления о биосинтетических процессах, происходящих в клетках метило трофных организмов в целом и сделать выводы об универсальности (или наобо рот, уникальности) их ароматического метаболизма. Особенно интересным яв ляется исследование у метилотрофных бактерий механизмов синтеза метаболи тов ароматической природы первичного и вторичного происхождения (амино кислот, витаминов, пигментов и антибиотиков) и сопоставление их по этим по казателям с хорошо охарактеризованными в этом отношении бактериальными штаммами.
Связь работы с крупными научными программами, темами. Тематика диссертационной работы связана с научными исследованиями, которые выпол нялись в разные годы по темам Министерства образования Республики Бела русь: «Изучение генетической организации грамотрицательных фитопатоген ных бактерий и бактерий, утилизирующих одно- и двухуглеродные соедине ния» (1991-1995) (№ госрегистрации 01860002420), «Изучение генетической регу ляции и ферментативного контроля синтеза биологически активных соедине ний ароматической природы (аминокислот, антибактериальных веществ, сиде рофоров) клетками грамотрицательных бактерий» (1996-2000) (№ госрегистра ции 01910035948) и «Исследование молекулярно-биологических механизмов сверхсинтеза антимикробных соединений у ризосферных бактерий Pseudomonas и генетическое конструирование на их основе высокоактивных штаммов продуцентов, пригодных для защиты сельскохозяйственных растений от заболе ваний различной этиологии», финансируемой ФФИ РБ (1996-1998) (№ госреги страции 19942706), а также в рамках ГПОФИ «Биотехнология» по темам: «Разра ботка генетических и биохимических основ создания биопрепаратов микробно го происхождения, пригодных для защиты растений» (1996-2000) (№ госрегист рации 19962097), «Исследование молекулярно-генетических механизмов фито защитного и стимулирующего рост растений действия микроорганизмов – про дуцентов антимикробных соединений» (1996-2000) (№ госрегистрации 19991670), «Разработка микробных препаратов для защиты растений на основе природных высокоактивных штаммов» (2001-2005) (№ госрегистрации 20012712).
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось исследование у метилотрофных бактерий генетических и биохимических основ метаболизма ароматических соединений, разработка новых подходов использо вания биосинтетического потенциала данных организмов и создание штаммов продуцентов биологически активных соединений ароматической природы на их основе.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Отобрать и охарактеризовать штаммы метилотрофных бактерий, пер спективные в плане их биотехнологического использования для получения микробных метаболитов ароматической природы. С учетом особенностей мета болизма данных организмов разработать приемы получения ауксотрофных и регуляторных мутантов и создать коллекцию генетически маркированных штаммов для исследования механизмов регуляции метаболизма ароматических соединений и разработки подходов их практического использования.
2. Изучить связь между метилотрофным метаболизмом (ассимиляцией С1 соеднинений) и ароматическим путем и сделать заключение о возможности ис пользования метилотрофных бактерий для создания на их основе штаммов продуцентов ароматических аминокислот и других метаболитов ароматической природы.
3. У метилотрофных бактерий, отобранных в качестве перспективных объ ектов для получения микробных метаболитов ароматической природы, устано вить изоферментный состав ключевого фермента ароматического пути – 3-дезо кси-D-арабиногептулозонат-7-фосфат-синтазы (ДАГФ-синтазы), а также меха низмы его регуляции.
4. Исследовать биосинтетический аппарат метилотрофных бактерий, обес печивающий синтез ароматических аминокислот триптофана, фенилаланина и тирозина, охарактеризовать пути и механизмы генетического и биохимического контроля этих процессов. Сопоставить метаболизм ароматических аминокислот у представителей изучаемой группы бактерий и хорошо известных в этом от ношении микроорганизмов.
5. Определить способность метилотрофных бактерий к синтезу вторичных метаболитов ароматической природы, расшифровать пути и регуляторные ме ханизмы их синтеза и определить биотехнологическую значимость данных соединений.
6. Разработать новые подходы практического использования метилотроф ных бактерий и рекомендации по их применению для получения биологически активных соединений ароматической природы, а также для создания на основе изучаемых микроорганизмов новых микробных препаратов.
Объект и предмет исследования. Объектом исследования служили бакте рии дикого типа и мутантные штаммы метилотрофных бактерий различных систематических групп. Предмет исследования – метаболизм ароматических со единений у метилотрофных бактерий, механизмы его регуляции на генетиче ском и биохимическом уровнях, связь ароматического пути с циклом ассимиля ции С1-соединений, а также биотехнологический потенциал метилотрофных бактерий и возможность использования этих организмов в качестве продуцен тов различных биологически активных соединений ароматической природы.
Гипотезы. Решение поставленных в диссертации задач построено на сле дующих гипотезах:
1. Высокая активность ключевого фермента ароматического пути ДАГФ синтазы может служить критерием для отбора перспективных в биотехнологи ческом отношении штаммов метилотрофных бактерий.
2. РМФ-цикл ассимиляции С1-соединений у метилотрофных бактерий свя зан с ароматическим путем на уровне эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирува та, которые образуются в этом цикле при утилизации бактериальными клетка ми метанола и служат субстратами ключевого фермента ароматического пути – ДАГФ-синтазы.
3. Механизмы регуляции ароматического пути у метилотрофов сходны с таковыми у большинства известных бактериальных штаммов, что подтверждает универсальный характер регуляторных процессов метаболизма ароматических соединений у организмов разного систематического положения.
4. Репрессия синтеза ключевого фермента ароматического пути ДАГФ синтазы является распространенным явлением среди метилотрофных бактерий.
5. Метилотрофные бактерии – перспективные в биотехнологическом от ношении объекты, пригодные для получения первичных и вторичных микроб ных метаболитов ароматической природы.
Методология и методы проведенного исследования. Для решения по ставленных задач использован комплексный подход, основанный на примене нии микробиологических (способы культивирования, идентификация микроорганизмов, определение антимикробной активности), генетических (скрещивание бактерий, химический и транспозонный мутагенез), биохимиче ских, химических и физико-химических методов (ферментативный анализ, хи мический синтез, количественный и качественный анализ микробных метабо литов), а также биотехнологических приемов.
Научная новизна и значимость полученных результатов. Разработаны критерии отбора метилотрофных бактерий – перспективных объектов биотех нологии, включающие поиск штаммов с высоким уровнем синтеза ключевого фермента ароматического пути ДАГФ-синтазы, первичную оценку их способ ности к продукции микробных метаболитов ароматической природы, рост на простых источниках углерода и энергии, какими являются метанол и его произ водные. Использование такого подхода позволило создать коллекцию бактерий дикого типа и генетически маркированных штаммов облигатных и факульта тивных метилотрофных бактерий разных таксономических групп, пригодных для получения на их основе биологически активных соединений ароматической природы. Выделен и охарактеризован новый, ранее не описанный вид облигат ных метилотрофных бактерий M. mucogenes M75, имеющих КДФГА/ТА вариант РМФ-цикла, а также штамм факультативных метилотрофных бактерий P. putida M, у которых утилизация метанола осуществляется уникальным способом – за счет активности алкогольдегидрогеназы, обладающей широкой субстратной специфичностью в отношении низших спиртов.
Впервые у облигатных метилотрофных бактерий, имеющих КДФГА/ТА вариант РМФ-цикла, обнаружена прямая зависимость уровня синтеза ДАГФ синтазы от концентрации метанола в среде культивирования, что подтверждает гипотезу о тесной связи и согласованности процессов ассимиляции С1 соединений и метаболизма ароматических соединений. Роль связующих эле ментов между двумя системами клеточного метаболизма выполняют эритрозо 4-фосфат и фосфоенолпируват. Полученные данные открывают новые возмож ности реализации биосинтетического потенциала метилотрофных бактерий и их использования для создания штаммов-продуцентов биологически активных соединений ароматической природы.
Исследование изоферментного состава, а также механизмов регуляции ак тивности и синтеза ДАГФ-синтазы у метилотрофных бактерий позволило обна ружить их большое сходство по этим параметрам с большинством известных в этом отношении микроорганизмов и подтвердить универсальность организм ции и основных регуляторных механизмов ароматического пути у бактерий, не зависимо от их систематического положения.
Разработка нового подхода изучения регуляции синтеза ДАГФ-синтазы с использованием мутантов, имеющих блоки того или иного участка шикиматно го пути (Aro- -фенотипа), позволила впервые обнаружить этот регуляторный механизм не только у метилотрофных бактерий (M. flagellatum KT, M. capsulatus ИМ и P.putida M), но и ряда других представителей рода Pseudomonas (например, P. aeruginisa, P. fluorescens, P. acidovorans и др.), у которых ранее он обнаружен не был. На основании полученных данных сделан вывод о широком распростра нении среди бактерий механизма регуляции синтеза ДАГФ-синтазы путем ре прессии.
В процессе изучения синтеза триптофана установлено, что этот участок ароматического пути у метилотрофных бактерий регулируется посредством репрессии и ретроингибирования, и в этом отношении изучаемые организмы имеют сходство с большинством известных бактерий. Вместе с тем, у факульта тивных метилотрофных бактерий P. putida M зарегистрирован новый механизм индукции синтеза триптофан-синтазы индол-3-глицерофосфатом, что обнару жено лишь у отдельных представителей Pseudomonas.
При изучении синтеза фенилаланина и тирозина установлено, что этот участок ароматического пути у метилотрофных бактерий регулируются слабо, что отличает их от других микроорганизмов. У метилотрофных бактерий P. putida M обнаружен новый, редкий для прокариотических организмов путь превращения фенилаланина в тирозин, осуществляемого ферментом фенила ланингидроксилазой. Идентификация этого пути была положена в основу раз работки оригинальной методики получения Tyr--мутантов.
Составлены интегральные схемы биосинтеза ароматических аминокислот у метилотрофных бактерий, которые демонстрируют ключевые регуляторные звенья и возможные «рычаги» управления биосинтетическими процессами, что необходимо для разработки подходов направленной дерегуляции ароматиче ского пути при создании штаммов-продуцентов.
