Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов

На правах рукописи

Николаев Юрий Александрович АУТОРЕГУЛЯЦИЯ СТРЕССОВОГО ОТВЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ Специальность 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

МОСКВА – 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Г.И. Эль-Регистан

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Р.Н. Ивановский Доктор биологических наук, профессор Д.Н. Островский Доктор биологических наук А.Г. Меденцев Ведущая организация – Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук

Защита диссертации состоится «28» марта 2011 в 14 ч на заседании Диссертаци онного совета Д002.224.01 при Учреждении Российской академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, просп.

60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Автореферат разослан « » января 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д002.224. к.б.н. Т.В. Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Проблема адаптации организмов к изменяющимся условиям окружения является одной из центральных в биологии. Наибольшей приспособ ляемостью к флуктуациям окружающей среды обладают микроорганизмы, иссле дованиям механизмов адаптации которых посвящено множество оригинальных работ и обзорных материалов [Хочачка, Сомерo, 1988;

Henge-Aronis, 1993;

Фео филова, 2003]. Основное внимание уделяется внутриклеточным событиям форми рования стрессового ответа: экспрессии генов стрессовых регулонов (rpoS, оxyR, SOS-ответа, и др.) [Matin 1992;

Hengge-Aronis and Loewen, 1994;

Бут, 2005], био синтезу ферментов, пигментов и метаболитов антиоксидантной защиты клетки [Davies, 1987;

Меденцев с соавт., 2005;

Октябрьский, Смирнова, 2007], механиз мам репарации и стабилизации ДНК [Martinez, Kolter, 1997;

Farewell et al., 1998;

Головлёв, 1999], изменению в составе дыхательной цепи [Акименко, 1995;

Ме денцев с соавт., 1999;

Jean et al., 2004;

Бирюкова с соавт., 2008, 2009] переключе нию метаболических потоков на синтез стрессовых липидов, углеводов и белков, прежде всего «молекулярных шаперонов», контролирующих фолдинг и стабили зирующих макромолекулы белков [Меденцев с соавт., 2001;

Causton et al., 2001;

Феофилова, 1992, 2003;

Головлев, 2003;

Мельников, Ротанова, 2010].

С другой стороны, в последнее время получило признание представление о популяции микроорганизмов как о своеобразной многоклеточной системе, сущно стным свойством которой является взаимодействие отдельных клеток, когда их согласованная деятельность направлена на достижение общего результата [Shapiro, Dworkin, 1997;

Олескин с соавт., 2000;

Волошин, Капрельянц, 2004].

Описан целый ряд примеров популяционного поведения, контролируемого низко молекулярными внеклеточными микробными метаболитами-ауторегуляторами (АР) [Aaronson, 1981]. Вслед за А.С. Хохловым под внеклеточными ауторегулято рами будем понимать метаболиты, которые образуются всеми или частью клеток популяции, выделяются в окружающую среду и воздействуют на клетки популя ции, вызывая их качественные изменения [Хохлов, 1988]. Ауторегуляторы кон тролируют целый ряд жизненных явлений у микроорганизмов: биолюминесцен цию у светящихся бактерий [Fuqua et al., 1994;

Visick, McFall-Ngai, 2000];

морфо генез и продукцию антибиотиков у стрептомицетов [Хохлов, 1988];

синтез факто ров вирулентности патогенными бактериями [Whiteley et al., 1999;

Бухарин с со авт. 2005];

роение (swarming) бактерий [Shapiro, Dworkin, 1997];

автолиз, образо вание и прорастание покоящихся форм [Хохлов, 1988;

Wirth et al., 1996;

Dworkin, 1996;

Sudo et al., 1997;

Kaprelyants et al., 1999;

Эль-Регистан с соавт., 1983;

1998;

2005]. Достижения в этой области биологии бактерий, сформировавшейся в само стоятельное направление – химическую экологию, отражены в ряде обзоров и мо нографий [Aaronson, 1981;

Хохлов, 1988;

Shapiro, Dworkin, 1997, Барбье, 1987, Shapiro et al., 1997, 1998;

Kaprelyantz et. аl., 1999, 2005, Бухарин с соавт., 2005].

В исследовании АР выделяют три этапа: первый - их обнаружение в биотес тах, специально разрабатываемых для каждого случая [Aaronson, 1981]. На этом этапе, как правило, используют культуральные жидкости, вытяжки из клеток и подобные субстанции. Разработка нового биотеста может приводить к обнаруже нию новых АР. На втором этапе производят выделение и идентификацию химиче ских соединений, ответственных за биологические эффекты АР. На последнем этапе исследуют механизмы действия идентифицированных ауторегуляторов.

Среди многочисленных ауторегуляторов недостаточно исследованы те, кото рые имеют функции адаптогенов - веществ, контролирующих компенсаторно приспособительные реакции микроорганизмов к стрессовым воздействиям и раз витие культур в неоптимальных условиях роста.

К началу диссертационной работы (начало 1990х годов) лишь некоторые кол лективы выполняли исследования, посвященные участию внеклеточных адаптоге нов (ВА) в приспособлении бактерий к неблагоприятным условиям. Исследования ВА, как правило, не носили систематического характера. Вместе с тем адаптивный потенциал микроорганизмов, занимающих все возможные экологические ниши, существенно более высокий, чем у других живых организмов, предполагает нали чие ауторегуляторного контроля систем адаптации к изменениям окружающих ус ловий. Известны следующие внеклеточные ауторегуляторы, участвующие в разви тии адаптивных реакций микроорганизмов: гомосеринлактоны и производные тетрагидрофурана некоторых морских вибрионов способствуют их адаптации к голоданию и ряду стрессоров [Srinivasan et al., 1998;

McDougald et al., 2003;

Mostertz et al., 2004;

Krin et al., 2006];

протекторы белковой природы у Escherihia coli [Rowbury, Goodson, 2001];

осмопротекторы, содержащиеся в лизатах клеток галобактерий [Кокоева, Плакунов, 1993];

антимутагены молочнокислых бактерий белковой и небелковой природы [Воробьёва с соавт., 1993, 2005];

внеклеточные адаптогены тиобацилл, представленные аминокислотами [Пивоварова с соавт., 1991]. Однако, наличие приведённых примеров не давало целостной картины зна чимости участия внеклеточных адаптогенов в жизни микроорганизмов, их роль в стрессоадаптации оставалась малоисследованной. Отмеченная малоисследован ность внеклеточных адаптогенов в совокупности с их определённым функцио нальным многообразием, их наличием у микроорганизмов различных таксономи ческих групп, а также высоким потенциалом практического применения обусло вили актуальность изучения микробных метаболитов этого типа (внеклеточных адаптогенов) – их обнаружение с применением биотестов (защитных эффектов при сублетальных и летальных воздействиях и развитии культур в неоптимальных условиях), определение химической природы, исследование механизмов действия.

Исследуя физиологию псевдомонад, автор обнаружил, что у них существенно выражена обратимая адгезия - первая фаза формирования биоплёнок, занимающих важное место в жизнедеятельности бактерий [Marshall, 1996;

O’Toole et al., 2000], а также важных для биотехнологии и медицины [Ильина с соавт., 2004]. Возмож ность ауторегуляторного контроля обратимой адгезии бактерий и важность этого феномена для практической деятельности обусловили интерес к исследованию ау торегуляции обратимой адгезии бактерий в рамках настоящей работы.

При рассмотрении стрессоадаптации выделяют две группы приспособитель ных реакций активно развивающихся организмов – с изменением и без изменения стратегии жизни [Бухарин с соавт., 2005]. В первом случае организмы остаются в том же состоянии, продолжают развитие;

во втором случае происходит смена стратегии жизни – как правило, с активного роста на переживание. В этой связи интересна ситуация с исследованием ауторегуляторов образования покоящихся форм (ПФ), факторов d1, которые регулируют адаптивные реакции, связанные со сменой стратегии развития – переходом в покоящееся состояние. Эти соединения представлены у бактерий алкилоксибензолами (АОБ) [Эль-Регистан с соавт., 1980;

Бухарин с соавт., 2005;

Мулюкин, 2010]. Механизмы, посредством которых АОБ контролируют развитие анабиотического состояния ПФ заключаются в: стабили зации клеточных мембран [Капрельянц с соавт., 1987], ингибировании активности ферментов [Колпаков с соавт., 2000], а также в индукции фенотипической диссо циации клеток [Ильинская с соавт., 2002]. Можно было ожидать участия АОБ в и стрессоадаптации первого типа - без изменения стратегии развития культур, т.е. в адаптации растущих культур к неблагоприятным физико-химическим условиям среды и смене условий развития. Представляло интерес исследовать как феноме нологию, так и механизмы стрессопротекторного действия АОБ на разных уров нях – молекулярном, клеточном, популяционном.

Исходя из вышеизложенного были сформулированы Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было исследовать закономерности ауторегуляции адаптации микроорганизмов к неблагоприятным и повреждающим воздействиям и изменениям условий роста: (1) феноменологию ауторегуляции адаптивных реак ций, (2) химическую природу внеклеточных адаптогенов, (3) механизмы действия внеклеточных адаптогенов.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить с помощью разработанных нами биотестов феноменологию участия внеклеточных адаптогенов в адаптации микроорганизмов про- и эукариот к стрессорным воздействиям различной природы.

2. Выявить функции внеклеточных адаптогенов в обратимой адгезии клеток бактерий как адаптивной реакции на стресс новой среды. Определить хими ческую природу внеклеточных адаптогенов, контролирующих обратимую адгезию клеток. Выяснить роль обратимой адгезии в стрессоустойчивости микроорганизмов.

3. Изучить роль алкилоксибензолов как внеклеточных адаптогенов микроорга низмов к сублетальным и летальным воздействиям стрессоров различной природы (тепловой шок, окислительный, осмотический стрессы) в зависи мости от их структуры и концентрации.

4. Исследовать механизмы действия алкилоксибензолов в: регуляции активно сти и стабильности ферментных белков, антиоксидантной защите клеток, активации генов стрессовых регулонов, а также контроле фенотипической вариабельности как адаптивном потенциале популяции.

Научная новизна работы.

