Генетика репродуктивных барьеров и морфологических различий между видами крупносемянной группы рода fagopyrum mill.

На правах рукописи

Фесенко Иван Николаевич Генетика репродуктивных барьеров и морфологических различий между видами крупносемянной группы рода Fagopyrum Mill.

Специальность 03.02.07 – генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2013 1 Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики и биотехнологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур Россельхозакадемии в 1998-2012 гг.

Научный консультант:

Ригин Борис Викторович, доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник отдела генетики ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова Россельхозакадемии

Официальные оппоненты:

Борисов Алексей Юрьевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией генетики растительно-микробных взаимодействий ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии Макарова Галина Александровна, доктор биологических наук, главный научный сотрудник Малого предприятия ГНУ Агрофизического научно исследовательского института Россельхозакадемии Соловьев Александр Александрович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА им. К.А.

Тимирязева Ведущее учреждение: ГНУ Московский научно-исследовательский институт сельского хозяйства «Немчиновка» Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится « 6 » ноября 2013 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.041.01 при ГНУ Всероссийский научно исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова Россельхозакадемии по адресу: 190000, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 44;

тел.: (812) 314-78-36, факс: (812) 571-87-28, e-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова Россельхозакадемии Автореферат размещен на сайтах: http://vir.nw.ru и http://www.vak.ed.gov.ru « 28 » июня 2013 г.

Автореферат разослан « » 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Гаврилова Вера Алексеевна Актуальность работы Гречиха является важной продовольственной культурой: в России ее посевы занимают около 1 млн. га. Все возделываемые в России сорта представлены одним видом – Fagopyrum esculentum Moench.(гречиха обыкновенная). Этот вид обладает классической гетеростилией, обеспечивающей облигатное перекрестное опыление, которое считается одной из причин нестабильности урожая зерна (Campbell С., 2003) и обусловливает сложность селекционной работы с культурой. Попытки использования самофертильных форм в селекции гречихи не имели успеха из-за свойственной виду сильной инбредной депрессии. В Юго-Восточной Азии в качестве зерновой культуры возделывается также автогамный вид F. tataricum Gaertn.

(гречиха татарская): в Китае его посевы занимают треть площадей под гречихой (Wang Y., Campbell C., 2004). В России этот вид не возделывается из за его несоответствия местным условиям и потребительским традициям.

Объединение ценных качеств возделываемых видов в одном генотипе оказалось невозможным (Samimy C. et al., 1996).

Внимание к межвидовой гибридизации гречихи как способу создания самоопыляющихся сортов гречихи обыкновенной резко усилилось после открытия автогамного вида F. homotropicum Ohnishi, близкородственного F.

esculentum (Ohnishi O., 1995). F. homotropicum, вместе с F. tataricum, F. cymosum Meisn. и F. esculentum, относится к крупносемянной группе рода Fagopyrum (Ohnishi O., 2009);

другие виды, составляющие мелкосемянную группу, не имеют практического значения (Ohnishi O., 2010). В отличие от F. tataricum, вид F. homotropicum способен скрещиваться с F. esculentum с получением фертильных межвидовых гибридов. Тем не менее, для получения гибридов в этой комбинации используют методы культивирования незрелых зародышей (Wang Y, Campbell C., 1998).

Другим перспективным подходом к созданию форм гречихи с высокой инбредной жизнеспособностью является использование искусственного амфидиплоида F. giganteum Krotov, полученного скрещиванием тетраплоидных образцов F. tataricum и F. cymosum (Кротов А.С., Драненко Е.Т., 1973).

Амфидиплоид самофертилен, но поддерживает гетерозис за счет межгеномных взаимодействий. F. giganteum перспективен для введения в культуру в России, однако для этого требуется преодоление ряда его недостатков, в первую очередь – сокращение продолжительности вегетационного периода и улучшение технологических качеств зерна. Это может быть сделано только посредством гибридизации F. giganteum с родительскими видами.

Для проведения эффективной работы по межвидовой гибридизации и использования полученных гибридов в селекционной работе необходимо: а) выяснение генетических механизмов, обусловливающих репродуктивные барьеры между видами;

б) исследование особенностей генетического контроля признаков, ассоциированных с типом системы размножения в роде Fagopyrum;

в) экспериментальное определение возможности интрогрессии интересующих генов (и признаков) одного вида в другой. Немаловажное значение имеет выяснение закономерностей эволюции системы размножения видов крупносемянной группы рода Fagopyrum.

Цель работы Изучить генетику репродуктивных барьеров и морфологических различий между видами крупносемянной группы рода Fagopyrum в связи с исследованиями процессов видообразования и возможностей обмена генами между видами.

Задачи исследований 1. Изучить генетику барьеров несовместимости между видами крупносемянной группы рода Fagopyrum, действующих на стадии роста пыльцевых трубок.

2. Изучить генетику различий (внутривидовых и межвидовых) по ряду признаков (форма семян, устойчивость к опадению семян, размер цветка, размер соцветия, число соцветий, тип цветка).

3. Разработать эффективную методику получения и использования в селекции межвидовых гибридов F. esculentum c F. homotropicum.

4. Исследовать формообразовательный процесс у гибридов амфидиплоида F. giganteum с родительскими формами F. tataricum и F. cymosum.

Научная новизна 1. Впервые для таксонов с гетероморфной системой несовместимости у видов крупносемянной группы рода Fagopyrum выявлены функциональные гены несовместимости гаметофитного типа, один из которых ассоциирован с доминантным аллелем супергена гетеростилии. Показано, что гетеростилия в роде Fagopyrum возникла взамен утраченной гаметофитной системы несовместимости. Получено прямое экспериментальное доказательство формулы Д. Льюиса (1954), объединившей известные компоненты супергена гетеростилии и S-локусов гомоморфных систем несовместимости.

2. На основе анализа морфологии и генетических механизмов системы несовместимости F. esculentum, F. homotropicum, F. cymosum и F. tataricum предложены вероятные последовательности событий на начальных стадиях их дивергенции.

3. Установлено, что окультуривание F. esculentum сопровождалось накоплением рецессивных генов, увеличивающих размер соцветия;

переход к самоопылению дикого вида F. homotropicum сопровождался накоплением рецессивных генов, уменьшающих размер цветка.

4. Установлено, что ген S4, контролирующий гомостилию цветка морфологически различных образцов F. homotropicum, находится в группе сцепления №4. Выявлен мультиаллелизм по субгену Р.

5. Гомостилия цветка F. tataricum обусловлена рецессивными аллелями субгенов G и A, в сочетании с минус-аллелями модификаторов, влияющих на длину пестика. Аллель субгена P в геноме F. tataricum отличается от аллелей этого субгена, характерных для F. cymosum.

6. Установлено наследование новых мутаций tepal-like bract (tlb), articulation (atl) и мутации, вызывающей замену 2-3 лепестков химерными структурами, сочетающими фрагменты лепестков и генеративных органов;

определена локализация гена TLB, контролирующего базальную границу экспрессии генов В-класса.

7. Выявлены гены, контролирующие число соцветий у детерминантной формы гречихи (гомозигота по аллелю det).

Практическое значение работы 1. Амфидиплоид F. giganteum рассматривается как перспективная основа для создания материала с высокой инбредной жизнеспособностью, поддерживаемой за счет межгеномных взаимодействий. Созданы предпосылки для селекционной работы с F. giganteum: путем гибридизации с родительскими формами (F. tataricum и F. cymosum) получены межвидовые рекомбинанты с почти оптимальной продолжительностью вегетационного периода и улучшенными характеристиками зерна.

2. Разработаны методики массового получения межвидовых гибридов F.

esculentum F. homotropicum и их ускоренной селекционной проработки. Это позволило создать селекционный материал, на основе которого был выведен и передан в производство сорт Темп.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Прогамная несовместимость между видами крупносемянной группы рода Fagopyrum обусловлена действием механизмов двух типов.

2. Идентифицировано два гена несовместимости гаметофитного типа, проявляющихся в межвидовых скрещиваниях гречихи. Один из них ассоциирован с доминантными генами, контролирующими тип цветка.

3. Гетеростилия в роде Fagopyrum Mill. возникла взамен утраченной гаметофитной системы несовместимости.

4. Формирование культивируемого вида F. esculentum сопровождалось накоплением рецессивных генов, увеличивающих размер соцветия.

5. Формирование F. homotropicum сопровождалось мутацией доминантного аллеля S-локуса, изменением его локализации, и накоплением рецессивных минус-аллелей генов, влияющих на размер цветка.

Апробация работы Результаты работы доложены на следующих симпозиумах и конференциях: 7-м (Канада, 1998), 8-м (Корея, 2001), 9-м (Чехия, 2004), 10-м (Китай, 2007) (публикации в сборниках трудов) и 11-м (Орел, Россия, 2010)(публикации и доклад) международных симпозиумах по гречихе;

3-м международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования" (Москва – Пущино, 1999);

2-м (С.-Петербург, 2000), 3-м (Москва, 2004)(доклад), 4-м (Москва, 2009) съездах ВОГиС;

международной конференции "Генетические коллекции, изогенные и аллоплазматические линии" (Новосибирск, 2001);

2-й конференции московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (Москва, 2003);

I(IX) международной конференции молодых ботаников (С.-Петербург, 2006);

2nd Meeting of the European Society for Evolutionary Developmental семинаре основы создания Biology, (Belgium, 2008);

"Научные высокоэффективных технологий производства гречихи и проса" (Орел, 2009);

региональной научно-практической конференции "Инновационный потенциал молодых ученых – АПК Орловской области" (Орел, 2010).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 67 печатных работ в международных и отечественных научных журналах, сборниках симпозиумов и конференций, в том числе 22 – в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, Методические рекомендации, Авторское свидетельство РФ №46923 на сорт Темп, Патент РФ на селекционное достижение №5456 на сорт Темп.

Личный вклад автора Все результаты, представленные в диссертационной работе, получены при участии автора с 1998 по 2012 год. Участие автора было определяющим при постановке проблемы диссертационной работы, при выполнении всех экспериментов, при оформлении научных публикаций. Сорт гречихи Темп создан совместно с сотрудниками лаборатории селекции крупяных культур ВНИИЗБК.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на 252 страницах, состоит из введения, 7 глав (обзор литературы (глава 1), условия проведения опытов, материал и методы (глава 2), описание экспериментов (главы 3, 4, 5), обсуждение (глава 6) и описание практического использования результатов работы (глава 7)), выводов, рекомендаций для селекционной практики и списка цитированной литературы, насчитывающего 398 источников, в т.ч. 60 на русском языке.