Впервые установлено, что биосинтетическими предшественниками диок сихинолинового ядра пиовердина Рm – пигмента бактерий P. putida M – является фенилаланин и дигидрооротат. Детальный анализ механизмов регуляции син теза указанных соединений, а также самого пигмента, позволил создать общую схему его биогенеза. Полученные в этом разделе работы данные необходимы для разработки новых приемов конструирования штаммов-продуцентов пиг мента с использованием молекулярно-генетических подходов.
Определена природа антагонистической активности бактерий P. putida M, которая обеспечивается пиовердином Рm за счет его способности связывать Fe3+ ионы и переводить их в неусвояемую для других микроорганизмов форму. По казано, что пиовердин Рm обладает высокой антиоксидантной активностью.
Практическая значимость полученных результатов. При анализе осо бенностей С1- метаболизма метилотрофных бактерий отобран облигатный ме тилотроф M. mucogenes M75, характеризующийся высокой скоростью роста на метаноле. Штамм M. mucogenes M75 рекомендован для определения степени за грязнения среды метилсодержащими соединениями, а также их высокоэффек тивной деструкции. Факультативный метилотрофный штамм P. putida M, клет ки которого утилизируют метанол за счет активности алкогольдегидрогеназы широкой субстратной специфичности, рекомендован в качестве продуцента этого уникального фермента. Из числа генетически и биохимически охаракте ризованных ауксотрофных мутантов отобраны штаммы, пригодные для ис пользования в качестве тест-культур для отбора продуцентов ароматических аминокислот среди метанол- и этанолутилизирующих бактерий.
Получены регуляторные мутанты, способные к сверхпродукции трипто фана. Один из штаммов P. putida M35 рекомендован в качестве продуцента L триптофана на низших спиртах (630 мг/л), а также для получения микробной биомассы (белка одноклеточных), обогащенной этой незаменимой аминокисло той. Отобран мутантный штамм P. putida M15 – продуцент триптофан-синтазы (уровень синтеза 200 нмоль/минмг белка), пригодный для получения данного фермента в больших масштабах, а также микробного синтеза L-триптофана из индола и серина. Разработан оригинальный способ синтеза 5-фосфорибозил пирофосфата («раннего» предшественника триптофана) и его количественного определения.
Впервые показано, что клетки облигатного метилотрофа M. mucogenes M являются природными продуцентами 2,3-диоксибензоата (уровень продукции 180 мг/л). Штамм рекомендован для получения этого соединения с помощью микробного синтеза.
Установлена способность флуоресцирующего пигмента пиовердина Рm связывать ионы металлов Zn2+, Ni2+, Co2+, Sn2+, Cu2+, Cd2+, Mo6+, W6+ и переводить их в нерастворимые комплексы, что может быть использовано для разработки новых приемов извлечения металлов (в том числе тяжелых) из различных сред.
Наличие у пиовердина Рm антирадикальной активности, сопоставимой с дейст вием известных полифенолов, позволяет рекомендовать этот пигмент для ис пользования в качестве нового антиоксидантного средства.
Обнаружена высокая антимикробная активность пиовердина Рm, которая обеспечивает синтезирующим его метилотрофным бактериям P. putida M спо собность подавлять рост и развитие широкого спектра микроорганизмов, вклю чая фитопатогенные. Помимо антимикробной активности у изучаемых бакте рий выявлена способность стимулировать рост растений. Эти особенности штамма P. putida M легли в основу создания биопрепарата Бактофил для защи ты растений от заболеваний различной этиологии и стимуляции их роста. В со ответствии с «Лабораторным регламентом на получение препарата Бактофил, ж» получены его опытные партии и произведено их испытание в производст венных условиях. Применение Бактофила позволило сократить заболеваемость растений на 47-85 % в зависимости от типа возбудителя. Особенно перспектив ным является использование Бактофила для борьбы с галловой нематодой – эффективность подавления инфекции при выращивании огурцов составила от 78,2 %, до 95,2 %. Прибавка урожая – 0,59 кг/м2.
Полученные в диссертации данные и соответствующие выводы раскрывают новые возможности практического использования метилотрофных бактерий и служат основой для дальнейшей разработки подходов их биотехнологического использования. Новизна результатов работы и их практическая значимость под тверждена рядом авторских свидетельств, патентов Беларуси и России.
Материалы диссертации вошли в обзоры, опубликованные автором в раз ные годы, внедрены в учебный процесс и научные исследования на кафедре ге нетики Белорусского государственного университета, нашли применение при разработке общих и специальных курсов, учебных и методических пособий для студентов биологов и биотехнологов.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Разработаны критерии отбора перспективных в биотехнологическом от ношении штаммов метилотрофных бактерий, которые были положены в основу создания коллекции бактерий дикого типа и генетически маркированных штаммов для исследования метаболизма ароматических соединений у изучае мой группы бактерий и использования их в практических целях. Охарактеризо ван новый вид облигатных метилотрофных бактерий M. mucogenes М75, обладающих КДФГА/ТА вариантом РМФ-пути, а также новый штамм P. putida M, отнесенный к числу факультативных метилотрофов на основании его способности осуществлять утилизацию метанола за счет активности алкогольдегидрогеназы.
2. У облигатных метилотрофных бактерий, реализующих РМФ-цикл (КДФГА/ТА вариант), путь ассимиляции С1-соединений связан с ароматиче ским метаболизмом. Роль связующих элементов при этом играют промежуточ ные продукты этого цикла – эритрозо-4-фосфат и фосфоенолпируват, являю щиеся одновременно субстратами ДАГФ-синтазы.
3. Фермент ДАГФ-синтаза метилотрофных бактерий имеет типичный для большинства известных микроорганизмов состав – трех-, либо двухизофер ментный, а также подобные способы биохимической и генетической регуляции.
4. Синтез триптофана у метилотрофных бактерий, как и у большинства других известных бактериальных штаммов, регулируется с помощью репрессии trpEDC-генов и ретроингибирования ключевого фермента триптофанового пу ти – антранилат-синтазы. Для отдельных штаммов характерна индукция синте за триптофан-синтазы индол-3-глицерофосфатом.
5. Синтез фенилаланина и тирозина у метилотрофных бактерий, подобно триптофану, регулируется посредством репрессии и ретроингибирования. Од нако по сравнению с известными в этом отношении бактериями данный уча сток ароматического пути у них контролируется слабо, и большая часть генов, участвующих в синтезе указанных аминокислот, экспрессируется конститутив но. Обнаружен редкий для прокариотических организмов путь превращения фенилаланина в тирозин, катализируемый фенилаланингидроксилазой, синтез которой является индуцибельным.
6. Природные штаммы метилотрофных бактерий способны к синтезу био логически активных соединений ароматической природы, в частности, 2,3-диоксибензоата и флуоресцирующего пигмента пиовердина Рm. Оба соеди нения выполняют функцию сидерофоров, а пиовердин Рm, кроме того, обладает антиоксидантной и антимикробной активностями. Пиовердин Рm отличается по своему строению и свойствам от подобных пигментов других бактерий. Био синтетическими предшественниками пиовердина Рm являются фенилаланин и дигидрооротат.
7. Метилотрофные бактерии рекомендованы для широкого практического использования: создания тест-систем для ауксонографической оценки продук ции ароматических аминокислот на низших спиртах;
генетического конструи рования продуцентов ароматических аминокислот, а также их предшественни ков и соответствующих ферментов;
получения биологически активных соеди нений, в частности, 2,3-диоксибензоата и флуоресцирующего пигмента пиовер дина Рm с помощью микробного синтеза и создания на основе изучаемых бакте рий биопрепаратов для защиты растений.
Личный вклад соискателя. Теоретические разработки, постановка задач и выбор подходов для их решения, основные результаты диссертационной рабо ты, их анализ и обсуждение выполнены лично автором. В постановке экспери ментов принимали участие также аспиранты и сотрудники кафедры генетики и НИЛ молекулярной генетики бактерий при кафедре микробиологии Белорус ского государственного университета, которые работали под руководством дис сертанта. Так часть материалов, представленных в главе 3, получена совместно с к.б.н. Олехновичем И.Н., к.б.н. Доброжинецкой Е.В., материалов главы 4 со вместно с к.б.н. Блажевич О.В., к.б.н. Лысаком В.В., к.б.н. Комаровой М.С. Ами нокислотный анализ и идентификация фосфолипидов проведены в Институте микробиологии НАН Беларуси.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты работы доло жены или представлены на различных симпозиумах, конференциях, съездах и семинарах, в том числе: Всесоюзных совещаниях «Новые направления биотех нологии» (Пущино, 1985;
1990;
1994);
III Всесоюзной конференции «Биосинтез ферментов микроорганизмами» (Кобулети, 1986);
XI Всесоюзном совещании «Плазмида» (Пущино, 1986);
Международной конференции «Теория и практика получения аминокислот» (Ереван, 1986);
VII Симпозиуме «Молекулярные меха низмы генетических процессов» (Москва, 1990);
6-ом Международном симпо зиуме по генетике промышленных микроорганизмов (Страсбург, 1990);
Между народной конференции по фитопатогенным бактериям (Версаль, 1992);
IV Все союзной конференции «Микроорганизмы в сельском хозяйстве» (1992);
V-VII съездах БОГиС (Горки, 1986;
Минск, 1992;
Горки, 1997);
Научной конференции, посвященной 75-летию биологического факультета Белгосуниверситета (Минск, 1997);
Международной конференции «Молекулярная генетика и биотехноло гия» (Минск, 1998);
Международной конференции «Проблемы микробиологии и биотехнологии» (Минск, 1998);
Международной конференции «Микробиоло гия и биотехнология на рубеже XXI столетия» (Минск, 2000);
Научно практических семинарах во время проведения «Дней науки и техники Беларуси в Китае» (Пекин, 1999) и Вьетнаме (Ханой, 2000);
Международной научной кон ференции «Ксенобиотики и живые системы» (Минск, 2000);
Научно практической конференции «Защита растений на рубеже XXI века» (Минск, 2001), Юбилейной конференции, посвященной 80-летию БГУ (Минск, 2001), VIII съезде БОГиС (Минск, 2002), Международной научной конференции «Интегри рованные системы защиты растений. Настоящее и будущее» (Минск, 2002), Ме ждународной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2004), Международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2004) и др.