С применением разработанных биотестов продемонстрирована способность микроорганизмов различных таксономических групп в процессе развития проду цировать специфические внеклеточные метаболиты - адаптогены, способствую щие приспособлению микроорганизмов к неблагоприятным воздействиям или из меняющимся условиям существования. ВА контролируют компенсаторно приспособительные реакции микроорганизмов как при стрессах, запрограммиро ванных в цикле развития микробных культур (голодания, смене среды роста), так и при незапрограммированных стрессорных воздействиях разной природы (тер мическом, окислительном, осмотическом, токсическом). Ауторегуляция стрессо вого ответа имеет место при воздействиях разной интенсивности: рост замедляющих, рост-прекращающих, летальных. Установлено, что ВА, имеющие различные функции, представлены соединениями разных классов – насыщенными углеводородами, липоциклопептидами, алкилоксибензолами, белками.

Впервые описаны феноменологически, выделены и идентифицированы вне клеточные адаптогены нового типа, контролирующие адгезивные свойства клеток в условиях стресса новой среды. Регуляторы адгезии представлены у P. fluorescens н-алканами и протеазами, у B. licheniformis – липоциклопептидом. Показано влия ние физико-химических факторов на величину обратимой адгезии клеток. Доказа на защитная функция обратимой адгезии клеток при воздействии стрессоров.

Установлена роль алкилоксибензолов как адаптогенов, защищающих клетки бактерий и дрожжей от стрессорных воздействий различной природы (теплового шока, -облучения, фотоокисления). Выявлена адаптивная функция АОБ в обеспе чении активного роста микроорганизмов при значениях температуры и рН, неоп тимальных для роста и близких к границам толерантности. Обнаружено, что фор мирование стрессового ответа сопряжено с повышением биосинтеза АОБ. Показа на зависимость адаптогенных эффектов АОБ от их структуры и концентрации.

Механизм протекторного действия АОБ включает их функционирование как мо дификаторов белков, эффективных перехватчиков активных форм кислорода (АФК), включая синглетный кислород, активаторов экспрессии стрессовых оперо нов (SOS-ответа и rpoS-регулона стационарной фазы). Доказана способность АОБ направленно модифицировать структуру ферментных белков, что приводит к из менению их каталитической активности и повышению операционной и функцио нальной стабильности. Короткоцепочечные АОБ (С7-АОБ) повышают активность ферментов в широком диапазоне концентраций, а длинноцепочечные (С12-АОБ) – при низких концентрациях повышают активность, а при более высоких – ингиби руют её. Повышение каталитической активности определяется повышением кон формационной (междоменной) подвижности белковой глобулы. Показана антиок сидантная активность АОБ, продукты окисления частично идентифицированы;

они сохраняют антиоксидантные свойства и способность модифицировать белки, действуя при меньших концентрациях, чем нативные АОБ.

Обнаружено концентрационное влияние длинноцепочечных АОБ на изме нение популяционного спектра бактериальных культур как способ реализации их адаптивного потенциала.

Доказанная видонеспецифичность внеклеточных адаптогенов может обеспе чивать их адаптогенные функции на уровне сообщества.

Полученные результаты существенно расширяют современные знания о биологии микроорганизмов в области саморегуляции стрессового ответа и при способлении микробных популяций к новым или неблагоприятным условиям ок ружения. На их основе сформулировано положение о системе внеклеточных адап тогенов микроорганизмов: «Микроорганизмы обладают системой ауторегуляции адаптации к неблагоприятным факторам среды разной природы и интенсивности.

Эта система включает внеклеточные метаболиты - адаптогены, оказывающие дей ствие на генном, молекулярном, клеточном и популяционном уровнях». Предлага ется считать внеклеточные адаптогены самостоятельной группой биологически активных веществ, функция которых – контроль адаптации микробной популяции к неблагоприятным факторам окружающей среды или новым условиям роста.

Практическая значимость 1. Полученные в работе результаты могут быть использованы для разработки эффективных способов направленной регуляции роста промышленных штаммов и сообществ микроорганизмов и повышения биосинтеза биологически активных веществ;

способов антиоксидантной защиты про- и эукариотных организмов;

для совершенствования методов борьбы с микробной контаминацией и биообраста ниями. Регуляторы адгезии могут быть использованы для предупреждения обра зования биопленок и при создании средств защиты материалов.

2. На основе природных АОБ и их химических производных разработаны способы: (а) стабилизации и направленного изменения активности ферментных белков;

(б) ингибирования ферментативной и микробной активности в бродиль ных производствах с целью консервации продукта, в частности при производстве пива, кумыса, кваса, молочнокислых продуктов;

(в) защиты материалов от биопо вреждений. На основе материалов диссертации получены патенты РФ (RU № 02329300 от 26.12.2006 и RU № 2400069 от 11.06.09), подготовлены и поданы 4 за явки на патенты РФ (№ 2009109569 от 17.03.09;

№ 2009134293 от 15.09.09;

№ 2010108915 от 11.03.10;

№ 2010108916 от 11.03.10).

3. На основе информации о структуре и механизмах действия АОБ созданы:

(1) серия биоцидных препаратов ИНМИОЛ, предназначенных для защиты мате риалов от биоповреждений и (2) серия препаратов СИДОВИТ для обработки се мян и посевов с целью защиты от фитопатогенной микрофлоры, повышения уро жайности, всхожести, лёжкости зерна и его технологических свойств. Препараты ИНМИОЛ и СИДОВИТ успешно испытаны в полевых условиях, что подтвержде но соответствующими актами. Экономический эффект от применения препаратов на основе АОБ в масштабах России может составить около 30 млрд. рублей в год.

4. Часть материалов диссертации рассматривается в курсе «Промышленная микробиология», читаемом на кафедре микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносо ва, а также вошла в учебное пособие «Основы динамической биохимии» (Плаку нов, Николаев, 2010).

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены в виде устных или стендовых сообщений и обсуждались на: Int. Symp. on Bacteriology and Appl. Мicrobiology, Paris, 2002;

Int. Symp. on Subsurface Microbiology, Copenhagen, 2002;

Всероссийской научно-технической конференции-выставке «Высокоэффек тивные пищевые технологии, методы и средства их реализации», Москва, 2003;

Втором Московском Международном Конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития», Москва, 2003;

35th COSPAR Scientific assembly, Paris, France, 2004;

Второй международной конференции «Микробное разнообразие: со стояние, стратегия сохранения, биологический потенциал, Пермь-Казань-Пермь, 2005;

15th IUPAB and 5th EBSA International Biophysics Congress, 2005, Montpellier, France;

Всероссийской молодёжной школе-конференции «Актуальные аспекты со временной микробиологии», Москва, 2005;

Пятой Национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования наноматериалов и наносистем (РСНЭ НАНО-2005), Москва, 2005;

Конференции «Коммуникация у бактерий», Москва, 2005;

Третьей научно практической конференции "МЕДБИОТЕК", Москва, 2006.;

VI национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, ней тронов и электронов для исследования материалов, Москва, 2007;

Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные ас пекты исследования симбиотических систем», Саратов, 2007;

Международной на учно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», Москва, 2008.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 60 работ, в том числе экспериментальных статей и 5 обзоров в печатных изданиях, рекомендованных ВАК, 1 учебное пособие (монография), 13 тезисов конференций, 2 патента РФ, заявки на патенты РФ.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из разделов: введе ние, обзор литературы, экспериментальная часть (материалы и методы исследова ния, результаты и обсуждение), практическое значение, заключение, выводы, спи сок литературы, приложения;

изложена на 355 стр., содержит 105 рисунков, таблицы. Список литературы включает 625 работ, в том числе 423 на английском языке.

Место выполнения работы и личный вклад соискателя. Основная часть работы выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, в лабораториях нефтяной микробиологии (зав. лаб. д.б.н. С.С. Беляев), почвенной микробиологии (зав. лаб. д.б.н. Н.С. Паников), классификации и хранения уни кальных микроорганизмов (зав. лаб. чл.-корр. РАН В.Ф. Гальченко). Часть резуль татов получена при выполнении совместных работ с Институтом химической фи зики им. Н.Н.Семёнова РАН (д.ф.н. Ю.Ф. Крупянский), кафедрами микробиоло гии и биофизики МГУ им. М.В. Ломоносова (д.б.н. Л.И. Воробьева, к.б.н. М.Г.

Страховская), Московским государственным университетом пищевых произ водств (д.т.н. М.В. Гернет, к.б.н. Е.Ф. Шаненко, асп. И.А. Конаныхина), Институ том биоорганической химии РАН (д.х.н. С.Г.Батраков);

Российским химико технологическим университетом им. Д.И. Менделеева (д.б.н. И.А. Крылов, асп.

С.С. Хабибулин), Российским государственным аграрным университетом – МСХА им К.А. Тимирязева (к.б.н. Т.И. Шатилова), Казанским институтом биохимии и биофизики Казанского НЦ РАН (к.б.н. Ю.В. Гоголев), Институтом клеточного и внутриклеточного симбиоза УРО РАН г. Оренбург (чл.-корр. РАН О.В. Бухарин, д.б.н. Н.В. Немцова, к.б.н. Н.Б. Перунова), Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (д.б.н. В.И. Дуда, к.б.н. Н.Е. Сузина), ГНИИ генетики и се лекции промышленных микроорганизмов (д.б.н. А.С. Миронов, к.б.н. Т.А. Воей кова). Часть работы выполнена во время стажировки автора в университете г.

Абердин, Великобритания.

Личный вклад соискателя состоял в планировании и проведении исследова ний, анализе и обобщении полученных результатов, их оформлении для публика ций.

Финансовая поддержка. Работа проводилась при финансовой поддержке РФФИ (гранты 03-04-48403-а;

04-04-49710-а;

05-04-48977-а;

05-04-49520-а;

06-08 01469-а;

07-04-01011а;

07-04-12121-офи;

08-04-90305-Вьет-а;

08-04-99078-р-офи), а также Фонда Уэлкама и Королевского общества Великобритании, НАТО.

Защищаемые положения:

1. Микроорганизмы различных таксономических групп обладают способно стью синтезировать специфические метаболиты - внеклеточные адаптогены (ВА), функцией которых является регуляция эффективности компенсаторно приспособительных реакций, обеспечивающих адаптацию микробных популяций к изменяющимся или неблагоприятным условиям окружения.

2. Стрессы, запрограммированные в циклах развития микробных культур, и стрессорные воздействия окружающей среды, являются факторами, стимулирую щими биосинтез микробных адаптогенов.

