Эволюция высоковирулентного вируса гриппа а (h5n1) в экосистемах северной евразии (
На правах рукописи
Щелканов Михаил Юрьевич Эволюция высоковирулентного вируса гриппа А (H5N1) в экосистемах Северной Евразии (2005–2009 гг.)
Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук
03.02.02 – вирусология
Научный консультант:
академик РАМН, д.м.н., профессор Д.К. Львов Москва, 2010 2
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук научно исследовательском институте вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН.
Научный консультант: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Дмитрий Константинович Львов
Официальные оппоненты: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Николай Вениаминович Каверин академик РАМН, доктор биологических наук, профессор Олег Иванович Киселёв доктор медицинских наук, профессор Юрий Захарович Гендон
Ведущая организация: Учреждении Российской академии медицинских наук научно исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН
Защита состоится «_» _ 2010 г. в _ часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.020.01 при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: Москва, 123098, ул. Гамалеи, д. 16, конференц-зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.
Автореферат разослан « » _ 2010 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 001.020. Доктор медицинских наук Елена Ивановна Бурцева 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
.
1.1. Актуальность проблемы.
Вирусы гриппа А (Orthomyxoviridae 1, Influenza A virus), обладающие высокой степенью изменчивости генома, являются этиологическими агентами опасных инфекционных заболеваний человека и животных, способных протекать в форме обширных эпизоотий, эпидемий и пандемий с высокой смертностью [Львов Д.К., 1974, 2010;
Сергеев В.А., 1983;
Киселёв О.И., 2003;
Малеев В.В., 2006;
Гендон Ю.З., 2008;
Каверин Н.В., 2008].
Геном вируса гриппа А представлен 8 сегментами РНК негативной полярности:
[PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS]. Описаны 16 типов НА (Н1–16) и 9 типов NA (N1–9). Из 144 теоретически возможных субтипов – комбинаций типов НА и NA – в настоящее время, известны 115 (79.9 %). Развитие молекулярно-генетических методов привело к накоплению большого количества полноразмерных нуклеотидных последовательностей генома, классификация которых позволила выделить отдельные генотипы для каждого сегмента [Lu G., 2007] – PB2: A–C, E–L (11 генотипов);
PB1: A–I (8 генотипов);
PA: A–K (11 генотипов);
НА: Н1: A–D (4 генотипа);
H2: A–I (9 генотипов);
H3: A–D, F (5 генотипов);
H4: A–C (3 генотипа);
H5: A–C, E–K (10 генотипов);
Н6: A–G (7 генотипов);
H7: A–F (6 генотипов);
H8: A (1 генотип);
H9: A–C, E–G, I, J (8 генотипов);
H10: A–E (4 генотипа);
H11: A–C (3 генотипа);
Н12: A, B (2 генотипа);
H13: А–C (3 генотипа);
Н14: А (1 генотип);
Н15: А (1 генотип);
Н16: А, В, С (3 генотипа) (итого для НА: 16 подтипов, 70 генотипов);
NP: A–H (8 генотипов);
NA: N1: A–L (12 генотипов);
N2: A–G (7 генотипов);
N3: A–D, F (4 генотипа);
N4: A–C (3 генотипа);
N5: B–D (3 генотипа);
N6: A–E (5 генотипов);
N7: A–G (7 генотипов);
N8: A–C (3 генотипа);
N9: A, B (2 генотипа) (итого для NA: 9 подтипов, 46 генотипов);
М: A–G (7 генотипов);
NS: подтип 1: A–F (6 генотипов);
подтип 2: A, B, D (3 генотипа) (итого для NS:
2 подтипа, 9 генотипов).
Природным резервуаром вируса гриппа А являются птицы водно-околоводного экологического комплекса – в первую очередь, подсем. речных уток (Anatinae Leach, 1820) сем. утиных (Anatidae Leach, 1820), а также сем. чайковых (Laridae Rafinesque, 1815) и крачковых (Sternidae Vigors, 1825). Из 115 известных, на сегодняшний день, субтипов вируса гриппа А, 114 (99.1 %) изолированы от диких птиц. Современные молекулярно-генетические методы предоставляют всё больше информации о механизмах адаптации птичьих вариантов вируса к новым хозяевам. Поэтому грипп А следует рассматривать как зооантропонозную инфекцию [Львов Д.К., 1974, 2006;
Webster R.G., 1976, 1992;
Laver W.G., 1979;
Lvov D.K., 1987, 2008]. Преодолевая межвидовые барьеры, вирусы гриппа А способны проникать в популяции новых потенциальных хозяев, адаптироваться и циркулировать среди них достаточно продолжительное время.
Варианты вирусов гриппа А птиц, имея аффинность рецептор-связывающего сайта НА к 2’-3’-сиаловым кислотам, поражают, главным образом, эпителий кишечника птиц [Гамбарян А.С., 2007]. Инфекция слабовирулентными (LPAI – low pathogenic avian influenza) Семейство Orthomyxoviridae, в настоящее время, включает 5 родов: Influenza A virus (прототип – вирус гриппа А);
Influenza B virus (вирус гриппа B);
Influenza C virus (вирус гриппа C);
Thogotovirus (вирус Тогото);
Isavirus (вирус инфекционной анемии лососевых) [Kawaoka Y., 2005].
вариантами этого вируса может протекать инаппарантно, в форме энтерита.
Высоковирулентные (HPAI – highly pathogenic avian influenza) варианты, связанные с подтипами НА / Н5 и НА / Н7, вызывают системное заболевание – классическую чуму птиц (КЧП) – при котором ведущими симптомами являются поражение нервной и сосудистой систем [Perroncito E., 1878;
Сюрин В.Н., 1998]. Молекулярным маркёром HPAI-фенотипа является обогащение сайта протеолитического нарезания НА базофильными аминокислотными остатками [Alexander D.J., 1986]. КЧП способна вызвать обширные эпизоотии с уровнем падежа, приближающимся к 100 %. По мере роста численности людей и поголовья сельскохозяйственных птиц, такие эпизоотии становятся всё более масштабными, увеличивая риск преодоления вирусом межвидового барьера и формирования нового пандемического варианта [Львов Д.К., 1972, 1974, 2005;
Сюрин В.Н., 1972;
Webster R.G., 1976;
Lvov D.K., 1987, 2008].
Варианты вирусов гриппа А, адаптированные к млекопитающим, имея аффинность рецептор-связывающего сайта НА к 2’-6’-сиаловым кислотам, поражают эпителий слизистой оболочки верхних отделов респираторного тракта, в результате чего происходит дегенерация, некроз и отторжение пораженных клеток трахеи и бронхов [Гамбарян А.С., 2007;
Львов Д.К., 2010]. Однако главным звеном в патогенезе гриппа А является поражение сосудистой и нервной систем, возникающее вследствие токсического действия вируса и стимулирования образования активных форм кислорода. Нарушение микроциркуляции является причиной возникновения геморрагических проявлений – от носовых кровотечений до геморрагического отека лёгких и кровоизлияний в вещество головного мозга [Киселёв О.И., 1994;
Колобухина Л.В., 2001;
Чучалин А.Г., 2006]. Вирусы гриппа А являются этиологическими агентами эпизоотической бронхопневмонии свиней;
гриппа и тяжёлых пневмоний, осложнённых бактериальными коинфекциями, человека;
заразного катара верхних дыхательных путей лошадей;
заразного кашля верблюдов;
эпизоотических бронхопневмоний морских млекопитающих [Горбунова А.С., 1973;
Сюрин В.Н., 1998;
Львов Д.К., 2005;
Колобухина Л.В., 2008].
Вирусы гриппа А занимают важное место в структуре заболеваемости людей острыми респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ), составляющими до 90 % от всех других инфекционных болезней [Гендон Ю.З., 2001;
Киселёв О.И., 2003]. По данным Всемирной Организации здравоохранения (ВОЗ), только тяжёлыми формами гриппа в мире ежегодно заболевают 3–5 млн. человек. Заболеваемость гриппом в РФ – 25–35 млн., из них 45–60 % – дети. Экономический ущерб РФ от сезонного эпидемического гриппа составляет, в среднем, 80 млрд. руб. / год, или порядка 85 % экономических потерь от инфекционных болезней в целом [Онищенко Г.Г., 2002, 2006]. Гриппозная инфекция играет важную роль в обострении хронических заболеваний и развитии осложнений, нередко являющихся причиной смерти больных: показано, что наличие хронических сердечно-сосудистых или лёгочных заболеваний повышает риск летального исхода при гриппе в 50–100 раз [Киселёв О.И., 1994;
Колобухина Л.В., 2008].
В период пандемий заболеваемость и смертность от гриппа А приобретают катастрофические масштабы стихийного бедствия. Например, пандемия «испанки» (1918– 1919 гг.;
прототип – A/Brevig Mission/1/18 (H1N1) [A, A, A, 1A, A, 1A, B, 1A]) привела к заражению 600 млн. и гибели 50–100 млн. (т.е. 30 % и 5 % населения Земли, соответственно).
Пандемия «азиатского гриппа» (1957–1959 гг.;
прототипный штамм – A/Singapore/1/57 (H2N2) [A, E, B, 2A, A, 2A, B, 1A]) стала причиной гибели более 1 млн.;
пандемия «гонконгского гриппа» (1968–1970 гг.;
A/Hong Kong/1/68 (H3N2) [A, D, B, 3A, A, 2A, B, 1A]) – около 1 млн.;
крупная эпидемия «русского гриппа» (1977–1978 гг.;
A/USSR/90/77 (H1N1) [A, A, B, 1B, A, 1A, B, 1A]) – около 300 тыс. человек [Гендон Ю.З., 1998;
Супотницкий М.В., 2006]. Современная пандемия «свиного гриппа» (2009–2010 гг.;
A/California/07/09 (H1N1) swl [C, D, E, 1B, A, 1F, F, 1A]), на конец марта 2010 г., по данным ВОЗ, стала причиной более 17 тыс. смертей, потребовала масштабных затрат и усилий международного сообщества на проведение противоэпидемических мероприятий [Львов Д.К., 2010;
Цыбалова Л.М., 2010].
Вероятность преодоления вирусом межвидового барьера резко возрастает в период обширных эпизоотий. В частности, пристальное внимание исследователей привлекает современная эпизоотия HPAI / H5N1, которая началась ещё в 1997 г. в Юго-Восточной Азии.