Работа иллюстрирована 55 рисунками и 33 таблицами.

1. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РЕПРОДУКТИВНЫХ БАРЬЕРОВ МЕЖДУ ВИДАМИ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ. ФИЛОГЕНИЯ ВИДОВ РОДА FAGOPYRUM (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) Анализируются современные представления о природе репродуктивных постзиготических и прогамных барьеров между видами высших растений, эволюционные взаимосвязи между известными системами несовместимости.

Обсуждаются известные генетические механизмы действия различных систем несовместимости, в том числе – на уровне межвидовых скрещиваний.

Изложены современные представления о филогении рода Fagopyrum Mill.

2. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ОПЫТОВ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Эксперименты проведены в теплице и на опытном поле лаборатории генетики и биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института зернобобовых и крупяных культур. Как правило, колебания погодных условий по годам в летний сезон были в пределах адаптивной нормы гречихи и морфологических повреждений у контрольных растений не вызывали. Единственное исключение – 2010 год: рекордно высокая температура воздуха в июле и августе в сочетании с небольшим количеством осадков крайне негативно повлияли на развитие растений.

В работе использованы следующие образцы гречихи:

F. esculentum subsp. esculentum: диплоидные сорта Богатырь, Скоро спелая 86 (индетерминантный тип роста), Деметра, Дождик, Дикуль (детерминантный тип роста);

тетраплоидный сорт Минчанка, тетраплоидные селекционные образцы ВНИИЗБК;

мутации wl (willow leaf)(группа сцепления №4);

tlb (tepal-like bract), ген TLB картирован автором;

atl (articulation), автором установлено влияние этой мутации на проявление доминантного гена SHT (опадение семян по разделительному слою);

форма с заменой 2-3 лепестков химерными структурами, сочетающими признаки лепестков и генеративных органов (автором выделена мутация и установлено ее наследование);

формы с детерминантным типом роста, различающиеся по числу соцветий на побегах;

гомостильная форма Гд-1 (Замяткин Ф.Е., 1971).

F. esculentum subsp. ancestrale: C9015 (Китай, пров. Юньнань)(2х=16).

F. homotropicum: С9139 (Китай, Юньнань), С9606 (Китай, Сычуань) (2х=16);

H#4 (2n=32).

F. tataricum subsp. potanini: С9119 (Китай) (2х=16).

к-17 (Китай), к-62 (Канада), к- F. tataricum subsp. tataricum:

(Белоруссия), к-103 (Индия), FT9901 (Алтайский край)(2х=16);

к-108 и к-113, тетраплоидные (4х=32) аналоги образцов к-17 и к-66.

F. cymosum: С9143 и С2049 (Китай)(2х=16);

к-4231 (Индия)(4х=32).

F. giganteum (амфидиплоид, полученный скрещиванием F. tataricum с F.

cymosum (к-108 к-4231) (Кротов А.С., Драненко Е.Т., 1973): к- (мономорфный по типу цветка (длинностолбчатый) образец);

гетеростильный аналог F. giganteum, полученный нами скрещиванием к-108 к-4231 с использование в качестве опылителя короткостолбчатых растений к-4231 F.

cymosum (Fesenko I.N., 2005).

Образцы к-17, к-66, к-103, к-108, к-113, к-109, к-4231 получены из коллекции ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова. Образцы С9015, С9139, С9606, С9119, С9057 и С9143 любезно предоставлены проф. O. Ohnishi (университет Киото). Образец H#4 любезно предоставлен C. Campbell (Канада).

Мутантные формы wl (nr), tlb, atl выделены во ВНИИЗБК в разное время.

Форма с заменой 2-3 лепестков химерными структурами, сочетающими признаки лепестков и генеративных органов, выделена автором.

Характеристики образцов, использованные в работе, приведены при описании экспериментов.

Наблюдение роста пыльцевых трубок проведено в ультрафиолетовом свете после окрашивания анилиновым синим. Пестики для микроскопии были извлечены из цветков через 6-7 часов после опыления и зафиксированы в 1мл свежеприготовленной смеси "3 этанол: 1 ледяная уксусная кислота". После фиксации (2-5 дней) материал был промыт в 2 сменах воды, и помещен в 2М NaOH на 18-20 часов, и затем (после промывки в воде) раздавлен покровным стеклом в капле раствора анилинового синего. В каждой комбинации проанализировано не менее 10 цветков, взятых не менее, чем с 4-5 растений;

в качестве опылителей использовано не менее 5 растений. Длина пыльцевых трубок измерена с помощью программы AxioVision Rel. 4.7.

Объем пыльцевого зерна определяли по формуле V=(d2D)/6 (объём эллипсоида вращения), где d и D – короткий и длинный диаметры эллипса (пыльцевого зерна под микроскопом). Измеряли не менее 30 пыльцевых зерен каждого образца.

Скрещивания проведены в контролируемых условиях в теплице. Цветки гомостильных и короткостолбчатых растений кастрировали перед опылением, длинностолбчатые цветки, как правило, опыляли без кастрации. Отсутствие пыльцы на рыльцах до опыления контролировали с помощью лупы (20).

Типы генетических взаимодействий, а также приблизительное число генов, участвующих в расщеплении, определяли с помощью алгоритма, описанного Н.А. Соболевым (1976), в котором использованы подходы К.

Мазера (Mather K., 1949) для анализа генетических взаимодействий, и Кастла Райта (Castle W.E., 1921;

Wright S., 1968) для оценки числа генов. Параллельно, для оценки числа генов, участвующих в расщеплении, в работе использовали подходы, основанные на анализе распределений величины признака у родительских форм и в гибридных поколениях (Powers L., 1951;

Мережко А.Ф., 1994).

Другие особенности методов исследования представлены в соответствующих разделах.

3. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ГЕНЕТИКА ПРИЗНАКОВ ЦВЕТКА И СЕМЯН ВИДОВ F. TATARICUM И F. CYMOSUM Несмотря на существенные морфологические различия, F. tataricum и F.

cymosum – относительно близкородственные виды, между которыми возможен обмен генами. Гибрид F. tataricum F. cymosum на тетраплоидном уровне впервые был получен А.С. Кротовым и Е.Т. Драненко (1973). Синтезированный амфидиплоид оказался фертильным, и получил статус искусственной видовой формы F. giganteum Krotov (гречиха гигантская). Мы продолжили эту работу (Фесенко И.Н., Голышкин Л.В., 1997;

Fesenko I.N., Fesenko N.N., 1998): были получены фертильные реципрокные гибриды F. giganteum с обоими родительскими видами (F. tataricum и F. cymosum), а также гибриды F.

tataricum с F. cymosum на диплоидном и тетраплоидном уровнях (Fesenko I.N. et al., 2001;

Fesenko I.N., 2005).

В главе приведены результаты генетического изучения:

1) полиморфизма по типу семян (включая межвидовые различия);

2) альтернативы "наличие/отсутствие функционального разделительного слоя на плодоножке" (ключевой признак для разделения F. tataricum на подвиды);

3) различий между F. tataricum и F. cymosum по типу цветка (гомостилия/гетеростилия).

Генетический контроль полиморфизма по форме семян Плод татарской гречихи – трехгранный орешек, чаще всего с закругленными ребрами и продольной бороздкой на гранях, что сильно затрудняет его обрушивание. Дикие формы F. tataricum характеризуются наличием скульптуры на оболочке семян (шипов или "зарубок"): тип "notched".

Культивируемые образцы формируют семена без шипов: тип «round» (длина примерно равна ширине) или "slender" (длина примерно вдвое превышает ширину) (Hirose T. et al., 1995). "Рисовая" (rice) форма татарской гречихи рассматривается как наиболее перспективная для создания сортов, пригодных для производства крупы. Основное отличие этого типа – отсутствие продольной бороздки на гранях. Вместо неё на оболочке плода формируется выступающая продольная полоса, что существенно упрощает обрушивание (Wang Y., Campbell C., 2007). Дополнительным источником изменчивости для F. tataricum может служить дикий многолетний вид F. cymosum Meisn. (плоды с ровными гранями и четко выраженными ребрами, без шипов). Далее приведены результаты генетического анализа ключевых альтернатив, характеризующих морфологические различия между семенами разных типов F. tataricum:

"наличие – отсутствие шипов на семенах" и "продольная бороздка / продольный выступ посередине грани плода", а также различий по форме семян между F. tataricum и F. cymosum.

Ген SMK. Гибриды F1(roundnotched) и F1(notchedslender) формируют семена со скульптурными образованиями на оболочке (шипами). Расщепления в F2 показывают, что в обоих случаях отсутствие шипов контролируется одним рецессивным геном (табл. 3.1).

Таблица 3.1 - Анализ реципрокных гибридов F2 roundnotched и notchedslender F. tataricum (2004-2006 г.).

Комбинация Тип семян Проверка гипотезы 3: 2 Р Notched Round Slender к-17 С roundnotched 159 70 3,79 0, к-66 к-17 132 32 2,63 0, notchedslender к-66 к-62 70 19 0,63 0, к-62 С9119 245 83 0,02 0, Гибриды F1(slender round) формируют семена без скульптурных образований на оболочке, промежуточные по соотношению длины и ширины (гены, контролирующие отсутствие шипов на семенах этих форм, аллельны);

в F2 доля растений с зерном типа round составила 18,2% (2(3:1) =1,64).

Количественные различия между этими формами обусловлены одним геном, который может быть обозначен SMK (smooth kernel).

Ген SPL. В F1(riceround) доминировал тип round. В F2 наблюдалось расщепление на 2 фенотипических класса в соотношении 3:1 (табл. 3.2). Ген, контролирующий альтернативу "бороздка – продольный выступ на грани или "разлом" (split) (Wang Y., Campbell C., 2007)" может быть обозначен SPL (split).

Таблица 3.2 - Анализ гибридов F2 riceround и notchedrice F. tataricum (2008г.).

