Эволюция микробно-растительных симбиозов: филогенетические, популяционно-генетические и селекционные аспекты

На правах рукописи

ПРОВОРОВ НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ Эволюция микробно-растительных симбиозов:

филогенетические, популяционно-генетические и селекционные аспекты Специальность 03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации, представленной в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2009

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии Научный консультант академик Россельхозакадемии, доктор биологических наук, профессор Игорь Анатольевич Тихонович Официальные оппоненты член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Илья Артемьевич Захаров-Гезехус академик Россельхозакадемии, доктор биологических наук, профессор Марк Михайлович Левитин доктор биологических наук, профессор Константин Васильевич Квитко Ведущая организация Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Защита состоится “” 2009 г. в “” часов на заседании совета Д 212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Университетская наб., д. 7/9, кафедра генетики и селек ции, аудитория №1.

С авторефератом диссертации, представленной в виде научного доклада, можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского госуниверситета.

Автореферат разослан “” 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 212.232. кандидат биологических наук Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Генетика симбиотических систем привлекает в на стоящее время огромное внимание биологов как принципиально новое направление исследований, связанное с выходом всех направлений гене тического анализа (классический, молекулярный, популяционный) на уровень межвидовых взаимодействий. Симбиозы – чрезвычайно удобные модели для развития экологической генетики, изучающей взаимное влияние генетических процессов и определяемых ими отношений орга низмов с внешней средой (Инге-Вечтомов, 2009). Применительно к сим биозам решение этой задачи подразумевает анализ генетических эффек тов и экологических последствий, которые вызывают молекулярные про цессы в тесно интегрированной надорганизменной генной системе. Изу чая эти процессы, генетика симбиоза вносит в биологию уникальный вклад, обеспечивая системное использование молекулярных и экологиче ских подходов и открывая возможность для разработки ряда дискуссион ных проблем эволюционного учения (соотношение адаптивной и про грессивной эволюции, становление отношений мутуализма и биологиче ского альтруизма, действие отбора в надорганизменных системах).

Изучение эволюции симбиоза восходит к трудам А. де Бари (de Bary, 1879), который определил его как “сожительство разноименных организмов”, включающее эволюционно связанные мутуалистические и антагонистические отношения. Наилучшими моделями для анализа эво люционной генетики симбиоза оказались бактерии, взаимодействующие с эукариотами, в первую очередь с растениями и животными. Среди них наиболее изучены клубеньковые бактерии (ризобии) – азотфиксирующие симбионты бобовых, которые доступны для детального молекулярного и популяционно-генетического анализа (Симаров и др., 1990;

Young, 1992;

Spaink et al., 1998;

Jones et al., 2007). Активное изучение генетики взаи модействия со стороны растений-хозяев позволяет приступить к анализу эволюции симбиоза как надорганизменной генетической системы, кото рая по уровню своей целостности приближается к геному свободножи вущего (унитарного) организма (Тихонович, Проворов, 2003, 2009).

Использование филогенетических, популяционно-генетических и молекулярных подходов позволяет изучать симбиоз как продукт коэво люции партнеров, которая представляет собой совокупность макро- и микро-эволюционных процессов, осуществляемых в генетически интег рированных биосистемах (Проворов, 2001а). Однако, комплексное ис пользование этих подходов ранее не проводилось, что существенно огра ничивает возможности для выяснения взаимосвязей между эволюцион ными процессами, осуществляемыми на разных уровнях организации симбиоза: молекулярном, морфо-физиологическом и популяционном.

Наименее изученными остаются генетические механизмы эволюции му туалистических симбиозов, которые, повышая экологическую приспо собленность всех взаимодействующих партнеров, играют ключевую роль в формировании природных экосистем и экологически устойчивых агро ценозов.

Недостаточная разработанность эволюционных основ симбиоза яв ляется причиной того, что знания о генетике надорганизменных систем мало используются для их улучшения и практического использования. В то же время, потенциальный вклад эволюционной генетики симбиоза в практику очень велик. Областью ее применения является, в первую оче редь, сельское хозяйство, где микробно-растительные системы, улуч шенные с помощью генетических методов, представляют собой реальную альтернативу широкомасштабному применению минеральных удобрений и пестицидов, которые являются основными источниками загрязнения биосферы. Поэтому весьма актуальна задача повышения эффективности микробно-растительных симбиозов, определяемой как влияние симбио тического взаимодействия на экологическую приспособленность (про дуктивность) партнеров (Douglas, 1994).

Исходя из представлений о селекции как об эволюции, направляемой человеком (Вавилов, 1935), а также о возможности экстраполяции знаний о механизмах искусственной эволюции, происходящей при доместикации и селекции хозяйственно-ценных организмов, на естественные эволюционные процессы (Дарвин, 1991), мы вправе сформулировать задачу сравнительного изучения механизмов, лежащих в основе естественной и искусственной эво люции симбиозов. Такой подход позволяет использовать в селекционной, генно-инженерной и биотехнологической практике знания о природных ко эволюционных процессах, которые направлены на максимально полное про явление адаптивного потенциала растений. Эти знания должны быть востре бованы и при оценке эколого-генетических последствий широкомасштабно го использования симбиотических организмов, в том числе и созданных ге нетическими методами, для конструирования высокопродуктивных, эколо гически безопасных агроценозов.

Цель и задачи исследований Цель работы заключалась в изучении филогенетических и попу ляционно-генетических закономерностей эволюции мутуалистического симбиоза, направленном на анализ генетических механизмов коэволюции растений и микроорганизмов, а также на разработку подходов и методов для создания экологически эффективных надорганизменных комплексов.

Для достижения это цели мы поставили перед собой ряд задач.

1. На примере групп перекрестной инокуляции бобовых растений изучить филогенетические закономерности эволюции специфичности, проявляемой при образовании эффективного (N 2-фиксирующего) сим биоза, и проанализировать связь симбиотического потенциала со степе нью окультуренности растений.

2. Охарактеризовать полиморфизм симбиотических систем, обу словленный разнообразием клубеньковых бактерий (Rhizobium leguminosarum bv. viceae, Sinorhizobium meliloti) и бобовых растений (лю церна, донник, пажитник, козлятник) для оценки адаптивной ценности и селекционного потенциала различных параметров симбиосистем (азот фиксирующей активности и симбиотической эффективности).

3. Оценить относительные вклады растительных и бактериальных генотипов в определение экологической эффективности растительно микробного взаимодействия. На основе анализа связи между эффектив ностью и специфичностью симбиоза сформулировать основные принци пы селекции хозяйственно-ценных симбиотических систем.

4. С целью анализа механизмов коэволюции бобовых растений и ризобий на повышение эффективности мутуализма разработать методику математического моделирования микроэволюционных процессов, проис ходящих при взаимодействии симбиотических бактерий с растениями хозяевами. С помощью созданных моделей охарактеризовать действие ключевых микроэволюционных факторов (мутационный процесс, пере нос генов, различные формы отбора, генетико-автоматические процессы) при формировании генетической структуры микробно-растительных симбиозов.

5. Путем компьютерных экспериментов изучить связь эффективно сти симбиоза со специфичностью взаимодействия партнеров и с уровнем их изменчивости. Построить обобщенные схемы эволюции систем “рас тение-микроорганизм”, позволяющие анализировать популяционные ме ханизмы становления мутуалистического симбиоза и разрабатывать приемы для генетического регулирования его эффективности.

Научная новизна • Впервые изучена связь специфичности образования эффективно го азотфиксирующего симбиоза и филогении бобовых растений. Показа но, что корреляция таксономического деления со специфичностью обра зования эффективного N2-фиксирующего симбиоза отсутствует, хотя образование клубеньков является таксоноспецифичным признаком рас тений. Дикорастущие и малоокультуренные формы бобовых превосходят высоко окультуренные формы по эффективности симбиоза с ризобиями.

• Установлено, что варьирование бобовых растений (люцерна, донник, пажитник, козлятник) и ризобий (Rhizobium leguminosarum bv.

viceae, Sinorhizobium meliloti) по азотфиксирующей (ацетилен редуктазной) активности и симбиотической эффективности характеризу ется разными величинами статистических параметров (коэффициенты вариации, асимметрии, эксцесса), что свидетельствует о различиях эко лого-генетических механизмов контроля, проявления и эволюции этих признаков.

• С использованием метода двухфакторного дисперсионного ана лиза показано, что наиболее высокая экологическая эффективность ха рактерна для симбиозов, в которых максимален вклад специфичности взаимодействия партнеров (неаддитивные генотипические эффекты) в определение симбиотических признаков.

• Создана методика моделирования циклических микроэволюци онных процессов в популяциях микроорганизмов, взаимодействующих с растениями. Действие основных форм отбора (Дарвиновский, частотно зависимый, групповой) и генетико-автоматических факторов (генетиче ский дрейф, популяционные волны, миграция) приурочено к занятию бактериями определенных ниш в системах “хозяин-среда”.