Опубликованность результатов. Основные результаты диссертационной работы изложены: в научных журналах – 25, в сборниках статей и трудах – 17, тезисах докладов – 32, авторских свидетельствах и патентах – 11. Общее количе ство публикаций – 85. Общий объем опубликованных по теме диссертации ма териалов составляет 310 страниц (19,38 печатных листа).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, 5-ти глав, заключения, перечня использованных источ ников литературы и приложений. Общий объем диссертации составляет страницу, 85 таблиц на 47 стр., 86 рисунков на 46 стр. Список использованных источников включает 1034 наименования на 71 стр.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ПЕРВИЧНЫЙ И ВТОРИЧНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ АРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ У БАКТЕРИЙ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ Представлен аналитический обзор литературных данных, касающихся во просов биосинтеза микробными клетками биологически активных соединений ароматической природы, путей и механизмов регуляции их синтеза, а также ор ганизации генов или оперонов, контролирующих эти процессы. Приведены общие схемы ароматического метаболизма у бактерий, которые сопровождают ся информацией о ферментативном и генетическом обеспечении каждого из его этапов, особенностях этих процессов у представителей различных система тических групп, а также подробным перечнем синтезируемых бактериями пер вичных и вторичных метаболитов ароматической природы. Сделано заключе ние, что ароматический путь у бактерий обеспечивает синтез большого числа важнейших клеточных метаболитов – ароматических аминокислот, антибиоти ков, витаминов, пигментов, сидерофоров, алкалоидов и др. (рис. 1), представ ляющих существенный интерес в практическом отношении. На основании про веденного анализа и систематизации имеющихся данных о метаболизме арома тических соединений у бактерий сформулированы цели и задачи исследования.
ОБЪЕКТЫ, МЕТОДОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТАБОЛИТОВ АРОМАТИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ Объектами исследования служили облигатные, ограниченно-факуль тативные и факультативные метилотрофные бактерии дикого типа и их мутан ты, бактерии рода Pseudomonas, а также штаммы бактерий и грибов, применяе мые в качестве индикаторных культур при изучении антимикробной активно сти отдельных штаммов. В зависимости от поставленных в диссертационной ра боте задач применяли микробиологические, генетические, биохимические, хи мические, физико-химические и биотехнологические методы.
Для создания коллекции диких и генетически маркированных штаммов микроорганизмов использовали методы, необходимые для культивирования бактерий, их идентификации, а также методы химического и транспозонного мутагенеза. При изучении активности ферментов и механизмов их синтеза применяли ферментативный анализ, а также специальные методы биохимиче ской генетики. Идентификацию микробных метаболитов проводили с исполь энтеробактин бациллизин менахиноны СOOH рифампицин (витамин К 1 и К2 ) OH антикапсин тирозин 2,4-диацетилфлороглюцин OH пиохелин 2,3-диоксибензоат фенилаланин о-сукцинилбензоат СOOH COOH COOH OH HOOC CH2-CO-COOH OH H HC O COOH салицилат NH HO ИЗОХОРИЗМАТ 3-АМИНО-5-ОКСИБЕНЗОАТ OH триптофан ПРЕФЕНАТ микобактин COOH COOH Pyo-соединения я СOOH NH2 3,4-диокси N-ацетил CH2 бензоат аминофенон OH С СOOH АНТРАНИЛАТ п-ОКСИБЕНЗОАТ О H OH алкалоиды CH2-CO-COOH 1,6-фенизин дикарбоксилат NH феназиновые убихиноны пигменты n-АМИНОФЕНИЛПИРУВАТ COOH n-аминофенилаланин фолиеваяя тетрагидро кислота фолаты коринецин NH полиеновые антибиотики п-АМИНОБЕНЗОАТ хлорамфеникол, обафлуорин Рис. 1. Пути превращения хоризмата у бактерий. Пунктирная линия указывает на отсутствие данных о путях синтезе соединений зованием ауксонографических и химических тестов, а также газожидкостной, колоночной и тонкослойной хроматографии, гель-фильтрации, спектрофото метрического анализа, аминокислотного анализа, радиоактивной метки и др.
Фитозащитную и стимулирующую рост растений активность микробных пре паратов изучали с помощью соответствующих биотехнологических приемов.
Для обработки результатов экспериментов применяли методы математической статистики, включая встроенные статистические функции программы Excel.
БИОСИНТЕЗ ПЕРВИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ АРОМАТИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ МЕТИЛОТРОФНЫМИ БАКТЕРИЯМИ В ходе выполнения исследований выделены и охарактеризованы более 120 ти новых природных штаммов облигатных, ограниченно-факультативных и факультативных метилотрофных бактерий. Коллекция выделенных культур дополнена представителями известных родов и видов (16 штаммов), получен ных из коллекций различных институтов России. При подборе штаммов для ис следования в первую очередь оценивался их биосинтетический потенциал, а именно, способность к синтезу микробных метаболитов ароматической приро ды: аминокислот, витаминов, пигментов, антибиотиков, сидерофоров и других биогенных соединений, а также способность к росту на простых источниках уг лерода и энергии, какими являются метанол и его производные. В качестве ос новного критерия при этом была выбрана активность ключевого фермента ароматического пути ДАГФ-синтазы. Предполагалось, что высокая активность этого фермента может обеспечить ароматический путь достаточным количест вом метаболитов и, как следствие этого, привести к сверхпродукции тех или иных ароматических соединений после направленной дерегуляции их синтеза.
Анализ по этому показателю коллекции облигатных и факультативных метило трофных бактерий позволил отобрать пять штаммов: M. mucogenes M75, M. flagellatum КТ, M. capsulatus ИМ, P. methylica 2 и P. putida M, которые характери зовались более высоким уровнем активности ДАГФ-синтазы (табл. 1). Два из них – M. mucogenes M75 и P. putida M– выделены, идентифицированы и охарак теризованы в настоящей работе, а остальные – M. flagellatum КТ, M. capsulatus ИМ и P. methylica 2 – являются коллекционными и были описаны ранее другими ав торами.
Таблица Активность ДАГФ-синтазы у изучаемых метилотрофных бактерий Удельная Путь Происхождение активность Штаммы ассимиляции штаммов ДАГФ-синтазы С1-соединений (нмоль/мин·мг белка) РМФ цикл выделен из почвы на 2, M.mucogenes M75 (КДФГА/ТА территории Беларуси (коллекция БГУ, Минск) вариант) РМФ цикл коллекция 3, (КДФГА/ТА M.flagellatum KT ГосНИИГенетика вариант) (г. Москва) коллекция M.capsulatus ИМ 2,52 сериновый ИБФМ (г. Пущино) P.methylica 2 2,12 сериновый –"– за счет активности выделен из почвы на 3, P.putida M алкогольдегидро- территории Беларуси геназы (коллекция БГУ, Минск) Затем у отобранных штаммов тестировалась способность к росту на про стых, нетрадиционных источниках углерода и энергии, какими являются мета нол и его производные, а также учитывалась активность основных ферментов С1-метаболизма. Комплекс указанных выше показателей послужил основой для окончательного отбора бактериальных штаммов и их дальнейшего использова ния при решении тех или иных задач диссертационной работы.
Останавливаясь более детально на характеристике выделенных облигатных метилотрофных бактерий, следует отметить, что у M. mucogenes M75 утилизация метанола осуществляется за счет функционирования КДФГА/ТА варианта РМФ-цикла. Наиболее интересным среди факультативных метилотрофных бактерий является штамм P. putida M, отнесенный к уникальным представите лям Pseudomonas, который отличается от них способностью к росту на метаноле благодаря наличию алкогольдегидрогеназы – фермента широкой субстратной специфичности, осуществляющего окисление этого субстрата наряду с этано лом, хотя и с меньшей эффективностью.
Следующим этапом исследований было создание коллекции генетически маркированных метилотрофных штаммов, пригодных для изучения метабо лизма ароматических соединений. Проблема получения мутантов у метило трофных бактерий, в частности, облигатных, представляет известную слож ность, которую удалось преодолеть благодаря подбору специальных условий химического мутагенеза, а также учету особенностей метаболизма данных орга низмов. В результате была создана уникальная коллекция ауксотрофных и ре гуляторных мутантов, отличающаяся как своей полнотой, так и степенью изу ченности входящих в ее состав штаммов. Например, у бактерий M. mucogenes М75 впервые для облигатных метилотрофов получены и охарактеризованы ферментативно зависимые по ароматическим аминокислотам мутанты, имею щие мутации в генах trpE, trpD и trpF, trpA, trpB, tyrA и pheA. Подобный набор ауксотрофных мутантов был создан и для факультативных метилотрофных бактерий M. capsulatus ИМ, P. mеthуlica 2 и P. putida M.
С использованием токсических аналогов 5-метилтриптофана и 6 фтортриптофана у метилотрофных бактерий Methylobacillus и Pseudomonas по лучены регуляторные 5-МТR- и 6-FТR-мутанты, способные к сверхпродукции триптофана. Некоторые мутантные штаммы были предложены для практиче ского использования. Например, ряд штаммов P. putida M3, M7, M9 и M11 – в ка честве тест-культур для изучения продукуции ароматических аминокислот у метилотрофных бактерий;
P. putida trpA15 – как продуцент триптофан-синтазы и ферментативного получения триптофана из индола и серина;
P. putida М35 – продуцент триптофана.
Однако основной целью создания коллекции штаммов метилотрофных бактерий являлось ее использование для расшифровки генетических и биохи мических механизмов синтеза ароматических соединений у данной группы ор ганизмов, которая была начата с установления связи между ароматическим и метилотрофным метаболизмом, а также изучения изоферментного состава и ре гуляции ключевого фермента ароматического пути – ДАГФ-синтазы.