Проверка гипотезы Комбинация Тип семян 2(3:1) Р Notched Round Rice Rice+Notched к-103к-17 187 59 0,14 0, С9119 к-103 523 100 102 В F1(notchedrice) доминировал тип notched, в F2 наблюдалось расщепление, в котором можно было выделить 4 фенотипических класса (табл.

3.2) – два исходных и два рекомбинантных. Доля растений с семенами без шипов (round + rice) составила 25,47% (2(3:1)=0,09;

Р=0,76). Доля растений с семенами «рисового» типа (с шипами и без шипов) составила 21,44% (2(3:1) = 5,37;

Р=0,02). Доля двойных рецессивов spl/smk (тип rice) вдвое превышала ожидаемую при независимом расщеплении по этим генам: расчетная частота рекомбинации составила 28,2%.

Тип семян, характерный для F. cymosum. Линия к-108 (тетраплоидный аналог линии к-17) формирует семена c бороздкой без шипов (тип round), но с более грубой оболочкой, чем у диплоидного аналога. Семена F. cymosum (образец к-4231) имеют гладкие ровные грани и четко выраженные ребра. F.

giganteum (к-108 к-4231) формирует семена типа "notched" с четко выраженными шипами, то есть происходит восстановление доминантного типа:

рецессивные гены, вызывающие отсутствие скульптурных образований на оболочке плода у F. cymosum и F. tataricum, неаллельны.

Генетический анализ проведен на гибридах BC1F1(к-4231 F. giganteum) (гибриды F1(к-4231 F. giganteum) опыляли пыльцой к-4231: получено расщепление по генам F. tataricum, аналогичное расщеплению при анализирующем скрещивании. Среди этих гибридов 20 формировали семена, аналогичные семенам образца к-4231, и 21 – аналогичные семенам, характерным для F. giganteum (2(1:1) =0,02;

P=0,88): тип семян, характерный для образца к-4231 F. cymosum, контролируется одним рецессивным геном, что делает F. cymosum перспективным донором этого признака в селекционных программах по татарской гречихе.

Устойчивые к опадению семян образцы F. tataricum гомозиготны по рецессивным аллелям двух локусов, влияющих на развитие функционального разделительного слоя Детали методики анализа. Анализ расщеплений проведен в конце августа, когда на всех растениях были одновременно зрелые семена и открытые цветки.

С помощью лупы (20) идентифицировалось наличие выраженного разделительного слоя, и затем оценивалась легкость опадения зрелых семян и отмерших цветков. Облигатное опадение всегда ассоциировалось с ясно выраженным функциональным разделительным слоем. Для устойчивых к опадению растений характерно отсутствие разделительного слоя на плодоножке, или наличие слабозаметного нефункционального разделительного слоя. Поскольку развитие нефункционального разделительного слоя широко варьировало, в том числе в пределах растения, точный анализ альтернативы "отсутствие разделительного слоя/нефункциональный разделительный слой" не проводили.

Генетический контроль альтернативы облигатное опадение семян/ устойчивость к опадению. Гибриды F1 во всех изученных комбинациях скрещиваний между устойчивыми и неустойчивыми к опадению образцами (к 17 C9119, к-66 C9119 и FT9901 C9119) формировали функциональный разделительный слой на плодоножке. В F1 во всех перечисленных комбинациях наблюдалось соотношение 9:7 в пользу растений с опадающими семенами (табл. 3.3). Дигенный контроль признака подтвердился анализом семей F3.

Все гибриды F1 между устойчивыми к опадению семян образцами (к- к-17, к-17 FT9901, FT9901 к-66) не формировали разделительный слой на плодоножках. Следовательно, в каждой из перечисленных комбинаций как минимум один из двух выявленных рецессивных генов, нарушающих развитие разделительного слоя, идентичен у скрещиваемых линий.

Таблица 3.3 - Расщепления в F2 (устойчивые к опадению опадающие) (2004, 2005 г.).

Расщепление Потомство Тест 9:7, Комбинация *P № Опадающие Устойчивые FT9901 C 1 346 240 1,86 0, 2 351 239 2,52 0, 3 160 122 0,03 0, к-17 C 4 133 118 1,09 0, 5 131 103 0,01 0, к-66 C 6 54 51 0,99 0, 7 40 26 0,51 0, * Вероятность подтверждения гипотезы.

Гены, контролирующие развитие разделительного слоя на плодоножке, проявляют сцепление с локусами, влияющими на число узлов в зоне ветвления стебля и верхних ветвей: опадающие и устойчивые к опадению гибриды F2 во всех случаях достоверно различались по среднему числу вегетативных узлов на главном побеге (t=2,82... 6,85).

Идентифицированные мутации, нарушающие развитие разделительного слоя на плодоножке (обсуждение). Альтернатива "опадение семян по разделительному слою/устойчивость к опадению" является одной из ключевых в числе генетических различий между дикими и культурными формами растений. В роде Fagopyrum два вида имеют формы, устойчивые к опадению семян, то есть не формирующие действующий разделительный слой на плодоножке F. esculentum и F. tataricum.

У F. esculentum выявлено три или четыре гена, влияющих на развитие разделительного слоя (Matsui et al., 2004;

Wang Y. et al., 2005), включая ген ATL (Фесенко А.Н. и др., 2009), но в большинстве случаев подтверждается моногенный контроль устойчивости к опадению (Campbell C., 1995;

Wang Y.

Campbell C., 1998;

Fesenko N.N. et al., 1998, 2006;

Ohnishi O., 2000).

У F. tataricum нами выявлено по крайней мере два таких гена (Fesenko I.N., 2006). Мутация в любом из них вызывает устойчивость к опадению, но, несмотря на анализ образцов, представляющих три географически отдаленных области естественного распространения вида, во всех случаях зафиксирован дигенный контроль альтернативы "опадение – устойчивость". По мнению O.

Ohnishi (2000), сорные формы F. tataricum с опадающими семенами могли возникнуть в результате гибридизации между культурными и дикими формами.

В областях, где такие скрещивания имеют место, могут быть найдены формы с моногенным контролем устойчивости к опадению. Однако, вопрос о существовании "эволюционно долговечных" линий, несущих только одну такую мутацию, остается открытым.

Генетический контроль гомостилии цветка F. tataricum Гибриды F1 и F2 в комбинациях к-17 к-66 (также как к-108 к-113), к- C9119 и к-66 C9119 F. tataricum формировали только гомостильные цветки.

Следовательно, гены, контролирующие тип цветка различных образцов (и подвидов) татарской гречихи, аллельны.

Гомостилия рецессивна по отношению к F. tataricum короткостолбчатости и длинностолбчатости F. сymosum, но четкость проявления гетеростильных типов цветка у межвидовых гибридов была снижена по сравнению с гетеростильным родителем, пропорционально дозе генов F. tataricum в генотипе гибрида (табл. 3.4, 3.5).

Таблица 3.4 - Характеристики длинностолбчатости цветка тетраплоидных межвидовых гибидов F1 и родительских образцов (2000 г.).

Длина пестика Длина тычинки L1 - L L1, мм L2, мм Вид, гибрид X±m X±m X±m F. tataricum, к-108 1,48±0,02 1,44±0,03 0,04±0, к-108 к-119 2,18±0,02 1,82±0,04 0,38±0, F. giganteum, к-119 2,65±0,07 1,74±0,17 0,92±0, к-119 к-4231 3,11±0,07 1,62±0,09 1,48±0, к-4231 к-119 3,30±0,11 1,83±0,04 1,47±0, F. cymosum, к-4231 3,42±0,07 1,82±0,06 1,60±0, Таблица 3.5 - Характеристики короткостолбчатости цветка тетраплоидных межвидовых гибридов и гетеростильного вида F. cymosum (2000 г.).

Длина пестика Длина тычинки L2 - L L1, мм L2, мм Гибрид, вид X±m X±m X±m * к-108 F. giganteum 1,78±0,04 2,07±0,08 0,29±0, * F. giganteum 1,64±0,02 2,42±0,17 0,78±0, F. giganteum* к-4231 1,60±0,04 2,29±0,05 0,69±0, * к-4231 F. giganteum 1,63±0,01 2,90±0,02 1,28±0, F. cymosum, к-4231 2,15±0,04 3,64±0,04 1,49±0, * ресинтезированный амфидиплоид к-108 к-4231 с короткостолбчатыми цветками Сравнение гибридов F1 F. giganteum F. cymosum и F. cymosum F.

giganteum показало, что на степень выраженности гетеростилии, особенно на длину тычинок короткостолбчатых цветков, достоверно (t=13,2) влияет цитоплазма (табл. 3.5): цитоплазма F. cymosum обеспечивает более четкую экспрессию гетеростилии.

В расщепляющейся популяции F2 (F. tataricum F. giganteum) идентификация типа цветка была затруднена вследствие непрерывного варьирования признака от гомостилии до длинностолбчатости на уровне F.

giganteum: степень проявления длинностолбчатости цветков межвидовых гибридов прямо зависит от дозы генов F. cymosum в их генотипах.

Для идентификации аллеля субгена P (размер пыльцы) было проведено сравнение по размеру пыльцы Д- и К- форм F. giganteum. В качестве контроля использовались Д- и К- растения F. cymosum. Пыльца Д-формы F. giganteum была достоверно (t=2,69) мельче пыльцы К-формы (40,5103 и 44, мкм3,соответственно), но значительно крупнее пыльцы Д-формы F. cymosum (от 16,8103 до 33,3103 мкм3). Таким образом, F. tataricum несет функциональный аллель субгена P, отличающийся от соответствующих аллелей F. cymosum. Этот аллель может быть обозначен Pt.

Структура генетических различий между F. cymosum и F. tataricum по типу цветка (гетеростилия/гомостилия). Перекрестное опыление в роде Fagopyrum Mill. ассоциировано с гетеростилией (Yasui Y. et al., 1998).

Генетический анализ типа цветка проведен на F. esculentum (гречиха обыкновенная), и классический тип наследования гетеростилии был подтвержден: короткостолбчатый тип цветка определяется доминантным аллелем S-локуса, длинностолбчатая форма – рецессивная гомозигота ss (Dahlgren K.V.O., 1922).

