Фитогормоны как регуляторы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды
На правах рукописи
ТАЛАНОВА Вера Викторовна ФИТОГОРМОНЫ КАК РЕГУЛЯТОРЫ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ ФАКТОРАМ СРЕДЫ 03.00.04 – биохимия 03.00.12 – физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Петрозаводск – 2009
Работа выполнена в лаборатории экологической физиологии растений Института биологии Карельского научного центра РАН
Научный консультант: член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Титов Александр Федорович
Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Жиров Владимир Константинович доктор биологических наук, профессор Шакирова Фарида Миннихановна доктор биологических наук Моралев Сергей Николаевич
Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН
Защита диссертации состоится 27 марта 2009 г. в ч на заседании Диссерта ционного Совета ДМ 212.087.02 при Карельском государственном педагогиче ском университете по адресу: Петрозаводск, ул. Пушкинская, 17.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Карельского государствен ного педагогического университета.
Автореферат разослан « » февраля 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук А.И. Малкиель
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Фитогормоны принимают активное участие в регуляции многих биохимических и физиологических процессов в растениях, осуществляя свои функции как в обычных (нормальных) условиях, так и при различных неблагоприятных воздействиях. Это особенно важно, поскольку в природных условиях растения постоянно или периодически подвергаются действию тех или иных неблагоприятных факторов внешней среды, в частно сти, абиотических. В последние годы глобальные изменения климата привели к усилению его нестабильности, выражающейся, в том числе, в резких перепа дах температуры. С другой стороны, постоянно возрастающая антропогенная нагрузка на природную среду приводит к увеличению количества засоленных территорий и к загрязнению окружающей среды тяжелыми металлами. В силу этого проблема устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды абиотической природы не только не потеряла своей остроты, но и за метно актуализировалась. Не случайно во многих странах мира ее активно изучают и к настоящему времени накоплен весьма обширный и разнообразный экспериментальный материал. Однако, несмотря на очевидные успехи, данная проблема все еще далека от окончательного решения.
Как показывают исследования, формирование устойчивости растений к неблагоприятным абиотическим факторам представляет собой сложный, мно гокомпонентный процесс, включающий как специфические, так и общие (не специфические) реакции (Титов и др., 1983;
2006, 2007;
Дроздов и др., 1984;
Александров, 1985;
Удовенко, 1979;
Кузнецов, 1992;
Шакирова, 2001;
Чирко ва, 2002;
Кузнецов, Дмитриева, 2006;
Гончарова, 2007;
Ершова, 2007;
Жиров и др., 2007). К числу последних относят, в частности, изменения баланса фито гормонов (Тарчевский, 2001;
Шакирова, 2001;
Чиркова, 2002). Фитогормоны, являясь важными компонентами регуляторной системы растений, могут играть ключевую роль не только в ростовых и морфогенетических процессах, но и в адаптивных реакциях, связанных с воздействием неблагоприятных факторов (Гуревич, 1979;
Кулаева, Чайлахян, 1984;
Кораблева, 1989;
Жолкевич, Пусто войтова, 1993;
Кудоярова, 1996;
Hare et al., 1999;
Полевой и др., 1997;
Шаки рова, 1999, 2001;
Чиркова, 2002;
Фархутдинов, 2005;
Gusta et al., 2005;
Ершова, 2007). Некоторые из них, и, прежде всего, стрессовые гормоны – абсцизовая кислота (АБК) и этилен – способны действовать как регуляторы, определяя от вет растительных клеток на неблагоприятные воздействия. Выявлению роли фитогормонов в регуляции устойчивости растений к действию абиотических факторов посвящено довольно большое число работ. Однако при этом недос таточно внимания уделяется их участию в повышении устойчивости растений в начальный период действия неблагоприятных факторов, хотя результаты ря да исследований указывают на то, что именно в этот период в клетках и тканях растительного организма могут происходить весьма важные, если не главные, события, во многом предопределяющие весь последующий ход формирования устойчивости (Титов и др., 2006). Поэтому изучение основных закономерно стей формирования устойчивости растений к действию неблагоприятных фак торов среды и участия фитогормонов в этом процессе является весьма важным аспектом данной проблемы.
Цель и задачи исследований. Цель работы состояла в выявлении участия и роли фитогормонов в физиолого-биохимических механизмах формирования повышенной устойчивости растений к действию неблагоприятных факторов среды абиотической природы.
Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:
1) исследовать основные закономерности формирования устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды абиотической природы (низкие и высокие температуры, хлоридное засоление, тяжелые металлы) в зависимо сти от интенсивности и продолжительности их действия, уделяя при этом осо бое внимание начальному периоду воздействия;
2) выявить специфическую и неспецифическую составляющие повыше ния устойчивости растений в ответ на действие неблагоприятных факторов среды абиотической природы на основании изучения характера изменения ус тойчивости к действию низких и высоких температур, засоления и тяжелых металлов в процессе кросс-адаптации;
особенностей некоторых физиолого биохимических реакций растений на действие разных стресс-факторов;
фор мирования повышенной устойчивости на фоне подавления биосинтеза белков;
3) изучить закономерности динамики эндогенного уровня АБК в период формирования повышенной устойчивости растений к действию неблагоприят ных факторов среды разной природы;
4) исследовать влияние экзогенной АБК на устойчивость растений к не благоприятным факторам среды разной природы;
5) изучить действие неблагоприятных факторов среды разной природы и АБК на экспрессию генов;
6) исследовать изменение эндогенного уровня ИУК в период формиро вания повышенной устойчивости растений к действию низких и высоких тем ператур и эффекты экзогенной ИУК на устойчивость;
7) установить влияние цитокининов на устойчивость растений к дейст вию неблагоприятных факторов среды.
Основные положения, выносимые на защиту:
1) Формирование повышенной устойчивости растений к неблагоприят ным факторам абиотической природы (низкие и высокие температуры, хло ридное засоление, тяжелые металлы) сопряжено с быстрым транзитным изме нением уровня отдельных фитогормонов и, в частности АБК, а также их ба ланса, что обеспечивает переключение клеток с программ нормального разви тия (ростовой и онтогенетической) на адаптивные, которое происходит уже в начальный период действия стрессора.
2) Изменения в гормональной системе, происходящие в начальный пери од действия на растения неблагоприятных факторов среды абиотической при роды, играют важную роль в неспецифическом (общем) повышении устойчи вости, благодаря которому растение получает возможность в случае пролонги рованного действия стрессора включить механизмы долговременной адапта ции и таким образом обеспечить свою выживаемость в этих условиях.
3) Участие стрессового гормона АБК в формировании повышенной ус тойчивости растений к неблагоприятным факторам абиотической природы связано как с его способностью оказывать регулирующее влияние на различ ные физиолого-биохимических процессы, так и с активацией экспрессии от дельных генов (в частности, контролирующих транскрипционный фактор CBF, RAB-белки, белки холодового шока).
4) Фитогормоны, наряду с генетической системой, играют ключевую роль в защитно-приспособительных реакциях растений на действие неблаго приятных факторов абиотической природы.
Научная новизна работы. Показана способность растений при действии одного из неблагоприятных факторов среды абиотической природы (низкая температура, высокая температура, хлоридное засоление, тяжелые металлы) повышать устойчивость к другим стресс-факторам, при этом впервые выявлен различный характер изменения устойчивости растений к нескольким факто рам: постоянное увеличение устойчивости к действующему стрессору и тран зитное – к другим факторам.
Впервые установлено, что значительные изменения эндогенного уровня АБК и ИУК в начальный период действия неблагоприятных факторов предше ствуют росту устойчивости растений, что свидетельствует об участии этих гормонов в ее формировании. Показано, что положительное влияние цитоки нинов на устойчивость растений обусловлено индукцией транзитного накоп ления АБК.
Впервые показана способность экзогенной АБК повышать устойчивость не только к действующему в данный момент на растение стрессору, но и одно временно к ряду других стресс-факторов.
Впервые выявлена зависимость между повышением устойчивости листь ев и уровнем АБК в них при локальном действии закаливающих температур на корневую систему растения.
Впервые обнаружено, что один из возможных молекулярных механиз мов индуцирования АБК устойчивости растений огурца к низкой и высокой температуре, а также к хлориду натрия связан с ее регуляцией экспрессии гена транскрипционного фактора CBF1.
Впервые показано, что механизмы повышения холодоустойчивости рас тений пшеницы под влиянием низкой закаливающей температуры связаны с активацией экспрессии гена транскрипционного фактора WRKY.
Впервые показано, что повышение холодоустойчивости растений пше ницы в начальный период действия низкой температуры связано с экспрессией АБК-зависимых генов (Wrab17 и Wrab19) и cor-генов (Wcor15 и Wcs120), а при более продолжительном ее действии – прежде всего с экспрессией генов Wcor15 и Wrab17.