Для решения поставленных задач у метилотрофных бактерий, имеющих различные варианты С1-ассимиляционных циклов, изучали зависимость уровня синтеза ДАГФ-синтазы от концентрации источника углерода (т.е. метанола) в среде культивирования (рис. 2). В результате установлено, что уровень синтеза ДАГФ-синтазы в процессе культивирования «реагирует» на изменение концен трации метанола лишь у облигатных метилотрофных бактерий M. mucogenes M75 и M. flagellatum КТ, реализующих КДФГА/ТА вариант РМФ-цикла при ас симиляции метанола. Ранее такое явление для ДАГФ-синтазы описано не было.
Единственно возможное объяснение наблюдаемого явления может быть сле дующим – при повышении концентрации метанола в среде уровень синтеза соединений, необходимых для ДАГФ-синтазной реакции также повышается, в результате чего ре гистрируется возрастание удель Удельная активность ной активности самого фермента.
5 5 В пользу этого говорят также сле дующие факты:
во-первых, уровень синтеза ДАГФ-синтазы у изучаемых обли 4 гатных метилотрофных бактерий 2 увеличивается в известных преде лах (в 4 раза для M. flagellatum КТ и примерно в 20 раз для M. mucogenes M75) пропорционально содержа 1 2 3 4 5 нию метанола в среде (0,2-2,0 % Концентрация метанола, % для M. flagellatum КТ и 0,2-4,0 % для M. mucogenes M75);
Рис. 2. Зависимость удельной активноcти ДАГФ-синтазы метилотрофных бактерий во-вторых, уровень синтеза от концентрации метанола в среде культи ДАГФ-синтазы находится в про вирования. 1 – M. flagellatum KT;
2 – М. mucоgenes M75;
порциональной зависимости от 3 – P. methylica 2;
4 – M. capsulatus ИM;
5 – P. putida M;
концентрации субстратов реакции удельная активность фермента в нмоль/мин·мг белка – эритрозо-4-фосфата и фосфое нолпирувата в достаточно широких пределах (от 0 до 0,7 ммоль/л и от 0 до 0, ммоль/л, соответственно);
в третьих, известно, что у бактерий, облигатно использующих метанол, эритрозо-4-фосфат образуется в РМФ-цикле, а фосфоенолпируват – в процессе превращения одного из продуктов этого же цикла – 2-кето-3-дезокси-6-фосо фглюконата – в клеточный материал. Уровень синтеза ферментов РМФ-цикла у бактерий M. mucogenes M75 и M. flagellatum КТ достаточно высокий.
Представленные результаты позволили сделать заключение о существова нии прямой связи ароматического и метилотрофного метаболизма у организ мов, обладающих КДФГА/ТА вариантом РМФ-цикла. Следовательно, облигат ные метилотрофные бактерии могут считаться перспективными объектами для получения на их основе продуцентов ароматических соединений.
Что касается факультативных метилотрофных бактерий (M. capsulatus ИМ, P. mеthylica 2 и P. putida M), то индукции синтеза субстратов ДАГФ-синтазной ре акции (эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата) у них, по-видимому, не происходит, и уровень синтеза изучаемого фермента не зависит от концентра ции метанола в среде, что согласуется с представлениями о более сложном ха рактере зависимости между пентозофосфатным (или сериновым) циклом и ароматическим путем.
Исследование механизмов регуляции ароматического метаболизма у мети лотрофных организмов было начато с его общего участка шикиматного пути.
Установлено, что ДАГФ-синтазы метилотрофных бактерий имеет разный изо ферментный состав (рис. 3). В частности, ДАГФ-синтаза бактерий M. mucogenes A549 A280 AА А280 А А549 А 1, 0,9 1, 1, A 1, 0,8 1, 1,6 1, 0,8 1, 1, 0, 1, 0,7 1, 1, 0, 0, 0,8 1, 1, 0, 0,6 1, 0, 0, 3 1, 1, 0, 0,5 1,0 0, 0,6 1, 0, 0, 0,4 0, 0,4 0, 1 0, 0, 2 0, 0, 0, 0,3 0,6 0,4 0, 0, 0, 0,2 0, 0,2 0,4 0, 0, 0, 0, 0,1 0, 0,1 0,2 0, 0, 20 40 60 80 100 120 140 160 180 20 40 60 80 100 120 140 № фракции № фракции А549 А280 A549 A Д 1, 0, 0,5 В 1, 0, 1, 1, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 20 40 60 80 100 120 140 № фракции А А549 15 20 № фракции Г 1, 0, - профиль активности фермента;
1, 0, - профиль элюции белка.
1, 0, Рис. 3. Хроматография на ДЭАЭ 1, 0, целлюлозе изоферментов ДАГФ-синтазы 0, 0,4 бактерий M. mucogenes M75 (А), M. flagella 0, tum KT (Б), M. capsulatus ИМ (В), P. methylica 0, 2 (Г), P. putida M (Д). Цифрами обозначены: 1 0, 0, ДАГФС-[Tyr];
2 - ДАГФС-[Trp];
3 - ДАГФС-[Phe].
0, Вертикальная линия обозначает начало градиента 0, KCl от 0 до 0,5 моль/л. Пунктирная линия – про филь элюции белка 20 40 60 80 100 120 140 № фракции M75, M. flagellatum КТ и M. capsulatus ИМ состоит из трех изоферментов – ДАГФС-[Tyr], ДАГФС-[Phe] и ДАГФС-[Trp], а P. methylica 2 и P. putida M – двух – ДАГФС-[Tyr] и ДАГФС-[Trp].
На биохимическом уровне ДАГФ-синтаза изучаемых бактерий регулирует ся путем ретроингибирования, причем характер этого процесса зависит от изо ферментного состава. Так, активность фермента у M. mucоgenes M75, M. fla gellatum КТ и M. capsulatus ИМ ингибируется тремя ароматическими аминокис лотами (триптофаном, фенилаланином и тирозином), а у P. methylica 2 и P. pu tida M – триптофаном и тирозином. В ряде случаев зарегистрировано ингиби рующее действие антранилата и фенилпирувата (табл. 2).
Таблица Регуляция активности и синтеза ДАГФ-синтазы у метилотрофных бактерий Амино- Уд. акт. ДАГФ Ингибиторы кислоты, синтазы в Бактерии Изоферменты (ингибирование, %)* вызывающие нмоль/мин·мг репрессию белка триптофан (72) фенилаланин (46) ДАГФС-[Trp] нет тирозин (50) M. mucogenes M75 ДАГФС-[Phe] – антранилат (44) ДАГФС-[Tyr] фенилпируват (35) триптофан (40) ДАГФС-[Trp] триптофан 3,3–62, фенилаланин (99) M. flagellatum КТ ДАГФС-[Phe] тирозин 3,1–47, тирозин (99) ДАГФС-[Tyr] триптофан (50) ДАГФС-[Trp] фенилаланин (63) 3,5–20, M. capsulatus ИМ ДАГФС-[Phe] триптофан тирозин (47) ДАГФС-[Tyr] антранилат (20) триптофан (29) ДАГФС-[Trp] P. methylica нет – тирозин (50) ДАГФС-[Tyr] триптофан (26) фенилаланин 2,6–10, тирозин (62) ДАГФС-[Trp] P.putida M тирозин 2,8–8, антранилат (26) ДАГФС-[Tyr] фенилпируват (30) Примечания. * - В скобках указаны уровни ингибирования активности фермента при концентрации ингибитора 1 ммоль/л. ** - Приведены уровни активности фермента в состянии репрессии и дере прессии. Уд. акт. – удельная активность По своему составу и способу аллостерической регуляции ДАГФ-синтаза представителей облигатных метилотрофных бактерий рода Methylobacillus и фа культативных M. capsulatus ИМ более всего близка к одноименному ферменту бактерий семейства Enterobacteriaceae, для которых также характерно наличие трех изоферментов в его составе. Причем вклад каждого из изоферментов в суммарную активность ДАГФ-синтазы у Methylobacillus сходен с бактериями E. coli, поскольку изофермент ДАГФС-[Phe] у последних также является «доми нантным» и обеспечивает 80 % общей активности фермента. ДАГФ-синтаза фа культативного метилотрофа M. capsulatus ИМ имеет сходство с данным фермен том других представителей энтеробактерий, например Erwinia, у которых все три изофермента по активности равнозначны. Двухизоферментный состав ДАГФ-синтазы у метилотрофных бактерий P. methylica 2 и P. putida M является типичным для представителей Pseudomonas, при этом основной изофермент у них – ДАГФС-[Tyr].
С использованием зависимых по ароматическим аминокислотам мутантов (Aro --фенотипа) у метилотрофных бактерий изучена генетическая регуляция синтеза ДАГФ-синтазы (см. табл. 2). Репрессия синтеза фермента зарегистриро вана у трех метилотрофных штаммов из пяти изученных, независимо от того, являются ли они облигатными или факультативными по отношению к метано лу. При этом имеющееся у них число Аro-генов (число изоферментов) не соот ветствует количеству обнаруженных апорепрессоров: у бактерий M. flagellatum KТ из трех Аro-генов репрессии подвержены только два – aroH и aroF, у M. capsulatus ИМ один – aroH, а у P. putida M из двух генов aroH и aroF репресси руется только последний.