Прототипным штаммом для первой волны эпизоотии 1997 г. стал A/chicken/HK/258/97 (H5N1) [G, G, E, 5J, F, 1G, F, 1E] (т.н. генотип 0, или H5J 0). Этот штамм сформировался в результате множественных реассортаций: источником НА стал A/goose/Guangdong/1/96 (H5N1) [K, G, D, 5J, F, 1J, F, 2A];
NA – A/teal/HK/W312/97 (H6N1) [G, G, E, 6B, F, 1G, F, 1E];
внутренних генов – A/teal/HK/W312/97 (H6N1) и A/quail/HK/G1/97 (H9N2) [G, G, E, 9B, F, 2E, F, 1E] [Guan Y., 1999;
Hoffmann E., 2000]. Вторая волна эпизоотии началась в 1999–2000 г., когда произошли новые реассортации, в которых участвовали A/goose/Guangdong/1/96 (H5N1) и A/duck/HK/Y280/97 (H9N2) [K, G, E, 9C, F, 2B, F, 1E], и сформировались HPAI / H5N1 / 01, принадлежащие реассортационным генотипам A–E [Guan-02, Hatta-01] (не следует путать их с НА-генотипами линии H5J). Третья волна эпизоотии была предсказана отечественными исследователями [Lvov D.K., 2004] осенью 2001 г., когда в популяциях диких птиц Дальневосточно-Притихоокеанского миграционного русла была обнаружена аномально высокая интенсивность циркуляции вирусов гриппа А (Н5). Осенью 2003 г. эпизоотия HPAI / H5N1 охватила Юго-Восточную Азию, и мы стали готовиться к проникновению вируса в Северную Евразию (сформулировав, в частности, цели и задачи настоящей работы). Весной 2005 г. HPAI / H5N1 проник на юг Западной Сибири и осенью того же года вдоль миграционных путей диких птиц – на п-ов Индостан, в Европу, Среднюю Азию, Закавказье, Ближний Восток и в Африку. Весной 2008 г. вирус завершил захват Северной Евразии, проникнув в её восточный сектор.
Распространение HPAI / H5N1 на территории Старого Света может иметь катастрофические последствия в случае появления у этого вируса эпидемического потенциала, так как, во-первых, у человечества отсутствует коллективный иммунитет к вирусам гриппа А (Н5), а во-вторых, из 467 людей, заболевших в результате заражения HPAI / H5N1 за 2003–2009 гг., 282 умерли, т.е. летальность достигает 60 % [www.who.int].
Поскольку Северная Евразия является крупнейшим гнездовым ареалом птиц водно околоводного экологического комплекса, где происходят интенсивные межвидовые взаимодействия в системе «вирусы гриппа А – дикие и домашние птицы – млекопитающие», а также активная амплификация вирусных вариантов в неиммунных популяциях сеголетних птиц, изучение эволюции HPAI / H5N1 на данной территории представляет не только фундаментальный, но и несомненный научно-практический интерес.
1.2. Цель исследования: изучение эволюции HPAI / H5N1 в процессе популяционных взаимодействий вируса, диких и домашних животных на основе комплексного эколого вирусологического мониторинга в экосистемах Северной Евразии.
Работа выполнялась в соответствие с планом НИР «Популяционные взаимодействия в системе:вирусы гриппа - человек – животные» (госрегистрация № 0120.0 603538) и «Новые и возвращающиеся вирусные инфекции в системе биобезопасности государства» (госрегистрация № 0120.0 603544) НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.
1.3. Задачи исследования:
изучить характеристики циркуляции различных вариантов вируса гриппа А в экосистемах Северной Евразии накануне проникновения в них высоковирулентного вируса гриппа А (H5N1);
установить и обосновать схемы проникновения HPAI / H5N1 в экосистемы Северной Евразии;
изучить экологические, фенотипические и молекулярно-генетические характеристики, установить корреляции между гено- и фенотипом вариантов HPAI / H5N1, получивших распространение в Северной Евразии;
выяснить пути распространения и схемы циркуляции HPAI / H5N1 на территории Северной Евразии.
1.4. Научная новизна работы заключается в том, что впервые были проанализированы причины и последствия проникновения вариантов HPAI / H5N1 – с полными генотипами [K, G, D, 5J 2.2, F, 1J, F, 1E] и [K, G, D, 5J 2.3.2, F, 1J, F, 1E] – в Северную Евразию, описан процесс их распространения и молекулярной эволюции. Это стало возможным благодаря включению современных молекулярно-генетических методов в технологическую цепочку эколого вирусологических исследований, что также имеет инновационное значение: удалось интегрировать результаты экологических, вирусологических и молекулярно-генетических данных в единый комплекс, позволяющий вырабатывать достоверные среднесрочные прогнозы развития эпизоотии высоковирулентного вируса гриппа А (H5N1) в экосистемах Северной Евразии.
Впервые удалось добиться регулярного оперативного – в течение нескольких дней – получения молекулярно-вирусологических данных в ходе расшифровки эпизоотических вспышек HPAI / H5N1 в экосистемах Северной Евразии.
Разработаны новые высокоэффективные модели инфекции, вызванной HPAI / H5N1, в культурах клеток различного происхождения in vitro для разработки диагностических, лечебных и профилактических препаратов. Получен патент РФ № 2309983 (приоритет от 25.11.2005 г.) «Метод первичной изоляции штаммов вируса гриппа А, штамм virus A/duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1) для приготовления диагностических и профилактических препаратов, для оценки противовирусной активности различных соединений». С помощью этих моделей получены приоритетные данные о резистентности и чувствительности к действию ряда противогриппозных препаратов вариантов HPAI / H5N1, получивших распространение в экосистемах Северной Евразии.
Впервые рекомендованы производственные штаммы HPAI / H5N1, один из которых был использован для разработки и крупномасштабного производства отечественной ветеринарной вакцины.
1.5. Практическая ценность работы.
Показано, что в период 2001–2005 гг. HPAI / Н5 отсутствовали на территории Северной Евразии, что является важным элементом доказательства интродукции этого вируса весной 2005 г..
Установлен этиологический агент – HPAI / H5N1 – для восьми крупных эпизоотических эпизодов на территории Северной Евразии, что позволило корректно спланировать систему противоэпизоотических мероприятий.
Показано, что HPAI / H5N1, получивший распространение в экосистемах Северной Евразии, содержит ряд молекулярных маркёров, повышающих тропизм к клеткам млекопитающих и эпидемический потенциал этого вируса.
В результате анализа генома и прямых биологических экспериментов на высокоэффективных моделях in vitro было установлено, что штаммы HPAI / H5N Северной Евразии чувствительны к коммерческим антигриппозным химиопрепаратам – ремантдину, озельтамивиру, арбидолу и рибавирину – что чрезвычайно важно с точки зрения подготовки к возможной эпидемии и пандемии HPAI / H5N1, а также химиотерапии и химиопрофилактики контингентов повышенного риска заболеваемости (персонала ПТФ, ветеринаров, охотоведов и т.д.).
Получен приоритет по депонированию в Государственную Коллекцию вирусов РФ (ГКВ РФ) 60 штаммов HPAI / H5N1 (2005–2009 гг.) и 1 штамма LPAI / H5N3 (2003 г.). Штамм A/chicken/Novosibirsk/64/05 предложен в качестве кандидата в вакцинные штаммы и используется для крупномасштабного производства отечественной ветеринарной вакцины «ФЛУ ПРОТЕКТ Н5».
1.6. Основные положения, выносимые на защиту:
В период 2001–2004 гг. – накануне проникновения в Северную Евразию HPAI / H5N1 – на данной территории этот вирус обнаружен не был. Это является одним из элементов доказательства проникновения HPAI / H5N1 в Западную Сибирь весной 2005 г..
Вирус гриппа А, вызвавший эпизоотическую вспышку среди диких и домашних птиц в Барабинской низменности летом 2005 г., имел высоковирулентный фенотип, принадлежал к генотипу [K, G, D, 5J 2.2, F, 1J, F, 1E] и был генетически близок к штаммам, изолированным на оз. Кукунор (пров. Цинхай, КНР) весной 2005 г.. Проникновение Цинхай Сибирского генотипа (H5J 2.2) в Северную Евразию произошло во время весенней миграции диких птиц 2005 г. из Юго-Восточной Азии через оз. Кукунор и «Джунгарские ворота» (тектоническое понижение между Тянь-Шанем и Монгольским Алтаем).
Цинхай-Сибирский генотип (H5J 2.2) HPAI / H5N1, начиная с весны 2005 г. и по настоящее время, обладает следующими молекулярно-генетическими характеристиками: сайт протеолитического нарезания НА – P337QGERRRKKRGLF349 – обогащённый основными а.о., является маркёром HPAI-фенотипа;
РСС НА соответствует птичьим вариантам вируса гриппа А с повышенной аффинностью к 2’-3’-сиаловым кислотам;
в домене НА2 отсутствуют мутации, свойственные арбидол-резистентным штаммам;
белок NA содержит делецию – C49NQSIITYENNTWVNQTYVN68относительно штамма A/goose/Guangdong/1/96 (H5N1), что свидетельствует о принадлежности к генотипу Z;
в белке NA отсутствуют мутации, характерные для озельтамивир-резистентных штаммов;
белок PB2 содержит сайт K627, РВ1 – Р13, NS1 – K41, S42, делецию A80IASS84 (относительно консенсуса HPAI / H5N1) и E92, являющиеся маркёрами повышенного тропизма вируса к клеткам млекопитающих;
в белке РВ содержится ORF (95–367 н.о. относительно ORF PB1) для неструктурного белка PB1-F2, играющего важную роль в индукции апоптоза;
белок М2 содержит L26, V27, A30, S31 и G34, определяющие чувствительность к адамантановым производным – ремантадину и амантадину.
Таким образом, штаммы Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) содержат ряд маркёров повышенной вирулентности по отношению к клеткам млекопитающих, что увеличивает вероятность преодоления межвидового барьера. Вирус сохраняет аффинность РСС НА к 2’ 3’-сиаловым кислотам, содержащимся на поверхности эпителия птиц. Штаммы Цинхай Сибирского генотипа чувствительны к химиопрепаратам – ингибиторам нейраминидазной активности, функционирования протонных каналов, формируемых М2-тетрамерами, слияния мембран вириона и эндосомы, что подтверждается результатами как анализа генома, так и прямых экспериментов in vitro.
Распространение HPAI / H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) в западном секторе Северной Евразии осенью 2005 г. происходило в южном направлении вдоль Индо Азиатского миграционного русла (в результате чего вирус проник на п-ов Индостан) и в юго западном направлении вдоль Восточно-Европейского миграционного русла диких птиц, которые занесли вирус на юг Русской равнины, в Черноморско-Прикаспийский регион, откуда HPAI / H5N1 проник в страны Восточной и Западной Европы, Закавказья, Ближнего Востока и Африки. В этот период эпизоотия охватывала всё новые популяции неиммунных хозяев, а потому генетический дрейф вируса был выражен слабо.
Весной 2006 г. распространение HPAI / H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) происходило в направлении из зимовочных ареалов к гнездовым ареалам на территории Северной Евразии. В частности, в этот период вирус проник с дикими утками с п- ва Индостан в Восточную Сибирь, где вызвал на оз. Убсу-Нур (на границе Республики Тыва РФ и МНР) одну из крупнейших эпизоотий с высоким уровнем падежа среди диких птиц. При расшифровке этой эпизоотии были впервые обнаружены варианты Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) Тувинско-Сибирской подгруппы.