В межвидовых скрещиваниях между F. tataricum и F. cymosum гомостильный вид ведёт себя как рецессивная гомозигота ss (если принимать во внимание длину пестика и тычинок). В комбинации "гомостилия длинностолбчатость" получаются только длинностолбчатые гибриды;

в комбинации "гомостилия короткостолбчатость" получены длинностолбчатые и короткостолбчатые гибриды. Количественный анализ длинностолбчатых цветков межвидовых гибридов (включая беккроссы) показал промежуточное и явно полигенное наследование длины пестика. Таким образом, идентифицирован полигенный комплекс, участвующий в контроле гетеростилии F. cymosum и гомостилии F. tataricum.

У обыкновенной гречихи ранее была идентифицирована полигенная система с буферными свойствами, включающая в себя "плюс" и "минус" аллели по меньшей мере шести локусов, влияющих на длину пестика (Fesenko N.N., 1989). Обычное развитие гетеростилии бывает обусловлено плюс-аллелями в четырех из этих локусов и минус-аллелями – в двух. Единичная аллельная замена не оказывает существенного влияния на проявление гетеростилии.

Появление "рецессивных" гомостильных форм с короткими органами цветка было объяснено накоплением дополнительных минус-аллелей на фоне рецессивной гомозиготы по главному стрелочному гену S. В этих случаях уменьшение длины пестика до уровня тычинок у рецессивов по локусу гетеростилии было обусловлено аллельными заменами как минимум в двух локусах полимерной системы (Fesenko N.N., 1989).

Хотя экспрессия гетеростилии в популяции может варьировать, в аутбредных сортах гречихи обыкновенной заметного накопления редких аллелей в этих локусах не происходит вследствие действия стабилизирующего естественного отбора, направленного против форм, склонных к самоопылению, к которым относятся и длинностолбчатые растения с уменьшенной длиной пестика (Фесенко Н.Н., Фесенко И.Н., 2005). При изменении направления действия отбора, например в результате принудительного самоопыления, такие формы получают преимущество, благодаря чему были изолированы линии с генетически уменьшенной длиной столбика, вплоть до гомостилии (Fesenko N.N., 1989). Анализ межвидовых гибридов F. tataricum с F. cymosum (и F.

giganteum) позволяет заключить, что аналогичный генетический механизм определил возникновение гомостилии и самофертильности вида F. tataricum.

Однако, сформировавшийся гетеростильный вид (в том числе F. cymosum) не мог быть его прямым предком. F. tataricum несет, по-видимому, рецессивные аллели аналогов субгенов A (длина тычинок) и G (длина пестика) супергена гетеростилии. Но, с другой стороны, он несет функциональный, хотя и несколько отличающийся от соответствующего доминантного аллеля F.

cymosum, аллель субгена P. Таким образом, фрагмент предполагаемого аналога супергена гетеростилии, контролирующего основные характеристики морфологического диморфизма, у татарской гречихи имеет вид gPta. Мутация gpa gPta, необходимая для прямого происхождения F. tataricum от длинностолбчатой формы гетеростильного вида, выглядит маловероятной.

4. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕРМИНАЦИЯ ОСОБЕННОСТЕЙ СИСТЕМЫ РАЗМНОЖЕНИЯ ВИДОВ F. ESCULENTUM И F. HOMOTROPICUM F. esculentum и F. homotropicum – близкородственные виды, формирующие в скрещиваниях между собой на диплоидном уровне полностью фертильные межвидовые гибриды. F. esculentum (гречиха обыкновенная) – перекрестноопыляющийся вид с гетероморфной системой несовместимости, возделываемый как зерновая культура. Поскольку этот вид широко культивируется и является объектом селекционной работы, его полиморфизм достаточно хорошо изучен: известен ряд мутаций (мутации супергена гетеростилии, гомеозисные мутации и т.д.), составлена генетическая карта, включающая в себя семь групп сцепления из восьми возможных (Фесенко Н.В., 1983;

Fesenko N.N., 1989;

Ohnishi O., 1990;

Фесенко Н.В. и др., 2006). Дикий подвид F. esculentum subsp. ancestrale произрастает в горах южного Китая (Ohnishi O., 1991). Это более ксерофитные растения с "альпийским" типом роста (медленное развитие побега на ранней стадии и, как следствие, сильно укороченные нижние междоузлия) и функциональной гетеростилией.

F. homotropicum – недавно открытый вид, произрастающий на юге Китая (Ohnishi O., 1995). Известно несколько форм, объединенных под этим видовым названием в основном по двум признакам: тип системы размножения (автогамия, ассоциированная с гомостилией) и морфологическое сходство с F.

esculentum subsp. ancestrale (Asano N., Ohnishi O., 1999). Эволюционный и таксономический статус этих форм предстоит уточнить. Сейчас известно, что они различаются между собой по плоидности (2n=16 или 32), размеру цветка и степени репродуктивной изолированности от F. esculentum (Wang Y., Campbell C., 1998;

Fesenko I.N. et al., 2001;

Wang Y. et al., 2002). По-видимому, некоторые из них вполне можно рассматривать как самостоятельные виды, другие – как разновидности или микровиды.

Сравнение двух образцов F. homotropicum (C9139 и C9606) показывает существенные различия между ними по размеру цветка, размеру пыльцы и совместимости с F. esculentum (Fesenko I.N. et al., 2001). Образец C9139 (мелкие цветки, мелкая пыльца) выглядит как самостоятельный вид, репродуктивно изолированный от F. esculentum в естественных условиях: эта изоляция может быть преодолена в экспериментах. Образец C9606 (крупные цветки, крупная пыльца) совместим с F. esculentum в комбинации F. esculentum, Д C9606. В то же время, комбинация F. esculentum, К C9606 несовместима абсолютно (Fesenko I.N. et al., 2001).

Отсутствие заметной дивергенции геномов (заметных нарушений фертильности межвидовых гибридов), в сочетании с заметным накоплением достаточно контрастных морфологических изменений, предположительно ассоциированных с разнонаправленной эволюцией системы размножения и с доместикацией одного из видов, делает комплекс F. esculentum – F.

homotropicum (особенно эволюционная линия, представленная образцом С9139) подходящей моделью для анализа генетических изменений, сопровождавших эти процессы.

В главе приведены результаты изучения:

1) генетической системы, контролирующей изменчивость числа соцветий на фоне рецессивного аллеля локуса D (DET) (включая межвидовые различия);

2) генетического контроля различий между F. esculentum (сортовая популяция) и F. homotropicum (линия С9139) по размеру цветка и соцветия;

3) различий между F. homotropicum и F. esculentum по типу цветка (гомостилия/гетеростилия);

4) наследования новых мутаций (tepal-like bract, articulation, формы с заменой 2-3 лепестков химерными структурами, сочетающими признаки лепестков и генеративных органов).

Генетический контроль числа соцветий на побегах детерминантной формы гречихи Детерминантность, ограничивающая морфогенез репродуктивной сферы побега формированием 3-4 соцветий – один из ключевых признаков в селекции гречихи (Fagopyrum esculentum), поскольку с его помощью была в значительной мере решена проблема неограниченного роста, характерного для гречихи и, как следствие, значительно повышена дружность зацветания и созревания растений. В настоящее время признак "тип роста побегов" является ведущим в параметрах сортов гречихи (Фесенко Н.В. и др., 2006).

Детерминантность наследуется как рецессивная гомозигота по локусу, обозначенному D (Фесенко Н.В., 1968) или DET (Ohnishi O., 1990). Существует также количественная изменчивость числа генеративных узлов на побегах детерминантных растений: к настоящему времени выделены детерминанты с числом соцветий от одного до пяти и более, что может свидетельствовать о существовании генетической системы, регулирующей проявление рецессивной гомозиготы по локусу D.

Растительный материал и особенности генетического анализа.

Детерминантные линии с повышенным (4-5) числом соцветий были скрещены с линиями с "нормальным" (3) и пониженным (2) числом соцветий на побегах.

Фенотипы индивидуальных растений, включенных в скрещивания: 5+4+ (число соцветий на главном побеге и двух ветвях сверху) и 2+2+2 (Комбинация №1), 5+4+5 и 3+3+3 (Комбинация №2). Скрещивание растений и размножение гибридов проводили в теплице, морфологический анализ родительских форм и гибридов – в полевых условиях в 2008 г. В качестве контроля использовались линии, из которых были отобраны растения для скрещиваний.

Для оценки аллельного состава исследуемых локусов в геноме дикого вида F. homotropicum, близкородственного гречихе обыкновенной, анализировали детерминантные растения F2 F. esculentum (3+3+3) F.

homotropicum (линия С9139).

Чтобы минимизировать влияние модификационной изменчивости, для каждого растения определяли средние значения числа соцветий/побег (сумма по главному побегу и двум верхним ветвям деленная на три). Эти средние значения были использованы для генетического анализа.

Характер генетических взаимодействий и приблизительное число генов, участвующих в расщеплении, оценивали по методу Н.А. Соболева (1976).

Дополнительно для оценки числа генов использовался подход, основанный на разложении популяции на компонентные фенотипы (Мережко А.Ф., 1994).

Доля популяции F2, соответствующая родителю Р1 (родительская форма с большим значением признака), определялась как доля растений этого типа, в которой среднее значение признака равнялось среднему значению Р1.

Анализ гибридов между детерминантными линиями F. esculentum с разным числом генеративных узлов на побегах. В таблице 4.1 представлены результаты двух экспериментов по анализу наследования различий между детерминантными линиями по числу соцветий на побегах. В обоих экспериментах средние значения признака в F1 и F2 различались незначительно и недостоверно (t=0,41 и 0,55 для комбинаций №1 и №2, соответственно), однако наследование не было строго промежуточным (аддитивным).

Таблица 4.1 - Анализ наследования признака «число соцветий на побегах» F. esculentum (по Н.А. Соболеву, 1976)(2008 г.).