Практическая значимость работы. Выявленные общие закономерности ре акции растений на действие неблагоприятных факторов среды разной природы и результаты исследования участия фитогормонов в процессах адаптации имеют важное значение для понимания принципов и механизмов формирова ния повышенной устойчивости, позволяющей противостоять этим воздействи ям. Данные о роли фитогормонов в регуляции устойчивости к действию низ ких и высоких температур, хлоридного засоления и тяжелых металлов расши ряют и углубляют представления о природе устойчивости и позволяют наме тить пути для поиска новых способов и методов ее повышения. Основные ре зультаты и выводы работы могут быть использованы при чтении курсов лек ций по экологической биохимии, физиологии растений, а также отдельных спецкурсов.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Междуна родных, всесоюзных и российских конференциях и симпозиумах: «Молеку лярные механизмы генетических процессов» (Москва, 1983, 1987), «Механиз мы криоповреждения и криозащиты биологических объектов» (Харьков, 1984), «Физиолого-биохимические механизмы регуляции адаптивных реакций расте ний и агроценозов» (Кишинев, 1984), «Экологическая генетика растений и жи вотных» (Кишинев, 1987), «Биологически активные вещества в сельском хо зяйстве» (Ленинград, 1988), «Конференция по регуляторам роста и развития растений» (Киев, 1989), «Иммуноферментный анализ регуляторов роста расте ний. Применение в физиологии растений и экологии» (Уфа, 1990), Съезд Все союзного общества физиологов растений (Минск, 1990), «Рhуsiоlоgу оf Absсisiс Aсid. 30 yеаrs оf Disсоvеrу» (Пущино, 1993), «Регуляторы роста и раз вития растений» (Москва, 1993, 1995, 1997), «Моlесulаr Rеsроnsеs оf Plаnts tо Biоtiс аnd Abiоtiс Strеssеs» (Хельсинки, 1994, 1996, 1997), «Физико химические основы физиологии растений и биотехнология» (Москва, 1997), «Биоиндикация и оценка повреждения организмов и экосистем» (Петроза водск, 1997), «Молекулярные механизмы стрессовых реакций у растений» (Москва, 1998), «Karelia and Norway: the Main Trends and Prospects of Scientific Cooperation» (Петрозаводск, 1998), «Биологические основы изучения, освоения и охраны животного и растительного мира, почвенного покрова Восточной Фенноскандии» (Петрозаводск, 1999), «Signalling Systems of Plant Cells» (Мо сква, 2001), «Plants under Environmental Stresses» (Москва, 2001), «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке» (Сыктывкар, 2001), «Карелия и РФФИ» (Петрозаводск, 2002), «Наземные и водные экосистемы Северной Европы: управление и охрана» (Петрозаводск, 2003), «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2003, 2005), «Проблемы физиологии растений Севера» (Петрозаводск, 2004), «Структурно функциональные особенности биосистем Севера (особи, популяции, сообще ства)» (Петрозаводск, 2005), «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), «Северная Европа в XXI веке: природа, культура, экономика» (Петрозаводск, 2006), VI Съезд Об щества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007);
XII Съезд Русского ботанического общества (Петрозаводск, 2008);
XVI Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (Тампере, Финляндия, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 60 работ, в том числе 2 монографии и 30 статей в рецензируемых журналах, входящих в пере чень изданий, рекомендуемых ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из вве дения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей 4 главы, за ключения, выводов и списка цитируемой литературы (595 работ, в том числе 416 иностранных). Работа изложена на 377 страницах, содержит 98 рисунков и 27 таблиц.
Работа выполнена в соответствии с планами НИР Института биологии КарНЦ РАН по темам № г.р. 01.86.0084488, 01.91.0022161, 01.94.0002678, 01.99.0008968, 01.20.0411718 при поддержке грантов РФФИ № 94-04-12981, 97-04-49209, 98-04-03516р, 00-04-48305, 02-04-97519р, 05-04-97515р, 06-04 49107.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность своему учите лю чл.-корр. РАН А.Ф. Титову за постоянную и неоценимую поддержку, по мощь и внимание, оказываемые на всех этапах выполнения диссертационной работы. Автор искренне признательна всем сотрудникам лаборатории эколо гической физиологии растений, а также сотрудникам группы молекулярной биологии Л.В. Топчиевой и И.Е Малышевой за помощь в проведении экспери ментов. Особую благодарность автор выражает чл.-корр. РАН Н.Н. Немовой за всестороннюю подержку и ценные советы.
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объекты исследований. В качестве объектов исследований использовали растения озимой пшеницы (Тritiсum аеstivum L.) сортов Мироновская 808 и Московская 39, ячменя (Hordeum vulgare L.) сорта Отра, огурца (Сuсumis sаtivus L.) сортов Алма-Атинский 1 и Зозуля, сои (Glycine max [L.] Merr.) сор тов Амурская 310, Бурые масличные, Венгерка, Волна, Гизо, Добруджанка 18, Кубанская 4958, Ранняя 10 и Чиатурская, томата (Lycopersicon esculentum Mill.) сортов Московский осенний 3405 и Грунтовый Грибовский 1180.
Выращивание растений проводили в течение 7–14 сут на модифициро ванном питательном растворе Кнопа (рН 6.2–6.4) в рулонах фильтровальной бумаги (или в керамических сосудах с песком) в камере искусственного кли мата при постоянных условиях среды: температуре воздуха 22–25°С (в зави симости от объекта), его относительной влажности 60–70%, интенсивности света 170 мкмоль фотонов м-2·с-1 и фотопериоде 14 ч.
Действие низких и высоких температур на растения осуществляли в каме рах искусственного климата, сохраняя прочие условия неизменными. Локаль ное действие температуры 38°С на побег или корни растений осуществляли в специально сконструированной установке.
Хлоридное засоление создавали, помещая растения на растворы NaCl от 17 мМ до 1.38 М (сохраняя прочие условия неизменными).
Воздействие тяжелых металлов на растения проводили, помещая их на растворы CdBr2.4H2O или Pb(NO3)2 в концентрациях от 0.001 до 20 мМ.
Комбинированное действие стресс-факторов на растения проводили по следующим схемам: холодовое закаливание тепловое закаливание, холодо вое (тепловое) закаливание действие NaCl, холодовое (тепловое) закалива ние действие Pb(NO3)2.
Обработку растений фитогормонами проводили, помещая их на растворы АБК (Serva, Sigma, IСN), синтетических аналогов цитокинина – кинетина (КИН) и 6-бензиламинопурина (БАП) (IСN), ИУК (Colnbrook Bucks, IСN).
Обработку растений ингибиторами транскрипции и трансляции проводи ли, помещая их на растворы актиномицина Д (АКТ), циклогексимида (ЦГ) и хлорамфеникола (ХФ).
Устойчивость растений к низким и высоким температурам оценивали по реакции клеток высечек из листьев на тестирующее промораживание в микро холодильнике ТЖР-0.2/-20 («Интерм») (Дроздов и др., 1976) или прогрев в водном термостате (Александров, 1963). В качестве критерия устойчивости служила температура (ЛТ50), при которой в 50% клеток паренхимы листа на блюдали деструкцию хлоропластов и коагуляцию цитоплазмы с помощью све тового микроскопа. Теплоустойчивость корня оценивали по температуре (ЛТ50) гибели 50% клеток эпидермиса после прогрева в водном термостате (Балагурова и др., 1999). В ряде опытов устойчивость оценивали по выживае мости растений после их тестирующего охлаждения или прогрева.
Устойчивость растений к засолению оценивали по величине осмотическо го давления раствора NаСl (ЛОД50), вызывающего гибель 50% клеток листа (Балагурова и др., 2001), а в ряде опытов – по выживаемости растений.
Устойчивость растений к действию тяжелых металлов оценивали по их выживаемости, изменению линейных размеров корней и побегов, накоплению биомассы.
Содержание фитогормонов в растениях определяли с помощью твердо фазного иммуноферментного анализа (Кудоярова и др., 1986, 1990;
Veselov et al., 1992).
Оводненность тканей анализировали весовым методом, высушивая расти тельные образцы в термостате до постоянного веса при 105°С.
Интенсивность транспирации, устьичную проводимость и интенсивность СО2-газообмена листьев регистрировали с помощью портативной фотосинте тической системы НСМ-1000 («Walz»).
Содержание хлорофиллов и каротиноидов в листьях определяли спектро фотометрически после их экстракции 80%-ным ацетоном (Шлык, 1971).
Интенсивность дыхания листьев определяли манометрически в аппарате Варбурга по поглощению О2 (Семихатова, Чулановская, 1965).
Содержание растворимых белков в листьях анализировали спектрофото метрически после окрашивания Кумасси G-250 (Serva) (Bradford, 1976).
Содержание свободного пролина в листьях растений определяли по мето ду Л. Бейтс с соавт. (Bates et al., 1973).
Экспрессию генов транскрипционных факторов и стрессовых белков изучали после выделения из листьев растений тотальной РНК с помощью набора AquaPure RNA Isolation Kit (Bio-Rad) и обработки ДНКазой (Силекс).
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в режиме реального времени проводили на приборе iQ5 (Bio-Rad), используя набор iScript One-Step RT-PCR Kit, в котором ПЦР совмещена с обратной транскрипцией. Для ПЦР использовали прямой и обратный праймеры (Синтол): Wcor15 – GGGAGCAACCTCTTCCATAGTGT и CCAACCATCACAACCCTTCACTA;
Wrab1 – CGGGATGGGAGGAGACAAGTGAG и GGAATAGCGAAACAGAAGGAGGG;
Wrab – CAACCAGAACCAGGCGAGCTACG и CGGCTGTCTCTACGGCCTTCTGCTT;
Wcs – CACGGCACTGGCGAGAAGAAAGG и TGATGTTCTCCATGACGCCCTTC;
WRKY – CCGTTCAAGCCCAACAAGAAGAGG и CGAGGATGTCCTTCTGGCCGTAC;
CBF1 – TGTTTGGGATGCCGACTTTGTTG и GTCACCATCTCCTTCGCCGTCAT;
Actin – GGGACCTCACGGATAATCTAATG и AACCTCCACTGAGAACAACATTAC. Условия ПЦР: синтез кДНК 10 мин при 50°С, инактивация обратной транскриптазы мин при 95°С, 40 циклов ПЦР: денатурация 10 с при 95°С, отжиг праймеров и элонгация цепи 30 с при 55°С. Специфичность продукта проверяли плавлением амплифицированных фрагментов ДНК.
Повторности и статистическая обработка данных. Повторность в пределах отдельного варианта 3–6-кратная (20–60-кратная – при анализе ростовых пока зателей и выживаемости). Каждый опыт повторяли не менее 3 раз. Обработку экспериментальных данных проводили с помощью общепринятых методов ва риационной статистики, используя программу Microsoft Excel. Достоверность различий оценивали на основании t-критерия Стьюдента. В таблицах и на ри сунках приведены средние арифметические значения и их стандартные ошиб ки. В работе обсуждаются величины, достоверные при P0,05.
3. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ И ВАРЬИРОВАНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ ФАКТОРАМ СРЕДЫ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ИНТЕНСИВНОСТИ И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ИХ ДЕЙСТВИЯ Растения в период активной вегетации часто подвергаются воздействию различных неблагоприятных факторов окружающей среды абиотической при роды, таких как низкие или высокие температуры, засуха, гипоксия, засоление, тяжелые металлы, ионизирующее излучение, что приводит к замедлению их роста и развития, а иногда и гибели. В ответ на экстремальные воздействия в растениях происходят разнообразные перестройки биохимических и физиоло гических процессов, направленные на адаптацию организма к новым условиям и повышение устойчивости.
Низкие и высокие температуры Устойчивость растений к действию низких и высоких температур варьи рует в довольно широких пределах в зависимости от объекта (генотипа) и ус ловий окружающей среды, прежде всего, температурных (Александров, 1975, 1985;
Трунова, 1979, 2007;
Титов и др., 2006). Проведенное нами исследование холодоустойчивости растений в процессе холодового закаливания позволило установить, что заметное ее повышение у устойчивых к низким температурам видов (пшеница) происходит уже через 1 сут от начала их действия, а макси мальных значений она достигает через 5 сут (табл. 1). Сходные изменения ус тойчивости отмечены и у теплолюбивых видов (томат, огурец), с той лишь разницей, что процесс холодовой адаптации занимал у них меньше времени, как правило, 3–4 дня.
Таблица 1. Особенности формирования холодо- и теплоустойчивости растений при действии низких и высоких закаливающих температур Устойчивость, % от максимального Тем прироста Вид, сорт пера продолжительность закаливания, ч тура 3 9 24 72 2°С 0 25 620 90 Пшеница с. Мироновская 808* 40°С 38 82 100 100 10°С 0 20 38 100 Огурец с. Алма-Атинский 1* 38°С 65 96 100 100 8°С 0 18 44 86 Томат с. Московский осенний 3405** 40°С 41 90 100 100 Соя с. Чиатурская*** 40°С 100 100 100 100 * – фаза проростков,** – фаза 3-х настоящих листьев,***– фаза простых листьев.
Характер изменения теплоустойчивости растений при действии высоких закаливающих температур оказался сходным с изменением холодоустойчиво сти при холодовом закаливании, однако для достижения максимального уров ня устойчивости в первом случае обычно требовалось несколько часов (табл.
1). У всех изученных видов скорость закаливания и уровень достигаемой ус тойчивости в значительной степени зависят от интенсивности и продолжи тельности температурного воздействия, а также от видовых и сортовых осо бенностей растений. В целом процесс формирования устойчивости растений под влиянием низких температур, как правило, завершается в течение несколь ких дней, а при действии высоких температур – в течение нескольких часов.
Повышение холодо- и теплоустойчивости растений сопровождалось из менением интенсивности темнового дыхания листьев, снижением скорости нетто-фотосинтеза, некоторым снижением оводненности листьев, изменением концентрации хлорофиллов, накоплением водорастворимых белков (данные в диссертации). Полученные результаты позволяют сделать вывод, что характер изменения устойчивости и физиолого-биохимических показателей (и процес сов) обусловлен реализацией у растений под влиянием закаливающих темпе ратур адаптивых программ, направленных на повышение устойчивости.
Хлоридное засоление Засоление почв вызывает подавление роста и развития растений, наруше ние многих физиологических и биохимических процессов, что приводит к снижению их продуктивности и даже гибели (Строгонов, 1983;
Moons, 2003).
Токсическое действие засоления на растения в значительной степени опреде ляется его дозой. Нами установлено, что обработка проростков огурца хлори дом натрия в концентрации 0,8–1% вызывала резкое снижение их выживаемо сти. У проростков пшеницы негативное действие NaCl проявлялось при более высоких концентрациях. Степень воздействия NaCl зависела от его продолжи тельности: обработка 0,9%-ным NaCl в течение 1–6 ч практически не влияла на выживаемость проростков огурца, а 2–3-суточная экспозиция приводила к их полной гибели (рис. 1). Сходные данные получены на пшенице. Таким обра зом, характер реакции проростков пшеницы и огурца на засоление оказался однотипным, но пшеница отличалась более высокой устойчивостью.
Рис.1. Влияние NaCl на выживаемость пророст ков огурца с. Алма Атинский 1 (А) и пше ницы с. Мироновская 808 (Б). Концентрация NaCl: 1 – 0.9, 2 – 1.6, 3 – 4.5, 4 – 6.5%. Здесь и да лее бары у оси ординат:
НСР05 (наименьшая су щественная разность).
Тяжелые металлы Тяжелые металлы относятся к числу наиболее опасных химических ве ществ, которые даже в небольших количествах способны оказывать токсиче ское действие. Установлено, что свинец и кадмий ингибируют рост корней и надземной части растений, накопление их биомассы, а в высоких концентра циях – приводят к их гибели. Токсический эффект металлов усиливался с уве личением их концентрации, причем был заметно большим у кадмия, чем у свинца (табл. 2).
Таблица 2. Влияние тяжелых металлов на выживаемость растений ячменя с. Отра Выживаемость проростков, % Металл концентрация, мМ 0 3 6 12 18 Свинец 100 100 100 75±11 56±6 5± Кадмий 100 73±6 50±8 8±3 0 Отмеченное более значительное ингибирование роста корней, чем побе гов при действии тяжелых металлов связано с их преимущественным накопле нием в корнях. Например, нами показано, что в корнях щетинника зеленого аккумулируется 85–92% свинца (Лайдинен и др., 2004).
Действие свинца и кадмия в неповреждающих концентрациях сопровож далось снижением транспирации и интенсивности фотосинтеза растений огур ца, накоплением в тканях листьев водорастворимых белков и свободного про лина – осморегулятора, защищающего белки от денатурации, что указывает на активизацию защитных механизмов. Кроме того, результаты изучения реакции растений огурца, пшеницы и ячменя на последовательное действие кадмия или свинца в низких и высоких концентрациях показали, что под влиянием низких концентраций металла у растений происходит активизация адаптивных про цессов, в результате чего формируется повышенная устойчивость, позволяю щая им переносить без губительных последствий действие более высоких кон центраций металла (данные в диссертации). Таким образом, в зависимости от дозы воздействия тяжелые металлы или не оказывают влияния на растения, или вызывают стимуляцию их защитных механизмов, или, действуя в высоких концентрациях, приводят к повреждению их клеток и тканей.
В целом, в реакции растений на действие неблагоприятных факторов сре ды абиотической природы (низкие и высокие температуры, хлоридное засоле ние, тяжелые металлы) природы выявлены общие закономерности, указываю щие на зависимость характера ответа от дозы воздействия. При этом обнару жен целый ряд сходных физиолого-биохимических изменений, происходящих в растениях при действии различных стресс-факторов и, очевидно, играющих важную роль в процессах формирования повышенной устойчивости.
4. СПЕЦИФИЧЕСКОЕ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЕ ПОВЫШЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ В ОТВЕТ НА ДЕЙСТВИЕ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ РАЗНОЙ ПРИРОДЫ Сравнительное изучение природы адаптивных реакций растений на дей ствие различных стресс-факторов указывает на существование как общих (не специфических), так и специализированных механизмов устойчивости к ним (Удовенко, 1979;
Титов и др., 1983;
1989;
Кузнецов и др., 1990). В пользу функционирования общих механизмов свидетельствуют данные о том, что действие одного неблагоприятного фактора может приводить к повышению устойчивости к другому фактору (Кислюк, 1962;
Александров, 1975;
Дроздов и др., 1984;
Кузнецов и др., 1990). Это явление, названное «кросс-адаптацией», известно довольно давно (Hale, 1969), однако до сих пор его механизмы оста ются неясными (Sabehat et al., 1998;
Кузнецов, Дмитриева, 2006).
Кросс-адаптация растений к действию неблагоприятных факторов среды разной природы Наши исследования показали, что растение реагирует на действие стресс фактора в неповреждающей дозе повышением устойчивости не только непо средственно к нему, но и к ряду других стрессоров. Например, у пшеницы низ кая закаливающая температура 2°С в начальный период воздействия помимо повышения холодоустойчивости индуцирует рост устойчивости к высокой температуре, хлориду натрия и свинцу (рис. 2). С увеличением продолжитель ности низкотемпературного воздействия характер изменения этих видов ус тойчивости различался: холодоустойчивость продолжала возрастать и дости гала максимума на пятые сутки закаливания, в то время как устойчивость к действию высокой температуры, NaCl и Pb2+ постепенно снижалась.
Рис. 2. Влияние холодового (2°С) и теплового (40°С) закаливания на холодо- (1), теп ло- (2), соле- (3) и металлоустойчивость (4) проростков пшеницы с. Мироновская Высокая закаливающая температура (40°С) вызывала не только увеличе ние теплоустойчивости, но и в начальный период действия – повышение холо до-, соле- и металлоустойчивости (рис. 2). В дальнейшем на фоне стабильно высокого уровня теплоустойчивости, сохраняющегося до конца эксперимента, холодо-, соле- и металлоустойчивость снижались. Следует отметить, что дей ствие NaCl и соли свинца, в свою очередь, приводило к кратковременному по вышению холодо- и теплоустойчивости растений.
Таким образом, при действии стресс-факторов повышение устойчивости растений к ним в ряде случаев имело постоянный характер (например, холодо устойчивости при действии охлаждения), а в других – кратковременный, тран зитный характер (холодоустойчивости при действии высокой температуры, NaCl, свинца). Это позволяет считать, что повышение устойчивости растений в первом и втором случаях связано с разными механизмами.