• Выявлена ведущая роль частотно-зависимого отбора, происхо дящего при конкуренции штаммов ризобий за образование клубеньков, в формировании экотипически полиморфных, панмиктичных бактериаль ных популяций. Показано, что этот тип естественного отбора является важным фактором становления взаимовыгодных отношений партнеров в стрессовых условиях, неблагоприятных для поддержания признаков му туализма в популяциях микросимбионтов.

• Предложена обобщенная схема микроэволюции азотфиксирую щей симбиотической системы, в соответствии с которой популяционная динамика микросимбионтов следует стратегии “утраты-приобретения” sym-генов, циркулирующих между симбиотически активными и асим биотическими штаммами под контролем селективных и генетико автоматических факторов, индуцируемых хозяином.

• Показано, что в генетически полиморфных симбиосистемах се лективная ценность у специфичных по отношению к хозяину штаммов ризобий, способных формировать азотфиксирующие клубеньки лишь с некоторыми растительными генотипами, выше, чем у неспецифичных штаммов, эффективных в симбиозе со всеми растительными генотипами.

Однако общая эффективность симбиоза достигает максимального уровня при взаимодействии специфичных и неспецифичных мутуалистов.

Практическая значимость • Сформулированы принципы координированной селекции бобо вых растений и клубеньковых бактерий на повышение симбиотической активности: 1) широкое использование дикорастущих и малоокультурен ных форм бобовых, сохранивших высокий природный симбиотический потенциал;

2) подбор комплементарных сочетаний генотипов партнеров, оптимальных для эффективного симбиоза. Использование обоих подхо дов наиболее результативно при снижении популяционной изменчивости растений до уровня, который обеспечивает возможность подбора штам мов бактерий, эффективных в симбиозе со всеми растительными геноти пами, имеющимися в сортовых популяциях.

• Показано, что применение “ацетиленового” метода измерения нитрогеназной активности в селекции бобовых растений более результа тивно при отбраковке симбиотически неактивных генотипов, чем при отборе генотипов с максимальной симбиотической активностью, кото рый может проводиться лишь на фоне относительно однородного исход ного материала.

• Установлено, что основным условием реализации симбиотиче ского потенциала активно фиксирующих азот штаммов ризобий, ото бранных из природных популяций, либо полученных с помощью генети ческих методов, является подбор (конструирование) сортов растений, способных к эффективной передаче фиксированного азота из клубеньков и корней в надземные органы.

• Результаты работы использованы при подготовке двух патентов (СССР и России) и двух методических рекомендаций по проведению ге нетико-селекционных работ с симбиотическими системами. Материалы исследований включены в лекционный курс “Симбиогенетика” и в маги стерскую программу “Экологическая генетика” (биолого-почвенный фа культет СПбГУ, кафедра генетики и селекции). Автор являлся руководи телем или со-руководителем четырех диссертаций, авторы которых удо стоены ученой степени кандидата биологических наук.

Положения, выносимые на защиту • Дикорастущие и малоокультуренные формы бобовых растений превосходят производственные сорта по эффективности симбиоза с клу беньковыми бактериями.

• Азотфиксирующая активность и симбиотическая эффективность характеризуются разными параметрами генетической изменчивости, про являемой со стороны обоих партнеров бобово-ризобиального симбиоза.

• Координированная селекция партнеров бобово-ризобиального симбиоза должна быть направлена на подбор комплементарных пар гено типов партнеров: ризобий с высокой азотфиксирующей активностью и растений, способных полностью использовать биологический азот для построения биомассы.

• Эволюция ризобий на повышение эффективности мутуалистиче ского симбиоза с растениями происходит под действием специфичных для симбиоза форм отбора, индуцируемых при взаимодействии бактерий с хозяевами.

• Высокая генетическая гетерогенность и панмиктичность популя ций ризобий обусловлена частотно-зависимым отбором, действующим при конкуренции за образование клубеньков и обеспечивающим закреп ление редких генотипов в бактериальных популяциях.

• Повышение эффективности и специфичности бобово ризобиального симбиоза в ходе его эволюции обусловлено интенсивным отбором в пользу бактерий, способных к эффективному симбиозу лишь с некоторыми из доступных генотипов растений-хозяев.

Работа выполнена во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной мик робиологии, в лабораториях генетики и селекции микроорганизмов (1981-1992), биотехнологии (1992-2000) и биологии ризосферы (2000 2009). Автор считает своим приятным долгом выразить глубокую бла годарность руководителям этих лабораторий (докт. биол. наук, про фессору Б.В.Симарову, докт. биол. наук, академику И.А.Тихоновичу, докт. биол. наук Л.В.Кравченко) за всестороннюю поддержку работы.

Математическое моделирование эволюции симбиоза проводилось со вместно с канд. техн. наук Н.И.Воробьевым, которому автор приносит искреннюю признательность за плодотворное творческое содружест во. Автор благодарен коллегам, совместно с которыми проводилось изучение симбиотических систем “люцерна – Sinorhizobium meliloti” (докт. биол. наук, проф. А.И.Иванов, докт. биол. наук.И.Иванов Ю.Б.Саимназаров, канд. биол. наук Н.И.Сметанин, канд. биол. наук Т.А.Танривердиев), “пажитник – S. meliloti” (докт. биол. наук Ю.Д.Сосков), “вика – Rhizobium leguminosarum bv. viceae” (канд. биол.

наук О.Н.Курчак), “горох – R. leguminosarum bv. viceae” (канд. биол.

наук А.Н.Фесенко), “козлятник – R. galegae” (канд. биол. наук Е.Н.Метлицкая), “арахис – (Brady)Rhizobium sp.” (канд. биол. наук Д.З.Пулатова), “маш – (Brady)Rhizobium sp.” (канд. биол. наук Д.З.Пулатова И.У.Бахромов). Большую помощь в проведении вегетационных опы тов оказал канд. биол. наук С.Н. Федоров.

Федоров.

Апробация работы Материалы диссертации были представлены в форме устных докладов и лекций на научных конференциях: “Генетика симбиоза и паразитизма” (1984: Тульская обл., Молочные Дворы), 11-е Всесоюз. совещ. "Плазмида" (1986: Пущино), 5-й съезд ВОГиС (1987: Москва), 7-й Всесоюз. симпоз.

"Молекул. мех-мы генет. процессов" (1990: Москва), Республик. конфер.

"Биологич. фиксация молекул. азота и азотный метаболизм бобовых расте ний" (1991: Тернополь), 9-й Баховский колл. по азотфиксации (1995: Моск ва), I съезд ВОГиС (1997: Минск), II съезд ВОГиС (2000: Санкт-Петербург), III и V съезды ВОГиС (2004, 2009: Москва), Всерос. Конф. “Сельскохозяйст венная микробиология в XIX-XXI веках” (2001: С.-Петербург), Научно практ. конф. “Соврем. проблемы пр-ва кормов в условиях Сев.-Запада Рос сии” (2002: Петрозаводск), Научно-практ. конф. “Современное состояние российской биотехнологии” (2003: Пущино), 1-й, 2-й и 5-й Междунар.

Конгр. “Биотехнология: состояние и перспективы развития” (2002, 2003, 2009: Москва), 1-я, 2-я и 3-я Научные школы молодых ученых ВОГиС по Экологической генетике (1998, 2002, 2005: С.-Петербург), Школы молодых ученых “Экологическая генетика культурных растений” (1998: Саратов;

2004: Уфа;

2005: Краснодар), Международной научной конференции “Науч ное наследие Н.И.Вавилова – фундамент развития отечественного и мирово го сельского хозяйства” (2007: Москва), Всероссийская конференция “Фун даментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем” – пленарная лекция (2007: Саратов), Межрегиональная конференция “Стра тегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой” – пленарная лекция (2008: Саратов), 8-th Eastern Europ. Symp. "Nitrogenfix-92" (1992: Saratov, Russia), 1-st Europ. Nitrogen Fixation Conference (1994: Szeged, Hungary), 20-th EUCARPIA Meeting, Section Fodder Crops and Amenity Grasses – пленарная лекция (1996: Radzikow, Poland), 4-th Intern. Herbage Seed Conf. (1999: Perugia, Italy), 22-th EUCARPIA Meeting, Section Fodder Crops and Amenity Grasses (1999: St.-Petersburg, Russia), 16-th EUCARPIA Meeting, Genetic Resources Section (2001: Poznan, Poland), International Sympo sium on Transfer of Molecular Technologies from Model Legumes to Legume Crops (2002: Norwich, UK), 11-th International Congress on Molecular Plant Microbe Interactions (2003: St.-Petersburg, Russia), 5-th International Workshop on Plant Genetic Resources “Fitogen-2003” – пленарная лекция (2003: Sancti Spiritus, Cuba), First…Fourth Baltic Region Symposia and Postgraduate Courses “Agrobiotechnology Focused on Root-Microbe Systems” (2005: Kaunas, Lithua nia;

2006: Hamburg, Germany;

2007: St.-Petersburg, Russia;

2008: Tune, Den mark), 5-th Conference on Mycorrhiza ICOM5 “Mycorrhiza for Science and Soci ety” – пленарная лекция (2006: Granada, Spain);

“Plant-Microbe Interaction 2008” – пленарная лекция (2008: Krakow, Poland), 8-th European Nitrogen Fixation Conf. (2008: Gent, Belgium).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 222 научных труда (144 – на русском языке), в т.ч. 117 статей в рецензируемых журналах (17 - в меж дународных журналах, 75 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских диссертаций). Диссертант является соавтором или соредактором 9 книг (учебники, монографии, сборники трудов международных научных конференций).