Наиболее интересным среди изучаемых является штамм M. flagellatum КТ, у которого в дерепрессированном состоянии уровень удельной активности ДАГФ-синтазы оказался чрезвычайно высоким – 48-62 нмоль/мин·мг белка, что почти в 20 раз выше такового в состоянии репрессии (3,1-3,3 нмоль/мин·мг бел ка). Наоборот, отсутствие генетической регуляции ДАГФ-синтазы у бактерий M. mucоgenes M75 нельзя считать положительным, так как в этом случае невоз можно использовать прием повышения уровня синтеза фермента за счет его де репрессии. Однако дерегуляция фермента при снятии ретроингибирования, а также повышение уровня его синтеза за счет варьирования концентрации мета нола в среде культивирования (см. рис. 2) у данных бактерий сохраняется.
Следует отметить, что перечень бактериальных штаммов, у которых гене тическая регуляция синтеза ДАГФ-синтазы была известна к моменту начала вы полнения работы, ограничивался лишь несколькими представителями. Одной из основных причин слабой изученности этого механизма регуляции ДАГФ синтазы у бактерий являлось отсутствие адекватных методов его изучения.
Предложенный нами новый подход, основанный на изучении этого процесса с помощью Aro--мутантов (имеющих блок того или иного этапа шикиматного пу ти), позволил значительно увеличить разрешающую способность метода и об наружить данный тип регуляции синтеза ДАГФ-синтазы у лдостаточно боль шого числа новых бактериальных штаммов. Преимуществом использования Aro--мутантов является то, что с их помощью можно экспериментально созда вать условия репрессии или дерепрессии генов ароматического пути в зависи мости от условий выращивания бактерий (лимита или избытка соответствую щей аминокислоты). Для апробации этого метода попутно была изучена регу ляция синтеза ДАГФ-синтазы у ряда других представителей рода Pseudomonas, для которых ранее этот регуляторный механизм известен не был. В результате, репрессию синтеза ДАГФ-синтазы удалось зарегистрировать у значительного числа представителей рода Pseudomonas (P. ae-ruginosa, P. fluorescens, P. acidovorans и др.), что подтверждает наше предположение о более широком распростране нии этого явления среди микроорганизмов, чем считалось ранее.
Таким образом, анализ изоферментного состава ДАГФ-синтазы у различ ных штаммов метилотрофных бактерий, а также процессов регуляции активно сти и синтеза данного фермента позволил выявить сходство изучаемой группы с большинством известных в этом отношении микроорганизмов, продемонст рировать достаточно широкую распространенность механизмов генетического контроля синтеза ключевого фермента ароматического пути – ДАГФ-синтазы среди бактерий и сделать вывод об универсальности регуляторных механизмов ароматического метаболизма у представителей различных систематических групп.
Определенное сходство с другими бактериями проявляют метилотрофы и в отношении механизмов регуляции отдельных ветвей ароматического пути, а именно, синтеза триптофана, фенилаланина и тирозина. Изучение регуляции биосинтеза триптофана у метилобактерий на примере облигатного метило трофа M. mucоgenes M75 показало, что этот путь у них регулируется с помощью двойного контроля – репрессии trpE, trpD- и trpC-генов и ретроингибирования антранилат-синтазы триптофаном.
О репрессии генов судили по снижению уровня синтеза трех ферментов антранилат-синтазы, антранилат-5-фосфорибозилтрансферазы и индол-3 глицерофосфат-синтазы (от 3 до 20 раз) при избытке триптофана. Остальные ферменты триптофанового пути (в частности, А- и Б-активности триптофан синтазы, являющиеся продуктами генов trpАВ) у M. mucоgenes M75 синтезиру ются конститутивно (табл. 3).
Таблица Регуляция синтеза ферментов триптофанового пути у облигатных метилотрофных бактерий M. mucogenes М Удельная активность (нмоль/мин·мг белка) L-триптофан Штамм (мкг/мл) АС II ФРТ ИнГФС ТС-А ТС-Б дикий тип 500 0,06+0,01 1,76+0,1 6,5+0,2 0,1+0,01 3,8+0, trpE2 500 0 0,3+0,01 2,9+0, 1 0,11+0,01 3,9+0, 50 0 1,72+0,02 6,7+0,2 0,09+0,01 3,7+0, trpD6 500 0,09+0,01 0 4,2+0,1 0,16+0,01 4,3+0, 100 1,7+0,02 0 9,2+0,9 0,15+0,01 4,5+0, trpС14 500 0,08+0,01 1,13+0,01 1,2+0,01 0,15+0,01 4,6+0, 50 1,8+0,02 1,35+0,02 4,4+0,2 0,17+0,01 4,5+0, trpA10 500 0,06+0,01 1,21+0,02 3,5+0,1 0 5,9+0, 50 1,5+0,02 1,5+0,01 11,0+0,3 0 6,7+0, trpВ9 500 0,1+0,01 0,4+0,01 4,7+0,2 0,09+0,01 100 2,5+0,1 1,9+0,1 9,3+0,3 0,1+0,01 Примечание АС II - амидотрансферазная активность атранилатсинтазы;
ФРТ - антранилат-5 фосфорибозилтрансфераза;
ИнГФС - индол-3-глицерофосфат-синтаза;
ТС-А - активность субъединицы триптофан-синтазы;
ТС-Б - активность -субъединицы триптофан-синтазы Характер ингибирования ключевого фермента триптофанового пути – ан транилат-синтазы у M. mucogenes М75 такой же, как и у известных в этом отно шении бактерий (рис. 4). Снижение активности АС II на 50 % регистрировалось при концентрации триптофана 10- Относительная активность, % ТС-А моль/л, что говорит о слабой чувст вительности фермента к этому ин гибитору. Сигмоидный характер кривой ингибирования указывает на аллостерический тип его регу ляции.
АСII В ходе исследования показана возможность получения у облигат ных метилотрофных бактерий M. mucogenes М75 5-метил 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 10 -2 10 - триптофан- и 6- фтортриптофан Концентрация триптофана, моль/л резистентных регуляторных мутан Рис. 4. Ингибирование активности антра- тов (5МТR и 6-FТR), способных к нилат-синтазы (АСII) и триптофан-синта сверхсинтезу триптофана. Установ зы (ТС-А) у M. mucogenes M лено, что в основе этого явления лежит дерепрессия триптофанового пути, а также частичное снятие ретроинги бирования ДАГФ-синтазы и антранилат-синтазы. Таким образом, на примере бактерий М. mucogenes М75 продемонстрировано, что, несмотря на биохимиче скую уникальность и филогенетическую отдаленность от других групп бакте рий, у облигатных метилотрофов имеется сходный тип регуляции синтеза триптофана, осуществляемый с помощью репрессии трех генов trpEDC и рет роингибирования антранилат-синтазы. Способы дерегуляции этого пути у об лигатных метилиторофных бактерий также аналогичны.
У факультативных метилотрофных бактерий P. putida M регуляция синтеза триптофана осуществляется подобным образом – с помощью репрессии трех ге нов trpEDC (табл. 4). В условиях лимита этой аминокислоты синтез трех фермен тов -- антранилат-синтазы, антранилат-5-фосфоризобизтрансферазы и индол-3 глицерофосфат-синтазы увеличивается в 4-10 раз. Однако, помимо характерной для бактерий Pseudomonas репрессии, у бактерий P. putida M обнаружен новый тип регуляции синтеза триптофана – индукция trpА- и trpВ-генов индол-3-гли церофосфатом. Ингибирование активности ферментов зарегистрировано на уровне антранилат-синтазы и триптофан-синтазы триптофаном (рис. 5).
В ходе исследований разработаны новые интересные в практическом от ношении приемы получения предшественников триптофана, в частности, фосфорибозилпирофосфата, а также способы его количественного определе ния. Штамм P. putida M15, клетки которого способны к сверхсинтезу триптофан синтазы (200 нмоль/ мин·мг белка), отобран как сверхпродуцент этого фермен та и рекомендован для энзиматического получения триптофана из индола и серина в лабораторных и промышленных условиях.
С помощью токсических аналогов триптофана – 5-метилтриптофана, 5- и Таблица Регуляция синтеза ферментов триптофанового пути у факультативных метилотрофных бактерий P. putida M Относительная активность Триптофан Мутанты (мкг/мл) АС II ФРТ ФРАИ ИнГФС ТС-А ТС-Б 1,0 1, 1,0 1,0 1, дикий тип 50 1, (1,85) (0,02) (1,01) (7,35) (0,82) (1,42) 0, 0,7 1,3 1, trpE53 50 0 0, 1,02 0, 1,7 0,7 4, 2 0, 1,3 1, 0,6 0 0, trpD69 4,0 1,0 1, 0 0, 2 6, 1,0 0, 0 1, trpF2 50 1,1 1, 1, 4,9 0 2,5 1, 2 2, 0, 0 1, 0,8 0,8 0, trpC100 0 1,0 1, 0, 2 2,4 1, 1,2 0 10, 1,7 0,9 1, trpA88 0 139, 4,1 0,9 6, 2 11, 1,0 20,0 0,6 0, trpB9 50 0, 71,8 0,8 6, 2 3,9 2, Примечание. В скобках даны значения удельной активности ферментов у бактерий дикого типа, принятые за единицу 6-фтортриптофана получен набор ре гуляторных мутантов метилотроф 100 Относительная активность, % ных бактерий P. putida М, экскрети рующих триптофан в достаточно больших количествах вследствие дере гуляции генов trpEDC и снятия рет роингибирования антранилат-синта зы. Штамм P. putida М35, продукция триптофана у которого достигала 2 мг/л, рекомендован для дальнейшего 3 генно-инженерного совершенствова 0 ния и конструирования на его основе сверхпродуцентов триптофана и его 10-6 10-5 10-4 10-3 10- производных, а также получения бел Концентрация триптофана, моль/л ка одноклеточных, обогащенных этой Рис. 5. Ингибирование активности фер- незаменимой аминокислотой.