В феврале 2007 г. в Подмосковье имели место 9 локальных эпизоотических вспышек (8 – в Московской, 1 – в Калужской обл.), этиологически связанных с HPAI / H5N1 Цинхай Сибирского генотипа (H5J 2.2) и происходящих из единого источника на рынке «Садовод» (Юго-Восточный адм. округ г. Москвы) в результате непреднамеренных рукотворных действий. Штаммы, изолированные при расшифровке этой эпизоотии, были генетически близки к штаммам, полученным осенью 2006 г. в Причерноморско-Каспийском регионе, имели ряд уникальных аминокислотных замен относительно консенсуса Цинхай-Сибирского генотипа (особенно в белке РВ1, все 8 аминокислотных замен оказались уникальными) и положили начало новой генетической подгруппе внутри генотипа H5J 2.2 – Ирано Северокавказской.
В сентябре 2007 г. эпизоотическая вспышка среди диких и домашних птиц на лимане Лебяжий вблизи юго-восточного побережья Азовского моря (Краснодарский край) была этиологически связана с HPAI / H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) Тувинско Сибирской подгруппы.
Эпизоотическая вспышка в северной части Кубано-Приазовской низменности в декабре 2007 г. с эпицентром на ПТФ «Гуляй-Борисовская» (Ростовская обл.) имела ряд экологических особенностей: указанная ПТФ стала источником массового заражения диких птиц наземного экологического комплекса – грачей (Corvus frugilegus), ворон (Corvus corone), голубей (Columba livia), воробьёв (Passer montanus) и скворцов (Sturnus vulgaris) – у которых также наблюдали клинические проявления инфекции. Этиологический агент эпизоотии относился к Ирано-Северокавказской подгруппе Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2).
Центром генетического разнообразия высоковирулентного вируса гриппа А птиц Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) на территории западного сектора Северной Евразии является Кубано-Приазовская низменность.
Уровень вирулентности штаммов Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) последовательно снижался в период 2005–2007 гг.. Наиболее выраженное снижение вирулентности обнаружено в штаммах от домашних птиц, наименее выраженое – в штаммах от диких птиц. Путём сопоставления фенотипических и молекулярно-генетических данных выявлены точечные аминокислотные замены, вероятно влияющие на снижение вирулентности.
С весны 2005 г., когда HPAI / H5N1 начал распространяться в западном секторе Северной Евразии, и до весны 2008 г. в восточном секторе Северной Евразии не были обнаружены варианты HPAI / H5N1. В период 2005–2007 гг. на Дальнем Востоке – в Средне Амурской низм. и юге Приморского края – методом ОТ-ПЦР обнаруживались лишь LPAI / H (главным образом, среди, птиц водно-околоводного экологического комплекса).
Проникновение HPAI / H5N1 в экосистемы восточного сектора Северной Евразии произошло весной 2008 г. с мигрирующими дикими птицами из южных провинций КНР и примыкающих территорий Вьетнама и Лаоса и было связано с Уссурийским генотипом (H5J 2.3.2).
Эпизоотическая вспышка среди диких птиц на оз. Убсу-Нур летом 2009 г. была этиологически связана с HPAI / H5N1 Уссурийского генотипа (H5J 2.3.2). Проникновение вируса произошло из Юго-Восточной Азии вдоль Джунгарского миграционного русла.
Цинхай-Сибирский (H5J 2.2) генотип, распространённый в западном секторе Северной Евразии, отличается от Уссурийского (H5J 2.3.2), распространённого в восточном секторе, на 4.6–7.0 % по ORF HA;
в среднем, – на 5.8 %. Внутри генотипа H5J 2.2 можно выделить 4 генетические подгруппы (Цинхайскую, Западносибирскую, Тувинско-Сибирскую и Ирано-Северокавказскую), ORF HA которых отличаются, в среднем, на 1.5 %;
а внутри H5J 2.3.2 – 2 генетические подгруппы (Дальневосточно-Южнокитайскую и Западномонгольскую) и 2.1 %, соответственно.
1.7. Апробация диссертационной работы осуществлялась в ходе проведения ежегодных отчётных конференциях НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 2001– 2009 гг.;
сессий Проблемной комиссии по гриппу РАМН;
V Межрегиональной научно практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы здоровья населения Сибири: гигиенические и эпидемиологические аспекты» (Омск, Россия;
25– 26 ноября 2004 г.);
X Национальной конференции Монгольской Народной Республики «Актуальные вопросы вирусологии» (Улан-Батор, МНР;
25 ноября 2004 г.);
Международном семинаре «Изменение климата и здоровье населения России в XXI веке» (Москва, Россия;
5– 6 апреля 2004 г.);
III Всероссийской научно-практической конференции «Информационные технологии и математическое моделирование (ИТММ-2004)» (Анжеро-Судженск, Россия, 11– 12 декабря 2004 г.);
Всероссийской научно-практической конференции «Качество образования:
теория и практика» (Анжеро-Судженск, Россия, 10–11 декабря 2004 г.);
Международной научно-практической конференции «Болезни диких животных» (Покров, Владимирская обл., Россия, 28–30 сентября 2004 г.);
Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Кольцово, Новосибирская обл., Россия;
8–10 сентября 2004 г.);
Всероссийской научной конференции с участием зарубежных учёных «Сибирская зоологическая Конференция» (Новосибирск, Россия;
15–22 сентября 2004 г.);
Международной научной конференции «Современные проблемы эпизоотологии» (Краснообск, Новосибирская обл., Россия;
30 июня 2004 г.);
Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт Петербург, Россия;
1–2 декабря 2004 г.);
III Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, Россия;
20– 24 января 2004 г.);
III-го Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия;
14–18 марта 2005 г.);
Second European Influenza conference (Valetta, Malta;
September 11–14, 2005);
Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Сосновка, Новосибирская обл., Россия;
25–27 октября 2005 г.);
XI международной научной конференции «Современные проблемы информатизации в прикладных задачах» (Воронеж, Россия;
15–20 января 2006 г.);
XII Международной орнитологической конференции (Ставрополь, Россия;
31 января – 5 февраля 2006 г.);
VI Научно-практической конференции «Проблемы прогнозирования чрезвычайных ситуаций» (п. Никола, Иркутская обл., Россия;
5–7 сентября 2006 г.);
VI International conference «Options for the Control of Influenza» (Toronto, Canada;
June 17–23, 2007);
6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2007» («Генодиагностика–2007») (Москва, Россия;
28–30 ноября 2007 г.);
IV Международного ветеринарного конгресса по птицеводству (Москва, Россия;
08– 11 апреля 2008);
XIV International congress of virology (Istanbul, Turkey;
August 10–15, 2008);
Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирск, Россия;
9–10 октября 2008 г.);
VI Научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, Россия;
2–3 октября 2008 г.);
International conference «New trends in infectious diseases» (Lyon, France;
November 26–28, 2008);
8th Asia-Pacific congress of medical virology «Emerging zoonotic viruses in Northern Asia-Pacific ecosystems» (Hong Kong;
February 24 – March 02, 2009);
Международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Сосновка, Новосибирская обл., Россия;
14–15 мая 2009 г.);
Международной конференции «Emerging influenza viruses: H5N1, H1N1» (Marburg, Germany;
February 15–16, 2010).
Диссертационная работа получила рекомендации к защите в Диссертационном Совете Д 001.020.01 на совместном заседании Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ по специальности «Вирусология» при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и Отдела экологии вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Протокол № 7 от 27.05.2010).
1.8. Научные публикации по теме диссертации.
Результаты диссертационной работы отражены в 61 научной публикации: в 26 статьях (в том числе, опубликованных в периодических научных изданиях из списка ВАК – 22);
в 1 главе монографии;
в 2 статьях научных сборников;
в 32 тезисах научных конференций (13 – российских;
1 – Национальной конференции МНР;
13 – международных, проводимых в России;
5 – международных зарубежных).
1.9. Структура диссертационной работы (488 с. машинописного текста):
«Содержание» (9 с.), «Введение» (10 с.);
«Обзор литературы» (175 с., 108 рис., 18 табл.);
«Собственные исследования» (178 с., 66 рис., 63 табл.);
«Обсуждение полученных результатов» (25 с., 7 рис., 4 табл.);
«Выводы» (2 с.), «Дополнительные материалы» (89 с.;
список использованной литературы содержит 1256 наименований, из которых 521 – на русском языке).
2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Материалы и методы.
Сбор полевого материала – клоакальных смывов и внутренних органов от диких и домашних птиц – осуществляли в процессе планового мониторинга ключевых точек Северной Евразии, а также при расшифровке эпизоотий (табл. 1, рис. 1). Полевой материал доставлялся в лабораторию в сосудах Дьюара с жидким азотом (- 196 °С) и хранился в низкотемпературны холодильниках при температуре не выше - 50 °С;
все промежуточные операции осуществлялись без разрыва холодовой цепочки с применеием сухого льда (- 74 °С) [Львов Д.К., 1995, 2008].
Обратную транскрипцию с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) для индикация РНК вируса гриппа А в полевом матерале и вирусосодержащих образцах после Таблица 1 (начало). Данные о штаммах * HPAI / H5N1 (2005–2009 гг.), депонированных в ГКВ РФ.
Номер Клини- lg TCID50/ Месяц, Месяц, Регион Регион депонента ческая мл для год год в ГКВ РФ форма ** СПЭВ 2372 БКП 5. A/grebe/Novosibirsk/29/ дикие Юг Западной Сибири (Новосибирская обл.) Среднее значение: 5. (генотип H5J 2.2) Июль 2005 г.
2371 БЛН 7. A/duck/Novosibirsk/56/ (п. 2.3.1) A/duck/Novosibirsk/67/05 2376 СПГ 10. A/chicken/Novosibirsk/64/05 2373 СПГ 11. домашние A/chicken/Novosibirsk/65/05 2374 СПГ 10. A/chicken/Novosibirsk/66/05 2375 СПГ 10. Среднее значение: 10. 2379 БЛН 3. A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-1/ 2380 БЛН 4. A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-2/ 2381 БЛН 4. A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-3/ Республика Калмыкия) (Астраханская обл., (генотип H5J 2.2) 2382 БЛН 3. A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-4/ Ноябрь 2005 г.
Дельта Волги 2383 БЛН 5. A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-5/ (п. 2.3.2) дикие 2384 БЛН 5. A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-6/ 2385 БЛН 5. A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-7/ 2386 БЛН 4. A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-8/ 2387 БЛН 3. A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-9/ 2388 БЛН 4. A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-10/ Среднее значение: 4. 2393 БЛН A/grebe/Tyva/Tyv06-1/06 8. (Республика Тыва) (генотип H5J 2.2) Озеро Убсу-Нур 2394 БЛН 8. A/grebe/Tyva/Tyv06-2/ Июнь 2006 г.
A/cormorant/Tyva/Tyv06-4/06 2396 БКП 5. (п. 2.3.3) дикие A/coot/Tyva/Tyv06-6/06 2397 БЛН 5. 2395 СПГ 8. A/grebe/Tyva/Tyv06-8/ A/tern/Tyva/Tyv06-18/06 2399 БКП 5. Среднее значение: 6. A/chicken/Moscow/1/07 (Одинцовский р-н МО) 2403 СПГ 4. A/chicken/Moscow/2/07 (Домодедовский р-н МО) 2404 СПГ 4. A/chicken/Moscow/3/07 (Подольский р-н МО) 2405 СПГ 4. (Московская обл., (генотип H5J 2.2) Калужская обл.) Февраль 2007 г.