Материалы и методы Штаммы ризобий люцерны (Sinorhizobium meliloti: CIAM1723=425а, CIAM1752=406б, 281, 851, CIAM2502=852), гороха и вики(Rhizobium leguminosarum bv. viceae: CIAM1026=250a и CIAM0106=145a), козлятни ка (R. galegae: 740), маша (Bradyrhizobium sp. Vigna: CIAM190 и арахиса (B. sp. Arachis: CIAM0104) получены из коллекции клубеньковых бакте рий ВНИИСХМ. Штамм S. meliloti СХМ1 получен из лаборатории гене тики и селекции микроорганизмов ВНИИСХМ. Рекомбинантные штаммы S. meliloti c дополнительными копиями генов транспорта дикарбоновых кислот получены из отдела генетики Билефельдского университета, ФРГ от проф. А. Пюлера.

Семена бобовых растений получены из коллекции ВИР имени Н.И.

Вавилова (отделы кормовых и зернобобовых культур). Линии люцерны 1-3 степени инбридинга (полученные из сорта Омская 192 M. varia) пре доставлены Э.В.Квасовой и В.К.Шумным (Институт цитологии и генети ки СО РАН).

Стерильные микровегетационные опыты проводили при выращива нии растений на вермикулите с безазотной средой Красильникова Кореняко (Фёдоров и др., 1986). Вегетационные опыты проводили при выращивании растений в сосудах с нестерильной почвой по стандартной методике (Проворов и др., 1989). Полевые мелкоделяночные опыты про водили с использованием стандартных методик рандомизации повторно стей (Доспехов, 1972). Для статистической обработки данных использо вали методы одно- или двухфакторного дисперсионного анализа, фак торного анализа, корреляционного анализа, t-критерия Стьюдента, а так же сравнения параметров экспериментально полученных распределений с нормальными (Лакин, 1990;

Дубров и др., 1998).

Маркирование плазмид транспозоном Tn5-mob и их последующую мобилизацию проводили с помощью нереплицирующегося в ризобиях вектора pSUP5011.

Для моделирования популяционной динамики симбиоза использова ли метод математической композиции, который позволяет использовать экспериментальные данные, полученные методами частной и популяци онной генетики, для реконструкции интегральных процессов коэволюции микроорганизмов и растений. Созданные на основе моделей методики компьютерных экспериментов обеспечивают прогнозирование эволюции симбиоза, происходящей под действием различных форм отбора в соче тании с другими микроэволюционными факторами (мутагенез, перенос генов, генетический дрейф, миграция, популяционные волны), дейст вующими в системах “хозяин-среда”.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Рассматривая эволюцию мутуалистических симбиозов, мы будем исхо дить из того, что они являются продуктами коэволюции растений и бак терий, которая была изначально определена в терминах взаимного влия ния селективных процессов, происходящих в популяциях партнеров (Mode, 1958;

Janzen, 1980). Возникшее позднее представление о коэво люции как о сопряженном кладогенезе взаимодействующих организмов (Doyle, 1998;

Schardl et al., 2008) позволило распространить понятие ко эволюции и на макроэволюционные процессы. Обе формы коэволюции партнеров симбиоза связаны с их адаптацией друг к другу и к неблаго приятным внешним условиям, основанной на интеграции генных систем взаимодействующих организмов (Тихонович, Проворов, 2003, 2009).

1. Филогенетические закономерности макроэволюции симбиоза Симбиоз является важнейшим фактором эволюции организмов, опреде ляющим становление многих групп растений, животных, грибов и бакте рий (Douglas, 1994). Анализ макроэволюции симбиоза предусматривает выяснение:

1) связей между таксономией (структурой филогенетических групп) каждого из партнеров и их симбиотическими свойствами;

2) соответствия (конгруэнтности) филогений макро- и микросимби онтов, определяемого соотношением процессов кладогенеза, происходя щего при их коэволюции.

Из литературы известно, что строгая приуроченность симбиоза к оп ределенным группам организмов, а также совпадение их таксономиче ского деления с симбиотической специфичностью, характерны для вер тикально наследуемых, генетически облигатных отношений, при которых партнеры не могут существовать самостоятельно в связи утратой жиз ненно важных функций. Для факультативных и экологически облигатных симбиозов, партнеры которых могут осуществлять базовые жизненные функции в свободноживущем состоянии (к их числу относится бобово ризобиальный симбиоз), связь специфичности с филогенией может быть весьма разнообразной – от их полного совпадения до отсутствия какой либо связи.

1.1. Связь симбиотической специфичности с филогенией бобовых Для бобово-ризобиального симбиоза связь специфичности с филогенией партнеров традиционно рассматривается в рамках теории групп перекре стной инокуляции (ГПИ) в соответствии с которой виды бобовых разде ляют на ряд групп, внутри которых растения могут свободно “обмени ваться” микросимбионтами (Fred et al., 1932;

Wilson, 1944;

Проворов, 1992). При этом “истинные” ГПИ (четко отграниченные друг от друга группы растений, между которыми, как правило, происходит полная пе рекрестная инокуляция) охватывают лишь небольшую часть сем. бобо вых (Fabaceae). Эти группы состоят из видов, относящихся либо к одному роду (например, виды Trifolium, вступают в симбиоз с Rhizobium legumi nosarum bv. trifolii;

виды Galega – в симбиоз с R. galegae), либо к не скольким близким родам из одной трибы (виды Pisum, Vicia, Lathyrus, Lens из трибы Viceae вступают в симбиоз с R. leguminosarum bv. viceae).

К началу нашей работы для большинства бобовых форма связи меж ду таксономией и специфичностью симбиоза была неясна. По мнению Л.М. Доросинского (1970), само понятие специфичности бобово ризобиального симбиоза следует использовать только по отношению к его мутуалистическим (эффективным) формам, которые характеризуются высокой азотфиксирующей активностью и существенным повышением продуктивности растений, а не к образованию клубеньков, которое может быть результатом паразитарных отношений партнеров. Поэтому признак специфичности должен рассматриваться дифференцированно по отноше нию к клубенькообразованию и к формированию эффективного мутуа лизма, а соотношение этих форм специфичности с филогенетическими отношениями растений требует раздельного изучения.

Мы поставили своей задачей провести изучение структуры “истин ных” ГПИ с целью анализа связи специфичности образования эффектив ного симбиоза с таксономией растений. В качестве основной модели бы ла выбрана ГПИ люцерны, в которую входят роды люцерна (Medicago), донник (Melilotus) и пажитник (Trigonella) из трибы Trifolieae, вступаю щие в симбиоз с Sinorhizobium meliloti и S. medicae. При изучении специ фичности 12 видов люцерны и донника по отношению к штаммам S.

meliloti различного происхождения мы показали (Проворов, Симаров, 1984б), что эти бобовые включают: 1) симбиотически не специализиро ванные виды (Medicago borealis, M. caerulea, M. falcata, M. lupulina, M.

orbicularis, M. sativa, M. varia, Melilotus albus, M. officinalis), которые вступают в эффективный симбиоз со штаммами S. meliloti, выделенными из многих других представителей данной ГПИ;

2) узко специализирован ные виды, которые вступают в симбиоз только со штаммами из клубень ков этих же или немногих таксономически близких видов растений, а со штаммами иного происхождения формируют не фиксирующие азот клу беньки (Medicago arabica, M. hispida), либо вообще не вступают в симби оз (M. laciniata).

Оказалось, что симбиотически не специализированные виды вклю чают представителей всех четырех подродов люцерны (Medicago, Lupu laria, Orbicularia, Spirocarpos), а также виды донника, и это позволило нам предположить, что внутри ГПИ люцерны связь таксономии растений со специфичностью эффективного симбиоза отсутствует. Для того, чтобы проверить это предположение, мы подвергли наши данные математиче ской обработке, объединив их с данными из литературы. Эта обработка была проведена с помощью коэффициентов сходства, вычисляемых для видов А и В:

Sj = NAB / NA + NB + NAB, (1) где NA – число бактериальных штаммов, образующих эффективный сим биоз с видом А, но не с видом В;

NB – то же для штаммов, эффективных только на виде В;

NAB – то же для штаммов, эффективных с обоими ви дами растений (Проворов, 1985).