3. Обратимая адгезия клеток суспензионных культур является формой их адап тации к стрессорам разной природы. Ауторегуляторы адгезии концентрационно контролируют переходы между стадиями обратимой адгезии и планктонного су ществования.

4. Микробные алкилоксибензолы могут обладать функциями адаптогенов. За щитные эффекты АОБ в зависимости от их химической структуры реализуются как протекция клеток микроорганизмов от повреждающих воздействий или как сигнал тревоги для мобилизации защитных ресурсов клеток. Функции АОБ как сигналов тревоги опосредуются через контроль экспрессии генов стрессовых ре гулонов. Механизм протекторного действия АОБ включает их функционирование как структурных модификаторов ферментных белков, а также как антиоксидантов.

5. Фенотипическая диссоциация популяции, составляющая её адаптивный по тенциал, регулируется алкилоксибензолами, которые контролируют развитие оп ределённого варианта.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы основан на анализе 625 источников, содержит 6 глав, в которых рассматриваются типы стрессоров, типы ответов микроорганизмов на стрессорные воздействия, механизмы адаптации микроорганизмов, в том числе к конкретным стрессорам, связь факторов межклеточной коммуникации и стрессо вого ответа микроорганизмов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Бактерии: Escherichia coli MC4100, MJF274 и MJF276;

Micrococcus luteus NCIMB 13267;

Pseudomonas fluorescens NCIMB (NCIMB, Абердин, Великобритания);

E.coli c600, Bacillus licheniformis штамм № 12 (ФНЦ ГНИ ГСПМ), Bacillus subtilis BKM-B 428;

Pseudomonas aeruginosa (каф.

микробиологии МГУ);

дрожжи Saccharomyces cerevisiae (ИНМИ РАН) и Candida utilis BKM-Y 1668;

зелёные микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii Dang (каф.

биофизики МГУ). Бактерии выращивали на глюкозо-минеральных (К120 и М9) или сложных органических средах (LК, LB, МПБ);

дрожжи - на сусле (3.5оБл), в колбах на качалке (100-180 об/мин) при оптимальных температурах роста;

водо росль C.reinhardtii на среде Прата или М9 при постоянном освещении (1000 Лк) в статических условиях.

Микробиологические методы. Оптическую плотность (ОП) - светорассея ние клеточной суспензии измеряли нефелометрически (=540, 600 или 650 нм, l=10 мм). Массу сухих клеток (МСК) определяли после их высушивания до посто янной массы в течение 24 часов при температуре 105оС. Жизнеспособность клеток определяли по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве клеточ ных суспензий из ряда десятичных разведений на агаризованные среды. Термоус тойчивость клеток определяли после прогрева клеточных суспензий в ультратер мостате «UV-10» при соответствующих температурах в течение определённого времени с последующим определением числа КОЕ. Радиоустойчивость клеток оп ределяли по сохранению ими жизнеспособности (КОЕ) через 30 мин и 2 часа по сле -облучения интенсивностью 194 рад/с (установка ГУРХ 100000, -60Со). Ус тойчивость дрожжей к синглетному кислороду (1О2) определяли в клетках, фото сенсибилизированных хлорином е6, при их облучении монохроматическим лазе ром с =662 нм (20 мВт/см2) [Peng et al., 1997] с последующим определением чис ла КОЕ. Устойчивость к антибиотикам бактерий определяли, рассчитывая индекс ингибирования роста культуры IE=(1-ОПопыт/ОПконтр)х100. Микроскопические наблюдения проводили в микроскопе «Amplival» (Германия) с фазово контрастным устройством. Скорости роста и иные показатели роста бактериаль ных культур при изучении действия адаптогенов определяли по: 1) динамике све торассеяния их культур (=540, 600 или 650 нм - ОП540, ОП600, ОП650, КФК-2, КФК-56М, PyeUnicam);

2) численности колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве аликвот культур на плотные среды (МПА, сусло-агар и др.);

3) интенсив ности дыхания (выделению СО2), (ИК-анализатор «Инфралит», Германия).

Биохимические и физико-химические методы. В качестве химических ана логов микробных АОБ использовали алкилрезорцины С7-АОБ (5-метилрезорцин) и С12-АОБ (4-гексилрезорцин) (99% чистоты, синтезированные в МГУТХТ). Со единения вносили в реакционные среды в виде раствора в этаноле или в виде во дорастворимых К-солей. Концентрацию АОБ в образцах определяли с помощью колориметрической реакции с диазониевым производным 3,3’-диметоксибензи дина (реактивом Fast Blue B Salt diazotized (FBB), Sigma) [Tluscik et al., 1981]. Ко личество белка определяли колориметрически по методу Лоури [Lowry et al., 1951] или в реакции с Кумаси синим (Fluka) [Bradford, 1976]. Активность трипси на (Sigma) определяли модифицированным методом Ансона [Грачева с соавт., 1982]. Значения Кm и Vmax трипсина определяли из зависимостей Лайнуивера Бэрка. Активность - и -амилаз (Fluka) определяли по количеству образующихся при гидролизе крахмала редуцирующих веществ с 3,5-динитросалициловой ки слотой (Fluka) [Грачева с соавт., 1982;

Miller, 1959]. Вязкость растворов белков определяли вискозиметрическим методом [Алейникова, Рубцова, 1988]. Степень набухания белка определяли по модифицированной методике [Зимон, Лещенко, 2001]. Гель-фильтрацию растворов белков проводили на колонке (35,0х2,5 см), за полненной сефадексом G-75 (Chemapol). Продукты окисления АОБ определяли методом хромато-масс-спектрометрии (ХМС) на масс-спектрометре модели 5973 с газовым хроматографом модели 6890 (Hewlett Packrd, США), для детекции сво бодных радикалов использовали ЭПР-спектрометр (ЭПР-спектрометр ESR 70- XD/2, Bruker BioSpin). Для идентификации разделенных веществ использовали спектральные библиотеки NIST98 и Wiley275. О физико-химических свойствах микробных адаптогенов судили по сохранению/потере ими биологической актив ности после: 1) инкубации при рН 1 или 11;

2) прогревания (100оС, 20 мин;

3) ин кубации с протеиназой К (иммобилизованной на стекле, BDH, UK)(0,2 мг/мл, 2 ч, 30оС);

4) адсорбции на гидрофобном носителе (картридж Sep-Pak C18, Millipore, UK) с последующей элюцией метанолом. Молекулярную массу адаптогенов оце нивали методом ультрафильтрации (фильтр Centriplus с мембраной YM Millipore, UK, для молекул с М=3-10 кДа или в камере типа "Amicon", Россия, с мембранами Diaflo РМ-10, с порогом отсечения молекул с М10 кДа). Антиоксидантную ак тивность АОБ определяли по реакции обесцвечивания красителя дихлорфенолин дофенолята натрия в присутствии препаратов, а также на приборе «Цвет Яуза-01 АА». Молекулярную динамику лизоцима, модифицированного С7-АОБ и С12 АОБ, исследовали методами Рэлеевского рассеяния Мёссбауэровского излучения (РРМИ), диффузного рассеяния рентгеновских лучей (ДРРЛ) и молекулярно динамического компьютерного моделирования (МДКМ) (в лаборатории молеку лярной динамики ИХФ им. Н.Н. Семёнова РАН, д.ф.н., проф. Ю.Ф. Крупянский).

Генетические методы. Генотоксическое (мутагенное) или антимутагенное действие алкилоксибензолов выявляли в стандартном тесте без метаболической активации [Maron, Ames, 1983] с ауксотрофным по триптофану штаммом В Bacillus subtilis trpA5. Предварительно оценивали рост-ингибирующую актив ность алкилоксибензолов (С7-, С12-АОБ) по их влиянию на развитие этого штам ма. Для исследования влияния АОБ на активность стрессовых генов SOS-ответа (umuD) и rpoS-регулона (osmE) были получены тестерные штаммы на основе E.coli c600 thi, thr, leu pro-lac со встроенной малокопийной плазмидой pJEL246, несущей гибридные опероны umuD::lacZ и osmE::lacZ (во ВНИИГенетика, д.б.н., проф. А.С. Миронов). Об уровне экспрессии стрессовых генов судили по активно сти -галактозидазы, которую определяли по расщеплению субстрата (о нитрофенил--галактопиранозида) [Грачёва, 2005].

Методы идентификации микробных антиадгезинов. Антиадгезин P.fluorescens получали твердофазной экстракцией культуральной жидкости на ко лонке с гидрофобным сорбентом (Sep-Pak C18, Millipore) и идентифицировали ме тодом хромато-масс-спектрометрии на хроматографе 6890 и масс-спектрометре 5973 (Hewlett Packard) с использованием спектральных библиотек Willey275 и NIST98 по программе ChemStation (Hewlett Packard). Антиадгезины B.licheniformis получали методами колоночной хроматографии на силикагеле L100/160 (Lachema, Czech Republic) и тонкослойной хроматографии на пластинах с силикагелем (Merck, Germany) с выявлением аминной, амидной, эфирной, диольной, фосфат ной групп [Vaskovsky, Latyshev, 1975;

Kates, 1986]. Состав жирных кислот опреде ляли методом ХМС [Batrakov et al., 2003]. Аминокислотный состав определяли методами ТСХ и ХМС. ИК-спектры снимали на спектрометре Specord 71 (Carl Zeiss, Germany), в таблетках KBr. Спектры 13С-ЯМР получали на установке Unity Plus instrument (Varian, USA) [Batrakov et al., 2003].

Биотесты для обнаружения ВА. Для выявления ВА, влияющих на рост мик роорганизмов, в тест-культуры опытных вариантов фазы экспоненциального роста вносили культуральные жидкости (КЖ) (до 50% об.) от культур, подвергшихся действию стрессора (тетрациклин, окислитель N-этилмалеимид (NEM), выдержи вание при 44-50оС или 5-15оС в течение 1 ч) или от культур, растущих в обычных, не стрессовых, условиях – контрольные варианты. КЖ получали, отделяя клетки центрифугированием и мембранной фильтрацией ( пор 0.2 мкм). О наличии ВА судили по изменению скорости роста или по уменьшению лаг-периода опытных и контрольных культур, растущих в стрессовых или стандартных условиях, соответ ственно. Результаты были представлены количественно. Защитный эффект (К) выражали как К=К1+К2, где К1- степень восстановления скорости роста, К2 степень сокращения лаг-периода;

К1=(µпр-µмин)/ (µмакс-µмин);

К2=(t-tпр)/t, где µмакс скорость роста контрольной культуры в отсутствие стрессора, µмин - скорость рос та в опыте в присутствии стрессора, µпр - скорость роста в присутствии стрессора и протектора (тестируемой КЖ), t - продолжительность лаг-периода в присутствии стрессора, tпр-продолжительность лаг-периода в присутствии тестируемой КЖ.