Подмосковье A/chicken/Moscow/4/07 (Нарофоминский р-н МО) 2406 СПГ 4. (п. 2.3.4) A/goose/Moscow/5/07 (Талдомский р-н МО) 2407 СПГ 4. домашние A/chicken/Moscow/6/07 (Волоколамский р-н МО) 2408 СПГ 4. A/chicken/Moscow/7/07 (Раменский р-н МО) 2409 СПГ 4. A/chicken/Moscow/8/07 (Дмитровский р-н МО) 2410 СПГ 4. A/chicken/Moscow/9/07 (Боровский р-н КО) 2414 СПГ 4. Среднее значение: 4. * Жирным шрифтом выделены штаммы, для которых имеются сиквенсы полноразмрных геномов в базе данных GenBank;
«МО» – Московская область, «КО» – Калужская область.
** «БКП» – без клинических проявлений, «БЛН» – больная, «СПГ» – свежепогибшая птица.
Таблица 1 (окончание). Данные о штаммах * HPAI / H5N1 (2005–2009 гг.), депонированных в ГКВ РФ.
Экологиче Номер Клини- lg TCID50/ Месяц, ская Регион Штамм депонента ческая мл для группа год в ГКВ РФ форма ** СПЭВ птиц 2421 БЛН 3. A/Cygnus cygnus/Krasnodar/329/ Северо-восточная (генотип H5J 2.2) дикие Сентябрь 2007 г.
(Краснодарский часть акватории Азовского моря Среднее значение: 3. (п. 2.3.5) край) 2418 БЛН 3. A/chicken/Krasnodar/300/ A/chicken/Krasnodar/301/07 2419 БЛН 3. домашние A/chicken/Krasnodar/302/07 2420 БЛН 3. Среднее значение: 3. 2423 БКП 6. A/pigeon/Rostov-on-Don/6/ A/pigeon/Rostov-on-Don/7/07 2424 БКП 5. A/heron/Rostov-on-Don/11/07 2425 БКП 6. A/pigeon/Rostov-on-Don/21/07 2426 БКП 6. Юго-западная часть Русской Равнины дикие 2427 БКП 6. A/rook/Rostov-on-Don/26/ A/rook/Rostov-on-Don/27/07 2428 БКП 6. (генотип H5J 2.2) (Ростовская обл.) A/tree sparrow/Rostov-on-Don/28/07 2429 БКП 6. Декабрь 2007 г.
2435 БКП 6. A/starling/Rostov-on-Don/39/ (п. 2.3.6) Среднее значение: 6. A/chicken/Rostov-on-Don/31/07 2430 БЛН 7. A/chicken/Rostov-on-Don/32/07 2431 БЛН 7. A/chicken/Rostov-on-Don/33/07 2432 СПГ 7. A/chicken/Rostov-on-Don/34/07 2433 СПГ 7. домашние 2434 СПГ 7. A/chicken/Rostov-on-Don/35/ 2436 СПГ 7. A/muscovy duck/Rostov-on-Don/51/ A/chicken/Rostov-on-Don/52/07 2437 СПГ 7. Среднее значение: 7. Суйфун-Ханкайская A/Anas crecca/Primorje/8/08 2441 БКП 4. (Приморский край) (генотип H5J 2.3.2) дикие Апрель 2008 г.
Среднее значение:
низменность 4. (п. 2.5.1) 2440 СПГ 4. A/chicken/Primorje/1/ A/chicken/Primorje/11/08 2442 СПГ 4. домашние A/chicken/Primorje/12/08 2443 СПГ 4. Среднее значение: 4. 2461 СПГ 3. A/grebe/Tyva/3/ (генотип H5J 2.3.2) (Республика Тыва) Озеро Убсу-Нур A/grebe/Tyva/5/09 2462 СПГ 2. Июнь 2009 г.
A/grebe/Tyva/8/09 2463 СПГ 2. (п. 2.5.2) дикие 2464 СПГ 2. A/bean goose/Tyva/10/ A/grebe/Tyva/15/09 2465 СПГ 3. A/grebe/Tyva/16/09 2466 БКП 2. Среднее значение: 2. * Жирным шрифтом выделены штаммы, для которых имеются сиквенсы полноразмрных геномов в базе данных GenBank;
«МО» – Московская область, «КО» – Калужская область.
** «БКП» – без клинических проявлений, «БЛН» – больная, «СПГ» – свежепогибшая птица.
Б В А Д Е Г З И Ж М К Л Рисунок 1. Клинические признаки заболевания КЧП, этиологически связанной с HPAI / H5N1, у диких и домашних птиц:
А – характерные движения – высокое поднятие киля – у больного красноголового нырка (Aythya ferina);
Б – больная домашняя утка (Anas platyrhynchos domesticus) в период заваливания головы: на спине у основания шеи видны признаки дерматита и гиперемии кожного покрова;
помутнение роговицы;
В – инъекция сосудов двенадцатиперстного участка кишечника и изменение структуры поджелудочной железы красноголового нырка (Aythya ferina);
Г – цианоз и отек слизистой оболочки пищевода с точечными кровоизлияниями у домашней курицы (Gallus gallus domesticus);
Д – парез нижних конечностей у больного лебедя-шипуна (Cygnus olor);
Е – утыкание клюва в дно лодки, искривление шеи, заваливание тела на киль у больного лебедя-шипуна (Cygnus olor);
Ж – инъекция сосудов двенадцатипёрстного отдела кишечника и брыжейки у больного лебедя-шипуна (Cygnus olor);
З – поздняя стадия заболевания у чомги (Podiceps cristatus): отчётливо выражены признаки нейроинфекции;
И – ранняя стадия заболевания у лысухи (Fulica atra): малоподвижность и дыхательная недостаточность при отсутствии признаков нейроинфекции на фоне умеренного энтерита;
К – кровоизлияние в жировую ткань у инфицированной домашней курицы (Gallus gallus domesticus);
Л – полнокровие сосудов кишечника у инфицированного сизого голубя (Columba livia);
М – полнокровие сосудов кишечника и изменение структуры поджелудочной железы у мёртвого инфицированного грача (Corvus frugilegus).
изоляции проводили с использованием праймеров, специфичных для сегментов NP, HA / H5 и НА / Н7, а ОТ-ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) – М и HA / H5 [Киреев Д.Е., 2007;
Гребенникова Т.В., 2008].
Изоляцию вируса проводили путём заражения 9–10-дневных развивающихся куриных эмбрионов в аллантоисную полость, а также клеточных линий СПЭВ и MDCK [Шубладзе А.К., 1949;
Соминина А.А., 2006], предоставленных РККК при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.
Идентификацию штаммов осуществляли с помощью РГА, РТГА [Hirst G.K., 1941;
МУ 3.3.2.1758-03], ИФА [МУ 3.3.2.1758-03Бутенко А.М., 2008], РН [Шубладзе А.К., 1949;
Дерябин П.Г., 2008], [Мирзабеков А.Д., 2003;
биологических микрочипов Гребенникова Т.В., 2008], ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ с набором специфических праймеров, а также – в ряде случаев – с помощью секвенирования нуклеотидных последовательностей полноразмерного вирусного генома или его фрагментов [Sanger F., 1977;
Прилипов А.Г., 2008].
Изучение спектра клеточного тропизма штаммов HPAI / H5N1 проводили с использованием перевиваемых клеточных линий MDCK, СПЭВ, BHK-21, HEL, Vero-E6, Mpf, L929, CC81, CRFK, предоставленных РККК при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН [Каталог РККК, 1999], а также первичной культуры клеток ФЭК [Дерябин П.Г., 2007].
Изучение чувствительности штаммов HPAI / H5N1 к химиопрепаратам in vitro проводили при заражении клеточной линии СПЭВ. Снижение уровня репродукции вируса в присутствие препаратов – солянокислого ремантадина (АО «Адамантан», РФ), солянокислого амантадина («Олайнфарм», Латвия), рибавирина (виразол) (ICN Pharmaceutical, США), арбидола («Мастерлек» РФ) – по сравнению с контролем без препарата оценивали по уровню ЦПД, титра в РТГА и с помощью ИФА [Ленёва И.А., 1994;
Львов Д.К., 2006].
Депонирование прототипных штаммов осуществляли в ГКВ РФ (табл. 1) [Фадеева Л.Л., 2008], а нуклеотидных последовательностей – в международную базу данных GenBank [Benson D.A., 2010].
Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием собственных информационных технологий на основе MS Excel, MatLab и WinStatics [Shchelkanov M.Yu., 1997;
Щелканов М.Ю., 1998].
2.2. Мониторинг вирусов гриппа А на территории Северной Евразии в период 2001–2004 гг..
В период 2001 – 2004 гг. на территории Северной Евразии изолировались только низковирулентные штаммы вирусов гриппа А, включая Н5 (рис. 2). Штамм LPAI A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03 был депонирован в ГКВ РФ (Удостоверение ГКВ 2366).
Отсутствие высоковирулентных штаммов вируса гриппа А (H5) в Северной Евразии на протяжении 2001–2004 гг. является одним из элементов доказательства проникновения HPAI / H5N1 в Западную Сибирь весной 2005 г..
Рисунок 2. Изоляция низковирулентных штаммов от диких и домашних птиц в ключевых точках Северной Евразии (2001–2004 гг.).
2.3. Развитие эпизоотии HPAI / H5N1 в западном секторе Северной Евразии, начиная с весны 2005 г..
2.3.1. Расшифровка эпизоотии с высоким уровнем падежа среди диких и домашних птиц на юге Западной Сибири летом 2005 г. (см. рис. 12) позволила ретроспективно установить, что этиологическим агентом является HPAI / H5N1 [K, G, D, 5J 2.2, F, 1J, F, 1E], который генетически близок к штаммам, изолированным от диких птиц на оз. Кукунор (пров. Цинхай КНР) в мае 2005 г., и вместе с ними формирует Цинхай-Сибирский генотип, получивший позднее международное обозначение H5J 2.2 (рис. 3). Молекулярные маркёры биологических свойств этого генотипа HPAI / H5N1 представлены в табл. 2.
По данным ОТ-ПЦР, заражённость в очаге эпизоотии домашних птиц была свыше 95 %, диких – 35–50 % (главным образом, – водного экологического комплекса: речных уток (Anatinae) и больших поганок (Podiceps cristatus)). Методом биопробы на модели РКЭ и перевиваемых клеточных линий были изолированы 6 штаммов HPAI / H5N1 из клоакальных смывов и внутренних органов диких птиц без клинических проявлений, а также от погибших и больных домашних птиц (табл. 1). В клеточных культурах эти штаммы репродуцировались без добавления трипсина. Чувствительность клеточных линий последовательно возрастала в ряду BHK-21 HEL Vero-E6 MDCK СПЭВ. Штамм A/chicken/Novosibirsk/64/05, обладавший рекордным уровнем как продуктивности in vitro, так и титров антисывороток в РТГА, был выбран в качестве вакцинного кандидата: этот штамм используется для крупномасштабного производства отечественной ветеринарной вакцины «ФЛУ ПРОТЕКТ Н5».