В результате ГПИ люцерны была разделена на три подгруппы, из кото рых наиболее многочисленная (1-я) состоит из симбиотически не специали зированных видов, а 2-я и 3-я – из специализированных видов, причем для M. laciniata перекрестная инокуляция с другими видами люцерны часто не выявляется. Хотя специализированные виды 2-й и 3-й подгрупп относятся только к одному из подродов Medicago (Spirocarpos), при анализе всей сово купности данных мы не обнаружили связи между делением этого рода на подроды и на подгруппы специфичности (табл. 1 и 2).

Аналогичные результаты дало изучение специфичности образования симбиоза Rhizobium leguminosarum bv. viceae с различными видами рода Vi cia, произрастающими в Среднеазиатском регионе (Курчак и др., 1995), а также проведенный на основании литературы анализ распределения видов клевера по подродам р. Trifolium и по подгруппам специфичности, выделяе мым в ГПИ клевера (Проворов, 1992;

Provorov, 1994) и видов бобовых, не входящих в истинные ГПИ (табл. 3). В последнем случае вероятность пере крестной инокуляции для видов из разных подсемейств или триб бобовых оказалась меньшей, чем для видов из одной трибы, а максимальная частота перекрестной инокуляции характерна для видов, представляющих один и тот же род. В то же время, специфичность образования эффективного (N2 фиксирующего) симбиоза не зависит от таксономического родства растений.

Возможная интерпретация различий по специфичности симбиоза, про являемой на уровне образования клубеньков и развития эффективного сим биоза, заключается в том, что образование клубеньков и симбиотическая азотфиксация возникли на разных этапах эволюции бобовых. Например, эволюция бобово-ризобиального симбиоза могла пройти через паразитарную стадию (образование не фиксирующих азот клубеньков) (Проворов, 1987, 1991;

Provorov, 1994), о чем говорит наличие ряда “общих” генов, участ вующих в развитии клубеньков и в защите растений от патогенов (Spaink, 1995;

Brewin, 2004;

Jones et al., 2007;

Тихонович, Проворов, 2007).

Таблица 1. Распределение видов Medicago и Melilotus по подгруппам группы пере крестной инокуляции (ГПИ) люцерны (Проворов, 1985, 1992;

Проворов и др., 1995) Виды растений* Результаты инокуляции различными Под штаммами Sinorhizobium meliloti группы ГПИ Всего % штаммов с разными фе люцер штаммов нотипами Fix+ Nod+Fix– Nod– ны Medicago aculeata (S) 49 44,9 55,1 0 M. arabica (S) 160 23,2 75,0 1,8 M. borealis (M) 47 95,7 4,3 0 M. caerulea (M) 47 97,9 2,1 0 M. cancellata (M) 7 100 0 0 M. daghestanica (M) 3 67 33 0 M. falcata (M) 80 87,5 12,5 0 M. glutinosa (M) 25 36 40 24 M. hemicaerulea (M) 7 42,9 57,1 0 M. hispida (S) 124 19,4 68,5 12,1 M. laciniata (S) 214 3,7 51,4 44,9 M. littoralis (S) 49 89,8 10,2 0 M. lupulina (L) 129 84,5 13,2 2,3 M. mimima (S) 89 96,6 3,4 0 M. orbicularis (O) 120 77,5 20,0 2,5 M. polymorpha (S) 80 23,7 76,3 0 M. praecox (S) 80 89,9 6,3 3,8 M. quasifalcata (M) 7 100 0 0 M. rigidula (S) 80 96,2 0 3,8 M. rugosa (S) 49 20,4 79,6 0 M. sativa (M) 152 80,3 15,1 4,6 M. scutellata (S) 49 85,7 14,3 0 M. truncatula (S) 80 82,5 17,5 0 Melilotus albus 216 79,6 19,9 0,5 M. indicus 80 23,7 76,3 0 M. officinalis 129 93,0 7,0 0 *Для видов люцерны в скобках указана принадлежность к подродам: Medicago (M), Lupularia (L), Orbicularia (O), Spirocarpos (S).

Симбиотические фенотипы: Fix+ – образование N2-фиксирующих клубеньков, Nod+Fix–– образование не фиксирующих N2 клубеньков, Nod– – клубеньки не образуются.

Выявленная в ходе филогенетического анализа эволюционная лабиль ность N2-фиксирующего симбиоза может быть связана с его необязательно стью для онтогенеза растений, которая сочетается с высокой адаптивной цен ностью симбиоза, проявляемой в условиях дефицита азота. Мы предположи ли, что специфичность мутуалистического взаимодействия может быть связа на не с таксономией растений, а с их экологической специализацией.

Таблица 2. Анализ сходства различных видов Medicago по специфичности обра зования эффективного симбиоза (Проворов, 1992;

Provorov, 1994) Сопоставляемые виды растений принадлежат: Коэффициенты сходства, Sj К одной и той же подгруппе ГПИ люцерны 1-й 0,92±0, 2-й 0,86±0, К разным подгруппам ГПИ люцерны 1–2 0,23±0, 1–3 0,05±0, 2–3 0,07±0, К одному и тому же подроду Medicago 0,63±0, К разным подродам Medicago 0,62±0, Таблица 3. Связь симбиотической специфичности и таксономического родства у бобо вых растений, не входящих в “истинные” группы перекрестной инокуляции, изученная на основании учета элементарных тестов на перекрестную инокуляцию (ЭТПИ)* Сопоставляемые Число ЭТПИ Доля (%) Доля (%) ЭТ виды растений при- положитель- ПИ, в кото Общее В которых надлежат к: ных ЭТПИ рых сформи изучали эф от их общего ровался эф фективность числа фективный симбиоза симбиоз Одному роду 1051 731 86,6±0,87 76,2±1, Разным родам од- 1917 557 65,4±1,09 72,0±1, ной трибы Разным трибам 3256 860 56,2±0,86 75,0±1, одного подсемейст ва Разным подсемей- 2456 722 58,6±0,99 76,7±1, ствам Для всех бобовых 8680 2870 62,5±0,52 74,9±0, *Если бактериальный штамм, выделенный из растений вида А, формировал клу беньки на растениях вида В, то мы считали осуществленным 1 положительный ЭТПИ (который мог сопровождаться формированием эффективного или не эф фективного симбиоза), а если клубеньки не формировались, то был получен отрицательный ЭТПИ. В таблице суммированы данные о 8680 ЭТПИ, выполнен ных с бобовыми, представляющими 132 рода из 31 трибы всех трех подсемейств сем. Fabaceae (Проворов, 1992;

Provorov, 1994).

Для проверки этой гипотезы мы изучили специфичность симбиоза с различными штаммами S. meliloti, выделенными в Кавказском центре разнообразия рода Medicago, у трех экологически различающихся видов:

M. daghestanica и M. glutinosa – экологически специализированные (эн демичные) виды, M. hemicaerulea – вид с широкой экологической ампли тудой. Оказалось (Проворов и др., 1995), что для эндемичных видов M.

daghestanica и M. glutinosa характерно образование более эффективного симбиоза с “гомологичными” штаммами, выделенными из клубеньков этих же видов, чем с “гетерологичными” штаммами из других видов. Од нако для экологически пластичного вида M. hemicaerulea такого различия не выявлено: он формирует одинаково эффективный симбиоз со “свои ми” и “чужими” штаммами ризобий.

1.2. Эволюция симбиотрофного питания азотом у бобовых культур В связи с тем, что для большинства почв характерен дефицит подвижных форм азота, многие группы растений используют два типа азотного пита ния – симбиотрофный (кооперация с ризобиями, актиномицетами, циа нобактериями, ризосферными или эндофитными бактериями) и авто трофный (самостоятельное усвоение азотных соединений, главным обра зом аммонийных и нитратных форм) (Проворов, 1996б).

Мы изучили динамику эффективного симбиоза в эволюции культур ных растений, оценив баланс различных типов азотного питания у ряда видов бобовых, и сопоставили его со степенью окультуренности расте ний. Оказалось, что для мало окультуренной вики мохнатой (Vicia villosa) характерно преобладание симбиотрофного типа азотного питания, тогда как для высоко окультуренной вики посевной (V. sativa) – преобладание автотрофного типа (рис. 1).

Для математического анализа данных о соотношении альтернатив ных типов азотного питания был использован коэффициент симбиотиче ской эффективности (Gibson, 1962):

MS 100% E= (2) MC где МS и МC – показатели продуктивности растений в условиях симбио трофного или автотрофного питания азотом, соответственно. Используя коэффициент Е, мы сопоставили полученные нами результаты с данными литературы и выяснили (рис. 2), что преобладание автотрофного питания характерно для высоко окультуренных видов бобовых, а преобладание симбиотофного питания – для мало окультуренных видов.