Родительские Число 2 g формы, D E N lim X m генов гибриды Комбинация 2,7…5,6 3,950, P1(1) №1 2,0…2,8 2,490, P2(1) 2,3…4,0 2,890, F1(1) - 1, 2,0…5,5 2,850,04 0,255 1, F2(1) 230 Комбинация 3,0…7,0 4,50, P1(2) №2 1,8…4,4 3,130, P2(2) 2,0…5,2 3,580, F1(2) - 0, 2,6…6,0 3,680,06 0,321 0, F2(2) 104 Генетическим анализом по схеме Н.А. Соболева установлено, что в комбинации №1 отрицательное сверхдоминирование частично уравновешивалось противоположным эффектом эпистатических взаимодействий (табл. 4.1). Расчетное число генов, участвовавших в расщеплении, не превышало 3. В комбинации №2 наблюдалось частичное отрицательное доминирование;

эпистатические взаимодействия практически отсутствовали (Е=0,10), что полностью согласуется с расчетным числом генов, участвующих в расщеплении (табл. 4.1). Доля растений F2, среднее значение признака в которой была равна средней Р1 (родитель с большим значением признака), в опыте 2 была близка к 25% (25 растений из 104) ( 2 =0,05), ожидаемым при расщеплении по 1 гену. В комбинации №1 доля таких растений F2 составила 13,5% (31 растение из 230), что достоверно меньше 25% ( =16,28), но явно превышает 6,25% (2 =20,51), ожидаемых при расщеплении по двум генам. По-видимому, это можно объяснить частичным сцеплением генов, участвующих в расщеплении.

Анализ детерминантных межвидовых гибридов F2 F.esculentum F.

homotropicum. Межвидовые гибриды F1 характеризовались индетерминантным типом роста (признак F. homotropicum), среди гибридов F2 наблюдалось ожидаемое моногенное расщепление.

Среднее значение числа соцветий на побегах детерминантных межвидовых гибридов F2 составило 1,59, что значительно меньше средней для сортовых детерминантных популяций F. esculentum с "типичным" значением признака (2,75). В проанализированной выборке (164 растения) преобладали растения с 1-2 соцветиями на побегах. Степень редукции зоны плодообразования у этих детерминантов отражает аллельное состояние в геноме F. homotropicum генов, гомологичных генам, контролирующим степень редукции зоны плодообразования у детерминантной формы F. esculentum. Доля выборки растений межвидовых гибридов с максимальными значениями признака, средняя которой составила 2,75, то есть равнялась средней детерминантного родителя, составила 17,1%, что свидетельствует о расщеплении по двум сцепленным генам.

Генетическая система, модифицирующая фенотип (число соцветий) рецессивной гомозиготы по локусу D (обсуждение). Генетическим анализом выявлено небольшое число генов, участвующих в расщеплении, причем различные подходы дали близкие результаты. Дикий вид F. homotropicum, близкородственный гречихе обыкновенной (межвидовые гибриды полностью фертильны), с индетерминантным типом роста несет аллели модификаторов, снижающие число соцветий на побеге у гомозиготы по аллелю d до 1. Анализ выборки детерминантных межвидовых гибридов F2 (F. esculentum F.

homotropicum) показывает, что эти аллели доминируют над аллелями, обусловливающими большее число соцветий, причем различия между детерминантами с 1 и 3 соцветиями обусловлены, по-видимому, двумя частично сцепленными генами. Увеличение числа соцветий с 2-3 до 4- обусловлено дополнительными рецессивными генами.

По-видимому, F. homotropicum несет полный набор доминантных минус аллелей локусов, модифицирующих фенотип рецессивной гомозиготы по локусу D. Рецессивные плюс-аллели этих модификаторов обнаружены в популяциях детерминантных сортов Восточно-Европейского ареала. Поскольку аллель d был редкой примесью в восточноевропейских популяциях (Фесенко Н.В., 1968), направленный отбор рецессивных плюс-аллелей модификаторов для увеличения числа соцветий у детерминантов представляется маловероятным. В то же время, детерминанты сразу после обнаружения были включены в селекцию (Фесенко Н.В., 1968), и скорее всего они представляли собой растения не менее чем с 2-3 соцветиями на главном побеге. Кроме того, растения с одним соцветием (генеративным узлом) на главном побеге были обнаружены только среди межвидовых гибридов F2 с участием дикого вида F.

homotropicum, и, по-видимому, культивируемые популяции не несут полного набора доминантных минус-аллелей всех выявленных модификаторов.

Таким образом, рецессивные плюс-аллели модификаторов, определяющих степень редукции зоны плодообразования у детерминантов, накопились в популяциях на окраине ареала гречихи обыкновенной случайным образом, причем их концентрация оказалась достаточно высокой, что, по видимому, способствовало закреплению в этих популяциях и рецессивного аллеля d. Широкое использование детерминантных форм в селекции привело к увеличению концентрации плюс-аллелей этих модификаторов.

Генетика различий между F. esculentum и F. homotropicum по признакам, ассоциированным с типом системы размножения F. esculentum – возделываемый перекрестноопыляющийся вид с крупными цветками, собранными в крупные соцветия. Дикий вид F.

homotropicum – полиморфный самоопылитель: встречаются образцы как с достаточно крупными (почти как у F. esculentum), так и мелкими (примерно вдвое мельче, чем у F. esculentum) цветками и мелкими соцветиями. В разделе изложены результаты изучения генетического контроля межвидовых различий по размеру цветка и соцветия. Обсуждается возможная связь этих различий с разнонаправленной эволюцией системы размножения и/или доместикацией.

Материал и особенности генетического анализа. F. esculentum: сорт Скороспелая 86 (Ск. 86), для которого характерно минимальное варьирование числа узлов в зоне ветвления главного побега (Фесенко Н.Н., Гуринович И.А., 1999) и обычный размер соцветия (сорт создан без специального отбора по этому признаку);

F. homotropicum: образец C9139 из коллекции университета Киото, (почти чистая линия с мелкими гомостильными цветками и мелкими соцветиями);

Гибриды F1 и F2 (Ск. 86 C9139).

Для измерения брали пять полноценных свеже-сорванных цветков с каждого растения. Размер цветка определяли по величине радиуса венчика.

Размер соцветия определяли по числу составляющих его метамеров (повторяющихся единиц структуры растения (Harper J.L., 1977;

White J., 1979), в данном случае – элементарных соцветий). Такой подход успешно применяется для описания и сравнительного анализа строения главного побега и ветвей различных генотипов гречихи (Фесенко Н.В. и др., 2006).

Анализировали второе снизу соцветие на главном побеге.

Анализ вклада аллельных и неаллельных взаимодействий генов в контроль наследственной изменчивости признака, а также приблизительный подсчет числа генов, обусловливающих межвидовые различия, проведен по схеме, предложенной Н.А.Соболевым (1976).

Генетический контроль изменчивости по размеру соцветия. В среднем, соцветия растений из сортовой популяции перекрестноопыляющегося вида почти в 2 раза крупнее соцветий F. homotropicum. Однако, размах варьирования по этому признаку в популяции F. esculentum был настолько велик, что диапазоны изменчивости двух видов перекрывались (табл. 4.2).

Дополнительная (генотипическая) дисперсия популяции Р1 по сравнению с линией Р2 равнялась 2gP1 = X2P1(CV2P1 – CV2P2) = 15,32(0,2092 – 0,1342) = 6,02.

Популяция F1(Ск.86 С9139) была относительно однородной, со средним выражением признака близким к промежуточному (по отношению к родительским формам). Популяция F2(Ск.86 С9139) существенно отличалась от популяции F1(Ск.86 С9139) по среднему значению признака, что заставляет отказаться от предположения об аддитивном характере взаимодействия генов, обусловливающем промежуточное наследование признака в первом поколении.

Таблица 4.2 - Наследование числа элементарных соцветий в соцветии(1999 г.).

Родительская Число Число D E форма, элементарных генов 2ph 2 g n CV,% гибрид соцветий, шт.

lim Xm Р1, Ск.86 15,30,7 9… 23 20,9 10,23 6, Р2, С9139 7… 22 13,4 1,18 8,10, F1(P1P2) 12,60,7 11… 5 12,0 2,29 F2(P1P2) 5… 93 15,9 2,48 0,72 - 2,25 2, 9,90, Размах изменчивости гибридов второго поколения (lim = 5…16) был значительно меньше, чем между родительскими формами (lim = 7…22) из-за отсутствия в гибридной популяции растений с наиболее крупными соцветиями, что свидетельствует об участии в расщеплении большого числа генов.

Генотипическая дисперсия F2(Ск.86 С9139) также была относительно небольшой величины: 2gF2 = X2F2(CV2F2 - CV2P1) = 9,92(0,1592 – 0,1342) = 0,72.

Дальнейший генетический анализ проведен по схеме Н.А. Соболева (табл. 4.2).

Таким образом, промежуточное наследование размера соцветия гибридами первого поколения обусловлено разнонаправленностью аллельного и неаллельного взаимодействий генов. Предположение о полигенном контроле межвидовых различий по этому признаку подтвердилось, но в данной ситуации точное определение числа генов невозможно.

Особенностью рассматриваемой генетической ситуации является многократное превышение генотипической дисперсии популяции Р1(Ск.86) над генотипической дисперсией популяции F2(Ск.86 С9139) (табл. 4.2). Кроме того, в популяции F2(Ск.86 С9139) наблюдалась трансгрессия в сторону наименьшего значения признака, но отсутствовали растения с крупными соцветиями. Это можно объяснить тем, что по случайным причинам гибридные семена были получены на основе только одного генотипа, гомозиготного по минус-аллелям наиболее сильных локусов, определяющих генотипическую изменчивость сортовой популяции F. esculentum. Поэтому имеет смысл скорректировать результаты генетического анализа, построив модель этой ситуации. Неизвестная величина этой модели – Р1М, то есть фенотипическое значение уменьшенной средней Скороспелой 86. Вероятно, это значение должно быть ближе к F1, чем реальная популяционная средняя Р1. Иначе, модельную величину Р1М следует приравнять к полученному в эксперименте значению F1. Тогда исходные данные и ход анализа будут иметь следующий вид: Р1М=F1=12,6;

Р2=8,1;

F1=12,6;

F2=9,9;

Ха=0,5(12,6+8,1)=10,35;

а./=0,5(12,6 8,1)=2,25;

С1=12,6-10,35=2,25;

С2=9,9-10,35=-0,45;

d1=-1,8-2,25=4,05;

d2=-2,03;

f1=6,3;

f2=1,57;

D=-1,8;

E=2,8;

N=7,6.

Моделирование (замена Р1 на Р1М) не изменило характера выявляемых генетических взаимодействий: сверхдоминирования малого значения признака (D=-1,8) и перекрывающего его положительного сверхэпистаза (E=2,8), дающих в F1 иллюзию доминирования большого значения признака (положительного доминирования). При этом получена более правдоподобная оценка числа генов, участвующих в расщеплении.