Рисунок 3. Иерархическая структура нуклеотидных последовательностей полноразмерных ORF HA (1 707 н.о.) для прототипных штаммов HPAI / Н5, визуализированная с помощью UPGMA-алгоритма. Названия штаммов, изолированных в Чановской котловине летом 2005 г., выделены рамкой.
2.3.2. Расшифровка эпизоотии с высоким уровнем падежа среди лебедей-шипунов (Cygnus olor) в нижнем поясе дельты Волги в ноябре 2005 г. (см. рис. 12) показала, что этиологическим агентом был HPAI / H5N1, в генетическом отношении, близкий к западносибирским штаммам того же года (см. п. 2.3.1) и вместе с ними формирующий т.н.
западносибирскую подгруппу Цинхай-Сибирского генотипа (рис. 4, 13, табл. 8–9).
Все лебеди-шипуны (100 %) с клиническими признаками заболевания были положительны в ОТ-ПЦР.
Генетические характеристики почти всех изолированных штаммов были идентичны западносибирским;
исключение составлял только штамм A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-4/05, который содержал сайт Е627 вместо К627 в белке PB2, что свойственно большинству штаммов от птиц.
Таблица 2. Молекулярные маркёры биологических свойств Цинхай-Сибирского генотипа.
Белок Аминокислотная Сайт Потенциальные биологические свойства вируса последовательность PB2 627 K Повышенный тропизм вируса к клеткам млекопитающих.
PB1 13 P Повышенный тропизм вируса к клеткам млекопитающих.
н.о. 95– PB1- Неструктурный белок, играющий важную роль в 1–90 относительно F2 индукции апоптоза.
ORF PB Сайт протеолитического нарезания гемагглютинина, 337– PQGERRRKKRG обогащённый основными а.о., свидетельствует о HPAI 349 LF фенотипе.
202 E РСС, высокоафинный к 2’-3’-сиаловым кислотам, 238 Q НА содержащихся на поверхности клеток кишечника птиц.
240 G 376 Q 388 Q Чувствительность к арбидолу *.
397 K 467 K Делеция относительно штамма CNQSIITYENN A/goose/Guangdong/1/96 (H5N1) является маркёром 49– TWVNQTYVN вирулентности по отношению к курам (т.н. генотип Z).
NA 99 E Чувствительность к ингибиторам нейраминидазной 255 H активности – озельтамивиру * и занамивиру.
273 R 275 N 26 L Чувствительность к ингибиторам каналообразующей 27 V активности тетраметров М2 – ремантадину * и M2 30 A амантадину.
31 S 34 G 41 K Повышенный тропизм к клеткам млекопитающих.
42 S NS1 Делеция относительно консенсуса HPAI / H5N1 повышает 80–84 AIASS тропизм к клеткам млекопитающих 92 E Повышенный тропизм к клеткам млекопитающих.
* Подтверждено прямыми экспериментами in vitro.
2.3.3. Расшифровка эпизоотии с высоким уровнем падежа среди диких птиц на оз. Убсу-Нур летом 2006 г. (см. рис. 12) выявила этиологическую роль Цинхай-Сибирского генотипа HPAI / H5N1. В окрестностях этого озера полностью отсутствуют сельскохозяйственные птицы, что подчёркивает ведущую и самостоятельную роль диких птиц в распространении вируса и поддержании эпизоотий.
Были изолированы семь штаммов HPAI / H5N1 (табл. 1). Анализ генома показал отличие тувинских штаммов 2006 г. от североевразийских штаммов 2005 г. – позднее выяснилось, что мы впервые обнаружили варинаты этого вируса Тувинско-Сибирской генетической подгруппы (рис. 13, табл. 8–9). На филогенетическом древе (рис. 5) тувинские штаммы 2006 г. формировали отдельный кластер вместе с индо-пакистанскими штаммами весны-лета 2006 г., дистанцируясь от цинхайских штаммов 2006 г. – в отличие от западносибирских штаммов 2005 г., которые группировались вместе с цинхайскими штаммами весны-лета того же года.
Рисунок 4. Иерархическая структура нуклеотидных последовательностей ORF HA (1 707 н.о.) для прототипных штаммов вируса гриппа А Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2), визуализированная с помощью UPGMA-алгоритма. Названия штаммов, изолированных от лебедей-шипунов (Cygnus olor) в период эпизоотии в нижнем поясе дельты Волги (ноябрь 2005 г.), взяты в рамку.
Рисунок 5. Иерархическая структура нуклеотидных последовательностей ORF HA (1 707 н.о.) для прототипных штаммов вируса гриппа А Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2), визуализированная с помощью SL-алгоритма. Убсунурские штаммы 2006 г. взяты в рамку.
2.3.4. Расшифровка эпизоотии с высоким уровнем падежа среди сельскохозяйственных птиц в Подмосковье (Московская и Калужская области) в феврале 2007 г. (рис. 12) позволила установить этиологическую роль Цинхай-Сибирского генотипа HPAI / H5N1.
Штаммы HPAI / H5N1 были получены из всех 9 локальных эпизоотий (табл. 1). Анализ генома (на примере прототипного A/chicken/Moscow/2/07) выявил наибольшую гомологию с группой штаммов, изолированных в Причерноморско-Каспийском регионе зимой 2005– 2006 гг., что согласуется и с наличием большого числа общих аминокислотных замен (табл. 3).
170 Аминокислотные замены D N в НА и V I в РА прослеживаются, начиная с цинхайских штаммов, но большинство относятся к периоду зимы 2005–2006 гг..
Вместе с тем, подмосковные штаммы 2007 г. заметно отличаются, в молекулярно генетическом отношении, от всех других штаммов HPAI / H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2). В четырёх генах – РВ2, РВ1, НА и NP – имеется 12 уникальных аминокислотных замен (табл. 4), которые нигде, кроме этого штамма, не встречаются. Более того, все аминокислотные замены в белке РВ1 относительно консенсуса HPAI / H5N1 являются уникальными. На филогенетическом древе (рис. 6) эти штаммы формируют отдельную генетическую подгруппу, получившую название «Ирано-Северокавказская».
2.3.5. Расшифровка эпизоотии с высоким уровнем падежа среди диких и домашних птиц в юго-восточной части побережья Азовского моря (Краснодарский край) в сентябре 2007 г. (рис. 12) выявила дальнейшую стратификацию Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) на две генетические подгруппы: Тувинско-Сибирскую и Ирано-Северокавказскую.
Анализ генома изолированных штаммов (табл. 1) позволил выявить значительную генетическую близость A/chicken/Krasnodar/300/07 (изолирован на ПТФ «Лебежья Чепигинское») и A/Cygnus cygnus/Krasnodar/329/07 (изолирован в ур. Лиман Лебяжий), что свидетельствует о том, что вирус проник на ПТФ из популяции диких птиц.
Внутри Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) выделялся кластер, содержащий штаммы, изолированные на территории Кубанско-Приазовской низменности. Внутри этого кластера (заключенного в прямоугольную рамку на рис. 7) чётко дифференцировались две генетические подгруппы: Тувинско-Сибирская и Ирано-Северокавказская (табл. 8–9). Первой из них принадлежат штаммы A/chicken/Krasnodar/{300,329}/07 и содержат ряд аминокислотных замен как общих с тувинскими штаммами 2006 г. (табл. 5), так и уникальных для штаммов данной эпизоотии (табл. 6).
2.3.6. Расшифровка эпизоотии с высоким уровнем падежа среди диких и домашних птиц в северной части Кубано-Приазовской низменности (Ростовская область) в декабре 2007 г. подтвердила продолжающуюся молекулярную эволюцию Цинхай-Сибирского генотипа.
Экологические особенности распространения инфекции заключались в активном вовлечении в эпизоотический процесс диких птиц наземного комплекса – грачей (Corvus frugilegus), ворон (Corvus corone), голубей (Columba livia), воробьёв (Passer montanus) и скворцов (Sturnus vulgaris) – которые в огромных количествах скапливаются в окрестностях населённых пунктов и птицефабрик в осенне-зимний период, во время сезонных кочёвок.
Таблица 3. Аминокислотные замены в генах штамма A/chicken/Moscow/2/07 относительно консенсуса, которые встречаются в ограниченном числе штаммов HPAI / H5N1 Цинхай Сибирского генотипа (H5J 2.2).
Замена в Штаммы, имеющую такую же Белок Позиция Консенсус A/chicken/ аминокислотную замену относительно Moscow/2/07 консенсуса, что и A/chicken/Moscow/2/ 126 K R A/Cygnus cygnus/Iran/754/ PB2 A/Cygnus cygnus/Iran/754/06;
338 V I A/chicken/Sudan/1784-{7,10}/ PA 554 A/bar-headed goose/Qinghai/2/05 V I A/cat/Dagestan/87/06;
A/Cygnus cygnus/Iran/754/06 ;
52 T A A/chicken/Krasnodar/01/06 ;
A/chicken/Adygea/203/06.
A/bar-headed goose/Qinghai/{1-10}/05;
A/brown-headed gull/Qinghai/1/05;
A/Great black-headed gull/Qinghai/{1-3}/ A/great cormorant/Qinghai/3/05;
A/ruddy shelduck/Qinghai/1/05;
A/whooper swan/Qinghai/1/05;
A/grebe/Novosibirsk/29/05;
A/duck/Novosibirsk/56/05;
A/duck/Novosibirsk/02/05;
170 D A/wild duck/Omsk/103-01/05;
N HA A/whooper swan/Mongolia/13/05;
A/pied magpie/Liaoning/7/05;
A/chicken/Inner Mongolia/64/05;
A/chicken/Tambov/570-2/05;
A/chicken/Crimea/{04,08}/05;
A/goose/Crimea/615/05;
A/cat/Dagestan/87/06;
A/chicken/Adygea/203/06;
A/duck/Egypt/1300-NAMRU3/07.
A/chicken/Afghanistan/1207/06;
A/cat/Dagestan/87/06;
171 N D A/Cygnus cygnus/Iran/754/06;
A/chicken/Adygea/203/06;
A/grebe/Tyva/Tyv06-{1,2,8}/06.
A/chicken/Afghanistan/1207/06;
A/Cygnus cygnus/Iran/754/06;
10 Y H A/grebe/Tyva/Tyv06-{1,2,8}/06;
A/duck/Tuva/01/06.
A/bar headed goose/Qinghai/{1–4,9,10}/05;
NP 373 A A/great black headed gull/Qinghai/{2,3}/05;
T A/whooper swan/Qinghai/1/05.
A/chicken/Afghanistan/1207/06;
A/Cygnus cygnus/Iran/754/06;
397 N S A/grebe/Tyva/Tyv06-{1,2,8}/06;
A/duck/Tuva/01/06.
NA 44 A/Cygnus olor/Italy/808/06 R C Рисунок 6. Иерархическая структура ORF НА (1 707 н.о.) штаммов HPAI / H5N1 Цинхай Сибирского генотипа (H5J 2.2), визуализированная с помощью SL-алгоритма. Жирным шрифтом выделен подмосковный штамм 2007 г.. Компактные кластеры, соответствующие некоторым хронологическим группам штаммов, заключены в рамки.