Рисунок 1. Использование викой мохнатой (Vicia villosa) и викой посевной (V.

sativa) симбиотически фиксированного азота (N2) или азотных удобрений (N) в форме карбамида. Размеры столбиков соответствуют средним прибавкам (по срав нению с безазотным контролем) для массы растений (белые) или накопления в них азота (заштрихованные) в вегетационных опытах (Курчак, Проворов, 1995).

Важно отметить, что наиболее резкие различия по соотношению альтер нативных типов азотного питания выявляются для растений, образующих недетерминированные клубеньки с “амидным типом” ассимиляции фикси рованного азота (горох, люцерна, кормовые бобы, козлятник, клевер, вика), тогда как у бобовых с детерминированными клубеньками “уреидного типа” (соя, фасоль, маш;

возможно, арахис) данные различия выражены гораздо менее резко. Эта закономерность может быть связана с тем, что специализи рованная система усвоения фиксированного азота, характерная для уреид ных клубеньков, не участвует в ассимиляции азотных удобрений и в мень шей степени подвержена ингибированию продуктами азотного обмена, чем ассимиляторная система амидных клубеньков. Результаты сравнительного изучения динамики накопления азота в растениях Vicia sativa и V. villosa, проведенное с помощью изотопных (15N) методов (Kurchak et al., 2000), по зволяют предположить, что снижение симбиотической активности при окультуривании растений связано с повышением чувствительности N2 фиксирующей системы к азотным соединениям, в первую очередь, к накап ливающимся в клубеньках продуктам N2-фиксации.

Повышенная эффективность симбиотрофного питания азотом у дико растущих и мало окультуренных бобовых может быть выявлена и при ана лизе внутривидовой изменчивости, которую мы изучили на примере пажитни ка греческого (Trigonella foenum graecum), разделяемого на два подвида: дико растущий индийский и окультуренный средиземноморский (Синская, 1950;

Сосков, Байрамов, 1990). В дикорастущих образцах и сортах пажитника выяв ляются растения, которые образуют фиксирующие N2 клубеньки (Fix+), не фиксирующие N2 клубеньки (Fix–) и не образуют клубеньков (Nod–). При этом индийский подвид обладает наибольшими частотами Fix+ и Nod+ растений, тогда как у средиземноморского подвида частоты Nod+ растений резко сни жены, а Fix+ растения не выявляются (табл. 4).

Рисунок 2. Эффективность симбиотрофного питания азотом у бобовых культур.

Приведены средние значения коэффициентов эффективности (Е, формула 1) с дове рительными интервалами: 1 – горох посевной (Pisum sativum), 2 – кормовые бобы (Vicia faba), 3 – вика посевная (V. sativa), 4 – люцерна культурная (Medicago sativa, M.

varia), 5 – вика мохнатая (V. villosa), 6 – козлятник восточный (Galega orientalis), 7 – клевер сходный (Trifolium ambiguum), 8 – фасоль обыкновенная (Phaseolus vulgaris), – соя культурная (Glycine max), 10 – маш (Vigna radiata), 11 – арахис (Arachis hypogaea). Серым цветом выделены виды растений с преобладанием симбиотрофного типа азотного питания над автотрофным типом. Для вики, маша и арахиса использо ваны собственные данные, для остальных видов – данные из литературы (см. обзор:

Проворов, 1996б).

Таблица 4. Симбиотические свойства различных подвидов пажитника греческого (Trigonella foenum graecum) Показатели* Микровегетационный опыт Полевой опыт И С Г И С Г % Nod+ 78±3,4 20±2,8 71±3,4 71±9,0 19±5,6 58±13, растений % Fix+ 61±4,6 0 39±4,5 55±12,6 0 34±14, растений Число клу- 15,7±0,9 12,7±0,7 16,2±1,2 15,9±1,5 10,8±0,9 13,7±1, беньков на Nod+ растение Исследовали по 10 образцов индийского (И) и средиземноморского (С) подвидов, а также 9 межподвидовых гибридов (Г), анализируя по 30-40 растений каждого образца при инокуляции штаммами 851 и 852 S. meliloti (Проворов и др., 1987а;

Сосков и др., 1992).

*Фенотипы растений обозначены как в таблице 1.

С использованием “ацетиленового” метода мы показали, что у лю церны дикорастущие и мало окультуренные формы превосходят по азот фиксирующей активности сорта, что согласуется с данными, полученны ми ранее (Тихонович, 1991) для гороха (рис. 3).

Рисунок 3. Нитрогеназная активность (НА, измеренная ацетиленовым мето дом, мкМ С2Н4 на растение в сутки) у дикорастущих (мало окультуренных) форм (1) и производственных сортов (2) бобовых. Данные по люцерне, Medi cago sativa, M. varia взяты из: Проворов, Тихонович, 2003;

Provorov, Tikhonovich, 2003;

данные по гороху, Pisum sativum ssp. sativum предоставил И.А.Тихонович.

Тот факт, что культурные растения обеднены наследственными факторами, обеспечивающими способность к симбиотрофному пита ния азотом, может быть связан с длительным возделыванием и се лекцией растений в условиях достаточного, а иногда и избыточного снабжения азотом, при котором происходила автоселекция форм с преобладанием автотрофного типа азотного питания. Маш и арахис, для которых мы выявили преобладание симбиотрофного азотного питания (табл. 5), хотя и являются стародавними бобовыми культу рами, возделываются главным образом в тропических регионах, на бедных почвах и при низких уровнях азотных удобрений (Жуков ский, 1950). В то же время, люцерна, горох, соя и фасоль длительное время возделывались в условиях интенсивного земледелия, при вы сокой обеспеченности азотом.

Таблица 5. Отзывчивость маша (Vigna radiata) и арахиса (Arachis hypogaea) на ино куляцию ризобиями и на внесение минерального азота в форме NH4NO3 (Пулатова и др., 1998;

Provorov et al., 1998) Варианты Маш (среднее по 2 сортам) Арахис (среднее по 3 сортам) опыта Масса Масса семян Масса Масса семян (г на 1 м2) (г на 1 м2) 1 растения 1 растения Инокуляция* 5,0 106,9 2,2 121, N60 4,6 (–) 91,6 (–) 1,5 (–) 99,7 (–) N120 4,9 103,5 1,6 (–) 110,0 (–) Инокуляция 5,5 (+) 116,0 (+) 2,5 (+) 125,5 (+) + N Без 3,7 (–) 78,6 (–) 1,1 (–) 87,2 (–) обработки НСР (0,05) 0,31 3,81 0,17 2, *Использовали производственные штаммы: CIAM1901 для маша, CIAM0104 для арахиса;

(+) или (–) – достоверные отличия от варианта с инокуляцией. N60 и N120 – внесение удобрений из расчета 60 и 120 кг/га азота.

Однако продолжительное возделывание бобовых культур на вы соком азотном фоне не может считаться единственной причиной их сниженной симбиотической активности. Данные об отрицательной корреляции между числом клубеньков и эффективностью каллусо образования у пажитника греческого (Provorov et al., 1996) позволя ют предположить, что симбиотические свойства растений могли снижаться в результате отбора на высокую регенерационную актив ность (при селекции пастбищных и многоукосных культур). Выяв ленные нами отрицательные корреляции симбиотической эффектив ности с содержанием масла в семенах арахиса или крахмала в семе нах маша (Саимназаров и др., 1997) могли быть причиной снижения симбиотической активности при селекции по биохимическому со ставу семян.

Итак, филогенетический анализ показал высокую эволюционную лабильность бобовых по способности к взаимодействию с ризобия ми, а также позволил предположить, что динамика основных сим биотических признаков растений (клубенькообразующей активности и способности формировать эффективно фиксирующий N 2 мутуали стический симбиоз) определяется разными эволюционными факто рами. Для выявления этих факторов весьма важными представляют ся вопросы о том, каким образом эволюционная динамика симбиоти ческих признаков связана с популяционной структурой сортов, из меняемой в ходе селекции, и как она реализуется в ходе коэволюции растений с полиморфными популяциями микросимбионтов.

2. Популяционная динамика эффективного симбиоза В основу изучения мутуалистических симбиозов должно быть положено пред ставление об их генетический целостности (Тихонович, Проворов, 2003), ко торая проявляется на онтогенетическом уровне (“встраивание” микросимби онтов в индивидуальное развитие растения- или животного-хозяина) и на по пуляционном уровне (перекрестное влияние селективных процессов, происхо дящих в популяциях партнеров). Первым шагом к изучению популяционной целостности бобово-ризобиального симбиоза является анализ сопряженной изменчивости бактериального и растительного компонентов. Практически значимым результатом этой работы должна стать мобилизация генетических ресурсов растений и бактерий в целях селекции, генетического конструирова ния и биоинженерии хозяйственно-ценных симбиозов.