Наследование межвидовых различий по размеру цветка. Все изученные растения F. esculentum формировали более крупные цветки, по сравнению с растениями линии С9139 F. homotropicum. Варьирование величины радиуса венчика в популяции вида-перекрестника было значительно шире, чем у линии С9139. Относительная изменчивость также была выше у F. esculentum (табл.

4.3). Популяция гибридов F1(Ск.86 С9139) была небольшой и относительно однородной, с промежуточным наследованием признака. Популяция гибридов F2(Ск.86 С9139) существенно отличалась от популяции гибридов F1(Ск. С9139) по среднему выражению признака (табл. 4.3;

t=7.8), что свидетельствует об участии неаддитивных взаимодействий в контроле варьирования признака.

Размах изменчивости среди гибридов F2 был значительно меньше, чем между родительскими формами (lim = 2,07…4,71 мм) из-за отсутствия среди проанализированных гибридных растений второго поколения наиболее мелкоцветковых форм, что свидетельствует об участии в расщеплении большого числа генов.

Таблица 4.3 - Наследование различий между F. esculentum (Ск. 86) и F.homotropicum (С9139) по признаку "радиус цветка" (1999 г.).

Родитель- Число D E Радиус цветка, мм ская генов 2 ph, g, CV, форма, n мм2 мм % гибрид lim Xm Р1, Ск.86 3,46…4, 23 7,3 0,0934 0, 4,140, Р2, С9139 2,07…2, 22 3,4 0,0055 2,190, 3,24…3, F1(P1xP2) 5 2,4 0,0063 3,300, 2,80…4, F2(P1xP2) 93 8,9 0,1079 0,1000 2,02 -1,88 3,690, Оценка величины и характера генетических взаимодействий, а также числа генов, участвующих в расщеплении, была сделана по схеме Н.А.

Соболева (1976) (табл. 4.3). Таким образом, близкое к промежуточному (по сравнению с родительскими формами) проявление признака в F1 связано с разнонаправленностью аллельного и неаллельного взаимодействия генов.

Подтвержден полигенный характер расщепления в F2 (12 генов), но следует отметить, что в данной ситуации точное определение числа генов невозможно.

Эволюция размера цветка и соцветия у F. esculentum и F. homotropicum (обсуждение). Генетическим анализом выявлено, что размер цветка и размер соцветия демонстрируют разные направления эволюционных изменений, и, следовательно, их изменения вызваны разными селективными факторами.

Поскольку плюс-аллели доминируют в локусах, контролирующих размер цветка, и рецессивны в локусах, контролирующих число элементарных соцветий в соцветии, "диким типом" для гречихи можно считать фенотип с крупными, хорошо заметными цветками, в сочетании с небольшим числом элементарных соцветий. Эволюция самоопыляющегося вида F. homotropicum сопровождалась только уменьшением размера цветка. С другой стороны, сортовая популяция перекрестноопыляющегося вида F. esculentum поддерживает генетическую систему, обеспечивающую формирование крупного цветка (исходный, или "дикий" признак) и крупного соцветия (приобретенный, или мутантный признак).

Крупное соцветие, очевидно, необходимо для возделываемых сортов.

Селекция на урожайность ведет к увеличению числа метамеров в соцветии. В данной работе использован сорт Скороспелая 86 F. esculentum, который не селектировался на увеличение размера соцветия, но внутрисортовой полиморфизм по этому признаку оказался достаточно высоким. Изменчивость числа метамеров соцветия в пределах сорта Скороспелая 86 обусловлена локусами с более сильным эффектом, чем полигены, контролирующие межвидовые различия. Высокая генетическая гетерогенность по размеру соцветия, возможно, является компонентом генетической системы внутрипопуляционного гетерозиса, необходимой для поддержания продуктивности сорта. В то же время, показано возможность успешной селекции на дальнейшее увеличение размера соцветия (Мартыненко Г.Е., 1996).

Энтомофильным видам необходимы крупные цветки, заметные для насекомых. С другой стороны, a priori, крупное соцветие выполняет те же функции. Однако, как показано в нашей работе, увеличение размера соцветия обусловлено накоплением рецессивных генов, и, по-видимому, является результатом вторичной эволюции, возможно, уже после доместикации.

Остается открытым вопрос, почему перекрестноопыляющийся предок F.

homotropicum поддерживал генетическую систему, которая контролировала развитие соцветия небольшого размера?

Экспериментально установлено (Harder L.D., Barrett S.C.H., 1995), что одновременное распускание множества цветков в соцветии приводит к гейтеногамии (опылению пыльцой соседних цветков). Таким образом, поддержание комплекса генов, обеспечивающего формирование небольшого числа метамеров в соцветии, характерного для диких форм, вероятно, оптимизирует пыльцевой режим, когда плотность популяции становится низкой. В культивируемых популяциях плотность ценоза всегда достаточна для нормального функционирования перекрестного опыления, и вероятность гейтеногамии сводиться к минимуму. Поддержание небольшого числа элементарных соцветий в соцветии F. homotropicum может рассматриваться также в рамках концепции экономии затрат на репродукцию.

Гены, определяющие тип цветка, в геноме F. homotropicum Локус S4. Расщепление по типу цветка в F2 гомостильного межвидового гибрида F. esculentum C9606 достоверно соответствует 3:1 (2=0,01;

P=0,91):

все 512 гомостильных (Гд) растений были не устойчивы к опадению семян по разделительному слою, 169 длинностолбчатых (Д) гибридов были устойчивы к опадению. Расщепление по типу цветка среди гибридов BC1F1(F. esculentum C9606) достоверно соответствовало 1:1 (2=0,39;

P=0,53): 78 Гд (75опад. : уст.к опад.) и 86Д (1 опад. : 85 уст.к опад.). Частота рекомбинации варьировала от 0% (в F2) до 1,2…3,9 % (для BC1F1). Аналогичные результаты были получены в экспериментах с участием образца С9139 F. homotropicum (Fesenko N.N. et al., 1998). Гибриды F1 (C9139 C9606) были гомостильными и опадающими. В комбинации F. esculentum, Д F1(C9139 C9606) было получено 61 гибридное растение, каждое из которых формировало гомостильные цветки. Это прямо подтверждает, что локусы, контролирующие гомостилию цветка линий C9139 и C9606 идентичны. Локус SHT по нашим данным сцеплен с геном WL (группа сцепления №4): 5,3…9,5 % рекомбинации.

Следовательно, ген гомостилии F. homotropicum также относится к группе сцепления №4. В дальнейшем этот локус будет обозначаться S4.

Рецессивный аллель локуса (S) гетеростилии. Прямые данные о том, что гомостилия F. homotropicum и гетеростилия F. esculentum контролируются разными локусами, получены анализом расщепления в F2 короткостолбчатых гибридов F. esculentum, К C9139: кроме ожидаемых короткостолбчатых и гомостильных растений, здесь был обнаружен третий фенотипический класс – длинностолбчатые растения (табл. 4.5). Поскольку короткостолбчатые межвидовые гибриды, которые несут доминантный аллель локуса гетеростилии, не могут одновременно нести рецессивный аллель того же локуса, полученный от того же родителя, можно заключить, что рецессивный аллель локуса гетеростилии мог быть получен только от F. homotropicum.

Таким образом, этот автогамный вид несет рецессивный аллель s локуса гетеростилии, «замаскированный» эпистатическим геном S4.

Мультиаллелизм субгена Р. Если оба доминантных гена (S F. esculentum и S4 линии C9139) включают в себя один и тот же доминантный аллель субгена Р, то гомостильные (Гд) и короткостолбчатые (К) гибриды F1 (F. esculentum C9139) должны были бы иметь одинаковые характеристики пыльцы. Однако, пыльца К-гибридов (V=44,7±0,8 мкм3 103) оказалась крупнее пыльцы гомостильных (V=34,3±1,1 мкм3 103). Таким образом, аллель субгена Р, определяющий размер пыльцы линии С9139, отличается от доминантного и рецессивного аллелей этого субгена у F. esculentum. Он был обозначен PC9139.

Количественный эффект замены Р на PC9139 может быть определен как разница между объемами пыльцевых зерен К- и Гд- гибридов F1 ( =44,7 – 34,3=10, мкм3 103). Доля участия полимерных генов в контроле изменчивости этого признака эквивалентна разнице между растениями, несущими одинаковые аллели главных локусов. Она может быть оценена как разница между К растениями F. esculentum и К-гибридами F1 (F. esculentum C9139) ( =52,2 – 44,7 = 7,5 мкм3 103), или между Гд-гибридами F1 (F. esculentum C9139) и гомостильными растениями образца С9139 ( =34,3 – 27,2=7,1 мкм3 103).

Аллельные варианты субгенов, входящих в состав локуса S4. Локус S образцов С9139 и С9606 включает в себя рецессивный аллель g и доминантный аллель A, однако, аллели субгена Р различаются. Образец С9606 несет супераллель gPA (длинный столбик, крупная пыльца и длинные тычинки);

образец С9139 несет супераллель gPC9139A (длинный столбик, пыльца промежуточного размера, длинные тычинки). Формы F. esculentum с пыльцой промежуточного размера выделялись и ранее (Фесенко Н.Н., 1995), но вывода о мультиаллелизме субгена Р сделано не было. Это стало возможным благодаря сравнительному анализу эффектов локусов S и S4.

Дополнительные доказательства аллополиплоидной природы тетраплоидного F. homotropicum Все гибриды F1 F. esculentum (4x), Д H№4 были автофертильны, с гомостильными (Гд) цветками и опадающими (по разделительному слою) семенами. Тот же характер наследования в F1 в этой комбинации наблюдался и на диплоидном уровне. Анализ гибридов расщепляющихся поколений проводился в полевых условиях, где часть гибридных растений заметно поразилась болезнями (как и линия H#4), из-за чего фенотип некоторых из них не удалось идентифицировать.

В популяции F2 (F. esculentum (4x), Д H№4) проанализировано растение, и зарегистрированы следующие фенотипы: 99 растений с опадающими семенами (70 гомостильных, 25 длинностолбчатых и неидентифицированных по типу цветка) и 2 – с неопределенным фенотипом по опадению (1 длинностолбчатое и 1 неидентифицированное по типу цветка).