ментов синтеза триптофана у бактерий Исследование регуляции био P. putida М. 1 – ФРТ, 2 – ТС-Б, 3 – АС II синтеза фенилаланина и тирозина у облигатных метилотрофных бакте рий M. mucogenes М75 показало, что этот участок ароматического пути у них контролируется путем репрессии синтеза хоризматмутазы и префенатдегидра тазы тирозином. Как видно из результатов табл. 5, в условиях лимита этой ами нокислоты уровень синтеза хоризматмутазы возрастает в 2,5 раза, а префенат дегидратазы – в 6 раз. Синтез префенатдегидрогеназы – фермента, участвующе го в синтезе тирозина – осуществляется конститутивно. Биосинтез фенилалани на дополнительно контролируется на биохимическом уровне путем ингибиро вания активности префенатдегиратазы фенилаланином, причем в присутствии тирозина степень ингибирования снижается в два раза (табл. 6).
Таблица Регуляция синтеза фенилаланина у бактерий M. mucogenes М Удельная активность Аминокислоты (нмоль/мин · мг белка) Мутанты (мкг/мл) ХМ ПДТ дикий тип без добавок 4,5+0,2 2,3+0, фенилаланин (500) 4,8+0,1 1,9+0, тирозин (500) 4,8+0,2 1,9+0, триптофан (500) 4,8+0,2 1,9+0, М фенилаланин (150) 4,8+0,1 н.о фенилаланин (500) 6,7+0,3 н.о М тирозин (200) 13,5+0,5 17,3+0,7* тирозин (500) 5,4+0,2 2,6+0,1* М триптофан (80) 4,3+0,1 2,13+0, триптофан (500) 3,0+0,1 1,65+0, Примечания. ХМ хоризматмутаза, ПДТ префенатдегидратаза. * - Различия статистически достоверны при р 0, Изучение этого пути у фа Таблица культативных метилотрофных Ингибирование активности префенат бактерий P. putida M позволило дегидратазы M. mucogenes М обнаружить уникальный фермент Ингибиторы Ингибирование (%) фенилаланингидроксилазу, ши (0,5 ммоль/л) роко распространенную лишь тирозин среди эукариотических организ фенилаланин 84+2, мов и осуществляющую превра триптофан щение фенилаланина в тирозин.
тирозин У бактерий P. putida M этот путь фенилаланин } 44+1,3 синтеза тирозина является допол триптофан нительным к основному: хоризмат префенат п-оксифенил фенилаланин пируват тирозин. Наличие } 49+1, тирозин двойного пути синтеза этой ами нокислоты создает определенные фенилаланин } 80+1,7 трудности. при получении ауксо триптофан трофных Tyr--мутантов. Для ре шения этого вопроса был разработан новый способ их отбора, основанный на использовании бактериями фенилаланингидроксилазного пути утилизации фенилаланина в качестве источника углерода и энергии. Его идентификация дала возможность разработать оригинальную методику получения и отбора Phu--, Tyu--и Tyr--мутантов, которые были использованы для изучения регуля ции синтеза фенилаланина и тирозина (табл. 7).
Таблица Регуляция синтеза фенилаланина и тирозина у бактерий P. putida M Аминокислоты, Относительная активность Штаммы мкг/мл ХМ ПДТ ПДГ дикий тип фенилаланин 100 1,0 1,0 1, тирозин 200 (29,2) (26,0) (2,1) триптофан phu1phe60 фенилаланин 100 0,9 0,04 0, 4 1,2 0,04 1, phu1tyr39 тирозин 200 0,8 0,6 0, 40 1,0 0,8 0, 0, trpE53 триптофан 100 1,6 1, 2 1,5 1,1 0, Примечание. ХМ хоризматмутаза, ПДТ префенатдегидратаза, ПДГ префенатдегидрогеназа В результате было установлено, что у исследуемых бактерий путь син Относительная активность, % 100 теза фенилаланина и тирозина на ге нетическом уровне регулируется в не значительной степени. При анализе регуляторных механизмов тирозино вого пути зарегистрирована репрессия 50 синтеза префенатдегидрогеназы трип тофаном и индукция синтеза фенила ланингидроксилазы фенилаланином.
Единственным механизмом биохими ческой регуляции синтеза фенилала нина у данных бактерий является ин гибирование активности префенатде 10-6 10-5 10-4 10-3 10- гидратазы фенилаланином и трипто Концентрация ингибитора, моль/л фаном (рис. 7).
Рис. 7. Ингибирование активности префе Исследование у метилотрофных натдегидратазы P. putida M фенилаланином бактерий метаболизма ароматических (1) и триптофаном (2) аминокислот позволило составить об щие схемы их биосинтеза (рис. 8 и 9), установить ключевые регуляторные зве нья биосинтетических процессов и определить возможные рычаги управления ими, что является чрезвычайно важным при выборе подходов направленной де регуляции ароматического пути и создании штаммов-продуцентов. Главным регуляторным звеном ароматического пути является его первый этап, контро лируемый ДАГФ-синтазой, представленной у облигатных метилотрофных бак терий Methylobacillus aroH-, aroG- и aroF-генами, а у представителей факульта фенилаланин тирозин фенилпируват n-оксифенилпируват ФЭП + хоризмат префенат Э4Ф антранилат Рис. 8. Регуляция биосинтеза ароматических аминокислот у M. mucogenes M75. 1- ДАГФ синтаза, 2 - хоризматмутаза, 3 - префенатдегидра таза, 4 - антранилат-синтаза, 5 - антранилат фосфорибозилтрансфераза, 6 - индол-3 6 глицерофосфат-синтаза;
ФЭП – фосфоенол пируват, Э4Ф - эритрозо-4-фосфат.
- ретроингибирование, - репрессия.
триптофан ФЭП + Э4Ф триптофан фенилпируват фенилаланин хоризмат префенат 2 антранилат n-оксифенилпируват тирозин 3 Рис. 9. Регуляция синтеза ароматических аминокис лот у P. putida M. 1- ДАГФ-синтаза;
2 - антранилат-синтаза;
- N-5-фосфорибозил-антранилатизомераза;
4 - триптофан синтаза;
5 - префенатдегидратаза;
6 - префенатдегидрогеназа;
- фенилаланингидроксилаза.
триптофан - индукция - ретроингибирование, - репрессия, тивных метилотрофных Pseudomonas – aroH- и aroF- генами, соответственно. В регуляции синтеза триптофана важную роль играет группа генов trpEDC, экс прессия которых контролируется негативно триптофаном. Синтез фенилала нина и тирозина у Methylobacillus регулируется на уровне pheA-гена, а также tyrА-гена с помощью триптофана.У облигатных и факультативных метило трофных бактерий ключевыми ферментами ароматического пути, регуляция которых осуществляется путем ретроингибирования, являются три – ДАГФ синтаза, антранилат-синтаза и префенатдегидратаза.
БИОСИНТЕЗ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ АРОМАТИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ МЕТИЛОТРОФНЫМИ БАКТЕРИЯМИ Биосинтез 2,3-диоксибензоата. При дальнейшем анализе возможностей биотехнологического использования метилотрофных бактерий в качестве про дуцентов ароматических соединений установлено, что клетки облигатных ме тилотрофных бактерий M. mucogenes M75 выделяют в среду вещество, иденти фицированное как 2,3-диоксибензоат. Синтез его осуществляется по известному пути: хоризмат изохоризмат А540 А 0,7 2,3-диоксибензоат. Показано, что 2, продукция 2,3-диоксибензоата ре 2,1 0,6 прессируется Fe3+-ионами (рис. 10), на основании чего был сделан вы 1,8 0, вод о том, что это соединение явля 1, 0,4 ется компонентом системы, участ 1,2 вующей в ассимиляции Fe3+-ионов, 0,3 и выполняет у бактерий M. mu 0, 0,2 cogenes M75 функцию сидерофора.
0,6 Помимо Fe3+-ионов на синтез 2,3 0,1 диоксибензоата оказывают нега 0,3 тивное влияние n-аминобензоат, n 0 оксибензоат и антранилат, что ука 0 8 16 24 32 40 зывает на их участие в регуляции Время, ч метаболизма данного соединения.
Рис. 10. Влияние Fe3+ -ионов на рост культу- При изучении способности ры M. mucogenes M75 и продукцию кате- бактерий M. mucogenes М хольных соединений. Цифрами обозначены: 1 - синтезировать 2,3-диоксибензоат кривая роста при лимите Fe3+-ионов;
2 - кривая роста показано, что его выход составляет при избытке Fe3+-ионов в среде (10 мкг/мл);
3 - про 180 мг/л, что значительно дукция катехольных соединений при лимите Fe3+ превосходит известные продуценты.
ионов;
4 - продукция катехольных соединений при избытке Fe3+-ионов (10 мкг/мл) В практическом отношении 2,3 диоксибензоат представляет интерес как стимулятор роста микроорганизмов и может быть рекомендован для этих целей. Интересной является также способ ность этого соединения связывать кислородные радикалы и защищать клетки от их токсического действия.
Биосинтез пиовердина Рm. При анализе бактерий факультативного мети лотрофного штамма P. putida M на предмет способности синтезировать вторич ные метаболиты ароматической природы было установлено, что его клетки продуцируют флуоресцирующий пигмент пиовердин Рm, обладающий анти микробной активностью в отношении широкого спектра микроорганизмов, в том числе фитопатогенных. В серии предварительных экспериментов была расшифрована структура пиовердина Рm и осуществлен его физико химический анализ. Установлено, что, помимо короткого пептида, включающе го пять аминокислот – треонин, серин, лизин, оксиаспарагиновую кислоту и N оксиорнитин в молярных соотношениях 3 : 2 : 1 : 1 : 1, в состав пигмента входит ароматическое соединение – диоксихинолиновый хромофор, обусловливающий физико-химические свойства пигмента и его биологическую активность. Пока зано, что спектр поглощения пиовердина Рm характеризуется двумя максиму мами поглощения: первый расположен в ультрафиолетовой области спектра (230 нм), а второй в видимой области (400 нм);
при этом положение второго максимума поглощения зависит от рН среды и может смещаться от 378 нм (при рН 5,0) до 407 нм (при рН 9,0).