Таблица 4. Уникальные * аминокислотные замены в генах штамма A/chicken/Moscow/2/07 по сравнению со штаммами HPAI / H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2).
Замена в Альтернативная замена относительно Белок Позиция A/chicken/ Консенсус консенсуса Moscow/2/ 50 M отсутствуют I PB 64 I отсутствуют M 38 Y отсутствуют H 113 I отсутствуют T 212 L отсутствуют M 618 E отсутствуют K 646 M отсутствуют I G – A/duck/Kurgan/08/05;
PB A/Cygnus olor/Croatia/1/05;
654 S A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast2005-2-{1-10}/05;
N A/swan/Germany/R{65,606}/06.
A – A/chicken/Nigeria/{1047-{25,30,54},957-12}/06.
678 S отсутствуют G 741 A отсутствуют T Все аминокислотные замены в белке PB1 уникальны PA Нет уникальных аминокислотных замен НА 545 M отсутствуют L NP 90 R отсутствуют K NA Нет уникальных аминокислотных замен Нет уникальных аминокислотных замен M Нет уникальных аминокислотных замен NS * Уникальными считаются те аминокислотные замены относительно консенсуса, которые встречаются только в белках штамма A/chicken/Moscow/2/07.
Таблица 5. Аминокислотные замены в белках вирусных штаммов A/chicken/Krasnodar/{300, 329}/07 относительно консенсуса, которые встречаются в ограниченном числе штаммов HPAI / H5N1 Цинхай–Сибирского генотипа (H5J 2.2).
Консен Замена Штаммы с такой же сусный Позиция Белок A/chicken/ заменой, что и в символ Альтернативные замены Krasnodar/ A/chicken/Krasnodar/ для {300, 329}/07 {300, 329}/07 генотипа H5J 2. A/grebe/Tyva/Tyv06 PB2 473 M отсутствуют T {1, 2, 8}/ A/grebe/Tyva/Tyv06 182 T отсутствуют I {1, 2, 8}/ PB A/grebe/Tyva/Tyv06- I– 451 V L {1, 2, 8}/06 A/chicken/Krasnodar/123/ 213 R отсутствуют отсутствуют K PA G – A/guinea 272 D fowl/Nigeria/957-12/06, отсутствуют E A/ostrich/Nigeria/1047-25/ A/grebe/Tyva/Tyv06 11 {1, 2, 8}/06, V отсутствуют I A/chicken/Afghanistan/1207/ A/duck/Egypt/1300 HA 12 S отсутствуют N NAMRU3/ A/grebe/Tyva/Tyv06 L– 512 {1, 2, 8}/06, A S A/chicken/Mahachkala/05/ A/duck/Tuva/01/ S– A/grebe/Tyva/Tyv06- A/chicken/Navapur/Nandurbar {1, 2, 8}/06, NA 320 P /India/7972/06, L A/duck/Tuva/01/06 A/chicken/Navapur/Nandurbar /India/7966/ Рисунок 7. Филогенетические древо для полноразмерных нуклеотидных последовательностей гена НА штаммов вируса гриппа А (H5N1) Цинхай-Сибирского (H5J 2.2) генотипа. Штаммы из урочища Лиман Лебяжий выделены жирным шрифтом полностью;
у остальных штаммов из Краснодарского края жирным шрифтом выделена часть названия «Krasnodar».
Таблица 6. Уникальные * аминокислотные замены в белках штаммов A/chicken/Krasnodar/{300, 329}/07 относительно консенсуса для HPAI / H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2).
Консенсус Замена в белке Позиция Белок штаммов Альтернативная замена относительно A/chicken/Krasnodar/ консенсуса {300, 329}/ PB2 354 I отсутствует V 495 V отсутствует I 213 R отсутствует K PA G – A/guinea fowl/Nigeria/957-12/06, 272 D E A/ostrich/Nigeria/1047-25/ 102 A D – A/сhicken/Volgograd/236/ S HA 178 R отсутствует I H – A/chicken/Navapur/Nandurbar/India/7972/06, 39 Q L A/chicken/Navapur/Nandurbar/India/7966/ NA 41 G отсутствует R 412 K отсутствует E NS1 64 ** I отсутствует M * Уникальными считаются те аминокислотные замены относительно консенсуса, которые встречаются только в белках штаммов A/chicken/Krasnodar/{300, 329}/07.
** Приводящая к этому нуклеотидная замена не влияет на последовательность белка NS2, так как находится в сплайсируемом участке.
Результаты обследования полевого материала методом ОТ-ПЦР свидетельствуют о том, что этиологическим агентом эпизоотии был HPAI / H5N1. Вирус проник в популяции диких птиц наземного экологического комплекса и обнаружен у 60 % (9 / 15) врановых птиц, 58 % (7 / 12) голубей, 20 % (1 / 5) скворцов, 10 % (1 / 10) полевых воробьёв.
Из собранного полевого материала были изолированы 15 вирусных штаммов (8 – от диких, 7 – от домашних птиц) (табл. 1). Группа гуляй-борисовских штаммов образует плотный кластер внутри Ирано-Северокавказской подгруппы, наиболее близкий к штамму A/chicken/Moscow/2/07 (см. п. 2.3.4) (рис. 8). Уникальные аминокислотные замены, имеющиеся в белках изолированных штаммов, можно разбить на четыре группы (табл. 7): 1. уникальные для группы гуляй-борисовских штаммов, но не штамма A/chicken/Moscow/2/2007 (13 сайтов в РВ2, РА, НА, NP, NA, M2);
2. уникальные как для группы гуляй-борисовских штаммов, так и для штамма A/chicken/Moscow/2/2007 (4 сайта в РВ2, РВ1, NP);
3. уникальные для штамма A/chicken/Moscow/2/2007, но которые не воспроизвелись для группы гуляй-борисовских штаммов (8 сайтов в РВ2, РВ1, НА);
4. уникальные для единственного изолированного штамма: I273 вместо консенсусного V273 в РВ1 у A/pigeon/Rostov-on-Don/6/07, а также V вместо консенсусного I273 в РА у A/starling/Rostov-on-Don/39/07. Штаммы из «московско иранской» подгруппы образца декабря 2007 г. сохранили 4 уникальные аминокислотные замены, впервые отмеченные у штамма A/chicken/Moscow/2/07, и приобрели 13 новых уникальных замен, не встречающихся в других штаммах Цинхай-Сибирского генотипа.
Рисунок 8. Филогенетическое древо (в форме крупных кластеров с перечислением характерных штаммов) гемагглютинина 163 штаммов Цинхай-Сибирского (H5J 2.2) генотипа вируса гриппа А (H5N1), для которых в базе данных GenBank имеются полноразмерные нуклеотидные последовательности. Иерархическая структура кластера, содержащего штаммы юга европейской части России, представлена полностью (жирным шрифтом выделены штаммы из эпицентра рассматриваемой эпизоотической вспышки).
Таблица 7 Аминокислотные замены, обладающие различной степенью уникальности, в белках группы гуляй-борисовских штаммов * HPAI / H5N1.
Замена в Замена в белках гуляй- белке штамма Альтернативные замены в той же Белок Позиция Консенсус борисовских A/chicken/ позиции относительно консенсуса штаммов Moscow/2/ Аминокислотные замены, уникальные для группы гуляй-борисовских штаммов, но не штамма A/chicken/Moscow/2/ PB2 73 Q Q отсутствуют R 269 R R отсутствуют K PA 451 S S отсутствуют A 31 Q Q отсутствуют H 56 K K отсутствуют R S – A/bar-headed goose/Qinghai/1/05;
HA T – A/bar-headed goose/Qinghai/2/05;
99 I I N A/whooper swan/Mongolia/13/05;
V – A/bar-headed goose/Qinghai/5/ NP 323 A A отсутствуют T 46 A A отсутствуют V A – A/chicken/Tula/4/05;
63 V V L NA A/Cygnus olor/Croatia/1/ 102 I I отсутствуют V 288 Q Q отсутствуют R 68 V V отсутствуют I M 81 Q Q отсутствуют R Аминокислотные замены, уникальные как для группы гуляй-борисовских штаммов, так и для штамма A/chicken/Moscow/2/ PB2 64 I отсутствуют M M 113 I V – A/bar-headed goose/Qinghai/3/ T T PB 618 E отсутствуют K K NP 90 K отсутствуют R R Аминокислотные замены, уникальные для штамма A/chicken/Moscow/2/2007, но не для группы гуляй-борисовских штаммов PB2 50 M M отсутствуют I 38 Y Y отсутствуют H 212 L L отсутствуют M 646 M M отсутствуют I G – A/duck/Kurgan/08/2005;
A/Cygnus olor/Croatia/1/2005;
A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast2005-2-{1 PB 654 S S 10}/2005;
N A/swan/Germany/R{65,606}/2006.
A – A/chicken/Nigeria/{1047 {25,30,54},957-12}/2006.
678 S S отсутствуют G 741 A A отсутствуют T НА 545 L L отсутствуют M * Имеются в виду пять штаммов, подвергнутых секвенированию: A/pigeon/Rostov-on-Don/6/07, A/rook/Rostov-on-Don/26/07, A/chicken/Rostov-on-Don/35/07, A/starling/Rostov-on-Don/39/07 и A/muscovy duck/Rostov-on-Don/51/07.
2.4. Мониторинг вирусов гриппа А в восточном секторе Северной Евразии в период 2005–2007 гг..
Вплоть до весны 2008 г. (см. п. 2.5.1) в восточном секторе Северной Евразии не были обнаружены ни проявления КЧП у диких и домашних птиц, ни вирусы HPAI / H5N1. В указанный период на юге Приморского края были изолированы 1 штамм LPAI / H4 и 1 штамм LPAI / H7. Методом ОТ-ПЦР на территории Среднеамурской низм. выявлена циркуляция LPAI / H5, главным образом, среди, птиц водно-околоводного, и LPAI / H7 – среди птиц наземного экологического комплекса (рис. 9).
Рисунок 9. Доля положительных результатов в ОТ-ПЦР на НА / Н и НА / Н7 вируса гриппа А среди диких птиц на территории Среднеамурской низменности (2005–2007 гг.).
2.5. Развитие эпизоотии HPAI / H5N1 в восточном секторе Северной Евразии, начиная с весны 2008 г..
2.5.1. Расшифровка эпизоотии среди диких и домашних птиц на юге Дальнего Востока (Приморский край) весной 2008 г. (рис. 12) выявила этиологическую роль HPAI / H5N1 нового для Северной Евразии генотипа.
Из полевого материала, собранного в д. Воздвиженка (Уссурийский р-н Приморского края) в апреле 2008 г., были изолированы 4 штамма HPAI / H5N1 (табл. 1).
Филогенетический анализ показал принадлежность воздвиженских штаммов к генотипу H5J 2.3.2 (получившему название «Уссурийский»;
рис. 10) с генотипической формулой [K, G, D, 5J 2.3.2, F, 1J, F, 1E].