2.1. Полиморфизм ризобий по признакам симбиотической эффективности Основными признаками ризобий, характеризующими их симбиотический по тенциал, являются: азотфиксирующая (нитрогеназная) активность, симбиоти ческая эффективность (влияние на продуктивность растений), а также способ ность конкурировать за образование клубеньков и хозяйская специфичность, проявляемая по отношению к разным видам и сортам растений (Доросинский, 1970;

Мишустин, Шильникова, 1973;

Симаров и др., 1990). Изучение взаимо связи этих признаков необходимо для разработки экспресс-методов отбора эффективных симбиотических систем, которую обычно связывают с исполь зованием “ацетиленового” метода (Hardy et al., 1968), основанного на способ ности нитрогеназы разрывать тройную связь не только в молекуле N2, но и в молекуле C2H2 (в последнем случае основным продуктом нитрогеназной реак ции является этилен C2H4). Дешевизна и простота определения ацетилен редуктазной активности (АРА) позволяет использовать ее для того, чтобы: 1) исключать из селекции симбиотически неактивные генотипы (Nod–, Fix–), 2) среди активных (Fix+) растений и бактерий отбирать формы с максимальным проявлением признаков симбиоза.

Ранее при проведении селекции ризобий люцерны (S. meliloti) было пока зало, что для штаммов, контрастно различающихся по симбиотическим свой ствам (например, Fix+ и Fix–), наблюдается высокая корреляция АРА и сим биотической эффективности (массы растений). Однако если в испытание бра ли штаммы, различия которых по азотфиксирующей активности носят коли чественный характер (например, Fix+ и Fix++), корреляция этих признаков час то оказывается низкой и недостоверной (Федоров, Симаров, 1987). Следова тельно, АРА наиболее пригодна для использования в качестве экспресс-метода на начальных этапах селекции, связанных с отбраковкой симбиотически неак тивных штаммов, однако для выявления штаммов, обладающих максимальной эффективностью симбиоза, ее использование ограничено. Для выяснения при роды этих ограничений, а также для поиска критериев отбора штаммов ризо бий на повышение симбиотической эффективности, был проведен анализа ее взаимосвязи с АРА в системах “R. leguminosarum bv. viceae – горох” и “Sinorhizobium meliloti – люцерна”.

2.1.1. Система “Rhizobium leguminosarum bv. viceae – горох” (аналитическая селекция) Простейшим подходом для изучения взаимосвязи между нитрогеназной ак тивностью и симбиотической эффективностью является анализ их изменчиво сти у природных изолятов ризобий, полученных из почвы или клубеньков растений (аналитическая селекция). Мы исследовали коллекцию из 481 штам ма ризобий гороха (R. leguminosarum bv. viceae) в серии из 52 вегетационных опытов, в результате которых было выявлено 7 эффективных штаммов, кото рые изучили в полевых опытах (работа проведена совместно с ВНИИ зерно бобовых и крупяных культур, г. Орёл).

Полученные данные показали, что селекция штаммов на способность по вышать накопление в растениях азота намного более результативна, чем на способность повышать массу растений (табл. 6). Корреляционный анализ по лученных данных показал (табл. 7), что нитрогеназная активность (АРА) слабо связана с параметрами симбиотической эффективности – массой растений и накоплением в них азота. Низкие, хотя и достоверные корреляции выявлены по совокупности вегетационных опытов, в которых проверяли штаммы, кон трастно различающиеся по симбиотической активности. Однако эти корреля ции отсутствовали в полевых опытах, где изучались только эффективные штаммы. Следовательно, в данных условиях селекция ризобий по нитрогеназ ной активности мало эффективна, однако она может быть результативной по способности штаммов повышать накопление в растениях азота, которое хоро шо коррелирует с их массой. Это различие связано с тем, что накопление азота отражает азотфиксирующую активность за весь период вегетации, тогда как АРА позволяет оценивать эту активность в течение небольших промежутков времени, когда она подвергается случайным колебаниям.

Важно отметить, что общее накопление азота в растениях достоверно коррелирует как с их массой, так и с концентрацией азота, хотя между двумя последними показателями связь отсутствует. Это показывает, что дополни тельные количества азота, которые хозяин получает благодаря повышению азотфиксирующей активности бактерий, могут быть лишь частично использо ваны им для своего развития.

Таблица 6. Симбиотическая эффективность природных штаммов Rhizobium legumino sarum bv. viceae на горохе сорта Орловчанин (Орлов и др., 1995;

Фесенко и др., 1995) Показатели 52 вегетационных опыта 8 полевых опытов Доля (%) штаммов, способных МИ 4,6±1,0 57,3±5, достоверно повышать: Nобщ 10,2±1,4 Прибавки (%) по:* МИ 27,0±2,1 7,0±0, Nобщ 33,8±2,3 9,7±0, *Прибавки относительно контроля без инокуляции вычисляли только для эффективных штаммов, инокуляция которыми приводила к достоверному возрастанию симбиотических признаков: МИ – массы инокулированных растений, Nобщ – общего накопления азота.

Таблица 7. Корреляционный анализ симбиотических признаков при селекции штаммов Rhizobium leguminosarum bv. viceae на эффективность симбиоза с горохом (Орлов и др., 1995;

Фесенко и др., 1995) Сопостав- 52 вегетационных опыта 8 полевых опытов а b а b ляемые r0 rmin… rmax r0 rmin… rmax признаки НА – МИ 34* –0,33…+0,78 +0,21* 4 –0,30…+0,52 +0, НА – N% 34* –0,48…+0,65 +0,08 3 –0,29…+0,34 +0, НА – Nобщ 36* –0,47…+0,71 +0,21* 4 –0,25…+0,60 +0, МИ – N% 26 –0,48…+0,73 +0,04 6 –0,20…+0,28 +0, МИ – Nобщ 52** +0,23…+0,99 +0,87** 8 +0,58…+0,92 +0,82** N% – Nобщ 49** –0,10…+0,91 +0,58* 8 +0,09…+0,88 +0,67** а Число опытов, в которых коэффициент корреляции положителен (достоверность корреляции для совокупности опытов оценивали с помощью критерия знаков;

*Р 0,05;

**Р0 0,01). bГенеральные коэффициенты корреляции () определяли, вычисляя для каждого значения r величины z = 0,5 ln(1+r)/(1–r), которые распределены по нор мальному закону, после чего оценивали достоверность отличия z от 0 (*Р0 0,05;

**Р 0,01), а значения определяли по таблицам на основании средних величин z.

МИ – масса инокулированных растений, N% – концентрация в них азота, Nобщ – об щее накопление азота, НА – нитрогеназная (ацетилен-редуктазная) активность.

2.1.2. Система “Sinorhizobium meliloti – люцерна” (рекомбинантные штаммы) Для более детальной характеристики процессов усвоения азота при эф фективном симбиозе, который формируется благодаря повышению азот фиксирующей активности бактерий, мы использовали генетическую сис тему, созданную во ВНИИСХМ совместно с Билефельдским университе том (отдел генетики) и состоящую из рекомбинантных штаммов S.

meliloti, полученных путем амплификации генов, которые контролируют энергоснабжение нитрогеназы, связанное с транспортом в бактерии ди карбоновых кислот. Этот транспорт контролируется сукцинат-пермеазой DctA, синтез которой зависит от специфичных для гена dctA транскрип ционных регуляторов DctBD и от неспецифичных регуляторов NifA и NtrA, вовлеченных также в регуляцию генов нитрогеназы (Jording et al., 1994). Штаммы изучали в стерильных опытах, при выращивании люцер ны на безазотном субстрате (вермикулит), что позволило отказаться от использования АРА, проявляющей низкую корреляцию с массой расте ний, а для оценки N2-фиксирующей активности использовать накопление в них азота (Проворов и др., 1994а;

Онищук и др., 2009). Для характери стики эффективности симбиоза наряду с массой растений, использовали накопление в них углерода, отражающее интенсивность фотосинтеза, который является источником энергии для азотфиксации (Streeter, 1995).