В ходе работы обнаружено высокое сродство пиовердина Рm к ионам трех валентного железа, а также ионам двухвалентных (Zn2+, Ni2+, Co2+, Sn2+, Cu2+, Cd2+) и шестивалентных (W6+ и Mo6+) металлов. Это свойство пигмента может быть использовано для разработки новых приемов извлечения тяжелых метал лов из различных сред и детоксикации почв. Высокая хелатирующая способ ность пиовердина Рm позволила предположить наличие у него достаточно высо кой антирадикальной активности, что открывает широкие перспективы исполь зования пигмента в пищевой промышленности и медицине в качестве антиок сидант. Анализ этого свойства у пиовердина Рm, проведенный в системе пере кисного восстановления ПНТХ, показал наличие таковой (50 %-ное ингибиро вание свободнорадикальных процессов наблюдалось при концентрации пиг мента 25 мкг/мл), что сопоставимо с действием меланина и других полифено лов. Установлено, что антиоксидантная активность пигмента связана с его хела тирующей способностью.
Для выяснение путей и механизмов синтеза ароматической части молекулы пиовердина Рm был разработан новый генетический подход выявления его био синтетических предшественников с использованием зависимых по ароматиче ским аминокислотам и азотистым основаниям мутантов (Aro-- и Pyr--мутантов).
Клетки мутантного штамма P. putida M1 (аro1phu1-генотипа), имеющего блок одного из этапов шикиматного пути, а также дефект фенилаланингидрокисла зы – фермента, превращающего фенилаланин в тирозин, выращивали в усло виях лимита и избытка каждой из ароматических аминокислот. В результате было установлено, что продукция пигмента регистрировалась только при из бытке в среде L-фенилаланина (100 мкг/мл) (рис. 11), тогда как L-триптофан и L-тирозин в тех же концентрациях подобного действия не оказывали. Анало гичные результаты были получены и в присутствии D-формы фенилаланина.
Вместе с тем, при использовании 2,3-диоксибензоата, 3,4-диоксибензоата, 2,4 диоксибензоата, n-оксибензоата, n-аминобензоата, катехола, салицилата, 3,4 А диоксифенилаланина (ДОФА) или 1 антранилата продукция пигмента не восстанавливалась. Было сделано заключение, что пиовердин Рm син тезируется у бактерий P. putida M только при участии фенилаланина (в D- или L-форме).
Дополнительное доказательство участия фенилаланина в биосинтезе пиовердина Рm было получено в экспериментах по включению в его 1 состав меченого 14С-фенилаланина.
Клетки бактерий P. putida M1 выра щивали в присутствии метки и затем 600,нм 300 400 500 после выделения и очистки пигмен та определяли уровень остаточной Рис. 11. Продукция пиовердина клетка радиоактивности (табл. 8). Было ус ми штамма P. putida M1. 1 – при избытке тановлено, что в пигмент переходит трех аминокислот, 2 – L-фенилаланина, 3 – L триптофана, 4 – L-тирозина и 5 – лимите трех 41,7 % радиоактивной метки.
аминокислот Таблица Включение 14С-фенилаланина в молекулу пиовердина Рm Концентрация Удельная Доля остаточной Анализируемый пигмента в радиоактивность, радиоактивности препарат усл.единицах мкКи/мл (%) культура в стацио- 0,612 нарной фазе роста супернатант после 9,0 0,282 46, осаждения клеток препарат очищенного пигмента 5,6* 0,163 26, Примечание. * - Степень разведения раствора пигмента 1, С использованием Pyr--мутантов установлено, что вторым биосинтетиче ским предшественником пиовердина Рm является дигидрооротат (табл. 9). Было показано, что в норме пигмент синтезируется лишь бактериями, не имеющими дефектов в области pyrA–pyrC-генов, которые, как известно, кодируют синтез фер ментов карбамоилфосфатсинтазы, аспартат-транскарбамоилазы и дигидроорота зы. С другой стороны, мутации в этих генах вызывали либо полную утрату способ ности к пигментообразованию (мутации pyrA- и pyrB-генов), либо существенно снижали его синтез с одновременным изменением характерных для него свойств (мутация pyrC-гена). Дефекты pyrD- и pyrE-генов, контролирующих синтез дигид рооротатдегидрогеназы и оротатфосфорибозилтрансферазы, не влиял на образо вание пигмента. В процессе изучения генетической и физиологической регуляции интеза пиовердина Рm показано, что его синтез репрессируется ионами Fe3 и других металлов (Ni2+, Sn2+, W6+) (рис. 12), а также глюкозой. Оптимальными усло виями для синтеза пигмента являются: температура 28-30°С, рН среды 6,0-8,0 и источник углерода сукцинат 0,2-0,4 %.
Таблица Продукция пигмента Pyr --мутантами бактерий P. putida M Штаммы Продукция Антибактериальная Способность пигмента пигмента (%) активность связывать Fe3+-ионы Pyr+(дикий тип) 100,0 + + pyrА19 0,6 - н.о.
pyrB2 2,9 - н.о.
pyrCD22 28,6 - + pyrC41 23,13 - + pyrD7 100,0 + + pyrE32 100,0 + + Примечание. н.о. – Не определяли А 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Ионы металлов Рис. 12. Продукция пиовердина Рm в присутствии ионов металлов. 1 - контроль, 2 - Li+, 3 Cu2+, 4 - K+, 5 - Cd2+, 6 - W6+, 7 - Mg2+, 8 - Ca2+, 9 - Cr3+, 10 - Pb2+, 11 - Ni2+, 12 - Mn2+, 13 - Mo6+, 14 - Al3+, 15 La3+, 16 - Zn2+, 17 - Ba2+, 18 - Fe3+, 19 - Sn2+. Ионы Li+, K+, Mg2+, Ca2+, Mn2+, Zn2+, Ba2+, Sn2+, Al3+, La3+, Fe3+, Cr3+, W6+, Mo6+ использовали в концентрации 100 мкмоль/л, ионы Cu2+, Cd2+, Pb2+ - 50 мкмоль/л, а Ni2+ 2 мкмоль/л Угнетающее действие на синтез пигмента оказывали также аскорбиновая кислота, N,N-диэтилдитиокарбомат и сульфосалицилат. Кроме того, синтез предшественика диоксихинолинового ядра пигмента дигидрооротата регу лируется посредством ингибирования активности аспартат-транскарбамоилазы нуклеотидами (ЦТФ, ГТФ, УТФ) и пирофосфатом, а также стимуляции фенила ланином. Участие фенилаланина в регуляции активности аспартат транскарбамоилазы является достаточно интересным фактом и подтверждает наличие связи между пиримидиновым и фенилаланиновым путями в процессе синтеза изучаемого пигмента.
Получены регуляторные 5-фторурацилрезистентные мутанты бактерий P.
putida М, способные к сверхсинтезу пиовердина Рm. Повышенная продукция пигмента у аналогрезистентных мутантов коррелировала с возрастанием актив ности трех ферментов пиримидинового пути: карбамоилфосфатсинтазы, ас партат-транскарбамоилазы и дигидрооротазы.
На основании полученных результатов предложена гипотетическая много этапная схема синтеза пиовердина Рm (рис. 14). Логическим продолжением ис следований в этом направлении явилась детализация предложенной схемы, в ча стности, ее первого этапа, предусматривающего включение фенилаланина в пигмент при взаимодействии с дигидрооротатом. С помощью биохимических и генетических подходов было показано, что наиболее вероятным предшественни ком пиовердина Рm является производное фенилаланина фенилацетамид.
.
HOOC O HOOC O H H COOH CO2 HN NH NH HN + OH NH2 O H H III NH II I H 2O HOOC H HOOC N + NH O H 2O H H N NH NH H H V O NH HOOC IV H H 2O N NH + HO HO NH R VII R 2 OOC HOOC O H H N N NH NH + + HO HO HO NH2 NH HO R VI VIII Рис. 14. Предполагаемая схема пути синтеза диоксихинолинового ядра пиовердина Pm из фенилаланина и дигидрооротата у бактерий P. putida M. I фенилаланин;
II ди гидрооротат;
III VII предполагаемые предшественники;
VIII пиовердин Pm. R1- карбоновая кисло та или ее амид. R2 - пептидная часть Обнаруженная в ходе исследований антимикробная активность пиоверди на Pm в отношении ряда фитопатогенных бактерий и грибов, послужила осно ванием для более детального исследования этого феномена и проведения работ прикладного плана по созданию на основе синтезирующих этот пигмент мети лотрофных бактерий P.putida M биопрепарата для защиты растений. Исследо вание антагонистической активности данного штамма в отношении 771 культу ры микроорганизмов, большинство из которых являются представителями фи топатогенной микрофлоры растений, показало чрезвычайно высокую антимик робную (подавляет рост более 95,9 % культур) активность изучаемых бактерий.
Не менее интересным свойством бактерий P. putida M оказался их фитостиму лирующий эффект, связанный, вероятно, с антиоксидантной активностью пиг мента. Стимулирующее действие P. putida M зарегистрировано в отношении сельскохозяйственных культур. На уровне проростков увеличение основных пока зателей роста возрастало в 2-4 раза.
Полученные данные аргументировали вывод, что штамм P. putida M является перспективным объектом агробиотехнологии и может быть использован для созда ния на его основе биопрепарата широкого спектра противомикробного действия, обладающего одновременно антиоксидантной активностью, а также способностью стимулировать рост растений. Такой препарат был разработан под коммерческим названием Бактофил, проведены его лабораторные и производственные испыта ния. Установлено, что обработка растений препаратом приводит к значительному снижению их заболеваемости и является в некоторых случаях более эффективной, чем действие эталонного препарата Превикур, особенно в отношении возбудите лей мучнистой росы, стеблевого аскохитоза и пероноспороза. Например, эффек тивность защитного действия препарата Бактофил в производственных условиях находилась в пределах от 47 % до 85 % в зависимости от типа заболевания. Осо бенно перспективным оказалось применение Бактофила для борьбы с галловой нематодой (эффективность подавления инфекции на культуре огурцов соста вила от 78,2 %, до 95,2 %). Прибавка урожая составила 0,59 кг/м2.