К=1 означает полное элиминирование стрессового воздействия, К=0 - отсутствие протекции.

Наличие ВА, влияющих на адгезию псевдомонад и бацилл, определяли по разнице в величине ОП культур лаг-фазы, после инокулирования отмытыми клет ками экспоненциально растущей культуры без (контроль) или с добавлением (опыт) КЖ (50% об) экспоненциальной культуры. Начальная ОП составляла 0.05 0.1 ед. (Pye-Unicam SP-450 UV/VIS, с ценой деления шкалы 0.01). Адгезию клеток характеризовали по показателям: величины адгезии, рассчитываемой по формуле:

(ОПнач-ОПмин)/ОПнач, где ОПнач и ОПмин - ОП в момент засева и в момент достиже ния минимальной ОП (максимальной адгезии), соответственно;

времени удержа ния - времени, прошедшего от момента внесения инокулята до начала схода кле ток с поверхности культиватора, что регистрировалось по резкому возрастанию ОП культуры. За 1 ед. антиадгезина принимали такое его количество в 1 мл, кото рое приводило к снижению адгезии клеток в опытной культуре в 2 раза по срав нению с контрольной. Наличие летучих метаболитов P.fluorescens, влияющих на адгезию клеток, определяли по ОП тест-культуры в свежей среде при подаче в колбу воздуха от культуры-источника. Устойчивость адгезированных клеток (B.licheniformis) к окислительному стрессу (NEM, 200 M, 20 мин) определяли по численности КОЕ в суспензии клеток, десорбированных с использованием стек лянных шариков (d=1-2 мм, встряхивание на качалке, 1мин).

Расчёты и статистическая обработка данных. Эксперименты проводили в 3-5 повторных опытах с 2-3 параллельными вариантами в каждом. Статистические расчёты проводили на ПЭВМ с использованием программ Статграф и Excell-2003.

На графиках представлены результаты типичных физиологических (ростовых) экспериментов;

на остальных иллюстрациях и в таблицах приведены средние арифметические значения. При сравнении опытных и контрольных данных по критерию Стьюдента их считали различающимися для р0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследование состояло из трёх частей, соответствующих трём основным эта пам исследования ауторегуляторов. На первом этапе (этапе поиска новых адапто генов с применением биотестов) исследовали феноменологию ауторегуляции адаптации у ряда микроорганизмов - про- и эукариот к стрессорным воздействиям разной природы и интенсивности. На втором этапе (выделения и идентификации адаптогенов) исследовали аутореуляцию малоисследованной формы адаптации микроорганизмов - обратимой адгезии и идентифицировали вещества - ауторегу ляторы адгезии. В третьей части описаны адаптогенные функции и механизмы действия алкилоксибензолов, известных ранее как ауторегуляторы образования покоящихся форм микроорганизмов.

Глава 1. Роль внеклеточных ауторегуляторов в адаптации микроорганизмов про- и эукариот к стрессу новой среды, неоптимальным параметрам роста и шоковым воздействиям.

Доказана способность микроорганизмов различных таксономических групп в присутствии стрессоров разной природы и силы (вызывающих снижение скорости роста, остановку роста, биоцидный эффект) продуцировать внеклеточные метабо литы, участвующие в защите клеток от этих стрессоров.

1.1. Адаптогены к стрессам, замедляющим рост бактерий.

На этом этапе работы для описания адаптогенов использовали биотесты, вы деления веществ, ответственных за биологический эффект, не проводили. В экс периментах культуральные жидкости (КЖ), содержащие адаптогены – «стрессо вые» КЖ, получали от культур после воздействий: антибиотика тетрациклина ( мкМ);

повышенной (44-48оС) или пониженной (5-15оС) температур;

окислителей (Н2О2 и NEM, 10 мкМ). Биологические эффекты этих КЖ проверяли при действии на тест-культуры следующих стрессоров: тетрациклина (50 мкМ), NaCl (0.7 М), NEM (10 мкМ), повышенной температуры (44оС) (рис.1).

а б 1 1, 0, ОП ОП 0,8 0, 0, 0, 0,2 0 2 4 ч 0 1 ч 2 в г 1,2 0, 0, 0, ОП ОП 0, 2 0,3 0,4 0, 0, 0 1 2 3 4 0 1 ч2 3 4 ч д 1, Рис. 1. Рост E.coli без и с внесением 1 «стрессовой» КЖ (после действия тетра 0, ОП циклина) при действии различных стрес 0,6 соров: а – тетрациклина (100 мкМ), б – Н2О2 (500 мкМ), в – NEM (10 мкМ), г – 0,4 NaCl (0.7 M), д – Т=44оС. 1 –добавление 0, свежей среды роста, 2 –добавление 0 «стрессовой» КЖ, 3 – рост в отсутствие стрессора при Т=37оС.

0 1 2 ч Воздействия стрессоров различным образом влияли на рост E. сoli: I. При внесении тетрациклина или инкубации при высокой температуре рост бактерий продолжался без периода задержки, но с меньшей скоростью (рис. 1 а, д). Ско рость роста в контрольных вариантах (без стрессовой КЖ) снижалась с 0.8-0.9 ч- до 0.45 ч-1 в присутствии тетрациклина и до 0.45-0.6 ч-1 при тепловом шоке. II. В присутствии окислителей - Н2О2 и NEM, рост останавливался и после периода за держки возобновлялся со скоростью, близкой к первоначальной (рис. 1 б, в). Пе риод задержки роста составлял 3-4 ч для Н2О2 и 2-3 ч для NEM. III. При осмотиче ском шоке (NaCl 0.7 М) наблюдали задержку роста на 0.5-1.5 ч, после чего рост продолжался с пониженной скоростью 0.2 ч-1.

Во всех стрессовых ситуациях в опытных вариантах добавление (50% об.) «стрессовой» КЖ, полученной при тетрациклиновом стрессе, способствовало адаптации культур: превышение скорости роста по сравнению с контролем (без «стрессовой» КЖ) в условиях тетрациклинового стресса составило 20-50%;

в ус ловиях температурного стресса – 15-60%;

период восстановления экспоненциаль ного роста сократился при окислительном стрессе, вызванном Н2О2 на 1-2 ч, вы званном NEM - на 1.5-2.5 ч, при осмотическом шоке - на 1 ч. Отметим, что при действии окислителей (рис. 1 б, в), скорость роста тест-культур под влиянием «стрессовой» КЖ полностью восстанавливалась, что можно объяснить вероятной антиоксидантной активностью ВА.

Образование защитных экзометаболитов клетками E.coli было показано в ус ловиях других стрессорных воздействий: внесении NEM (окислительный стресс), инкубации при низкой (5-15оС) или высокой (44-48оС) температурах (холодовой или тепловой стресс, соответственно). Протекторные эффекты полученных в этих условиях КЖ были проверены при действии на тест-культуру различных стрессо ров. Величины защитного действия различных «стрессовых» КЖ в различных стрессовых условиях представлены в табл. 1.

Установлено (рис. 1, табл. 1), что «стрессовые тетрациклиновая и NEM» КЖ защищали клетки E.coli, от действия тех же стрессоров – теплового шока и окис лителей, практически полностью снимая их рост-ингибирующее действие, однако не защищали клетки от тетрациклинового стресса и минимально - от осмотическо го шока. «Холодовая» КЖ была эффективна против термо- и осмотического стрессов, не действовала при тетрациклиновом стрессе и оказывала минимальный эффект в условиях NEM-стресса. Наибольшими защитными свойствами от дей ствия всех испытанных стрессоров обладала тетрациклиновая КЖ.

Таблица 1. Величины защитного эффекта К* культуральных жидкостей E.coli, получен ных в разных стрессовых условиях, и испытанных при действии различных стрессоров.

Стрессор при полу- Стрессовые условия испытания КЖ 44оС чении «стрессовой» NEM Тетрациклин NaCl КЖ Окислитель, NEM 0.85 0 0.25 0. Тетрациклин 1.0 0.15 0.23 0. о Нагрев (44-48 С) 0.65 0 0.23 0. о Холод (5-15 С) 0.15 0 0.25 0. * Защитный эффект рассчитывали по формуле К=К1+К2, как описано в методах исследо вания. К1 отражал степень восстановления скорости роста, К2 - сокращение периода за держки перед восстановлением экспоненциального роста.

Различия в действии «стрессовых» КЖ могут быть обусловлены поликомпо нентностью внеклеточных адаптогенов, как это имеет место для галобактерий и E.coli [Кокоева, Плакунов, 1996;

Вахитов, 2007]. Не менее вероятно, что стрессо протекторами являются соединения, обладающие антиоксидантной активностью, нейтрализующие избыток образующихся активных форм кислорода, уровень ко торых различен в различных стрессовых условиях. Этому предположению не про тиворечат наблюдения, показавшие, что E.coli в стрессовых условиях выделяет в окружающую среду низкомолекулярные SH-содержащие метаболиты антиоксиданты [Воробьёва с соавт., 1995;

Октябрьский, Смирнова, 2007].

Таким образом, в условиях стресса конкретного типа (тетрациклинового или другого) клетки бактерий выделяют внеклеточные метаболиты, способствующие более эффективной адаптации к этому, а также другим типам стресса (окисли тельному, осмотическому и тепловому).

1.2. Адаптогены к стрессам бактерицидной интенсивности.

Была выявлена способность бактерий образовывать в условиях более сильно го стрессового воздействия, вызывающего частичную потерю клетками жизнеспо собности (сублетальной температуры 48-50оС) внеклеточные метаболиты, защи щающие клетки при воздействии стрессоров бактерицидной интенсивности (ус ловное - название фактор ХII). Добавление такой «стрессовой» КЖ E.coli к экспо ненциально растущей культуре E.coli (50% об) снижало скорость её роста с 0.82±0.07 ч-1 до 0.13±0.15 ч-1 (на 80-90 %). Отметим, что КЖ от культур, подверг шихся более мягкому нагреванию (44-48оС) (содержащих адаптогены с условным названием фактор ХI), таким рост-замедляющим действием не обладали. Адапто генная функция фактора ХII была выявлена в опыте, результаты которого пред ставлены на рис. 2.