Сходные результаты получены при комбинированном (последовательном) действии стресс-факторов разной природы (данные в диссертации). Так, не продолжительная тепловая предобработка или холодовая предобработка суще ственно ускоряли процесс формирования повышенной устойчивости при по следующей адаптации растений к холоду или теплу, соответственно. Кратко срочное воздействие низких или высоких температур способствовало повыше нию резистентности растений к ионам свинца, а краткосрочное действие ионов свинца вызывало увеличение теплоустойчивости проростков. Длительная пре добработка как солью свинца, так и низкой или высокой температурой приво дила к снижению устойчивости. Приведенные результаты свидетельствуют в пользу функционирования общих механизмов устойчивости к действию свин ца и неблагоприятных температур. Поскольку защитная реакция наблюдается лишь при краткосрочном воздействии первого из факторов, то можно заклю чить, что неспецифические механизмы устойчивости функционируют лишь в начальный период их действия. На более поздних этапах, по-видимому, вклю чаются специфические механизмы устойчивости, которым, очевидно, принад лежит определяющая роль в формировании и поддержании адаптированного состояния растений к тому или иному стрессу. В частности, к специфическим механизмам адаптации к действию тяжелых металлов могут быть отнесены: их связывание металлотионеинами и фитохелатинами (Титов и др., 2007).
Формирование устойчивости растений к действию неблагоприятных температур на фоне ингибирования синтеза белка Важную роль в механизмах повышения устойчивости растений к неблаго приятным факторам среды играют изменения в экспрессии генов и, соответст венно, прекращение (снижение) синтеза обычных белков и индукция так назы ваемых стрессовых белков (Thomashow, 1998;
Войников и др., 2004). Учиты вая это, нами с использованием ингибиторов транскрипции и трансляции, бло кирующих повышение устойчивости (Трунова, Зверева, 1977;
Титов и др., 2002), изучена зависимость между процессом формирования устойчивости растений и активностью белоксинтезирующей системы.
Показано, что ингибитор транскрипции АКТ (табл. 3), а также ингибито ры трансляциии ЦГ и ХФ препятствовали повышению устойчивости растений при действии на них низких и высоких закаливающих температур. Как следует из полученных данных, формирование повышенной холодоустойчивости рас тений при низкой температуре и теплоустойчивости при высокой температуре связано с активностью белоксинтезирующей системы и синтезом белков de novo.
Таблица 3. Влияние АКТ (2 мг/л) на холодо- и теплоустойчивость проростков томата с. Московский осенний 3405 при действии низкой и высокой температур Устойчивость клеток листа к 5- Устойчивость клеток листа к Вариант мин промораживанию (ЛТ50), °С 5-мин прогреву (ЛТ50), °С контроль АКТ контроль АКТ 25°С, 1 сут -6,5±0,05 -6,5±0,04 52,0±0,06 52,0±0, 8°С, 3 сут -7,8±0,08 -6,8±0,10 53,2±0,05 53,3±0, 40°С, 1 сут -7,1±0,04 -7,1±0,07 58,8±0,09 53,5±0, Напротив, рост холодоустойчивости при высокой закаливающей темпера туре, а также теплоустойчивости при низкой закаливающей температуре не за висит (или зависит в незначительной степени) от активности белоксинтези рующей системы, поскольку их уровень при обработке растений АКТ не отли чался от контрольного варианта (закаливание без АКТ) (табл. 3).
Подобного рода данные рассматриваются нами как подтверждение воз можности функционирования у растений специфических и неспецифических механизмов устойчивости к действию стресс-факторов разной природы. Судя по полученным результатам и данным литературы, специфическое реагирова ние на действие экстремальной температуры связано с экспрессией генов и синтезом соответствующих стрессовых белков, хотя при охлаждении и нагреве могут индуцироваться не только специфические, но и одинаковые белки (Вой ников и др., 1987;
Кузнецов и др., 1987;
Sabehat et al., 1998;
Rizhsky et al., 2002). Неспецифическое реагирование проявляется в первую очередь в на чальный период действия стресс-факторов. На более поздних этапах адапта ции, когда включается механизм специфического реагирования, происходит постепенное снижение неспецифической устойчивости. Следовательно, наи более важным может оказаться вклад неспецифических реакций в адаптацию именно в начальный период действия абиотических факторов.
5. АБСЦИЗОВАЯ КИСЛОТА КАК ГОРМОН СТРЕССА И ЕЕ УЧАСТИЕ В МЕХАНИЗМАХ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К ДЕЙСТВИЮ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ РАЗНОЙ ПРИРОДЫ В исследованиях реакции растений на действие различных неблагоприят ных факторов среды особое место принадлежит абсцизовой кислоте (Косаков ская, Майдебура, 1989;
Шакирова, 2001;
Чиркова, 2002), в частности, показано ее накопление под влиянием обезвоживания (Cowan et al., 1995), засоления (Moons et al., 1997), низких (Janowiak et al., 2002) и высоких температур (Фар хутдинов, 2005). Наше внимание было сосредоточено на одновременном изу чении содержания АБК в растениях и их устойчивости прежде всего в началь ный период действия неблагоприятных факторов разной природы.
Изменение уровня эндогенной АБК в растениях и их устойчивости при действии неблагоприятных факторов среды Низкие температуры. Сравнительное изучение динамики содержания эн догенной АБК у контрастных по отношению к температурному фактору видов растений, с одной стороны, и динамики их устойчивости к низким температу рам, с другой стороны, позволило установить, что закаливающие температуры, оптимальные для формирования повышенной устойчивости холодостойкого (пшеница) и теплолюбивого (огурец) видов растений, вызывали значительное накопление свободной АБК в тканях листьев уже в начальный период их дей ствия. Так, содержание АБК в листьях пшеницы при действии температуры 2°С возрастало уже через 1–8 ч холодового закаливания и продолжало увели чиваться (после снижения к концу первых суток) в течение 3 сут, а затем сни жалось (рис. 3). Что касается холодоустойчивости, то ее заметный прирост на блюдали через 8–24 ч от начала закаливания и затем она возрастала и достига ла максимума на 4–5 сут (рис. 3). Под влиянием кратковременного воздействия температуры 10°С в листьях проростков огурца также наблюдалось значитель ное увеличение содержания АБК, которое было временным, транзитным и в дальнейшем (на 5 сут) происходило его возвращение к исходному значению, в то время как устойчивость оставалась на достигнутом уровне.
Следовательно, формирование холодоустойчивости как у холодостойких, так и у теплолюбивых растений под влиянием низких закаливающих темпера тур сопровождается достаточно быстрым накоплением АБК в листьях. Причем наблюдаемое повышение содержания гормона в листьях в начальный период холодовой адаптации опережало по времени рост устойчивости растений. Не обходимо подчеркнуть и еще один важный момент. После довольно быстрого и значительного повышения уровня эндогенной АБК в листьях растений в дальнейшем происходило его постепенное снижение, хотя устойчивость при этом продолжала возрастать. Таким образом, полученные нами данные свиде тельствуют о быстром, но временном, транзитном возрастании уровня свобод ной АБК в листьях растений при действии низких закаливающих температур, в отличие от постоянного (монотонного) повышения холодоустойчивости в этих условиях. По-видимому, обнаруженное нами накопление АБК, предшествую щее повышению холодоустойчивости, может служить в качестве триггера для последующего процесса адаптации растений к низким температурам.
Рис. 3. Динамика холодоустойчивости листьев и содержания в них свободной АБК при действии низких закаливающих температур на проростки пшеницы с. Миронов ская 808 (А) и огурца с. Алма-Атинский 1 (Б) Таким образом, формирование повышенной устойчивости к низким тем пературам как холодостойкого, так и теплолюбивого видов растений связано со значительным возрастанием уровня АБК в их листьях.
Высокие температуры. При тепловом закаливании проростков пшеницы содержание АБК в листьях уже через 10 мин от начала действия температуры 40°С возрастало примерно в 2 раза, продолжало увеличиваться в течение пер вых 2 ч закаливания, а спустя 7 ч температурного воздействия – снижалось (рис. 4). В этом случае первоначальное повышение теплоустойчивости проро стков наблюдали только через 1–2 ч закаливания, и в дальнейшем она возрас тала в течение 7 ч. Таким образом, увеличение содержания АБК предшество вало повышению теплоустойчивости проростков пшеницы, наблюдаемому в начальный период закаливания, а следовательно, формирование повышенной устойчивости при действии закаливающих температур связано с быстрым на коплением этого гормона. Сходные результаты получены на огурце.
Рис. 4. Динамика теплоус тойчивости листьев и со держания в них свобод ной АБК при действии высоких закаливающих температур на проростки огурца с. Алма-Атинский 1 (А) и пшеницы с. Миро новская 808 (Б) Быстрое возрастание уровня свободной АБК в растениях может быть обу словлено как ее высвобождением из связанных форм (Веселов, 2001), так и усилением ее биосинтеза (Taylor et al., 2000). Как показали наши исследования, предобработка проростков огурца АКТ или ЦГ до начала воздействия темпе ратуры 38°С не только подавляет процесс тепловой адаптации, но и блокирует индуцируемое тепловой закалкой накопление АБК в листьях (рис. 5). Следова тельно, можно полагать, что в этом случае ингибиторы транскрипции и транс ляции подавляют биосинтез ферментов, участвующих в биосинтезе АБК, что приводит к снижению ее аккумуляции и соответственно перестройке метабо лизма, индуктором которой она выступает.
В целом, быстрое и значительное возрастание уровня АБК в растениях в начальный период действия высоких закаливающих температур позволяет сделать вывод об участии этого гормона в формировании теплоустойчивости.
При этом АБК проявляет себя как триггер, запускающий процесс повышения устойчивости.
Рис. 5. Влияние АКТ и ЦГ на теплоустойчивость листьев (А) проростков огурца с.
Алма-Атинский 1 и содержание свободной АБК (Б) в них при действии температуры 38°С. 1 – контроль (без ингибитора), 2 – АКТ (2 мг/л), 3 – ЦГ (0,8 мг/л).