Ещё при первичном обследовании полевого материала было установлено, что структура НА и NA изолированных штаммов из Приморья отличается от штаммов Цинхай-Сибирского генотипа 2.2, поскольку между ними имелись существенные различия в картине гибридизации с нуклеотидными зондами биологического микрочипа чипа (рис. 11). Действительно, оказалось, что гомология изолированных приморских штаммов со штаммами Цинхай Сибирского генотипа составляет для HA 92.9–95.3 %, для NA – 94.1–95.3 %. Таким образом, гибридизационный профиль биочипа может быть использован для первичного генотипирования высоковирулентных штаммов вируса гриппа А (H5N1). Сайт Рисунок 10. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей ORF НА штаммов, изолированных в с. Воздвиженка (выделены жирным шрифтом).
А Б В Рисунок 11. Результаты субтипирования вируса гриппа А с помощью биочипов:
А – структура биочипа;
Б – картина гибридизации при анализе A/chicken/Novosibirsk/64/05 (H5N1) Цинхай Сибирского генотипа (H5J 2.2);
В – картина гибридизации при анализе A/chicken/Primorje/1/08 (H5N1) Уссурийского генотипа (H5J 2.3.2).
протеолитического разрезания НА у A/chicken/Primorje/1/08 и A/Anas crecca/Primorje/8/ характерен для генотипа 2.3.2: P337QRERRRKRGLF348;
он имеет делецию K345 по сравнению с Цинхай-Сибирским генотипом (P337QGERRRKKRGLF349). Остальные свойства соответствуют Цинхай-Сибирскому генотипу (табл. 2).
2.5.2. Расшифровка эпизоотии среди диких птиц на озере Убсу-Нур (Республика Тыва) в июне 2009 г. (рис. 12) выявила расширение ареала HPAI / H5N Уссурийского генотипа (H5J 2.3.2);
2. появление внутри этого генотипа собственных генетических подгрупп.
Из собранного полевого материала были изолированы 12 вирусных штаммов, 6 из которых были депонированы в ГКВ РФ (табл. 1). Анализ генома показал их принадлежность к HPAI / H5N1 генотипа Н5J 2.3.2. Наиболее близкой последовательностью ORF HA для убсунурских штаммов 2009 г. являются штаммы, изолированные на монгольской стороне того же озера в мае того же года.
Клинические признаки заболевания у диких птиц во время эпизоотии 2009 г. (связанной с генотипом H5J 2.3.2) существенно отличались от эпизоотии 2006 г. (связанной с генотипом H5J 2.2), когда ведущим симптомом было поражение ЦНС. В 2009 г. ведущим симптомом была интоксикация, что приводило к вялости и птиц и притуплению у них чувства опасности.
Инфекционный титр убсунурских штаммов 2009 г. снижен по сравнению со штаммами от диких птиц, изолированных на юге Приморья в апреле 2008 г.. Таким образом, циркуляция HPAI / H5N1 генотипа H5J 2.3.2 в восточном секторе Северной Евразии – также, как и циркуляция генотипа 2.2 в западном секторе Северной Евразии – сопровождается расширением ареала и снижением инфекционности.
2.6. Причины и последствия проникновения HPAI / H5N1 в экосистемы Северной Евразии (2005–2009 гг.).
2.6.1. Распространение и генетическая дивергенция Цинхай-Сибирского (H5J 2.2) генотипа HPAI / H5N1 необходимо начать описывать с осени 2001 г., когда в ходе планового мониторинга 2 ключевых точек Северной Евразии сотрудники НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН зафиксировали аномально высокую интенсивность циркуляции LPAI / H5 (ранее изолированных на Алтае) в популяциях диких птиц, совершавших осенний перелёт к зимовочным ареалам (главным образом – в Юго-Восточной Азии) вдоль Дальневосточно-Притихоокеанского миграционного русла (рис. 12). На территории Юго Восточной Азии – в условиях колоссальной плотности диких и домашних птиц и интенсивных популяционных взаимодействий – могла произойти селекция вирусных вариантов и превращение LPAI HPAI, о чём было доложено в октябре 2003 г. на Международной конференции «Options for the control of Influenza V» в Окинаве [Lvov D.K., 2004]. Через три месяца стало ясно, что сделанный прогноз полностью оправдался – в конце 2003 г.
HPAI / H5N1 вызвал в Юго-Восточной Азии масштабную эпизоотию.
После начала эпизоотии HPAI / H5N1 осенью 2003 г. был сделан второй прогноз: в одну из ближайших вёсен этот вирус проникнет на территорию Северной Евразии с перелётными дикими птицами вдоль одного из миграционных русел – Джунгарского (проходящего через «Джунгарские ворота» – тектоническое понижение между Тянь-Шанем и Монгольским Алтаем) и Дальневосточно-Притихоокеанского (вдоль тихоокеанского побережья Азии). Тогда Результаты этих исследований не вошли в диссертационную работу, но упоминуются в данном разделе для придания целостности изложению материала.
же – в рамках подготовки к возможным эпизоотическим событиям – были сформулированы цели и задачи настоящей диссертационной работы, начаты научно-организационные мероприятия по подготовке мониторинговых исследований в предполагаемых районах прорыва вируса.
Рисунок 12. Причины и последствия проникновения HPAI / H5N1 Цинхай-Сибирского (H5J2.2) и Уссурийского (H5J 2.3.2) генотипов в Северную Евразию: весна 2005 г. – лето 2009 г..
Результаты расшифровки эпизоотии с высоким уровнем падежа среди диких и домашних птиц на юге Западной Сибири летом 2005 г. (см. п. 2.3.1) подтвердили сделанное предположение: близость западносибирских и цинхайских штаммов (рис. 3) свидетельствует в пользу того, что занос HPAI / H5N1 в Северную Евразию (на юг Западной Сибири и, вероятно, далее на север вплоть до побережья Северной Ледовитого океана) произошёл во время весенней миграции диких птиц 2005 г. из Юго-Восточной Азии через оз. Кукунор и «Джунгарские ворота» (рис. 12).
Третий прогноз заключался в том, что во время осенней миграции 2005 г. дикие птицы разнесут вирус вдоль пролётных путей и в зимовочные ареалы. Этот прогноз также подтвердился: осенью 2005 г. ареал Цинхай-Сибирского генотипа охватил весь западный сектор Северной Евразии, Среднюю Азию, Индостан, Закавказье, Ближний Восток и Африку.
Этот прогноз тоже полностью оправдался. В частности, крупная эпизоотия среди лебедей шипунов (Cygnus olor) в нижнем поясе дельты Волги в ноябре 2005 г. (см. п. 2.3.2) произошла на одном из наиболее интенсивных «перекрёстков» миграционных путей диких птиц.
Источником вируса стали мигрирующие дикие утки (Aythya fuligula), только после прилёта которых заболевание распространилось среди местных лебедей-шипунов.
Генетическая близость штаммов HPAI / H5N1 с юга Западной Сибири (июль 2005 г.) и из нижней дельты Волги (ноябрь 2005 г.) свидетельствует о том, что, распространяясь в течение этих четырёх месяцев во всё новых популяциях неиммунных хозяев, когда генетический дрейф не является условием избегания вирусом иммунного прессинга, варианты Цинхай-Сибирского генотипа не претерпели существенных генетических изменений. Однако попав в зимовочные ареалы – в Африке и на п-ове Индостан – где высокая плотность популяций диких птиц водно-околоводного экологического комплекса сочетается с их значительной иммунной прослойкой, вирус вынужден был начать генетический дрейф, в результате которого в гнездовые ареалы Северной Евразии весной 2006 г. с мигрирующими птицами должны были вернуться генетически модифицированные варианты вируса. Это был наш четвёртый прогноз, который также подтвердился в процессе последующего эколого вирусологического мониторинга.
Возвращение HPAI / H5N1 из зимовочных ареалов в гнездовые происходило не всегда теми же путями, что и занс весной. Например, генетическая близость убсунурских штаммов (июнь 2006 г.) (см. п. 2.3.3) с индо-пакистанскими штаммами зимы-весны и дистантность от цинхайских штаммов весны того же года (рис. 5) свидетельствует о том, что занос вируса в Убсунурскую Котловину весной 2006 г. произошёл не из Юго-Восточной Азии вдоль Джунгарского миграционного русла (как это было весной 2005 г. – см. п. 2.3.1), а вдоль восточного ответвления Индо-Азиатского миграционного русла с восточносибирскими утками, инфицирование которых произошло во время зимовки в 2005 / 2006 гг. на п-ве Индостан (рис. 12), где они смешиваются с популяциями западносибирских уток, встретившихся с вирусом весной-летом 2005 г.. Утки, вернувшиеся в Западную Сибирь весной 2006 г. занесли туда близкородственные убсунурским варианты (н-р, A/duck/Omsk/1822/06 (H5N1) на рис. 5).
Другие филогенетически близкие варианты HPAI / H5N1 из GenBank не могут считаться предшественниками убсунурских штаммов, так как были изолированы позже – осенью-зимой 2006 г. в Южной Корее и в 2007 г. в Юго-Восточной Азии: осенью 2006 г. убсунурские варианты вируса были занесены туда вдоль Джунгарского пролётного русла. Варианты Тувинско-Сибирской генетической подгруппы, впервые обнаруженные во время убсунурской эпизоотии 2006 г., вдоль миграционных русел диких птиц распространились в западном направлении и вызвали, в частности, эпизоотию в окрестностях лимана Лебяжий вблизи юго восточного побережья Азовского моря в сентябре 2007 г. (см. п. 2.3.5).
В то время, как Срединный Регион Северной Евразии был местом зарождения Тувинско-Сибирской генетической подгруппы, в Причерноморско-Каспийском регионе сформировалась другая – Ирано-Северокавказская генетическая подгруппа – с которой мы впервые столкнулись при расшифровке эпизоотии среди сельскохозяйственных птиц в Подмосковье в феврале 2007 г. (см. п. 2.3.4). Естественные миграции птиц в феврале на территории Подмосковья отсутствуют (за исключением локальных перемещений зимующих птиц). Однако Москва, являясь крупнейшим транспортным узлом в европейской части России, включена в систему транспортировки сельскохозяйственной продукции и сельскохозяйственных птиц. То, что именно последние стали источником завозного вируса, свидетельствует покупка птицы всеми владельцами заражённых подворий на рынке «Садовод», который рассматривается как вторичный очаг при неизвестном первичном эпизоотическом очаге. Вирус был завезён на московский рынок в мёрзлой подстилке вольеров с птицами из одного из неназванных до сих пор регионов Северного Кавказа. Таким образом, эта эпизоотия имела непреднамеренное рукотворное происхождение.
Варианты Ирано-Северокавказской генетической подгруппы вызвали и обширную эпизоотчискую вспышку в северной части Кубано-Приазовской низменности в декабре 2007 г.
(см. п. 2.3.6). Широкое вовлечение в эпизоотический процесс птиц наземного экологического комплекса (рис. 1.Л–М), которые в огромных количествах скапливаются в окрестностях населённых пунктов и ПТФ осенне-зимний период, во время сезонных кочёвок, было связано с попаданием отходов ПТФ «Гуляй-Борисовская» в примыкающие антропогенные биоценозы.