В две культуры с одинаковой ОП - контрольную и опытную, имеющую сниженную скорость роста вследствие 1.5-часовой прединкубации с фактором ХII, вносили окислитель (NEM, 200 мкМ). В результате окислительного стресса чис ленность клеток в контрольном варианте быстро снижалась (со скоростью 1. lg/час). Добавление КЖ, содержащей фактор XII непосредственно перед внесением NEM (без прединкубации), замедляло более чем в 2 раза скорость гибели культу ры в течение первого часа (до 0.7 lg/час), после чего скорость отмирания станови лась такой же, как в контроле. Прединкубация клеток (1.5 час) со стрессовой КЖ до внесения NEM многократно усиливала защитный эффект: первоначальная ско рость отмирания была в 8 раз ниже, чем в контроле (0.2 против 1.7 lg/час), а коли чество КОЕ через 3 часа инкубации выше в 1000 раз.

Оба фактора, ХI и ХII, имели массу менее 10 кДа, были устойчивы при рН 1 и 11, различались устойчивостью при хранении (4оС, 7 сут.) и кипячении (10 мин.) – в этих условиях ХI - не стабилен, ХII – стабилен. Они также различались условия ми образования и защитными эффектами (рис. 3, 4): ХI имел функции адаптогена протектора прямого действия, ХII - индуктора, запускающего систему адаптивных реакций для повышения жизнеспособности клеток после необходимой прединку бации с ним (рис. 2, 4).

Таким образом, при воздействии одного и того же стрессора, в зависимости от его дозы, микроорганизмы реализуют два пути защиты (адаптации), различаю щихся химической природой синтезируемых внеклеточных адаптогенов и меха низмами их защитного действия: при умеренном, рост-замедляющем, действии стрессора реализуется система протекторной защиты, при рост-останавливаю щем, сублетальном действии стрессора - система индукции адаптивных ресурсов.

КОЕ, % Рис. 2. Влияние «стрессовой» КЖ E.coli (условия получения - тепловой шок, 48 0,1 50оС) на отмирание клеток в присутст вии 200 мкМ NEM. 1- контроль без до 0,01 1 бавления «стрессовой» КЖ;

2 – в при сутствии «стрессовой» КЖ, добавленной 0, одновременно с внесением NEM;

3 – как 0,0001 2, но КЖ добавлена за 1.5 ч до внесения 0 1 2 ч NEM.

Отн. ед.

оС Отн. ед 100 80 3 II 1 I 40 40 4 0 0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 % мин Рис. 3. Накопление внеклеточных адапто- Рис. 4. Зависимость активности факторов генов у E.coli в ходе теплового стресса. 1 ХI и ХII E.coli от их концентрации. По оси – температура;

2 – относительное содер- абсцисс - концентрация факторов в % от жание веществ, поглощающих при 270 нм, их концентрации в исходной КЖ (соот отражающее степень повреждения клеток;

ветствует %-ному содержанию КЖ). По 3 - содержание фактора ХI. 4 - содержание оси ординат - их активность в % от мак симальной.

фактора ХII.

1.3. Адаптогены к стрессу новой среды.

В биотесте на стресс новой среды клетки культуры E.coli, экспоненциально растущей в богатой органической среде LB, отмытые от среды роста, переносили в свежую глюкозо-минеральную среду К120, без добавления (контроль) или с до бавлением КЖ (50% об.) от культуры, росшей экспоненциально на среде К (опыт). Биотест более эффективен при использовании малых доз инокулята (0.5 % об.).

Смена состава питательной среды вызывала задержку роста в контрольном варианте на 6-7 часов, тогда как в опытных вариантах лаг-период сокращался до часа, что указывало на наличие в КЖ растущей культуры фактора адаптации к но вой среде (ФАНС). Этот фактор начинал внеклеточно накапливаться уже через минут после внесения инокулята в свежую среду роста, был термолабилен и пол ностью разрушался за 30 мин при 120оС (рис. 5).

1.4. Внеклеточные адаптогены разных микроорганизмов Способность микроорганизмов продуцировать внеклеточные адаптогены:

факторы ХI, ХII и ФАНС, защищающие клетки от стрессорных воздействий, была продемонстрирована также для ОП540 других бактерий (P.fluorescens 1, и B. subtilis и дрожжей (C.

utilis).

P.fluorescens синтезировала 0, адаптоген прямого действия – + КЖ фактор ХI, который повышал 0, устойчивость бактерий в усло 0,4 LB-K120 виях супраоптимальных темпе ратур, высоких и низких значе 0, ний рН, а также фактор адапта 0 ции к новой среде;

оба метабо 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 лита представлены низкомоле ч кулярными амфифильными со Рис. 5. Рост E.coli после перенесения отмытых кле единениями небелковой приро ток из среды LB в среду К120.

ды. Псевдомонада также обра зовывала вещества, подавляю щие её адгезию (см. гл. 2). Все три фактора адаптации бактерий B.subtilis и E.coli (ФАНС, XI и XII) обладали Таблица 2. Эффективность перекрёстного действия вне- перекрестным действием клеточных факторов адаптации - ФАНС, ХI и ХII E.coli, между собой, но не с B.subtilis и C.utilis. C.utilis, на которую дейст вовал только фактор XI Объект полу- Фактор Тест-объект воздействия E.coli (табл. 2). C.utilis чения «стрес- «стрессовой» КЖ продуцировала ФАНС, совой» КЖ B.subtilis E.coli C.utilis действующий на обе бак ФАНС + + терии, а также XII, дейст B.subtilis XI + + вующий только на XII + + B.subtilis.

ФАНС + + Приведённые резуль E.coli XI + + + таты демонстрируют спо XII + + собность микроорганиз ФАНС + + мов различных физиоло C.utilis XI - - гических групп синтезиро XII + - Обозначения: + наличие эффекта, - отсутствие эффекта вать внеклеточные факто в биотестах при тепловом шоке (44оС или 50оС) и стрес- ры адаптации, синтез которых стимулируется се новой среды.

стрессорными воздействиями разной природы и разной интенсивности как запла нированными в цикле развития культур (стресс новой среды), так и неблагоприят ными факторами среды - воздействиями токсикантов, экстремальных значений температуры, рН, солёности. Механизмы защитного действия внеклеточных адап тогенов различаются (протекция или индукция).

Выявленное перекрёстное действие внеклеточных адаптогенов предполагает, что в микробном сообществе имеют место межвидовые взаимодействия, осущест вляющиеся с участием низкомолекулярных видонеспецифичных метаболитов, и обеспечивающие его устойчивое функционирование.

Один из типов ауторегуляторов, антиадгезины, были более детально исследо ваны на втором этапе работы.

Глава 2. Ауторегуляция бактериальной адгезии Обратимая адгезия микробных клеток в погружённых культурах является формой их адаптации к стрессу новой среды и контролируется внеклеточными ау торегуляторами с активностью антиадгезинов.

Жизнь в прикрепленном состоянии является одной из стратегий обитания бактерий в разных экотопах, а адгезия является универсальной адаптивной реак цией, повышающей защищенность микроорганизмов в неблагоприятных для роста или повреждающих условиях. Исследования адгезии, в основном, посвящены изу чению факторов, усиливающих прикрепление клеток [Marshall, 1985, 1996]. Меха низмы снижения клеточной адгезии изучены недостаточно. Информации о регу ляции первого этапа адгезии, её обратимой стадии, до наших работ не было. Обра тившись к вопросу обратимой адгезии бактерий мы исследовали её ауторегуляцию и роль в ответе P. fluorescens и B.licheniformis на стресс новой среды.

2.1. Регуляция обратимой адгезии клеток Pseudomonas fluorescens Обратимое прикрепление клеток планктонной культуры P. fluorescens к стек лу культиватора проявлялось при переносе активно растущих бактерий (на среде М9) в свежую среду того же состава и усиливалось при использовании малых ко личеств инокулята (ОП600=0.07-0.1). Процесс визуализировался характерным ви дом кривой роста "с провалом" в течение первого часа после внесения инокулята (рис. 6). После наблюдаемого снижения численности клеток в водной фазе (уча сток 1) следовала фаза восстановления ОП суспензии за счет быстрого схода кле ток с поверхности стекла (участок 2), после чего культура продолжала экспонен циальный рост с той же скоростью, что и контрольная (участок 3). Цикл адгезии схода проходил за время, меньшее времени генерации клеток.

Важным элементом обратимой адгезии оказалось существование тонкого ме ханизма её регуляции. Пунктирная кривая 4 на рис. 6 отражает рост опытной культуры в присутствии КЖ (50% об) от собственной экспоненциально растущей культуры псевдомонады. Ингибирование адгезии клеток внесением КЖ экспонен циальной культуры обусловлено наличием в ней ауторегуляторов, снижающих ад гезивные свойства псевдомонад. Антиадгезины культуральной жидкости были идентифицированы (гл. 2.3).

ОП Рис. 6. Рост культуры P. fluorescens в среде М9. 1 - снижение ОП культу ры, вызванное адгезией клеток на стенках культиватора, 2 –возрастание ОП за счет схода клеток, 3 - экспо 4 ненциальный рост культуры, 4 – рост 0, опытной культуры в присутствии КЖ экспоненциально растущей культуры (50% об.) или препарата антиадгези на, смеси углеводородов, в концен трации 15 мкг/л.

0, 0 2 4 ч 2.2. Регуляция обратимой адгезии клеток Bacillus licheniformis Для клеток B. licheniformis, как и для клеток псевдомонад, характерны высо кие адгезионные свойства. Обратимая адгезия бацилл наблюдалась в лаг-фазе рос та при стрессе свежей или новой по составу среды (замене глюкозы на ацетат), в большей степени адгезия была выражена в условиях двойного стресса – если в дополнение к смене среды роста неоптимальными для роста были значения тем пературы, рН, солёности, концентрации ионов Са2+ (рис. 7). Для всех вариантов роста бацилл в неблагоприятных условиях установлена обратная зависимость ско рости роста культуры и величины адгезии клеток. В условиях, приближающихся к неростовым, адгезия приобретала необратимый характер. Было показано, что кон центрация и вид источника углерода в новой среде влияют на степень адгезии бак терий. Так, клетки B.licheniformis, выросшие в среде с глюкозой, обеспечивающей рост с высокой скоростью, и перенесенные в среду с ацетатом или в голодную среду, быстро прикреплялись к стеклу сосуда.