Хлоридное засоление. Установлено, что воздействие NaCl в субповреж дающей (150 мМ) и повреждающей (265 мМ) концентрациях в течение 1–6 ч приводило к значительной аккумуляции свободной АБК в листьях проростков огурца (рис. 6). Продолжительная экспозиция растений в условиях засоления снижала их выживаемость и уровень АБК, особенно при более высокой кон центрации. Из этого следует, что устойчивость огурца к непродолжительному действию хлоридного засоления связана с повышенным уровнем АБК.
Рис. 6. Влияние NaCl на выживаемость проростков (А) огурца с. Алма-Атинский 1 и содержание свободной АБК в их листьях (Б). Концентрация NaCl: 1 – 150, 2 – 265 мМ.
Необходимо подчеркнуть, что накопление АБК в проростках огурца при действии засоления было временным, а в дальнейшем происходило его сниже ние. Очевидно, что и при действии засоления на растения АБК проявляет себя или в качестве триггера, запускающего процессы формирования повышенной устойчивости, или в качестве одного из непосредственных участников, обес печивающих увеличение устойчивости в первые часы воздействия этого фак тора.
Тяжелые металлы. Воздействие на проростки огурца кадмия и свинца в концентрациях, не вызывающих их повреждения, приводило к значительному увеличению содержания свободной АБК в листьях в течение 1–4 ч. Отметим, что в начальный период действия тяжелых металлов они еще не проникали в листья, и их влияние на уровень АБК было опосредованным. В то же время при более длительном воздействии CdBr2 на проростки огурца содержание АБК в их листьях также оставалось на довольно высоким уровне (рис. 7).
Рис. 7. Влияние ионов свинца (А) и кадмия (Б) на содержание свобод ной АБК в листьях про ростков огурца с. Алма Атинский 1. Концентра ция Pb(NO3)2 – 0,1 мМ, CdBr2 – 0,05 мМ.
Полученные результаты позволяют предполагать, что отмеченное нами повышение уровня АБК в листьях и корнях связано с адаптивными реакциями растений на воздействие тяжелых металлов. В пользу этого свидетельствуют и результаты экспериментов, проведенных с использованием постепенно повы шающихся концентраций тяжелых металлов, в которых формирование устой чивости растений огурца к возрастающему действию свинца и кадмия корре лировало с аккумуляцией эндогенной АБК (данные в диссертации).
Таким образом, накопление эндогенной АБК в листьях растений в ответ на воздействие свинца и кадмия можно рассматривать в качестве одного из индукторов перестройки метаболизма, направленной на повышение устойчи вости растений к тяжелым металлам.
Локальное действие неблагоприятных температур. Действию неблагопри ятных факторов среды зачастую подвергается не все растение, а лишь его от дельные органы (части), хотя это может отражаться на функционировании других органов (частей), не испытавших такого воздействия (Моторина и др., 1964;
Кудоярова и др., 1999;
Митриченко, 1999). Ранее было показано, что действие высоких закаливающих температур на корневую систему или над земную часть растения индуцирует изменение устойчивости клеток не только прогретых органов, но и органов, которые непосредственно не подвергались прогреву (Акимова и др., 1991). Учитывая это, нами изучена динамика содер жания АБК в листьях и корнях проростков огурца и их устойчивости при ло кальном действии высокой температуры.
Полученные результаты показали, что прогрев листьев при 38°С вызывал у них не только повышение теплоустойчивости, но и уровня АБК (рис. 8). Вы сокая скорость накопления АБК, наблюдаемая в начальный период прогрева, свидетельствует о вовлечении этого гормона в процесс формирования повы шенной устойчивости листьев. Однако в дальнейшем содержание АБК в ли стьях снижалось, хотя их устойчивость продолжала возрастать. Очевидно, АБК в листьях проявляла себя как триггер, запускающий процесс повышения устойчивости, а в дальнейшем он развивался независимо от уровня гормона.
Прогрев корней, в отличие от листьев, вызывал повышение уровня АБК в их тканях, но приводил к снижению их теплоустойчивости. Из этого следует, что АБК не индуцирует повышения устойчивости корней.
Сравнение реакции листьев на прогрев корней, с одной стороны, и реакции корней на прогрев листьев, с другой, показало следующее. Локальный прогрев корней (рис. 8) вызывал в листьях те же изменения, что и прогрев самих листьев: временное повышение уровня АБК и монотонно нарастающее увеличение теплоустойчивости. Следовательно, прогретые корни направляли в побег какой-то сигнал о ее повышении, хотя теплоустойчивость самих корней снижалась. Прогрев листьев хотя и не повышал теплоустойчивость корней, но и не вызывал ее снижения, при этом содержание АБК в корне возрастало. Оче видно, прогретые листья посылали в корни сигнал к их адаптации, которая бы ла меньше, чем в листьях и выражалась не в повышении устойчивости, а толь ко в ее стабилизации. Функцию дистанционного сигнала при локальном дейст вии температуры может выполнять электрический (Ретивин, Опритов, 1993) или гидравлический импульс (Полевой и др., 1997), который предшествует гормональному ответу.
Рис. 8. Влияние прогрева (38°С) надземной части (А, Б) и корне вой системы (В, Г) проростков огурца с. Алма Атинский 1 на содержание АБК (1) в листьях (А, В) и корнях (Б, Г) и их теплоус тойчивость (2) Полученные результаты согласуются с имеющимися сведениями о быст ром изменении уровня АБК в одних органах растения в ответ на действие вы сокой (или низкой) температуры на другие его органы (Полевой и др., 1997;
Фархутдинов, 2005). Таким образом, наши данные свидетельствуют о быстрых и значительных колебаниях уровня эндогенной АБК в растениях при локаль ном действии температуры, что указывает на существование у них оператив ного механизма, обеспечивающего изменения содержания этого гормона.
Таким образом, можно заключить, что быстрое повышение уровня АБК в листьях проростков огурца не только при их прогреве, но и при действии вы сокой температуры на корни выступает в качестве фактора, участвующего в формировании теплоустойчивости листьев. Кроме того, быстрые изменения уровня АБК, наблюдаемые в органах (частях) проростка, пространственно удаленных от места локального действия неблагоприятной температуры, под тверждают важную роль этого гормона в интеграции защитно приспособительных реакций в системе целого растения.
Резюмируя представленные в данном разделе результаты, считаем, что накопление АБК в растениях под влиянием неблагоприятных факторов среды может служить универсальным «сигналом тревоги», не зависящим от природы стрессора. Различные стресс-факторы (низкие и высокие температуры, хло ридное засоление, тяжелые металлы) вызывают однотипные изменения уровня эндогенной АБК. Поскольку ее накопление в листьях растений происходит в начальный период действия указанных стрессоров, логично предположить, что рост устойчивости при действии каждого из них связан в той или иной мере с повышенным уровнем этого гормона. По-видимому, быстрое повышение уровня АБК представляет собой неспецифическую защитно приспособительную реакцию, имеющую важное значение для процессов адап тации растений. Вместе с тем, обращает на себя внимание тот факт, что воз растание уровня эндогенной АБК в растениях при действии различных по сво ей природе стресс-факторов носит транзитный характер. По-видимому, проис ходящие сдвиги в уровне АБК вносят свой вклад не только в процессы адапта ции в начальный период действия стресс-факторов, но и в переключение функциональной активности клеток на так называемые «адаптивные програм мы», действующие на более поздних этапах этого процесса.
Влияние экзогенной АБК на устойчивость растений к действию неблагоприятных факторов среды Влияние АБК на устойчивость при действии низких и высоких темпера тур. При изучении механизмов действия фитогормонов использование экзо генных гормонов, благодаря простоте и эффективности этого приема, делает его удобным инструментом при решении различных задач (Кулаева, 1973). В исследованиях роли АБК как возможного индуктора устойчивости растений к неблагоприятным температурам основное внимание исследователей было на правлено на изучение защитного действия экзогенной АБК при низких (Rikin et al., 1979) и высоких (Gong et al., 1998) повреждающих температурах. Однако не меньший интерес представляют данные, показывающие возможность мо дификации с помощью АБК холодового закаливания (Chen et al., 1983). Кроме того, к началу нашей работы практически ничего не было известно относи тельно влияния АБК на устойчивость растений к высоким температурам. Учи тывая это, нами проведено изучение влияния экзогенной АБК на холодо- и те плоустойчивость растений в условиях холодового и теплового закаливания.
На растениях томата показано, что эффекты АБК не зависят от срока ее введения в растения и, следовательно, от уровня их устойчивости. Например, обработка проростков АБК до закаливания, в ходе этого процесса (через 6 ч после его начала) или по его завершению (через 3 сут) приводила к одинако вому результату: повышению устойчивости независимо от того, был ли уже достигнут к этому времени максимальный ее уровень в контроле (закалка без АБК) или процесс повышения устойчивости еще продолжался (рис. 9). Таким образом, экзогенная АБК не только эффективна в отношении незакаленных растений, но и способна индуцировать дополнительный прирост устойчивости в той или иной степени адаптированных растений.
Рис. 9. Динамика тепло- и холодоустойчивости проростков томата с. Московский осенний 3405 при температуре 40°С в зависимости от сроков обработки АБК. К – контроль (без АБК), АБК – 0.1 мМ. Начало экспозиции с АБК обозначено стрелкой: А – за 6 ч до закаливания, Б – через 6 ч, В – через 3 сут после начала закаливания.