Кубано-Приазовская низменность является местом пересечения нескольких миграционных путей диких птиц, идущих из Западной Сибири в Африку и из Европы в Африку, Закавказье и Ближний Восток (рис. 12);
в мягкие зимы здесь зимуют птицы вводно околоводного комплекса. На территории южной оконечности Русской равнины выявлена циркуляция обеих генетических подгрупп Цинхай-Сибирского генотипа – Тувинско Сибирской и Ирано-Северокавказской. Таким образом, Кубано-Приазовская низменность является центром генетического разнообразия Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2).
2.6.2. Распространение и генетическая дивергенция Уссурийского (H5J 2.3.2) генотипа HPAI / H5N1 в Северной Евразии началось в апреле 2008 г., когда на одном из подворий в д. Воздвиженка (Уссурийский р-н Приморского края;
рис. 12) в апреле 2008 г.
произошёл падёж невакцинированных сельскохозяйственных птиц (см. п. 2.5.1). Источником заноса HPAI / H5N1 генотипа H5J 2.3.2 стали, по-видимому, чирки-свистунки (Anas crecca):
для них получен наибольший процент ОТ-ПЦР-позитивных результатов как в целом по югу Приморья (31.8 %), так и для окрестностей с. Воздвиженка (62.5 %), а штамм A/Anas crecca/Primorje/8/08 идентичен A/chicken/Primorje/1/08. Ретроспективно было установлено, что на данной территории имели место три основные волны миграции диких уток (вид с доминирующей численностью указан первым): 1. чирки-клоктуны и кряквы;
2. кряквы и чирки-трескунки;
3. чирки-свистунки. Сбор полевого материала был проведён в узком временном диапазоне, когда вдоль Суйфун-Ханкайской низменности осуществляли миграцию заражённые популяции чирков-свистунков. Наиболее близкими, в генетическом отношении, к воздвиженским штаммам 2008 г. являются штаммы генотипа 2.3.2, ранее изолированные в южных провинциях КНР, Вьетнама и Лаоса (рис. 10), где располагается и центр зимовочного ареала чирков-свистунков.
Весной 2009 г. Уссурийский генотип (2.3.2) вызвал эпизоотию на оз. Убсу-Нур (см. п. 2.5.2), где тремя годами ранее «полыхал» Цинхай-Сибирский генотип (2.2) (см. п. 2.3.3).
Расшифровка этой эпизоотии показала, что генотип 2.3.2 не только расширяет свой ареал в восточном секторе Северной Евразии (рис. 12), но и генетически дивергирует: убсунурские штаммы 2009 г. (как с российской, так и с монгольской стороны озера) дистанцируются от воздвиженских штаммов 2008 г. (табл. 8–9), формируя самостоятельную генетическую подгруппу (рис. 13).
2.6.3. Современная (2009 г.) генотипическая структура высоковирулентного вируса гриппа А (H5N1) на территории России представлена на рис. 13 и в табл. 8–9.
Цинхай-Сибирский (H5J 2.2) генотип, распространённый в западном секторе Северной Евразии, отличается от Уссурийского (H5J 2.3.2), распространённого в восточном секторе (рис. 28), по ORF HA на 4.6–7.0 % (табл. 8);
в среднем, – на 5.8 % (табл. 9).
Рисунок 13. Иерархическая структура нуклеотидных последовательностей полноразмерных ORF HA для прототипных штаммов HPAI / Н5N1 генотипов Цинхай Сибирского (H5J 2.2) и Уссурийского (H5J 2.3.2), визуализированная с помощью UPGMA алгоритма. Названия штаммов, изолированных на оз. Убсу-Нур летом 2009 г., взяты в рамку.
Внутри Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) можно выделить 4 генетические подгруппы (Цинхайскую, Западносибирскую, Тувинско-Сибирскую и Ирано Северокавказскую), ORF HA которых отличаются, в среднем, на 1.5 %;
а внутри Уссурийского генотипа (H5J 2.3.2) – 2 генетические подгруппы (Дальневосточно-Южнокитайскую и Западномонгольскую) со средней генетической дистанцией 2.1 % (табл. 9).
Таблица 8. Диапазон генетических расстояний (минимум – максимум) для ORF HA штаммов HPAI / H5N1 из различных эпизоотических вспышек Северной Евразии: число нуклеотидных замен (левый нижний угол таблицы) и процентное различие (правый верхний угол таблицы).
Цинхай-Сибирский генотип (H5J 2.2) Уссурийский генотип (H5J 2.3.2) Тувинско- Ирано- Тувинско- Ирано- Дальневосточно- Западно Цинхайская Западносибирская Сибирская Северокавказская Сибирская Северокавказская Южнокитайская монгольская подгруппа подгруппа Эпизоотия подгруппа подгруппа подгруппа подгруппа подгруппа подгруппа Оз. Цинхай Западная Дельта Волги Краснодарский Оз. Убсу-Нур Подмосковье Ростовская область Приморский край Оз. Убсу-Нур (май-июнь Сибирь (ноябрь край (июнь 2006 г.) (февраль 2007 г.) (декабрь 2007 г.) (апрель 2008 г.) (июнь 2009 г.) 2005 г.) (июль 2005 г.) 2005 г.) (сентябрь 2007 г.) (п. 2.3.3) (п. 2.3.4) (п. 2.3.6) (п. 3.10) (п. 3.11) (п. 2.3.1) (п. 2.3.1) (п. 2.3.2) (п. 2.3.5) 0.41 1. Оз. Цинхай – 0.53 – 1.46 0.70 – 1.76 0.94 – 2.11 1.23 – 2.05 1.82 – 2.69 1.46 – 2.34 4.63 – 5.04 5.62 – 6. (май-июнь 2005 г.) 7 0.53 0. Западная Сибирь 9 – 25 – 0.64 – 0.88 0.88 – 1.23 1.17 – 1.17 1.76 – 1.82 1.41 – 1.41 4.92 – 4.98 5.92 – 6. (июль 2005 г.) 9 0. Дельта Волги 12 – 30 11 – 15 0– 1.05 – 1.52 1.35 – 1.52 1.87 – 2.11 1.58 – 1.76 4.86 – 5.04 5.74 – 6. (ноябрь 2005 г.) 0. Оз. Убсу-Нур 16 – 36 15 – 21 18 – 26 0– 1.23 – 1.52 1.00 – 1.29 1.46 – 1.76 5.21 – 5.45 6.09 – 6. (июнь 2006 г.) Подмосковье 21 – 35 20 – 20 23 – 26 21 – 26 0 – 0 2.11 – 2.11 0.47 – 0.47 5.62 – 5.62 6.50 – 6. (февраль 2007 г.) Краснодарский 31 – 46 30 – 31 32 – 36 17 – 22 36 – 36 0 – 0 2.34 – 2.34 5.92 – 5.92 6.80 – 6. край (сентябрь 2007 г.) Ростовская 25 – 40 24 – 24 27 – 30 25 – 30 8 – 8 40 – 40 0 – 0 5.68 – 5.68 6.68 – 6. область (декабрь 2007 г.) Приморский край 79 – 86 84 – 85 83 – 86 89 – 93 96 – 96 101 – 101 97 – 97 0 – 0 1.99 – 2. (апрель 2008 г.) 0.29 0. Оз. Убсу-Нур 96 – 106 101 – 105 98 – 104 104 – 111 111 – 114 116 – 119 114 – 117 34 – 37 – (июнь 2009 г.) 5 Таблица 9. Средние генетические расстояния в форме числа нуклеотидных замен (левый нижний угол) и процентных различий (правый верхний угол) между генетическими подгруппами HPAI / H5N1, выявленными в экосистемах Северной Евразии.
Таксон Генотип H5J 2.2 Генотип H5J 2.3. Тувинско- Ирано- Дальневосточно генотип подгруппа Цинхайская Западносибирская Западномонгольская Сибирская Северокавказская Южнокитайская Цинхайская 16.8 \ 0.98 1.12 1.77 1.80 4.87 5. Западносибирская 19.2 6.0 \ 0.35 1.55 1.58 4.94 5. H5J 2. Тувинско-Сибирская 30.2 26.5 13.6 \ 0.80 1.89 5.59 6. Ирано-Северокавказская 30.8 26.9 32.3 2.7 / 0.16 5.67 6. Дальневосточно 83.2 84.3 95.4 96.8 0/0 2. Южнокитайская H5J 2.3. Западномонгольская 101.7 101.2 111.9 115.0 35.5 5.0 / 0. Таблица 10. Обратные величины титров в РТГА антисывороток к протипным штаммам HPAI / H5N1.
Западномонгольская Тувинско-Сибирская Западносибирская Северокавказская Дальневосточно Южнокитайская Штамм подгруппа подгруппа подгруппа подгруппа подгруппа Ирано Антисыворотка против штамма Западносибирская A/duck/Novosibirsk/56/05 320 320 320 160 подгруппа Тувинско-Сибирская A/grebe/Tyva/Tyv06-1/06 320 640 320 160 подгруппа Ирано A/chicken/Moscow/2/07 Северокавказская 320 320 320 160 подгруппа Дальневосточно A/chicken/Primorje/1/08 Южнокитайская 80 80 80 160 подгруппа Западномонгольская A/grebe/Tyva/3/09 160 80 80 160 подгруппа Рисунок 14. Схема формирования новых генетических вариантов вруса гриппа А вследствие асимметрии условий циркуляции вируса в популяциях птиц водно-околоводного экологического комлпекса в их гнедовых (весна лето) и зимовочных (осень-зима) ареалах.
Условные обозначения:
– интактная особь;
– инфицированная особь;
– инфицированная особь на фоне наличия противовирусных антител;
– иммунная особь;
– вирус гриппа А.
Важно подчеркнуть, что оба генотипа близки в серологическом отношении (табл. 10), что обоснвывает продолжение использования вакцины на основе штамма 2005 г..
Формирование генетических подгрупп связано с асимметрией условий циркуляции вируса гриппа А во время зимовочного и гнездового периодов в популяциях птиц водно околоводного экологического комплекса – основном природном резервуаре этого вируса. В первом случае, в зимовочных ареалов скапливаются предельно высокие концентрации птиц с максимально высоким уровнем коллективного иммунитета, что стимулирует вирус к интенсивному генетическому дрейфу. Новые вирусные варианты амплифицируются после появления неиммунных птенцов в весенне-летний период (рис. 14).
Рисунок 9. Динамика инфекционных титров in vitro у штаммов HPAI / H5N1 Цинхай Сибирского (H5J 2.2) генотипа от диких и домашних птиц в процессе развития эпизоотии в западном секторе Северной Евразии.
Обозначения: – дикие птицы;
– домашние птицы;
Аналитические выражения для линий трендов инфекционных титров (t – время, отсчитываемое от начала мая 2005 г.):
домашние птицы: TCID50=10.560 – 0.272 t;
дикие птицы: TCID50=5.922 – 0.066 t.
Таблица 8 (начало). Точечные аминокислотные замены в белках штаммов HPAI / H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2).