В механизмах регуляции адгезии задействованы механизмы, связанные как с подвижностью клеток, так и усилением синтеза адгезинов в неоптимальных усло виях роста. Внесение в голодающую по углероду культуру B.licheniformis 603 ан тибиотиков (хлорамфеникола и доксициклина), нарушающих синтез белка, сни жало количество прикреплённых клеток. Это можно объяснить нарушениями в синтезе поверхностных адгезинов, аналогично описанным эффектам ингибирова ния хлорамфениколом прикрепления к твердой поверхности морских бактерий [Раилкин, 1998] и действия ванкомицина и тейкопланина на адгезию стафилокок ков [Carcenty-Etess et al., 1993;

Drago et al., 2003]. Полученные результаты согла суются с данными об адаптивном значении адгезионного фенотипа - при голода нии у морских вибрионов и спирилл [Kjellerberg, 1984], Acinetobacter sp. [James et al., 1995], позволяющего утилизировать молекулы органического вещества, сор бированные поверхностью [Morgan, Dow, 1986;

Marshall, 1996], и снизить энерге тические затраты на передвижение [Паников, 1991].

а б 1,2 - Уд. скорость роста, ч - Уд. скорость роста, ч 0, 0,8 Адгезия, % 0, Адгезия, % 0, 0,4 30 0,2 0, 20 0, 10 -0, -0,4 0 0 0 20 40 60 0 50 [NaCl], г/л o t, C в - Уд. скорость роста, ч 0, Адгезия, % 0, 0,4 0,2 2 Рис. 7. Влияние температуры (а), концен 0 трации NaCl (б) и концентрации Са2+ (в) 0,0001 0,001 0,01 0,1 1 на рост (1) и адгезию (2) B. licheniformis.

2+ [Ca ], M Основная информация о широко известной высокой стрессоустойчивости прикреплённых клеток микроорганизмов относится к биопленкам с развитым мат риксом, что определяется фенотипами клеточной персистентности или покоя, а также защитными свойствами матрикса [Olson et al., 2002;

Jefferson, 2004;

Льюис, 2005]. О стрессоустойчивости обратимо прикрепленных бактерий сведений до наших исследований не было. Повышенная устойчивость обратимо адгезирован ных клеток B. licheniformis была продемонстрирована в экспериментах при ле тальном воздействии на них сильного окислителя (NEM, 200 мкM): доля выжив ших клеток в субпопуляции прикрепленных к стеклу бактерий оказалась в 10 раз выше по сравнению с неприкрепленными (рис. 8).

Повышение устойчивости адгезированных клеток может быть обусловлено изменением уровня экспрессии стрессовых генов. Например, при контакте с по верхностью в клетках P.aeruginosa усиливается экспрессия генов, ответственных за выработку альгината и супероксиддисмутазы [Donlan, 2002;

Sauer et al., 2002].

Не исключено также, что контакт клетки с поверхностью индуцирует генерализо ванные фазовые переходы мембранных структур, влияющие на их устойчивость и функциональную активность [Конев, 1987].

Таким образом, обрати КОЕ, % от 100% в исходной популяции Количество жизнеспособных клеток, 100 мая адгезия является способом быстрого реагирования микро организмов на стресс без изме нения стратегии жизни в про 1:1ОО 1 тивоположность необратимой адгезии. В состоянии обрати мой адгезии организм получает 0,9 0, возможность выбора: вернуть 1:1О ся к прежнему, планктонному 1 способу существования с высо кой скоростью роста, но и вы 0, сокой чувствительностью к Исходно После обработки NEM действию неблагоприятных факторов, или перейти к при Рис. 8. Численность жизнеспособных клеток (КОЕ) крепленному существованию с B. licheniformis в субпопуляциях свободно плаваю более низкой скоростью роста, щих (1) и прикрепленных (2) клеток до и после воз но с повышенной устойчиво действия окислителя (NEM, 200 мкм). 1:10 и 1:100 – стью к повреждающим воздей величина снижения концентрации КОЕ.

ствиям.

2.3. Идентификация химической структуры внеклеточных регуляторов адгезии псевдомонад и бацилл *.

Идентификация действующего начала любого ауторегулятора является необ ходимым этапом его исследования, так как информация о химической структуре и свойствах вещества позволяет повысить как эффективность исследования меха низмов его действия и выяснения роли в развитии микробных популяций, так и рекомендовать пути практического применения.

2.3.1. Антиадгезины псевдомонад. Регуляторы с функциями антиадгезинов, кон тролирующие сход адгезированных клеток P. fluorescens в водную фазу, были вы делены из КЖ экспоненциально растущих культур и идентифицированы методом хромато-масс-спектрометрии как смесь высокомолекулярных насыщенных нераз ветвленных углеводородов (УГВ) с длиной цепи 21-33 атомов углерода (табл. 3).

Суммарная концентрация УГВ в КЖ культуры P. fluorescens составляла 10- мкг/л (0.1-3.0 мкг/л отдельных индивидуальных компонентов смеси). Внесение препаратов очищенной фракции, а также индивидуальных УГВ в культуру бакте рий в условиях стресса новой среды приводило к уменьшению количества адге зированных клеток аналогично действию КЖ (рис. 6). При этом снижение адгезии клеток сопровождалось усилением их агрегации в водной фазе.

Исследования проводили совместно с д.х.н. С.Г. Батраковым, о чём автор помнит * с глубокой благодарностью Другой внеклеточный антиадгезин P.fluorescens, присутствующий в КЖ, был определён как белок с протеолитической активностью. Внесение в растущую культуру КЖ, содержащую белковый антиадгезин, приводило к подавлению адге зии клеток с одновремен Таблица 3. Углеводороды (н-алканы) в составе антиад ной активацией протеоли гезина P.fluorescens.

за и нарастанием в среде Концентра- Раствори Название Число концентрации белка. Вне ция в КЖ мость (нг/ атомов сение в культуру псевдо мл воды) (нг/мл) С монад модельного антиад 0, н-хенэйкозан гезина, протеиназы К, вос 0, н-докозан производило действие 8, 1, н-трикозан экспоненциальной КЖ 6, 1, н-тетракозан 4, 1, н-пентакозан 25 происходило значительное 3, 3, н-гексакозан 26 снижение адгезии клеток.

2, 1, н-гептакозан 27 Так как клетки псев 2, 1, н-октакозан 28 домонад имеют на клеточ 1, 1, н-нонакозан 29 ной поверхности адгезины 1, 0, н-триконтан глико-протеиновой приро 1, 0, н-хентриаконтан ды [Christensen et al., 1985;

0, 0, н-дотриаконтан Read, Costerton, 1987], то 0, 0, н-тритриаконтан наиболее успешным инги бирование адгезии клеток было при одновременном действии обоих антиадгези нов, содержащихся в КЖ псевдомонад - УГВ и протеазы.

Контроль адгезии грамотрицательных бактерий в условиях стресса новой среды, по-видимому, осуществляется двумя путями. Низкомолекулярные гидро фобные ауторегуляторы, н-алканы, блокируют липкие концы клеточных адгезинов и препятствуют прилипанию клетки к поверхности. Кроме того, они способствуют формированию в водной фазе тяжелых многоклеточных агрегатов за счет слипа ния клеток друг с другом, что также не способствует адгезии клеток на поверхно сти. Антиадгезины второго типа – протеазы, разрушают белковую часть молекулы адгезина, отщепляя его липкий конец, что препятствует адгезии и способствует сходу прикрепленных клеток.

2.3.2. Антиадгезины бацилл. Другим организмом, для которого определили хими ческую природу антиадгезина, были бактерии B. licheniformis. На основании ре зультатов ИК-спектроскопии, 1H- и 13C-ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии в сочетании с методами химического и энзиматического гидролиза бациллярный антиадгезин был идентифицирован как циклический липопептид, кольцевая часть которого составлена 7 аминокислотными остатками, а липидная - остатками 3 гидроксижирных кислот (рис. 9). Циклогептапептид ацилирован по N терминальной аминокислоте L-Asp, 3-гидроксижирной кислотой. Жирная кислота представлена смесью гомологов (13:0 - 17:0 с п-, изо- и антеизо- цепями), её 3-OH группа этерифицирована С-терминальной аминокислотой, L-Leu. Вещество такой структуры выделено впервые.

Антиадгезин обнаружен в культуральной жидкости и час CH CH тично связан с клетками (2:1).

CH (CH ) Связанный с клетками липоцик ЖК CH лопептид составлял 57% от об CH щей массы экстрагируемых вне CH O CH COOH CO клеточных липидов. При его кон CH NH CH CO L-Асп CH CH CH CH L-Лей центрации в культуральной жид CO 3 NH CH кости 1.6 мкг/мл он полностью NH L-Лей CHCH CH COOH CO подавлял адгезию клеток B.

CO CH CH CH L-Глу CH 2 NH licheniformis к стеклу (показано в L-Лей NH CHCH CO L-Вал прямом опыте).

CO CHNH L-Вал CH CH Следует отметить, что ли CO CH NH CH CH CH CH CH 3 поциклопептиды другой, но CH CH сходной структуры (лихенизины, сурфактины) были обнаружены у Рис. 9. Структура антиадгезина B. licheniformis.

некоторых других грамположи тельных бактерий как биосурфак танты с неизвестной биологической функцией бактерий [Konz et al., 1999;

Doekel, Marahiel, 1999;

Yakimov et al., 1999]. С описанием липоциклопептида B.

licheniformis 603, стала известной, по крайней мере, одна из функций этих липо пептидов – регуляция адгезии. Кроме того, антиадгезин B. licheniformis проявлял выраженную антимикробную активность против клеток Corynebacterium variabilis, обладающих гидрофобизированной поверхностью. Полученные нами результаты объясняют данные Колари [Kolari et al., 2001] об ингибировании образования био плёнки Deinococcus geothermalis при совместном культивировании или добавле нии бесклеточного экстракта B. licheniformis.

Полученные в данном разделе исследований результаты, позволяют сделать ряд заключений о роли и механизмах начального этапа бактериальной адгезии.