Принимая во внимание, что адаптация растений при холодовом закали вании сопровождается увеличением теплоустойчивости, а при тепловом зака ливании – ростом холодостойкости, мы изучали влияние АБК на теплоустой чивость при холодовом закаливании и на холодоустойчивость при тепловом закаливании, поскольку можно было ожидать, что обработка растений гормо ном будет одновременно индуцировать рост холодо- и теплоустойчивости при холодовом и тепловом закаливаниях. Проведенные эксперименты подтвердили это предположение. Так, при тепловом закаливании томата без АБК его холо достойкость в течение первых суток несколько повышалась, а затем постепен но снижалась до уровня, близкого к исходному (рис. 9). АБК повышала холо доустойчивость (если вводилась перед закаливанием) или препятствовала ее снижению (при обработке в ходе закаливания или по его завершению). Причем величина прироста устойчивости, индуцированная АБК, во всех случаях была примерно одинаковой. Следовательно, при действии закаливающих темпера тур АБК индуцирует повышение устойчивости как к холоду, так и к теплу.
Отметим, что краткосрочное действие на растения высокой закаливающей температуры вызывало не только увеличение их холодоустойчивости, но и со леустойчивости, которая при пролонгировании закаливания постепенно сни жалась (рис. 10). В этом случае АБК не только способствовала дополнитель ному приросту солеустойчивости проростков в начальный период действия высокой температуры, но и сохранению ее высокого уровня в дальнейшем.
Рис. 10. Влияние АБК на теплоустойчивость и со леустойчивость проро стков огурца с. Зозуля при действии темпера туры 38С.
1 – контроль (без АБК), 2 – АБК (0,1 мМ).
Таким образом, повышенный в результате экзогенной обработки уровень АБК в растениях способствовал при действии низкой и высокой закаливающей температуры дополнительному увеличению устойчивости к различным стрес сорам. Эти результаты позволяют предполагать непосредственное участие данного гормона в неспецифических механизмах повышения устойчивости к действию низких и высоких температур, по крайней мере, на начальном этапе процесса адаптации (первые минуты и часы воздействия стрессора).
По-видимому, влияние АБК на устойчивость к неблагоприятным факто рам может проявляться как через ингибирование и/или индукцию синтеза бел ков, так и через механизмы, не требующие изменений в функционировании ге нома. С целью проверки справедливости этого предположения нами было про ведено исследование совместного действия АБК и ингибиторов синтеза мРНК (АКТ) и белков цитоплазмы (ЦГ) на устойчивость растений.
Установлено, что в условиях холодового закаливания проростков томата экзогенная АБК вызывала дополнительное повышение их холодоустойчивости даже в присутствии АКТ и ЦГ, хотя достигаемый уровень устойчивости был несколько ниже, чем при обработке только АБК (рис. 11). Сходным образом изменялась теплоустойчивость проростков томата в случае совместного дейст вия АБК и ингибиторов белкового синтеза. Следовательно, АБК не только не препятствует синтезу белков, но и, как показывают исследования других авто ров, способна вызывать изменения в наборе синтезируемых в условиях небла гоприятной температуры белков (Xiong et al., 1999;
Larkindale, Knight, 2002).
Рис. 11. Влияние АБК и ингибиторов син теза РНК и белка на холодо- (А) и теплоус тойчивость (Б) проростков томата с. Мос ковский осенний 3405 при действии низкой (А) и высокой (Б) закаливающих темпера тур.
А: 8°С, 3 сут;
Б: 40°С, 1 сут.
1 – контроль, 2 – АБК (0.1 мМ), 3 – АКТ ( мг/л), 4 – АБК+ АКТ, 5 – ЦГ (2 мг/л), 6 – АБК + ЦГ.
Исходя из вышеизложенного, логично думать, что действие экзогенной АБК на устойчивость растений связано с ее способностью индуцировать экс прессию генов и синтез белков.
Одним из наиболее вероятных физиологических механизмов, через ко торые АБК участвует в повышении холодо- и теплоустойчивости растений, выступает также ее влияние на водный обмен (Dodd, 2003;
Pospilov, 2003). В частности, АБК препятствует обезвоживанию тканей растений благодаря снижению устьичной проводимости и транспирации, о чем свидетельствуют наши данные, полученные на огурце (Таланова и др., 2006).
Влияние АБК на устойчивость в условиях хлоридного засоления. Имею щиеся в литературе сведения о влиянии АБК на устойчивость растений к засо лению единичны (Amzallag et al., 1990). Учитывая это, нами проведено изуче ние эффектов экзогенной АБК на устойчивость растений к действию хлорида натрия. Установлено, что АБК вызывает заметное повышение солеустойчиво сти проростков огурца уже в начальный период (первые 2–6 ч) воздействия NaCl (рис. 12). Уровень теплоустойчивости растений, подвергнутых действию АБК и NaCl, был также значительно выше, чем в контроле. Таким образом, предобработка АБК растений в условиях хлоридного засоления способствова ла повышению как соле-, так и теплоустойчивости клеток листьев.
Исходя из полученных результатов, можно предположить, что более вы сокий уровень солеустойчивости проростков огурца при действии хлоридного засоления связан с повышенным уровнем АБК в них. Очевидно, АБК при дей ствии NaCl проявляет себя в качестве одного из участников процесса адапта ции, обеспечивающих неспецифическое повышение устойчивости растений в первые часы неблагоприятного воздействия.
Негативное воздействие хлоридного засоления на растения прежде всего связано с возникающим дефицитом воды и токсическим влиянием ионов на трия и хлора (Munns, 2002). Засоление вызывает снижение устьичной прово димости и транспирации, что, в свою очередь, влияет на поступление в лист углекислого газа и на интенсивность фотосинтеза (Posphilov, 2003). Нами было установлено, что обработка проростков огурца АБК заметно снижала устьичную проводимость и транспирацию, а также интенсивность нетто фотосинтеза как в обычных условиях, так и при засолении (табл. 4). Снижение устьичной проводимости при засолении проростков огурца приводило к уменьшению потери воды за счет транспирации. Очевидно, что снижение устьичной проводимости листьев способствует поддержанию уровня водного обмена при засолении растений, а следовательно, защищает их от излишней потери воды. Таким образом, АБК принимает участие в защитных реакциях растений на засоление, снижая устьичную проводимость и скорость транспи рации, что благоприятно для растения в данных условиях.
Рис. 12. Влияние АБК на соле- и теплоустойчивость проростков огурца с. Зозуля при последовательном действии температуры 38°С и NaCl (154 мМ).
1 – контроль (без АБК), 2 – АБК (0,1 мМ).
Таблица 4. Влияние АБК и NaCl на транспирацию и нетто-фотосинтез проростков огурца с. Зозуля* Интенсивность Устьичная Интенсивность Вариант транспирации, проводимость, нетто-фотосинтеза, ммоль м-2 с-1 ммоль м-2 с-1 мкмоль м-2 с- Контроль 1,05±0,08 102,4±6,4 5,16±0, NaCl, 120 мM 0,20±0,06 20,2±2,4 2,61±0, АБК, 0.01 мМ 0,57±0,05 40,9±3,5 3,10±0, АБК + NaCl 0,11±0,02 7,0±0,6 1,78±0, * экспозиция на АБК и NaCl – 5 ч.
Выявленное нами повышение теплоустойчивости растений огурца при действии засоления, наряду с подобного рода данными других авторов (Kuznetsov et al., 1999), свидетельствует о функционировании в растениях об щих механизмов устойчивости к указанным факторам. Для установления роли АБК в этих механизмах нами проведено изучение эффектов комбинированно го действия хлоридного засоления и высоких температур.
Показано, что одновременное действие NaCl и температуры 38°С на про ростки огурца приводило к повышению их теплоустойчивости (рис. 13). При этом уровень теплоустойчивости, достигнутый в первые 2 ч воздействия двух стрессоров, превышал таковой при действии только температуры 38°С, однако при более продолжительном (6 и 24 ч) воздействии – заметно уступал. Таким образом, экзогенная АБК способствует дополнительному приросту соле- и те плоустойчивости при комбинированном действии хлоридного засоления и вы сокой температуры. Полученные данные свидетельствуют об участии этого гормона в неспецифических механизмах формирования устойчивости к дейст вию стресс-факторов разной природы.
Рис. 13. Влияние АБК (0,05 мМ) на теплоустойчивость проростков огурца c. Зозуля при одновремен ном действии температуры 38°С и NaCl (120 мМ).
1 – 38°С;
2 – 38°С+АБК;
3 – 38°С+NaCl;
4 – 38°+ NaCl +АБК.
Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что в процессы адапта ции растений к действию хлоридного засоления и высокой температуры во влечена АБК, которая выступает в качестве триггера, запускающего процессы формирования повышенной устойчивости.
Влияние неблагоприятных факторов среды и АБК на экспрессию генов транскрипционных факторов и стрессовых белков Транскрипционный фактор CBF. Реакция растений на действие различ ных по своей природе стресс-факторов связана с экспрессией определенных генов (Thomashow, 1999). Например, экспрессия генов семейства транскрип ционных факторов CBF/DREB (C-repeated binding factor/dehydration response elements binding protein) индуцируется у арабидопсиса обезвоживанием (Kume et al., 2005), низкими температурами (Thomashow, 1999) и ионами кадмия (Su zuki et al., 2001). В свою очередь, CBF факторы активируют экспрессию генов ряда стрессовых белков (Knight et al., 2004). Учитывая это, нами изучена экс прессия гена CBF1 у растений при действии стресс-факторов и АБК.
Установлено, что действие на проростки огурца температуры 10°С вызы вает повышение уровня экспрессии гена транскрипционного фактора CBF1 и их холодоустойчивости. Экзогенная АБК стимулировала экспрессию данного гена уже при температуре 25°С, однако при холодовом закаливании в ее при сутствии дополнительного увеличения уровня экспрессии гена по сравнению с вариантом “холодовое закаливание без АБК” не происходило. В условиях вы сокой закаливающей температуры 38°С увеличение теплоустойчивости клеток листа огурца сопровождалось повышением уровня экспрессии гена CBF1 (рис.
14). Предобработка проростков АБК способствовала дополнительному росту теплоустойчивости при закаливании и усиливала экспрессию данного гена в начальный его период.
Рис. 14. Влияние тем пературы 38°С и АБК (0,1 мМ) на теплоус тойчивость (А) и экс прессию гена транс крипционного фактора CBF1 (Б) в листьях проростков огурца с.