Анализ данных двух микровегетационных опытов (МВО) и вегета ционного опыта (ВО) показал, что прибавки растений по массе были зна чительно ниже, чем по накоплению азота (рис. 4), что согласуется с дан ными, полученными на горохе (табл. 6). В ВО рекомбинанты в среднем превышали штамм Rm2011 по общему накоплению азота в растениях на 78%, а по их массе – лишь на 22% (рис. 4). Корреляционной анализ полу ченных данных показал, что масса люцерны тесно связана с общим нако плением в ней азота и углерода (табл. 8). В МВО №1 высокие корреляции отмечены при сопоставлении всех признаков, а в МВО №2 отсутствовали корреляции массы с концентрациями азота и углерода. Это различие мо жет быть связано с тем, что в МВО №1 изучали штаммы, контрастно раз личающиеся по симбиотической активности (включая мутанты со сни женной или утраченной N2-фиксацией), а в МВО №2 изучали только вы сокоактивные рекомбинанты. Важно отметить, что в обоих опытах на блюдали высокие корреляции между концентрациями в растениях азота и углерода. По-видимому, активная N2-фиксация усиливает фотосинтез, благодаря чему достигается оптимальный баланс С:N в растениях. Сти мулом для усиления фотосинтеза может быть также ускоренное погло щение бактероидами дикарбоновых кислот, связанное с активизацией сукцинат-пермеазной системы.

Рисунок 4. Симбиотическая активность рекомбинантов Sinorhizobium meliloti, полученных при введении дополнительных генов транспорта дикар боновых кислот в штамм Rm2011 (Онищук и др., 2009). Приведены средние данные по 9 рекомбинантам: 2011-121 (dctABD), 2011-121Н6 (dctABD), 2011 121SH2 (dctA), 2011-121/121SH2 (dctABD + dctA), 2011-H6/SH2 (dctABD + dctA), 2011-121HB4 (ntrA), 2011-SH2/HB4 (dctABD + ntrA), 2011-121HH5 (nifA), 2011 SH2/HH5 (dctA + nifA) (Engelke et al., 1989;

Jording et al., 1992).

Таблица 8. Корреляции симбиотических признаков люцерны, инокулированной рекомбинантами Sinorhizobium meliloti с дополнительными копиями генов транс порта дикарбоновых кислот (Онищук и др., 2009) Сопоставляемые признаки Опыт №1 Опыт № M – N% + 0,71* – 0, M – C% + 0,68* – 0, M – Nобщ + 0,84* + 0,81* M – Cобщ + 0,92** + 0,85* N% – C% + 0,83* + 0,92** Nобщ – Cобщ + 0,92** + 0,97** В микровегетационном опыте №1 изучены 23 контрастно различающиеся по азотфиксирующей активности штамма (4 мутанта фенотипа Fix–, 6 мутантов Fix+/–, 13 рекомбинантов и штамм “дикого типа” Fix+ и Fix++), в опыте №2 – рекомбинантов, генотипы которых указаны в подписи к рис. 4 (Fix+ и Fix++). М – надземная масса растений, N% и Nобщ – концентрация и общее накопление в них азота;

C% и Cобщ – то же для углерода. Корреляции достоверны при *Р0 0,05;

**Р0 0,01.

Для изучения природы ограничений в проявлении признака повы шенной симбиотической эффективности мы провели более детальное изучение группы из 9 рекомбинантов, полученных путем введения до полнительных копий “симбиотических” генов в штамм дикого типа (ука заны в подписи к рис. 4). Мы сопоставили проявление их симбиотиче ских признаков на двух неродственных сортах люцерны: с. Зайкевича (M.

varia) и с. Du Puits (M. sativa), для которых в микровегетационном опыте раздельно исследовали влияние инокуляции на массу и элементный (N, C) состав корней и надземной части. При образовании эффективного симбиоза (сравнение растений в стерильном контроле и при инокуляции штаммом Rm2011) у обоих сортов наблюдали возрастание надземной массы растений, а также концентрации и общего накопления в ней азота (табл. 9). При этом концентрация азота в корнях резко возрастала у с. Du Puits, но не изменялась у с. Зайкевича. Очевидно, что при образовании эффективного симбиоза растения с. Зайкевича полностью передают фик сированный азот из клубеньков и корней в надземную часть, а у с. Du Puits значительная его часть остается в корнях.

При повышении активности симбиоза, связанном с активизацией сукцинат-пермеазной системы (сравнение рекомбинантов с исходным штаммом Rm2011), у растений обоих сортов возрастает масса надземной части и накопление в ней азота. Однако это повышение невелико и со провождается значительным накоплением азота в корнях (31% дополни тельно фиксированного азота у сорта Зайкевича, 62% – у сорта Du Puits).

У сорта Du Puits при этом возрастает также и масса корней, что требует дополнительных затрат углерода, еще более ограничивающих эффектив ность симбиоза.

Таблица 9. Продуктивность люцерны сортов Зайкевича (M. varia) и Du Puits (M.

sativa) при взаимодействии с эффективными рекомбинантами Sinorhizobium meliloti (указаны в подписи к рис. 4) в микровегетационном опыт №2 (Онищук и др., 2009) Признаки Надземная часть Корни Сорт Зайкевича Cорт Du Puits Сорт Зайкевича Cорт Du Puits Отклонения (%) при инокуляции штаммом Rm2011 по сравнению с контролем MИ +31,4* +36,0* –41,9* –61,6* N% +63,6* +69,1* – 5,2 +70,5* Nобщ +115,2* +130,0* –45,5* –35,5* Отклонения (%) при сравнении рекомбинантов с родительским штаммом Rm MИ + 9,5* +15,3* – 8,5 +54,3* N% + 1,5 – 5,5 +33,7* + 2, Nобщ +10,9* + 8,7 +23,6* +57,5* Абсолютные значения массы (мг на пробирку) для растений MК 10,5 10,0 8,7 11, MИ 13,8 13,6 5,1 4, (Rm2011) *Отклонения статистически значимы (P0 0,05). МИ – масса инокулированных растений, МК – масса контрольных (не инокулированных) растений, Nобщ – общее накопление азота, N% – концентрация азота.

Важными особенностями анализа фенотипического эффекта бакте риальных генов, контролирующих симбиотическую эффективность, яв ляется зависимость ее проявления от генотипов хозяина, которые вносят более значимый вклад в варьирование признаков симбиоза, чем бактери альные генотипы (см. табл. 17), а также сильное неконтролируемое варь ирование этих признаков, обусловленное полиморфизмом растительных популяций (разд. 3.1). При сопоставлении результатов проведенных опы тов не удалось выявить достоверные корреляции между величинами сим биотической эффективности рекомбинантов, содержащих дополнитель ные копии генов транспорта дикарбоновых кислот, что затрудняет опре деление относительной ценности этих генов при конструировании высо коактивных штаммов ризобий. Для решения этой задачи мы определяли уровни влияния амплификации генов dctABD, dctA, nifA, ntrA на показа тели симбиотической эффективности с помощью факторного анализа.

Оказалось (табл. 10), что в МВО №1 и №2 с сортом Du Puits совмест ная амплификация структурного гена сукцинат-пермеазы dctA и специ фичных для него регуляторов dctBD демонстрирует наибольшее влияние на симбиотическую эффективность (о чем говорят высокие величины факторной нагрузки для dctABD) по сравнению с амплификацией гена dctA или неспецифичных регуляторов nifA и ntrA. В ВО с сортом Du Puits факторные нагрузки для dctA и dctABD одинаково высоки, а для неспе цифичных регуляторов nifA и ntrA они ниже, чем в МВО. В МВО №2 с сортом Зайкевича уровни влияния изученных генов на эффективность симбиоза оказались такими же, как в ВО с сортом Du Puits.

Таблица 10. Уровни влияния амплификации генов транспорта дикарбоновых кислот на показатели эффективности симбиоза Sinorhizobium meliloti с разными сортами люцерны Гены Величины факторных нагрузок* сорт Du Puits сорт Зайкевича МВО №1 МВО №2 ВО МВО № dctABD 0,72±0,02 0,65±0,05 0,63±0,10 0,65±0, dctA 0,39±0,06 0,38±0,06 0,65±0,05 0,58±0, nifA 0,29±0,07 0,34±0,07 0,17±0,01 0,21±0, ntrA 0,32±0,04 0,32±0,04 0,17±0,06 0,20±0, *Факторные нагрузки (приведены со стандартными ошибками) вычисляли для Min-вектора в многомерном пространстве, координатные оси которого характе ризуют количества копий генов транспорта дикарбоновых кислот, а также пара метры эффективности симбиоза – массу растений, содержание в них азота и угле рода. Значения факторных нагрузок находятся в диапазоне 0…1 (чем они выше, тем более значимо влияние амплификации гена, рассчитанное на одну копию).

Полученные данные позволяют предположить, что в неблагоприят ных для симбиоза условиях (МВО с сортом Du Puits, где продолжитель ность азотфиксации составила 8-10 суток) лимитирующей стадией обра зования N2-фиксирующей системы оказывается активация синтеза сук цинат-пермеазы DctA, осуществляемая на уровне транскрипции струк турного гена, в которой важную роль играют не только специфичные регуляторы dctBD, но и неспецифичные регуляторы nifA и ntrA. В более благоприятных условиях (ВО с сортом Du Puits, где период азотфиксации составляет 28-30 суток, а также МВО с сортом Зайкевича, который даже в условиях ограниченного роста обеспечивает активный отток продуктов N2-фиксации в надземную часть растений) эффективность симбиоза за висит от работы уже сформировавшейся пермеазной системы, и для ее повышения достаточно амплификации гена dctA. Одним из механизмов ингибирующего действия накапливающихся в клубеньках продуктов N2 фиксации может быть блокировка образования дикарбоновых кислот, снижающая скорость синтеза пермеазы DctA (на уровне активности транскрипционных регуляторов).