При глубинном культивировании бактерий их адаптивной реакцией на внезапные изменения условий роста (температуры, концентрации NaCl, Ca2+ и др.), состава среды или голодание является процесс прикрепления клеток к поверхности куль тиватора. При изменении условий роста в диапазонах, толерантных для вида, адге зия является обратимой, за пределами границ толерантности – необратимой. В со стоянии обратимой адгезии микроорганизмы более устойчивы к стрессорным воз действиям. Процесс обратимой адгезии находится под популяционным контролем, который осуществляется с участием внеклеточных низкомолекулярных метаболи тов. В экспоненциально растущей бактериальной культуре ингибиторы бактери альной адгезии концентрационно регулируют как стадию прилипания клеток к по верхности, так и стадию их схода для возврата к планктонному существованию.

Глава 3. Эффективность и механизмы защитного действия алкилоксибен золов как внеклеточных адаптогенов Микробные алкилоксибензолы обладают функциями адаптогенов, защитные эффекты которых в зависимости от их химической структуры и концентрации реализуются как протекция микроорганизмов от повреждающих воздействий или как сигнал тревоги для мобилизации адаптивных ресурсов клеток.

Группа внеклеточных микробных ауторегуляторов (факторы d1), участвую щих в контроле развития микробных культур, была описана в ИНМИ РАН до на чала наших исследований как аутоиндукторы анабиоза микроорганизмов, вызы вающие переход клеток в состояние покоя и представленные у бактерий смесью гомологов алкилоксибензолов (АОБ) класса алкилрезорцинов, а у дрожжей – ти розолом [Осипов с соавт., 1985;

Светличный с соавт., 1986;

Батраков с соавт., 1993;

Мулюкин с соавт., 1996;

Мулюкин, 2010]. В растущей микробной культуре запланированные стрессы, развивающиеся вследствие исчерпания источников пи тания или высокой клеточной плотности, сопровождаются повышением концен трации АОБ, что служит сигналом для перехода культуры в стационарную фазу с последующим образованием покоящихся цистоподобных клеток [Пронин с соавт., 1982;

Бабусенко с соавт., 1991;

Лойко с соавт., 2002;

Мулюкин с соавт., 2004;

Suz ina et al., 2006;

Мулюкин, 2010]. Описанные биологические эффекты АОБ предпо лагали их участие в реакциях адаптации вегетативных клеток микроорганизмов к незапланированным стрессорным воздействиям, т.е. неблагоприятным физико химическим факторам среды.

3.1. Влияние стресса на динамику накопления АОБ в микробной культуре Одним из доказательств адаптогенных функций АОБ является повышение их концентрации при развитии стрессового ответа клеток. Эти данные были получе ны на модели бактерии M. luteus, у которой аутоиндукторы анабиоза представле ны алкилоксибензолами класса алкилрезорцинов [Мулюкин с соавт., 1996;

Мулю кин, 2010], что позволяло количественно определять их содержание в КЖ и клет ках по результатам колориметрической реакции с красителем FBB [Tluscik et al., 1981].

После сублетального температурного шока (45оС, 15 мин) в экспоненциально растущей опытной культуре во время остановки роста (50 мин, реакция на шок) количество внеклеточных АОБ резко увеличивалось, тогда как в контроле их кон центрация не менялась (рис. 10 б). Выход культуры из стресса был сопряжен с возрастанием уровня АОБ в клетках при одновременном снижении их содержания в среде. В культуре, подвергнутой шоку, суммарное количество вне- и внутрикле точных АОБ увеличилось на 35% по сравнению с контролем, что отражает реак цию клеток микрококка на стрессовое воздействие (табл. 4).

Таким образом, развитие стрессового ответа бактерий M. luteus сопряжено с повышением биосинтеза АОБ, внеклеточный пул которых служит для их перерас пределения между клетками популяции и средой. Это предполагало, что повыше Таблица 4. Суммарное содержание вне- и внутриклеточных АОБ на единицу массы су хих клеток M. luteus (мг/г МСК).

Время отбора пробы, Количество АОБ, мг/г МСК (%) ч роста Контроль Опыт До термообработки, 5 ч 0.95 (100) 0.95 (100) После термообработки, 6 ч 1.06 (100) 1.43 (135) Начало стационарной фазы роста, 11 ч 1.24 (100) 1.53 (123) а б АОБ, мг/г ОП МСК 4-кж(о) 3 1, 6-кл(о) 2 2 0, 3-кж(к) 5-кл(к) 0, 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 Время, ч Время, ч Рис. 10. Влияние термошока (прогрев при 45оС, 15 мин.) на рост (а) и удельную кон центрацию (б) внеклеточных (кж) и внутриклеточных (кл) АОБ M. luteus.

Обозначения: 1 - контроль без прогрева;

2 - термошок;

3 - как 2, но за 30 мин до шока вносили 4 мМ С7-АОБ;

4 – как 3, но с 8 мМ С7-АОБ;

5 – как 3, но с 12 мМ С7-АОБ;

кл(к) – АОБ в клетках в контроле;

кл(о) – АОБ в клетках в опыте;

кж(к)– АОБ в КЖ в контроле;

кж(о) – АОБ в КЖ в опыте. Стрелкой сверху указан момент начала прогре ва. Стрелками снизу указаны моменты определения концентрации АОБ – на 5, 6, 9 и 11 ч роста культуры.

ние концентрации внеклеточных АОБ в микробной культуре, в том числе при их экзогенном внесении, будет способствовать защите клеток от стрессового воздей ствия, что было продемонстрировано в нижеописанных экспериментах.

3.2. Защита микроорганизмов алкилоксибензолами в стрессовых условиях 3.2.1. Защита микроорганизмов от воздействий летальной и сублетальной интенсивности.

Протекторные функции АОБ зависят от их структуры и концентрации.

В последующих экспериментах в качестве модельных АОБ были использова ны два гомолога - амфифильный С7-АОБ (5-метилрезорцин) и более гидрофобный С12-АОБ (4-гексилрезорцин). Выбор этих соединений обоснован тем, что у мик роорганизмов встречаются как амфифильные водорастворимые АОБ – тирозол у дрожжей, гидрохиноны и АОБ с радикалами С2-С8 у псевдомонад и микрококка, так и гидрофобные – большинство бактериальных АОБ [Батраков с соавт., 1993;

Kozubek, Tyman, 1999;

Stasiuk, Kozubek, 2010;

Мулюкин, 2010]. Именно две эти группы АОБ с различной водорастворимостью и представляют С7- и С12-АОБ.

АОБ с идентичным по структуре фенольным ядром (2,4-дигидрокси) и близкими по длине радикалами С2-С5 обнаружены у M.luteus [Мулюкин, 2010].

Протекторные функции АОБ были доказаны в опытах с прединкубацией культуры микрококка фазы линейного роста с химическим аналогом фактора d этих бактерий - С7-АОБ, который вносили за 30 мин до термошока (рис. 10а).

Протекторное действие АОБ имело концентрационно-зависимый характер с мак симумом эффекта при концентрации 12 мМ;

развитие культуры после термошока проходило без задержки роста, наблюдавшейся в контрольной культуре, хотя и с более низкой скоростью.

Стрессопротекторное дей ствие АОБ было также Н2О продемонстрировано на 80 Прогрев другом модельном объекте, КОЕ, % дрожжах Saccharomyces cerevisiae, в условиях тем пературного (45оС, 30 мин) и окислительного (Н2О2, 100 мМ, 30 мин) воздейст К 1 2 5 вий летальной интенсивно С7-АОБ, мМ Рис. 11. Влияние С7-АОБ на устойчивость клеток сти, которые приводили к S.cerevisiae к воздействию Н2О2 (100 мМ, 30 мин) и гибели значительной части клеток популяции (75-80% прогреву (45оС, 30 мин).

и 90-92%, соответственно).

В опытных вариантах АОБ вносили за 2 часа до стрессового воздействия. Показа но, что короткоцепочечный С7-АОБ в концентрациях 2-5 мМ повышал устойчи вость клеток дрожжей к перекиси водорода в 2-5 раз (рис. 11), тогда как более гидрофобный С12-АОБ, напротив, в концентрациях 5-300 мкМ понижал её (рис.

12). Аналогичное действие С7-АОБ и С12-АОБ проявляли в отношении дрожжей, подвергнутых термошоку (45оС, 30 мин) (рис. 11, 12).

Отмеченные различия в эффектах гомологов С7- и С12-АОБ объясняются различиями в молекулярных механизмах их действия в качестве структурных мо дификаторов белков и степенью антиоксидантной активности (подробно изложено в разделе 3.3). Способность АОБ модифицировать структуру ферментных белков приводит к повышению их стабильности и изменению каталитической активности в сторону как активации, так и ингибирования, что зависит от концентрации АОБ и степени их гидрофобности: ингибирующим действием, в основном, обладают более гидрофобные гомологи АОБ (С12-АОБ), активирующим – амфифильные (С7-АОБ) (равно как и продукты их окисления). Это обусловливало более актив ное функционирование защитных и репарационных систем клетки в случае с С7 АОБ и, напротив, их ингибирование в случае с С12-АОБ, и таким образом, потен цирование биоцидного действия стрессоров.

Хотя температурный стресс (как и многие другие) у 25 Н2О2 микроорганизмов сопро КОЕ, % Прогрев вождается накоплением ак тивных форм кислорода [Sugiyama, 2000;

Смирнова, 2001;

Рихванов, 2003], но в защите клеток от прямого окислительного стресса, К 5 15 50 150 по-видимому, большую С12-АОБ, мкМ роль в суммарном протек Рис. 12. Влияние С12-АОБ на устойчивость клеток торном действии С7-АОБ играет его более выражен S.cerevisiae к воздействию Н2О2 (100 мМ, 30 мин) и о ная, чем у С12- АОБ, анти прогреву (45 С, 30 мин).

оксидантная активность.

Поэтому оптимальная кон центрация С7-АОБ (5 мМ), одинаковая для защиты клеток от обоих стрессов, обеспечивала 5-кратное увеличение КОЕ при воздействии Н2О2 и только 2 кратное – при термошоке (рис. 11, 12).

Таким образом, синергизм или антагонизм действия стрес сора (Н2О2 или термошока) и АОБ (направление изменения ак КОЕ, % тивности ферментов клеток под 110 влиянием АОБ) обусловливало защиту клеток при действии С7 АОБ или стресспотенцирующий эффект в присутствии С12-АОБ.