Зозуля 1 – 38°С, 2 – 38°С+АБК.
Аналогично влиянию закаливающих температур, краткосрочное (1 ч) и более длительное (24 ч) воздействие NaCl (120 мМ) на проростки огурца вы зывало усиление экспрессии гена транскрипционного фактора CBF1, при этом возрастала их устойчивость к засолению (рис. 15).
Рис. 15. Влияние NaCl (120 мМ) и АБК (0. мМ) на солеустойчи вость (А) и экспрессию гена CBF1 (Б) у проро стков огурца с. Зозуля.
1 – NaCl, 2– NaCl + АБК.
Полученные данные позволяют предполагать, что повышение неспеци фической устойчивости растений огурца под влиянием низкой и высокой зака ливающих температур и хлорида натрия связано с увеличением уровня экс прессии гена транскрипционного фактора CBF1, а один из возможных меха низмов положительного действия АБК в отношении устойчивости связан с ее влиянием на экспрессию данного гена.
Транскрипционный фактор WRKY и cтрессовые белки. Повышение холо доустойчивости растений связывают с индукцией низкими температурами экс экспрессии Сor-генов (cold regulated genes), кодирующих COR-белки (Thomashow, 1999;
Трунова, 2007). Нами изучена экспрессия гена недавно от крытого транскрипционного фактора WRKY и Сor-генов белков у пшеницы при действии низкой температуры.
Сопоставление динамики холодоустойчивости клеток листьев и экспрес сии генов транскрипционного фактора WRKY у проростков пшеницы указы вает на существование определенной зависимости между уровнем экспрессии этого гена и формированием повышенной устойчивости в условиях действия низкой закаливающей температуры. В частности, нами обнаружено быстрое и значительное (в десятки раз по сравнению с исходным уровнем) увеличение экспрессии гена транскрипционного фактора WRKY, предшествующее росту холодоустойчивости проростков пшеницы (рис. 16). Из полученных данных следует, что повышение устойчивости связано с индукцией экспрессии гена WRKY в начальный период низкотемпературной адаптации. Предполагается, что транскрипционные факторы WRKY регулируют экспрессию генов, участ вующих в ответе растений на различные неблагоприятные воздействия, через их связывание с cis-элементами W-блока промотера (Euglem et al., 2000). Од нако, поскольку в наших опытах уровень экспрессии гена WRKY и холодоин дуцируемых генов Wcor15, Wrab17, Wrab19 и Wcs120 у растений пшеницы на чинает повышаться практически одновременно (в первые 15 мин действия низкой температуры), то, очевидно, транскрипционный фактор WRKY не уча ствует в регуляции экспрессии указанных генов (рис. 17).
Б А уровень экспрессии Относительный Относительный 80 экспрессии уровень 60 40 20 0 0,25 0,5 1 5 24 48 144 0,25 0,5 1 5 24 48 144 Экспозиция, ч Экспозиция, ч Рис. 16. Изменение уровня экспрессии гена WRKY в зависимости от времени действия низкой закаливающей температуры (4°С) и АБК на проростки пшеницы с. Москов ская 39. А – 4°С;
Б – 4°С+ АБК (0,1 мМ).
Уровень экспрессии гена Wcor15 повышался уже в первые минуты дейст вия температуры 4°С и достигал наибольшей величины на 2-е сут закаливания (рис. 16), когда холодоустойчивость уже была близка к максимуму (рис. 17).
Индукция экспрессии генов Wrab17, Wrab19 и Wcs120 в листьях пшеницы также происходила довольно быстро. Таким образом, формирование повы шенной устойчивости растений пшеницы, обнаруженное в наших опытах, со пряжено с более быстрой экспрессией Cor-генов (рис. 18). Важно отметить, что увеличение холодоустойчивости пшеницы при краткосрочном действии низкой температуры связано с экспрессией всех изученных генов – Wcor15, Wrab17, Wrab19 и Wcs120, а при продолжительном ее действии – прежде всего с экспрессией генов Wcor15 и Wrab17.
Рис. 17. Динамика холодоустойчивости пшеницы с. Московская 39 при действии за каливающей температуры (4°С) и АБК. 1 – 4°С;
2 – 4°С+ АБК (0,1 мМ).
Один из возможных механизмов защитного действия АБК заключается в регуляции экспрессии генов транскрипционных факторов и стрессовых белков (Gusta et al., 2000). АБК-индуцируемые гены содержат в промоторной области последовательность нуклеотидов ABRE (ABA-responsive element), вовлечен ную в экспрессию генов. К числу индуцируемых АБК регуляторных белков относят транскрипционные факторы bZIP, MYC/MYB (Bhatnagar-Mathur et al., 2008). В отличие от этого, транскрипционные факторы CBF/DREB считают АБК-независимыми, хотя по некоторым данным экзогенная АБК способна ин дуцировать накопление транскриптов CBF-генов, но в значительно меньшей степени, чем низкая температура (Knight et al., 2004). В проведенных нами экспериментах экзогенная АБК подавляла экспрессию гена транскрипционно го фактора WRKY проростков пшеницы при холодовом закаливании и не ин дуцировала аккумуляцию транскриптов при обычной температуре. Таким об разом, экспрессия холодоиндуцируемого гена транскрипционного фактора WRKY у растений не является АБК-зависимой.
В присутствии экзогенной АБК в первые минуты низкотемпературного воздействия на проростки пшеницы отмечено значительное усиление экспрес сии гена Wcor15, а через 2 сут от его начала – экспрессии генов Wcor15, Wrab17 и в меньшей степени Wrab19 (рис. 18). В отличие от этого, АБК инги бирует экспрессию гена Wcs120 при холодовом закаливании. Таким образом, положительное влияние АБК на холодоустойчивость растений пшеницы, от меченное нами, очевидно связано с ее способностью регулировать экспрессию генов Wcor15, Wrab17 и Wrab19.
Б А Относительный уровень ур овен ь экспр есси и О тн о си тельн ы й экспрессии 10 5 0,25 0,5 1 5 24 48 144 0,25 0,5 1 5 24 48 144 Экспозиция, ч Экспозиция, ч Г В Относительный уровень Относительный уровень экспрессии экспрессии 0 0,25 0,5 1 5 24 48 144 168 0,25 0,5 1 5 24 48 144 Экспозиция, ч Экспозиция, ч Е Д Относительный уровень Относительный уровень экспрессии экспрессии 0 0,25 0,5 1 5 24 48 144 168 0,25 0,5 1 5 24 48 144 Экспозиция, ч Экспозиция, ч З Ж Относительный уровень Относительный уровень экспрессии экспрессии 20 0 0,25 0,5 1 5 24 48 144 168 0,25 0,5 1 5 24 48 144 Экспозиция, ч Экспозиция, ч Рис. 18. Изменение уровня экспрессии генов Wcor15, Wrab17, Wrab19 и Wcs120 в за висимости от времени действия низкой закаливающей температуры (4°С) и АБК на проростки пшеницы с. Московская 39. А, Б – Wcor15;
В, Г – Wrab17;
Д, Е – Wrab19;
Ж, З – Wcs120. А, В, Д, Ж – 4°С;
Б, Г, Е, З – 4°С + АБК (0.1 мМ).
В целом, приведенные данные позволяют считать, что действие АБК в на чальный период воздействия неблагоприятных факторов среды направлено на индукцию и/или стимуляцию процессов, определяющих формирование повы шенной устойчивости. Важно, что именно в начальный период действия стрес сора, когда в растениях увеличивается эндогенный уровень гормона, у расте ний может повышаться устойчивость не только к действующему фактору, но и к ряду других факторов, тогда как при пролонгированном его действии отме чено ее снижение до исходных значений, происходящее на фоне уменьшения концентрации АБК. В то же время предобработка АБК до начала действия стрессора вызывала одновременное повышение устойчивости растений к не скольким стрессорам. На основании совокупности полученных данных можно сделать вывод об участии АБК в формировании повышенной устойчивости к различным стресс-факторам, а учитывая особенности динамики этого процес са, можно предполагать, что АБК способна выступать в качестве одного из триггерных механизмов для процесса формирования устойчивости.
6. РОЛЬ АУКСИНОВ И ЦИТОКИНИНОВ В МЕХАНИЗМАХ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К ДЕЙСТВИЮ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ Изменение уровня эндогенной ИУК в растениях при действии низких и высоких температур Имеющиеся в литературе сведения о динамике содержания ауксинов в растениях в условиях низкой температуры обычно указывают на его уменьше ние в этих условиях (Michaeli et al., 1999;
Лукаткин, 2002), при этом подчерки вается необходимость инактивации ауксинов и снижения, тем самым, ростовой активности растений, как условия увеличения устойчивости (Гуревич, 1979).
Между тем, обратная зависимость между уровнем активности ауксинов и ус тойчивостью отмечается далеко не всегда (Волкова и др., 1991). Учитывая это, нами была изучена динамика уровня эндогенной ИУК растений в начальный период действия низких и высоких закаливающих температур.
На холодостойком (пшеница) и теплолюбивом (огурец) видах растений показано, что характер изменения уровня ИУК в начальный период действия низких закаливающих температур и при их длительном действии может разли чаться: рост холодоустойчивости в течение первых суток действия температу ры 10°С происходил на фоне повышенного содержания ИУК в листьях, и только начиная со 2-х суток, уровень гормона снижался. В отличие от холодо вого, тепловое закаливание растений осуществлялось на фоне довольно вы сокого содержания свободной ИУК, характерного для растений, находящихся в обычных температурных условиях: после небольшого повышения в первые 0.5–1 ч воздействия температуры 38°С, в дальнейшем (в течение суток) содер жание гормона сохранялось на уровне, характерном для незакаленных расте ний (рис. 19).