В скрещивании F. esculentum (4x), Д F1(F. esculentum H№4) получено 11 опадающих гибридов (5 с гомостильными цветками и 6 с длинностолбчатыми) (Таблица 4.7). В результате самоопыления гомостильных гибридов BC1F1(F.e. (4x), Д H№4) получено 47 опадающих растений (27 Гд :

16Д : 4?) и 2 устойчивых к опадению длинностолбчатых растения.

Самоопыление Гд-растений из этой популяции позволило выделить потомства, расщепляющиеся по типу цветка, в которых все гомостильные растения были опадающими, а все длинностолбчатые – устойчивыми к опадению (Fesenko N.N., Fesenko I.N., 2007).

Эти результаты могут быть интерпретированы следующим образом: в генотипе линии H№4 поддерживается четыре доминантных аллеля локуса SHT, два из которых сцеплены с геном гомостилии цветка (как у диплоидных образцов F. homotropicum), а два других – не сцеплены с генами, определяющими тип цветка (как у F. esculentum subsp. ancestrale)(Fesenko N.N., Fesenko I.N., 2007). Такие особенности генотипа линии H№4 согласуются с гипотезой о гибридном происхождении тетраплоидных вариантов F.

homotropicum, предложенной O. Ohnishi и N. Asano (1999). Эта гипотеза, основанная на результатах анализа изоферментов, предполагает, что тетраплоидная ветвь F. homotropicum имела две предковые формы: одна из них – диплоидный F. homotropicum, другая – F. esculentum subsp. ancestrale (Ohnishi O., Asano N., 1999).

Наследование (и локализация) новых мутаций Мутация articulation (atl). Моногенная рецессивная мутация (расщепление в F2(wt (дикий тип) atl) – 215wt : 66atl, 2=0,34;

в F2(atl wt) 142wt : 36atl, 2=2,16), блокирует формирование разделительного слоя на цветоножке (эпистатирует доминантный ген SHT, сцепленный с локусом S (гомостилия F. homotropicum)): в популяции, расщепляющейся одновременно по atl и гаплотипу SHT-S4, все гомостильные растения мутантной формы были устойчивы к опадению семян, тогда как все гомостильные растения дикого типа были опадающими. Кроме того, мутация вызывает ряд морфологических изменений, например, формирование под цветком чешуевидной или лепестковидной структуры. Иногда один лепесток отсутствует в околоцветнике, но формируется несколько ниже, сбоку от цветоножки (Фесенко А.Н. и др., 2009). Эти данные пока не интерпретированы в рамках классической модели развития цветка (Soltis D.E. et al., 2007). Для определения локализации гена ATL также необходимы дополнительные эксперименты.

Мутация tepal-like bract (tlb) вызывает лепестковидность брактеи (кроющего листа цветка). В скрещиваниях с диким типом наследуется рецессивно моногенно (в F2 (tlb wt) соотношение мутантов и растений "дикого типа" составило 131:376, 2=0,19;

в F2 (wt tlb) – 25:104, 2=2,17).

Сделан вывод, что ген TLB контролирует базальную границу экспрессии генов класса В (Фесенко А.Н. и др., 2005;

Logacheva M.D. et al., 2008). По нашим данным, ген тесно сцеплен с локусами S4 и SHT. В F2 (tlb SHT-S4) получено расщепление 217wt : 67 tlb: все мутанты были длинностолбчатыми и устойчивыми к опадению, все растения дикого типа – гомостильными и опадающими. Среди гибридов F2(tlb F. esculentum subsp. ancestrale) также не было обнаружено рекомбинантных классов по генам TLB и SHT;

соотношение составило 177 wt :56 tlb.

Форма с заменой 2-3 лепестков химерными структурами, сочетающими признаки лепестков и генеративных органов выделена нами из популяции, расщепляющейся по мутации tlb. В отличие от ранее известной формы carpelloid (Sabitov A.M., 1989) или fagopyrum apetala2 (Lagacheva M.D. et al., 2008), эта рецессивная моногенная (в F2 соотношение мутантов и растений "дикого типа" составило 71:237, 2=0,43) мутация вызывает замену 2- лепестков химерными структурами, сочетающими признаки лепестков и генеративных органов. Как и две вышеупомянутые мутации, эта форма не имеет известных аналогов на других объектах. Ее интерпретация в рамках ABC-модели развития цветка пока представляется затруднительной (Soltis D.E.

et al., 2007).

5. ПРОГАМНАЯ НЕСОВМЕСТИМОСТЬ ВИДОВ РОДА FAGOPYRUM: МЕХАНИЗМЫ И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ Несовместимость видов на стадии роста пыльцевых трубок может контролироваться как генами действующих систем самонесовместимости, так и дополнительными генами, влияние которых на внутривидовую систему несовместимости не установлено (de Nettancourt D., 1977;

Li W. et al., 2010).

Закономерности прогамной несовместимости скрещиваний между видами рода Fagopyrum в большинстве случаев соответствуют правилу "односторонней несовместимости" (Lewis D., Crow L.K., 1958) между самонесовместимыми (СН) и самосовместимыми (СС) видами. В этой главе изложены результаты экспериментов по генетическому анализу выявленных прогамных барьеров между видами гречихи.

Закономерности роста пыльцевых трубок В иллегитимных комбинациях внутривидовых и межвидовых скрещиваний с участием длинностолбчатых (Д) растений пыльцевые трубки преодолевают расстояние, достаточное или большее, чем необходимо для преодоления пестика в легитимной (для этой пыльцы) комбинации (табл. 5.1;

для сравнения см. табл. 5.2).

Пыльца F. homotropicum и F. tataricum также прорастает в длиных (Д) пестиках обоих гетеростильных видов расстояние, как минимум достаточное для преодоления столбика собственного вида (табл. 5.1, 5.3). Приведенные данные, по-видимому, свидетельствуют об отсутствии каких-либо специфических механизмов торможения пыльцевых трубок другого вида в пестиках Д-растений F. esculentum и F. cymosum. Это предположение подтвердилось в экспериментах по гибридизации F. esculentum (Д) С9139:

когда в качестве материнской формы были отобраны длинностолбчатые растения с генетически укороченным пестиком, результативность скрещиваний в этой комбинации повысилась с 3,1 до 46,3%. Аналогичным образом, цветки длинностолбчатой (Д) формы F. giganteum (пестик короче, чем у Д-формы F.

cymosum) завязывали семена при опылении пыльцой F. tataricum:

результативность таких скрещиваний составила 26,7 %.

Таблица 5.1 - Длина пыльцевых трубок в пестиках длинностолбчатых (Д) цветков видов гречихи (2009, 2011гг.).

Пыльца (Д-Пестик) Размер Год пыльцы С9143 к- F. esculentum мкм 3103 F. cymosum F. cymosum F. esculentum, Д 456…1235 809… 18,3...25,8 2009 951… 2011 897...1271 621...1197 923... F. esculentum, К 37,6...59,1 2009 1744...2398 601... 2011 1829...2354 721... С9143 F. cymosum, Д 17,3...25,4 1287… 2009 1263... 2011 1121...1416 1227... С9143 F. cymosum, К 39,7...54,9 2009 1614... 2011 1687... к-4231 F. cymosum,Д 1193… 16,8...33,3 2011 1154... к-4231 F. cymosum,К 35,0...65,0 2009 1763...2401 2189... 2011 1920...2217 1975... к-17 F. tataricum 826…915 667… 10,0...21,3 2011 801...912 760... к-108 F. tataricum 576… 11,0...17,8 2011 601... С9139 909… 22,1...35,6 F. homotropicum 2011 1007... С2026 1111…1315 1122… 18,0...31,1 F. homotropicum 2011 921...1219 900... В большинстве комбинаций опыления коротких (К) пестиков F.

esculentum и F. cymosum пыльцевые трубки прорастали на очень короткое расстояние, останавливаясь в большинстве случаев в пределах рыльца (табл.

5.2). В комбинации F. cymosum (К) F. esculentum (Д) торможение трубок происходило в столбике. Единственная комбинация из этой серии, в которой не зафиксировано прогамных барьеров несовместимости – F. esculentum (К) F.

cymosum (Д).

В пестиках F. homotropicum и F. tataricum не зафиксировано активности известных S-генов: пыльцевые трубки во всех случаях достигали микропиле, или прорастали расстояние, превышающее необходимое для преодоления пестика в совместимых внутривидовых скрещиваниях (или самоопылении) (табл. 5.3);

в некоторых комбинациях получены гибридные семена.

Таблица 5.2 - Длина пыльцевых трубок в пестиках короткостолбчатых (К) цветков видов гречихи (2009,2011гг.).

Пыльца (К-Пестик) Размер пыльцы Год С9143 к-4231 С мкм 3103 F.esculentum F. cymosum F. cymosum F.

cymosum 831…886 211…649 190… F. esculentum, 18,3...25,8 2009 157... Д 2011 850...892 161...451 241...560 210... 112…134 64… F. esculentum, 37,6...59,1 К 2011 105...121 72... 954… F. cymosum, 16,8...33,3 2009 989...1003 1095... к-4231, Д 2011 895...922 880...1037 1148... F. cymosum, 20,0...26,8 2009 958...1001 976... С2049, Д 2011 943...1020 970... F. tataricum, 2х 61…96 90…144 106…118 94… 10,0...21,3 2011 70...101 80...127 100...122 100... 102…107 101…112 91… F.homotropicum 22,1...35,6 С9139 2011 100...112 99...112 85... 77… F.homotropicum 18,0...31,1 С2026 2011 83... Таблица 5.3 - Длина пыльцевых трубок в пестиках образцов F. homotropicum (F.h.)(2011 г.).