АНАЛИЗ И ОБОБЩЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ Детальный анализ представленных в диссертационной работе результатов исследований позволил сделать ряд важных обобщений, вскрыть новые законо мерности биологических явлений и продемонстрировать, что метилотрофные бактерии представляют существенный интерес как в теоретическом отношении, так и в плане их практического использования.
На примере ароматического пути метилотрофных бактерий подтверждена общность механизмов регуляции метаболизма (наличие генетического контро ля экспрессии генов путем репрессии или индукции, а также регуляции актив ности ферментов с помощью ретроингибирования) у широкого круга бактерий, независимо от их систематического положения и филогенетического родства.
Универсальной оказалась также схема расположения ключевых звеньев арома тического пути, на уровне которых функционируют регуляторные механизмы:
это первый этап общего участка ароматического пути, контролируемый ДАГФ синтазой, первый этап пути синтеза триптофана, контролируемый антранилат синтазой, и два первых этапа синтеза фенилаланина и тирозина, контролируе мых хоризматмутазой и префенатдегидратазой (префенатдегидрогеназой), со ответственно. Сходство обнаружилось также и по таким параметрам, как изо ферментный состав ДАГФ-синтазы (двух- или трехизоферментный), наличие генетической регуляции синтеза данного фермента, кластерность некоторых генов (в частности, группы trpEDC- и trpАВ-генов) в плане регуляции их экс прессии, сверхсинтез ароматических аминокислот в случае направленной дере гуляции синтеза, способность к синтезу вторичных метаболитов и др.
К числу новых закономерностей можно отнести выявленную у облигатных метилотрофных бактерий связь ассимиляции С1-соединений (КДФГА/ТА вари анта РМФ-цикла) и ароматического метаболизма. Роль связующих элементов при этом играют промежуточные продукты РМФ-цикла – эритрозо-4-фосфат и фосфоенолпируват, являющиеся одновременно субстратами ДАГФ-синтазы.
Установлена корреляция между уровнем активности данного фермента и спо собностью бактерий синтезировать ароматические соединения. Этот феномен может быть использован в качестве критерия для отбора перспективных в био технологическом отношении штаммов, разработки новых принципов реализа ции их биосинтетического потенциала, а также создания штаммов-продуцентов и получения ценных микробных метаболитов ароматической природы.
Поиск среди метилотрофных бактерий продуцентов ароматических мета болитов вторичного происхождения позволил обнаружить среди них природ ные продуценты 2,3-диоксибензоата и флуоресцирующего пигмента пиоверди на Рm, обозначить возможные аспекты их практического использования и про демонстрировать, что изучаемая группа бактерий пригодна для получения не только первичных, но и вторичных микробных метаболитов ароматической природы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. Создана коллекция бактерий дикого типа и генетически маркированных штаммов метилотрофных бактерий (более 300 культур) разных таксономиче ских групп. Выделен и охарактеризован новый, ранее не описанный штамм об лигатных метилотрофных бактерий M. mucogenes M75, у которых идентифици рован путь ассимиляции С1-соединений (КДФГА/ТА вариант РМФ-цикла). У факультативного метилотрофа, идентифицированного как P. putida M, обнару жен путь утилизации метанола при участии алкогольдегидрогеназы. С учетом физиологических и биохимических особенностей метилотрофных бактерий разработаны подходы получения ауксотрофных и регуляторных мутантов сле дующих фенотипов: Aro-, Trp-, Phe-, Tyr-, Nic-, Pyr-, Phu-, Tyu-, 5MTR и 6FTR, кото рые использованы для изучения регуляции метаболизма ароматических соеди нений первичного и вторичного происхождения, а также разработки подходов практического использования метилотрофных бактерий [1-3;
5-11;
13;
18;
20-23;
26-31;
33;
36;
45;
46;
48;
57;
61;
63;
69;
75-78;
81;
82;
85].
2. На примере облигатных метилотрофных бактерий, обладающих КДФГА/ТА вариантом РМФ-цикла, зарегистрирована связь метилотрофного и ароматического метаболизма. Роль связующих элементов при этом выполняют промежуточные продукты РМФ-цикла – фосфоенолпируват и эриторозо-4 фосфат, которые одновременно являются субстратами ДАГФ-синтазы и постав ляются в ароматический путь в ходе утилизации метанола бактериальными клетками Показано, что уровень удельной активности ДАГФ-синтазы находится в прямой зависимости от концентрации источника углерода и энергии (метано ла) в среде культивирования бактерий [11;
21;
27;
33;
36;
38].
3. У ряда метилотрофных штаммов, отобранных в качестве перспективных объектов для получения микробных метаболитов ароматической природы, изу чены строение и механизмы регуляции ДАГФ-синтазы. Установлено, что этот фермент у облигатных и факультативных метилотрофных бактерий имеет ти пичное для большинства известных организмов строение – представлен тремя изоферментами (у M. mucogenes M75, M. flagellatum KТ и M. capsulatus ИМ) либо двумя изоферментами (у P. methylica 2 и P. putida M), а также сходные механизмы регуляции активности и синтеза.
Впервые у метилотрофных бактерий обнаружена регуляция ДАГФ синтазы на транскрипционном уровне: у бактерий M. flagellatum KТ – трипто фаном и тирозином, у M. capsulatus ИМ – триптофаном, а у P. putida M – фени лаланином и тирозином. При этом число Аro-генов не соответствует количеству обнаруженных апорепрессоров: у бактерий M. flagellatum KТ из трех aro-генов репрессии подвержены только два – aroH и aroF, у M. capsulatus ИМ – только один – aroH, а у P. putida M из двух генов aroH и aroF репрессируется только по следний [7;
9;
11;
12;
21-23;
26;
27;
29;
33;
38;
45;
47;
49;
53].
4. При изучении механизмов регуляции синтеза триптофана установлено, что этот участок ароматического пути у метилотрофных бактерий регулируется посредством двойного контроля – репрессии trpE-, trpD- и trpC-генов и ретро ингибирования ключевого фермента антранилат-синтазы триптофаном, чем метилотрофы сходны с большинством известных бактерий. У бактерий P. putida M зарегистрирована индукция синтеза триптофан-синтазы (продукт генов trpAB) индол-3-глицерофосфатом, что характерно лишь для некоторых пред ставителей Pseudomonas.
Получены регуляторные, продуцирующие триптофан мутанты облигат ных и факультативных метилотрофных бактерий, для которых установлена ге нетическая основа сверхсинтеза данной аминокислоты. Это открывает возмож ности дальнейшего усовершенствования полученных мутантов и направленно го конструирования на их основе штаммов – продуцентов триптофана [3-5;
21 23;
26;
27;
29;
33;
38;
44-46;
64;
76].
5. Установлено, что в регуляции синтеза фенилаланина и тирозина у мети лотрофных бактерий также задействовано два механизма – репрессия и ретро ингибирование, однако по сравнению с известными бактериями на этом участ ке ароматического пути у метилотрофов регулируются лишь отдельные гены и наиболее типичным является конститутивный характер их действия. Например, у облигатного метилотрофа M. mucogenes M75 генетически регулируется синтез двух ферментов – хоризматмутазы и префенатдегидратазы (апорепрессор тиро зин), а у факультативного метилотрофа P. putida M – только одного – префенат дегидрогеназы (апорепрессор триптофан). Ретроингибирование у обоих штам мов осуществляется лишь на уровне префенатдегидратазы, ингибитором кото рой является фенилаланин.
Детальный анализ путей синтеза фенилаланина и тирозина позволил об наружить у P. putida M редкий для прокариотических организмов путь превра щения фенилаланина в тирозин, осуществляемый ферментом фенил аланингидроксилазой, синтез которого, в свою очередь, является индуци бельным. Идентификация этого пути дала возможность разработать ориги нальную методику получения и отбора Phu--, Tyu-- и Tyr--мутантов данного штамма [6;
8;
9;
21;
23;
26;
27;
29;
32;
33;
45].
6. В ходе изучения биосинтетического потенциала метилотрофных бакте рий выявлены природные продуценты биологически активных соединений ароматической природы. Клетки облигатного метилотрофа M. mucogenes M экскретируют 2,3-диоксибензоат, выход которого составляет 180 мг/л. Показано, что это соединение выполняет функцию сидерофора, его синтез контролирует ся Fe3+-ионами, а также рядом производных хоризмата (n-аминобензоатом, n оксибензоатом и антранилатом).
Установлено, что факультативные метилотрофные бактерии P. putida M способны синтезировать флуоресцирующий пигмент пиовердин Рm. Анализ молекулярного строения пигмента позволил установить, что в его состав, поми мо ароматического (диоксихинолинового) ядра, входит пептид, включающий пять различных аминокислот: треонин, серин, лизин, аспарагиновую кислоту и N-оксиорнитин в молярном соотношении 3:2:1:1:1. По аминокислотному соста ву пиовердин Рm является уникальным и отличается от пигментов, синтезируе мых известными представителями Pseudomonas. Исследование физико химических свойств пиовердина Рm показало, что его спектр поглощения имеет два максимума (230 нм и 400 нм), при этом положение последнего зависит от рН среды. Продемонстрирована высокая степень сродства пигмента к Fe3+-ионам, а также ионам тяжелых металлов – Zn2+, Ni2+, Co2+, Sn2+, Cu2+, Cd2+, W6+ и Mo6+. Хе латирующая активность пиовердина Рm обеспечивает бактериям P. putida М ан тимикробную активность в отношении широкого спектра про- и эукариотиче ских микроорганизмов. Показано, что пиовердин Рm обладает высокой антиок сидантной активностью [19;
21;
24;
27;
28;
35;
39;
42;
43;
50;
51;
54;
55;
58;
60;
62;
63;
70;
74;
83].