Рис. 19. Холодо- и те плоустойчивость кле ток листьев и содер жание в них ИУК при холодовом (А) и теп ловом (Б) закаливании проростков огурца с.
Алма-Атинский В целом, формирование повышенной устойчивости сопровождается неко торым возрастанием количества ИУК в листьях в начальный период закалива ния и последующем его снижением в более поздние периоды холодового зака ливания или возвращением к исходному уровню при тепловом закаливании.
Таким образом, двухфазный характер изменения уровня эндогенных ауксинов в листьях в начальный период действия низких и высоких температур позволя ет предполагать их участие в адаптивных реакциях растений. При продолжи тельном же действии неблагоприятных температур изменения в содержании ИУК, скорее всего, связаны, с необходимостью торможения ростовых процес сов и снижения уровня метаболической активности растения.
Влияние экзогенной ИУК на холодо- и теплоустойчивость растений при действии низких и высоких температур На растениях пшеницы нами показана возможность осуществления теп лового закаливания в присутствии экзогенной ИУК как в низких, так и относи тельно высоких (10–100 мг/л) концентрациях. Более того, выявлена зависи мость процесса повышения устойчивости при тепловом закаливании не только от концентрации экзогенного ауксина, но и от времени его введения в расте ния. В частности, обработка проростков пшеницы за 1 сут до воздействия тем пературы 40°С ИУК в высоких концентрациях (10–100 мг/л) снижала закали вающий эффект на 14–18% по отношению к варианту «закаливание без ИУК» (табл. 5). При концентрации ИУК 1 мг/л величина ингибирования закалки со ставляла около 10%, а при использовании концентрации менее 1 мг/л процесс закаливания не подавлялся вообще. При введении ауксина непосредственно перед закаливанием диапазон его концентраций, при которых тепловая адап тация протекала успешно, заметно расширялся. Обработка ИУК спустя 6 ч от начала действия температуры 40°С (когда формирование устойчивости завер шалось) вызывала ингибирование закалки лишь при применении гормона в концентрации 1 мг/л. Следовательно, обработка растений ИУК в довольно ши роком диапазоне концентраций не препятствует процессу их тепловой адапта ции.
Таблица 5. Влияние ИУК на устойчивость проростков пшеницы с. Мироновская 808 при тепловом закаливании (1 сут при 40°С) Степень ингибирования закаливания, % Время концентрация ИУК, мг/л обработки ИУК 0 0.01 0.1 1 10 За 1 сут до закалки 0 0 3* 11* 18 Перед закалкой 0 2* 3* 6 18 – Через 6 ч от начала закалки 0 7 14 21 – – * – различия с контролем (закалка без ИУК) недостоверны при Р 0,05.
Таким образом, то обстоятельство, что обработка растений ИУК не пре пятствует успешному протеканию процесса адаптации, позволяет думать, что этот гормон участвует в перестройке метаболизма, направленной на повыше ние устойчивости растений. Ауксины способны активировать или подавлять экспрессию десятков генов, в том числе ранних генов и генов вторичного от вета (Abel, Theodologis, 1996;
Веселов, 2001). Учитывая это, логично предпо лагать, что быстрое повышение его уровня в начальный период действия зака ливающих температур может прямо или опосредованно участвовать в запуске системы индуцированного синтеза белков. С другой стороны, быстрое дейст вие ауксинов связано не только с влиянием на экспрессию генов, но и с изме нением проницаемости мембран (Napier, Venis, 1995), активацией биосинтеза АБК (Hansen, Grossmann, 2000). В целом, несомненным является вывод об уча стии ауксина в контроле над адаптивными реакциями растений на действие неблагоприятных температур.
Влияние экзогенных цитокининов на устойчивость растений к действию неблагоприятных температур и хлоридного засоления Цитокинины, наряду с другими фитогормонами могут участвовать в реак циях растений, связанных с воздействием на них неблагоприятных факторов среды (Hare et al., 1997;
Лукаткин, 2002;
Фархутдинов, 2005;
Ершова, 2007). В настоящем разделе приведены экспериментальные данные, полученные при изучении влияния экзогенных цитокининов на устойчивость растений при фи зиологически нормальной температуре и в процессе холодового и теплового закаливания, а также при действии хлорида натрия.
Низкие и высокие температуры. Установлено, что экспозиция пророст ков томата на растворе кинетина при температуре 25°С вызывала увеличение устойчивости клеток листьев к краткосрочному охлаждению и прогреву, одно временно повышалась выживаемость проростков после тестирующего прогре ва или охлаждения (табл. 6).
Экзогенные цитокинины способны повышать эффективность как холо дового, так и теплового закаливания. Наиболее выраженным позитивным дей ствием в отношении закаливания обладал синтетический аналог цитокинина – БАП (рис. 20).
Таблица 6. Влияние кинетина (0,1 мг/л) на устойчивость проростков томата с. Московский осенний 3405 к действию низких и высоких температур Вариант Устойчивость клеток листа Выживаемость проростков (%) (ЛТ50, °С) к 5-минутному после тестирующего охлаждению прогреву охлаждения* прогрева* Контроль -6,5 ± 0.03 51,6 ± 0.04 42,3 ± 6.0 37,4 ± 5. Кинетин -7,2 ± 0.02 52,1 ± 0.03 78,5 ± 5.2 92,0 ±6. * тестирующее охлаждение и прогрев: 2°С, 3 сут;
45°С, 20 ч.
Рис. 20. Влияние БАП на теплоустойчивость листьев проростков огурца с. Алма Атинский 1 и содержание в них АБК при температуре 38°С.
К – контроль (без обработки БАП), БАП – 3 мкМ.
Нами было высказано предположение, что повышение устойчивости к неблагоприятным температурам с помощью экзогенных цитокининов связано с активацией работы белоксинтезирующего аппарата (Титов и др., 1986). В связи с этим весьма показательны результаты опытов по изучению совместно го влияния ингибиторов белкового синтеза (АКТ, ЦГ) и цитокинина на устой чивость растений. Так, у незакаленных растений томата кинетин увеличивал устойчивость клеток к низким и высоким температурам, АКТ и ЦГ не влияли на их устойчивость, но в значительной степени снижали прирост устойчиво сти, вызываемый цитокинином. При холодовом закаливании контрольных (без ингибиторов и гормона) проростков их холодоустойчивость увеличивалась, обработка кинетином приводила к дополнительному приросту устойчивости, а АКТ и ЦГ препятствовал ее повышению. В то же время в вариантах «кине тин+АКТ» и «кинетин+ЦГ» ингибиторы снижали стимулирующее действие гормона на холодоустойчивость. При тепловом закаливании АКТ и ЦГ инги бировали рост устойчивости, вызываемый кинетином.
На основании полученных нами результатов и данных литературы (Ку лаева, 1982;
Hare, van Staden, 1997;
Шакирова, 2001;
Кулаева, Кузнецов, 2002) можно заключить, что при повышении устойчивости растений к холоду или теплу в присутствии цитокинина активизируется система биосинтеза белка.
Очевидно, при действии на растения низких и высоких закаливающих темпе ратур цитокинины, стимулируя работу аппарата биосинтеза белка, тем самым создают более благоприятную внутриклеточную обстановку не только для идущих в это время конститутивных синтезов (как это наблюдается при опти мальных температурах), но и одновременно с этим для биосинтезов стрессо вых белков. Вместе с тем, нельзя не отметить, что действие цитокининов на устойчивость растений может осуществляться и через иные механизмы. В ча стности, БАП способствует открыванию устьиц и усиливает транспирацию как в нормальных температурных условиях, так и при неблагоприятных темпера турах (Pospiilov, 2003). Нами на проростках огурца выявлено повышение транспирации в присутствии БАП не только при действии температуры 25°С, но и в начальный период теплового закаливания при 38°С. Усиление транспи рации в начальный период действия повышенных температур приводит к сни жению температуры листьев, что благоприятно для растения в этих условиях.
Помимо этого, положительные эффекты цитокинина на растения в условиях неблагоприятных температур связаны с индукцией им накопления стрессового гормона АБК (рис. 20), который, по-видимому, выступает в качестве интерме диата в реализации антистрессового действия цитокининов.
Хлоридное засоление. В литературе имеются лишь единичные и к тому же противоречивые сведения о влиянии экзогенных цитокининов на растения в условиях засоления (Kirkham et al., 1974;
Аbdullah, Ahmad, 1990). Проведенное нами изучение влияния БАП на солеустойчивость проростков огурца показало, что обработка этим гормоном приводила к ее повышению уже в начальный период (первые часы) действия (табл. 7). При этом действие БАП было связано с его влиянием на процесс транспирации: в отсутствии стресса гормон заметно повышал интенсивность транспирации листьев проростков огурца на фоне практически неизменной устьичной проводимости. В начальный период засо ления происходило значительное снижение устьичной проводимости и интен сивности транспирации, а обработка проростков БАП препятствовала их сни жению (табл. 7).
Таблица 7. Влияние БАП на солеустойчивость, нетто-фотосинтез, транспирацию и устьичную проводимость проростков огурца с. Зозуля при действии NaCl (5 ч) Солеустойчи- Нетто- Интенсивность Устьичная Вариант вость фотосинтез, транспирации, проводимость, мкмоль м–2 с-1 моль м–2 с-1 моль м–2 с- (ЛОД50), МПа Контроль 0,75±0,05 5,06±0,18 0,68±0,06 82,5±5, NaCl, 120 мM 0,85±0,04 2,76±0,20 0,15±0,04 15,2±2, БАП, 4 мкМ 0,81±0,06 5,61±0,22 0,95±0,08 89,8±8, БАП + NaCl 0,90±0,04 3,78±0,15 0,27±0,03 24,6±2, Учитывая обнаруженную нами способность БАП оказывать положитель ное влияние на процессы транспирации и фотосинтеза в первые часы действия хлорида натрия на растения, можно заключить, что цитокинины принимают активное участие в защитных реакциях растений, наблюдаемых в начальный период засоления.