Длина пыльцевой трубки, мкм Размер пыльцы мкм Пыльца C9139 C9606 C2026 H# F.h. С9139 861...954 1248...1312 772…855 934… 22,1...35, F.h. С9606 865…921 1521...1609 1015… 34,6...65, F.h. С2026 854…965 686…742 882… 18,0...31, 869…976 1424...1615 880… F.h. H#4 53,9...67, 922… F.tataricum k-108 11,0...17, F.esculentum, Д 913… 18,3...25, F.esculentum, К 37,6...59,1 779...814 1001... Генетический анализ прогамных барьеров несовместимсти Комбинация F. esculentum (К) С9139 F. homotropicum. Отторжение пыльцевых трубок в этой комбинации контролируется генами несовместимости гаметофитного типа, ассоциированными с локусом S4 (гомостилия цветка) F.

homotropicum и доминантным аллелем локуса S F. esculentum. Анализом расщеплений установлено, что при скрещивании F. esculentum (К) F1 (F.

esculentum С9139) признаки "гомостилия" и "опадение (ген SHT, тесно сцепленный с S4)" почти не передаются потомству;

у гибридов F. esculentum (Д) F1 (F. esculentum С9139) по этим признакам наблюдаются менделевские соотношения. Таким образом, можно заключить, что пыльцевые трубки гибридов F1(F. esculentum С9139), проявившие несовместимость в тканях рыльца короткостолбчатых цветков F. esculentum, несли гены S4 и SHT.

Комбинация F. cymosum (К) F. tataricum. В комбинациях F. tataricum F. cymosum (Д, К) на диплоидном и тетраплоидном уровнях были получены длинностолбчатые и короткостолбчатые гибриды (см. главу 3).

Результативность реципрокных скрещиваний оказалась нулевой: пыльцевые трубки прорастают, но останавливаются обычно в тканях рыльца (табл. 5.2).

Такая же картина наблюдается при опылении пыльцой F. tataricum короткостолбчатых цветков F. giganteum и гибридов F1(F. giganteum F.

tataricum).

Гибриды F2 (F. tataricum (4х) F. giganteum) несут два полных гаплоидных набора хромосом F. tataricum, но расщепляются по генам F.

cymosum. При опылении цветков короткостолбчатых гибридов F2 (F. tataricum (4х) F. giganteum) пыльцой F. tataricum (к-108) наблюдалось торможение пыльцевых трубок в пестиках каждого из 34 проанализированных гибридных растений: ген, контролирующий несовместимость пестика К-формы F. cymosum с пыльцой F. tataricum, не рекомбинирует (жестко сцеплен) с доминантным аллелем локуса гетеростилии.

Комбинации F. cymosum (К) С9139 F. homotropicum и F. esculentum (K) F. tataricum. В пестиках Д-цветков F. esculentum и F. cymosum пыльцевые трубки F. tataricum и F. homotropicum прорастают расстояние, достаточное для преодоления собственного пестика при самоопылении (табл. 5.1). В Д столбиках F. giganteum трубки пыльцы обоих видов достигают микропиле. В К пестиках F. esculentum, F. cymosum и F. giganteum происходит четко выраженное торможение трубок пыльцы обоих автогамных (гомостильных) видов.

Цветки К-растений F2 (F. tataricum (4х) F. giganteum) опыляли пыльцой линии С9139. В столбиках каждого из 34 проанализированных гибридных растений наблюдалось торможение трубок пыльцы линии С9139. Таким образом, ген, контролирующий прогамную несовместимость комбинации F.

cymosum, К F. homotropicum, так же, как и ген, контролирующий несовместимость К-пестика F. cymosum с пыльцой F. tataricum, тесно сцеплен с доминантным аллелем локуса гетеростилии F. cymosum. Следовательно, можно предположить, что несовместимость К-пестика F. cymosum с пыльцой F.

tataricum и F. homotropicum контролируется одним и тем же геном, и, с другой стороны, F. tataricum и F. homotropicum несут один и тот же ген несовместимости пыльцы. Дополнительным свидетельством в пользу идентичности генов несовместимости пыльцы F. tataricum и F. homotropicum может служить прогамная несовместимость на стадии роста пыльцевых трубок комбинаций F. esculentum (К) F. tataricum и F. esculentum (К) С9139 F.

homotropicum.

Комбинация F. cymosum (К) F. esculentum (Д). Влияние доминантного S гена F. cymosum per se на совместимость К-пестика наглядно проявилось в условиях гибридной генетической среды: анализ несовместимости комбинации F. cymosum (К) F. esculentum (Д) был проведен на тех же короткостолбчатых растениях F2 (F. tataricum (4х) F. giganteum), что и анализ предыдущих комбинаций. Цветки межвидовых гибридов опыляли пыльцой длинностолбчатых растений F. esculentum и наблюдали рост пыльцевых трубок.

В пестиках 12 из 34 изученных растений пыльцевые трубки достигали микропиле. В остальных случаях (22 растения) наблюдалось остановка роста пыльцевых трубок, в основном в тканях столбика (как и в комбинациях F.

cymosum, к-4231 (К) F. esculentum (Д) и F. giganteum (К) F. esculentum (Д)).

Таким образом, прогамная несовместимость комбинации F. cymosum (К) F.

esculentum (Д) контролируется геном, не сцепленным жестко с локусом гетеростилии, но, по-видимому, проявляющимся только в присутствии его доминантного аллеля (короткостолбчатый цветок).

Комбинация F. giganteum (Д) F. esculentum (Д)). В комбинации F.

cymosum (Д) F. esculentum (К) не выявлено прогамных барьеров;

в иллегитимной комбинации F. cymosum (Д) F. esculentum (Д) пыльцевые трубки не достигают микропиле, но прорастают расстояние, большее, чем в легитимной комбинации F. esculentum (К) F. esculentum (Д) (табл. 5.1, 5.2).

Исходя из цитологической картины несовместимости иллегитимной комбинации F. cymosum (Д) F. esculentum (Д) можно предположить, что недостаточная длина пыльцевых трубок в данном случае связана с нехваткой в пыльцевых зернах пластических веществ, необходимых для роста пыльцевых трубок, то есть ген, вызывающий торможение трубок в комбинации F. cymosum (К) F. esculentum (Д), не экспрессируется в пестике Д-формы F. cymosum. Эта гипотеза не подтвердилась применительно к комбинации F. giganteum (Д) F.

esculentum (Д), где пыльцевые трубки прорастали расстояние 181...768 мкм, то есть меньшее, чем в комбинациях F. esculentum (К) F. esculentum (Д) и F.

cymosum (Д) F. esculentum (Д). Это можно связать с активизацией гена, контролирующего несовместимость комбинации F. cymosum (К) F. esculentum (Д). В случае с F. cymosum экспрессия этого гена, по-видимому, зависит от присутствия в генотипе доминантного аллеля локуса гетеростилии, то есть этот S-ген утратил элементы, необходимые для его самостоятельной экспрессии.

Поэтому его экспрессию в пестике Д-формы F. giganteum можно объяснить только тем, что недостающие для этого компоненты в данном случае получены от F. tataricum.

Пыльца длинностолбчатых гибридов F2 (Гд1 С9606) несовместима с пестиком короткостолбчатой формы F. cymosum. F. homotropicum (линии С и С9606) несет рецессивный аллель локуса гетеростилии, гипостатичный по отношению к гену S4, контролирующему гомостилию цветка. Ген S ассоциирован с одним из аллелей утраченной гаметофитной системы, проявляющимся при опылении пыльцой этого вида короткостолбчатых цветков F. esculentum и F. cymosum. Для ответа на вопрос, несет ли F. homotropicum второй (экспрессирующийся в пыльце Д-формы F. esculentum) аллель реликтовой системы несовместимости, были получены гибриды F2 (F.

esculentum (линия Гд1) С9606). Поскольку ген гомостилии цветка линии Гд аллелен локусу гетеростилии (S) F. esculentum, Д-растения, выщепляющиеся в F2 (Гд1 С9606), могли получить рецессивный s-аллель только от F.

homotropicum. Пыльца этих Д-растений тестировалась на совместимость с пестиками К-форм F. cymosum и F. esculentum. Всего протестировано растений. Пыльца каждого из них успешно прорастала К-пестик F. esculentum, но прекращала рост в К-пестике F. cymosum. Таким образом, по-видимому, F.

homotropicum также несет S-ген, идентичный по специфичности гену, вызывающему несовместимость пыльцы Д-формы F. esculentum с К-пестиком F. cymosum.

Обозначения генов, контролирующих прогамную несовместимость видов В изложенных экспериментах было выявлено два гена несовместимости, которые не являются аллелями одного локуса, но, по-видимому, представляют собой компоненты одной системы несовместимости, которая предположительно была утрачена в процессе эволюции и заменена гетеростилией. Ген, контролирующий несовместимость комбинаций F.

cymosum (К) F. tataricum, F. cymosum (К) С9139 F.homotropicum и F.

esculentum (К) С9139 F. homotropicum полностью функционален. Экспрессия второго гена, контролирующего прогамную несовместимость комбинации F.cymosum (К) F. esculentum (Д), зависит от наличия в генотипе первого гена.

По-видимому, элементы, отвечающие за самостоятельную экспрессию этого S гена, были утрачены, но сохранились фрагменты, определяющие специфичность реакции несовместимости.

Таким образом, эти гены реликтовой гаметофитной системы несовместимости можно обозначить S1 и S2, с указанием их видовой принадлежности. Это будет выглядеть следующим образом:

S1С, S2С – гены S1 и S2 в геноме F.cymosum;

S1T – ген S1 в геноме F. tataricum;

S1E и S2E – гены S1 и S2 в геноме F. esculentum;

S1H, S2H – гены S1 и S2 в геноме F.homotropicum.

Характеристики совместимости пыльцы и пестика амфидиплоида F. giganteum в межвидовых и внутривидовых скрещиваниях Амфидиплоид F. giganteum поддерживается в коллекции ВИР с момента его появления (Кротов А.С., Драненко Е.Т., 1973) как самофертильный гомоморфный (Д-форма) образец. Его короткостолбчатый аналог, синтезированный скрещиванием F. tataricum F. cymosum (К) (Fesenko I.N., 2005), также оказался самофертильным. Завязываемость семян в легитимных и иллегитимных скрещиваниях между растениями F.giganteum существенно не различалась.

Ген S1T неактивен в пыльце F. giganteum. Самофертильность короткостолбчатой формы амфидиплоида выглядит неожиданной на фоне полной несовместимости короткого пестика F. cymosum с пыльцой F. tataricum.

Поскольку в F. giganteum представлены полные наборы генов обоих видов, то необходимо признать, что, или ген несовместимости К-пестика F. cymosum, или ген несовместимости пыльцы F. tataricum должен быть инактивирован в геноме F. giganteum. Поскольку совместимость комбинации F. giganteum (К) F.