С последним связаны регулятор 0 1 4 8 10 11 ные эффекты длинноцепочечных С-7 АОБ, мМ АОБ на стадии отмирания куль Рис. 13. Протекторное действие С7-АОБ при туры и образования анабиотиче окислительном стрессе дрожжей S. cerevisiae (- ских покоящихся форм [Мулю облучение, доза 50 крад, жизнеспособность опре- кин, 2010]. Также отметим эколо деляли через 2 ч после облучения). гическое значение не только стрессопротекторной, но и стрес спотенцирующей функций АОБ для растительно-микробных биоценозов. Обна руженная способность длинноцепочечных АОБ потенцировать действие стрессо ров может быть выгодна для организмов, их продуцирующих, как средство борь бы с конкурентами или паразитами. Так, известно, что в семенах растений содер жится много длинноцепочечных алкилоксибензолов класса алкилрезорцинов [Ko zubek, Tyman;

1999], в присутствии которых жизнедеятельность фитопатогенной микрофлоры будет сильно подавлена.

Выявленные эффекты действия длинноцепочечных АОБ были использованы нами при разработке серии препаратов, предназначенных для защиты материалов от биоповреждения, а также способа стабилизации микробных препаратов.

Возможность эффективного адаптогенного действия С7-АОБ в защите клеток от стрессоров различной природы, вызывающих развитие окислительного стресса, была продемонстрирована в опытах с дрожжами S. cerevisiae. В первой серии экс периментов стресс индуцировали -облучением. С7-АОБ вносили в культуру дрожжей фазы линейного роста за 30 мин до облучения дозой 50 крад: при кон центрациях 11-13 мМ число жизнеспособных клеток увеличивалось на 20-30% (по сравнению с контролем без внесения АОБ) (рис. 13).

В другой модели повреждаю щим агентом был синглетный ки КОЕ, % слород, который генерировался в фотосенсибилизированных (хло 80 рином е6) клетках, при их облу чении лазером (=662 нм). В опытных вариантах в культуру дрожжей кроме хлорина вносили С7-АОБ за 30 мин до облучения.

Оптимальной для протекции бы ла концентрация 8 мМ, при кото рой для достижения гибели 75% 0 2 4 6 8 10 клеток требовалась доза облуче Доза, Дж/см ния в 3.5 раза большая, чем для Рис. 14. Дозовые кривые выживаемости клеток достижения такой же гибели не дрожжей S. cerevisiae, обработанных за 30 мин до защищенных клеток (12 и 3. облучения ( = 662 нм): 1 — только хлорином е6;

Дж/см, соответственно)(рис. 14).

Для этого же организма вы 2 — хлорином е6 и С7-АОБ (8 мМ);

3 - уровень, соответствующий 25% выживших клеток. ше было продемонстрировано защитное действие С7-АОБ при температурном и окислительном стрессах летальной интенсивности (рис. 11, 12).

Таким образом, обнаружено, что увеличение концентрации короткоцепочеч ных амфифильных АОБ в пролиферирующих культурах микроорганизмов защи щает клетки от стрессорных воздействий сублетальной и летальной интенсивно сти (прогрев, действие окислителей, -радиации, фотоокисление), что выражается в повышении их устойчивости и сохранении пролиферативной способности.

3.2.2. Роль алкилоксибензолов в адаптации микроорганизмов к неоптимальным условиям роста Помимо защиты от стрессорных воздействий сублетальной и летальной ин тенсивности алкилоксибензолы эффективно влияют на повышение физиологиче ской активности клеток в неоптимальных для роста условиях.

Адаптогенное действие такого типа было продемонстрировано для низкотем пературного брожения дрожжей S. cerevisiae в условиях осмотического стресса (высокого осмотического давления) который создавали, повышая содержание су хих веществ в сусле до 16%, что в 1.5 раза выше, чем в обычном сусле (11%), ис пользуемом в традиционном пивоварении. В опытных вариантах инокулят инку бировали в течение 2 часов с С7-АОБ (4 мМ). Культивирование вели в микро аэробных условиях в течение 11 суток Убыль СВ, при температуре 6оС. В контрольных г/200 мл вариантах (без С7-АОБ) повышение плотности сусла до 16% снижало ин 5 тенсивность брожения на 20%, тогда как предобработка С7-АОБ повышала интенсивность развития дрожжей на 25-30% (по урожаю на 8-11 сутки рос та) по сравнению с их развитием на 1 11%-ном сусле (рис. 15).

Аналогичное ростстимулирующее действие короткоцепочечных АОБ 0 2 4 6 8 10 Время брожения, сутки продемонстрировано в отношении Рис. 15. Влияние С7-АОБ (4 мМ) на устой- бактерий P. fluorescens и P. aeruginosa чивость дрожжей S. cerevisiae к осмотиче- при их развитии в неоптимальных для скому стрессу. 1 – рост на 11%-ном сусле;

2 роста условиях. При внесении как – рост на 16%-ном сусле;

3 – как 2, но клетки С12-АОБ (50 мкМ), так и С7-АОБ инокулята прединкубированы с С7-АОБ в (0.25 мМ) в среду роста урожай кле течение 2 ч. ток P. fluorescens возрастал на 10% и 30%, соответственно, в условиях культивирования бактерий при заще лочении среды (рН 9.5), когда ско мкг С-СО2/ч сут рость роста культуры в контроле была снижена на 80-90% по сравнению с оптимальными значениями рН (рН 5.5-7.5).

Адаптогенное действие препара та «Сидовит», разработанного нами на основе АОБ, исследовали в модели роста нефтеокисляющей бактерии P.

0 1 2 3 4 aeruginosa в среде М9 с ацетатом в % NaCl Рис. 16. Влияние препарата Сидовит (10 качестве источника углерода в усло мг/л) на скорость роста P. aeruginosa в жид- виях повышенной солености, имити кой среде М9 с ацетатом при разных кон- ровавшей действие природного стрес сора (рис. 16). В вариантах с содержа центрациях NaCl. 1- контроль, 2 – опыт.

нием в среде 1% NaCl скорость роста бактерий была снижена на 30% по сравнению с ростом в оптимальных условиях, при содержании NaCl более 5% роста не наблюдали. В опытных вариантах с вне сением препарата «Сидовит» 10 мг/л наблюдали возрастание скорости роста на 62% (урожай возрастал на 40%). В условиях нормы солёности (без добавления NaCl) эти показатели в присутствии препарата АОБ также увеличивались, но в меньшей степени – на 28% и 20%, соответственно.

В другой серии экспериментов - при изменении температурного режима куль тивирования P. аeruginosa, скорость роста снижалась на 25% при 10оС, а при 40оС – на 50% от максимальной в контроле (при 28-30оС) (рис.17).

Таким образом, адаптоген мкг С-СО2/ч/сут;

ный эффект АОБ при развитии % от контроля микробных культур в неопти мальных условиях роста выража 50 ется в существенном повышении 3 пролиферативной активности клеток при «дозах» стрессора (рН, солёности, температуры), при ближающихся к границам толе 20 рантности для вида.

10 1 Адаптогенная эффективность 0 препарата АОБ «Сидовит», о чём 0 10 20 30 40 50 судили по возрастанию скорости роста бактериальной культуры, температура, оС зависела от степени неоптималь Рис. 17. Влияние препарата АОБ «Сидовит» на ности температуры – она была скорость роста P. aeruginosa в жидкой среде М9 минимальной при температурной при разных температурах. 1 - контроль (без норме роста 28оС (17%) и увели АОБ), 2 – с АОБ, 10 мг/л, 3 – эффективность чивалась к границам температур препарата, повышение скорости роста, в % от ного диапазона роста: при 10 и контроля.

40оС, когда скорость роста в кон троле была снижена на 75 и 50%, соответственно, стимуляция скорости роста составила 40-55% (рис. 17).

В прикладном аспекте препараты алкилоксибензолов можно рекомендовать для повышения эффективности применения бакпрепаратов, используемых для биоремедиации почв.

3.3. Механизмы действия АОБ как адаптогенов Говоря о механизме действия того или иного фактора или соединения, имеют в виду совокупность установленных причинно-следственных связей, объясняю щих выявленный эффект через физические и химические свойства фактора (со единения) и изменения метаболизма клетки. С этих позиций рассмотрено участие алкилоксибензолов в развитии стрессового ответа микроорганизмов.

3.3.1. Функционирование алкилоксибензолов в качестве структурных модифика торов и стабилизаторов белков Одним из основных уровней формирования стрессового ответа клеток яв ляется повышение стабильности и сохранение функциональной активности кле точных макромолекул и, прежде всего, ферментных белков. В работе исследовали влияние различающихся гидрофобностью гомологов С12- и С7-АОБ на стабиль ность и изменение каталитической активности модельных ферментов - трипсина, - и -амилаз. Эффекты АОБ зависели от их структуры, концентрации и времени прединкубации с белком, необходимого для «созревания» нового конформера. В низких концентрациях гидрофобный С12-АОБ на 20-30% повышал, а в широком диапазоне более высоких концентраций - ингибировал активность ферментов (рис.

18, а). Амфифильный С7-АОБ повышал ферментативную активность во всём диа пазоне испытанных концентраций (рис. 18б).

а Активность, б Активность, % 100 80 1 120 20 0 2 4 6 8 10 0 0,03 0,05 0,25 0,5 1 1,5 С12-АОБ, мМ С7-АОБ, мМ Рис. 18. Концентрационная зависимость и влияние продолжительности прединкуба ции трипсина с С12-АОБ (а) и С7-АОБ (б) на его протеолитическую активность. Вре мя прединкубации с АОБ: 1 – 10 мин, 2 – 40 мин.

Сопряжённо с изменением активности модифицированных ферментов раз вивалась их устойчивость к денатурирующим воздействиям: функциональная ста бильность – сохранение каталитической активности после снятия стрессорного воздействия, и операционная стабильность – сохранение активности при неопти мальных параметрах катализа (рН, температуры). Активность нестабилизирован ного трипсина после тепловой денатурации (60°С, 10 и 20 мин) снижалась до 20 и 5%, а в комплексах с С12-АОБ сохранялось до 50% от активности фермента до термообработки (рис. 19а). Радиостабильность трипсина при -облучении дозой 12.7 крад повышалась в комплексах с С7-АОБ (4.8-9.6 мМ) в 3.5-7 раз (рис.19б).