Итак, использование симбиосистем (“Rhizobium leguminosarum bv.

viceae – горох”, “Sinorhizobium meliloti – люцерна”) показало, что возрас тание азотфиксирующей активности бактерий (в результате аналитиче ской селекции, либо генетического конструирования) повышает накопле ние азота в растениях более существенно, чем их массу. Из этого следует, что для полной реализации азотфиксирующего потенциала ризобий не обходим подбор генотипов бобовых, способных полностью использовать для развития биомассы дополнительно получаемый азот. На примере двух сортов люцерны, изученных на отзывчивость к инокуляции генетически мо дифицированными штаммами S. meliloti, можно видеть, что “узким местом”, ограничивающим использование дополнительно фиксированного азота, яв ляется его передача из корней в надземную часть растений.

2.2. Полиморфизм бобовых растений по признакам эффективного симбиоза Детальное изучение симбиотического полиморфизма бобовых мы прове ли на примере культурных видов люцерны, донника и пажитника, вхо дящих в ГПИ люцерны (табл. 11). Наименее изменчивой среди них ока залась люцерна, наиболее изменчивым – пажитник греческий, для кото рого проявление полиморфизма сильно зависит от генотипов микросим бионта: наиболее эффективны штаммы S. meliloti, выделенные из пажит ника (851 и 852), менее эффективны штаммы 425а и 406б из люцерны, и неэффективен штамм 281 из донника (Проворов, Симаров, 1984а, 1986а).

Таблица 11. Изменчивость симбиотических признаков у бобовых растений из ГПИ люцерны, по данным микровегетационных опытов (Provorov, Simarov, 1990) Растения Изучено образцов Коэффициенты вариации (%) по Fix+ Nod+Fix– Nod– Всего НА MИ Люцерна* 133 133 0 0 27-41 13- Донник** 8 8 0 0 21-52 18- Пажитник*** 29 13 12 4 55*** 53*** *Объединенные данные по видам Medicago sativa, M. varia, M. falcata (штамм СХМ1).

**Объединенные данные по видам Melilotus albus, M. officinalis (штамм 281).

***Данные для с. Нахичеванская шамбала (штамм 852). МИ – масса инокулиро ванных растений, НА – нитрогеназная (ацетилен-редуктазная) активность (фено типы растений обозначены как в табл. 1).

Изучение внутрисортовой изменчивости люцерны (при инокуляции штаммом СХМ1) показало, что у индивидуальных растений нитрогеназная активность более вариабельна, чем масса (табл. 12). При этом по нитрогеназ ной активности выявляется левосторонняя асимметрия (As0), то есть в попу ляциях преобладают растения с низким уровнем проявления этого признака.

Подобной асимметрией характеризуется распределение неинокулированных растений по массе, однако образование симбиоза приводит к нормализации этого распределения.

Таблица 12. Характеристика внутрисортового полиморфизма люцерны по сим биотическим признакам (при инокуляции штаммом СХМ1) Сорта растений Cv As МИ НА МК МИ НА Зайкевича (v) 16 31 +0,29 +0,01 +0,54* Краснодарская 13 30 +0,58* +0,47 +0, ранняя (v) Краснодарская 72 (v) 19 30 +0,33 –0,11 +0, Терра (v) 14 27 +1,44* –0,32 +0,66* Спарта (v) 21 38 +0,41 +0,10 +0, Славянская 17 41 +1,04* –0,67* +0, местная (v) Омская 192 (v) 19 36 +0,03 –0,49 +1,08* Ташкентская 3192 (s) 17 40 +0,43 –0,74* +0,88* Береке (s) 26 39 +1,24* –0,03 +0, Вахшская 300 (s) 21 38 +0,81* +0,19 +0,82* Средние 18,3±1,20 35,0±1,59 +0,66±0,14* –0,16±0,12 +0,53±0,10* Для характеристики распределений использовали коэффициенты: Cv – вариации (%), As – асимметрии (*распределение достоверно отличается от нормального;

Р 0,05). В скобках после названий сортов указана их принадлежность к видам люцерны:

Medicago varia (v) или M. sativa (s) (Lesins, Lesins, 1979;

Иванов, 1980).

МИ – масса инокулированных растений, МК – масса контрольных (не иноку лированных) растений, НА – нитрогеназная (ацетилен-редуктазная) активность.

Закономерности, выявленные при изучении нитрогеназной активности у люцерны, подтвердились при изучении козлятника восточного, Galega orien talis сорта Гале (табл. 13). По данным микровегетационных опытов, около 15% растений этого сорта формируют неактивные (Fix–) клубеньки, причем коэф фициенты вариации и асимметрии распределений Fix+ растений по нитроге назной активности для козлятника значительно выше, чем для люцерны.

Таблица 13. Полиморфизм козлятника восточного (с. Гале) по нитрогеназой ак тивности (НА) при инокуляции штаммом 740 (Метлицкая и др., 1995) НА, мкМ С2Н4 на 1 Fix+ растение в сутки Изучено растений % Fix+ Опыт Всего Среднее Cv As Ex растений 1 389 93,6 0,15±0,006 77,7 +1,02* +0, 2 402 80,8 0,12±0,007 108,6 +1,66* +2,30* 3 354 80,7 0,13±0,011 127,3 +1,69* +1,73* Коэффициенты (для Fix+ растений): Cv – вариации (%), As – асимметрии, Ex – эксцесса (*распределение достоверно отличается от нормального;

Р0 0,05).

Межпопуляционное варьирование люцерны было изучено на двух наборах генотипов: таксономически разнородном (99 образцов Medicago sativa, M. varia, M. falcata, представляющих все мировые центры происхождения люцерны;

рис. 5) и таксономически одно родном (34 образца M. sativa Среднеазиатского генцентра). Резуль таты этих опытов оказались сходными, так как для обеих групп ге нотипов: 1) прибавка массы растений более изменчива, чем нитроге назная активность (коэффициенты вариации 48-63% и 20-22%, соот ветственно);

2) эти признаки не коррелируют между собой и харак теризуются различными параметрами распределения, что говорит о разном генетическом контроле.

В связи с отсутствием четкой связи между азотфиксирующей активностью и симбиотической эффективностью со стороны как рас тений, так и ризобий, особый интерес приобретает вопрос о возмож ности использования “ацетиленового” метода в селекции активно фиксирующих N 2 симбиотических систем. Мы показали, что если набор из различающихся по происхождению сортов бобовых испы тывают на эффективность симбиоза с одним и тем же штаммом ри зобий, то корреляции оказываются недостоверными: для выборки из 99 сортов люцерны (рис. 5) коэффициенты корреляции ацетилен редуктазной активности с относительными (в %) и абсолютными (в мг) прибавками массы растений составили +0,13…+0,18 (Р 0 0,05).

Аналогичные данные были получены и при анализе выборки из сортов люцерны Среднеазиатского генцентра (r = +0,04…+0,30;

Р 0,05). Мы предположили, что отсутствие этой корреляции связано с высоким полиморфизмом изучаемых сортов растений, у которых способность индуцировать у находящихся в клубеньках бактерий нитрогеназную активность и ассимилировать продукты азотфикса ции характеризуется разными закономерностями генетического варьирования. Если это предположение правомочно, то корреляции азотфиксирующей активности и симбиотической эффективности должны проявляться на фоне генетически однородных выборок рас тений. Для проверки этого предположения мы использовали серию самофертильных линий люцерны (M. varia) сорта Омская 192.

Оказалось, что у полученных линий симбиотическая эффек тивность (относительные прибавки массы от инокуляции) вдвое ни же, чем у исходного сорта). Однако по нитрогеназной активности (АРА) подобного снижения не наблюдали, причём три линии харак теризовались ее возрастанием (табл. 14). Корреляционный анализ показал, что связь АРА с массой растений отсутствует при сопостав лении разных линий люцерны, но выявляется для индивидуальных растений внутри линий (табл. 15). Это показывает, что селекция рас тений по АРА может приводить к повышению симбиотической эф фективности только при работе с относительно однородным исход ным материалом.

Для того, чтобы подтвердить возможность селекции растений на повышение симбиотической эффективности с помощью “ацетилено вого” метода, мы провели опыты с козлятником восточным (Galega orientalis) – культурой с преобладанием симбиотрофного типа азот ного питания над автотрофным типом (рис. 2). В микровегетацион ных опытах, результаты которых представлены в таблице 12, из сор та Гале были отобраны 107 растений с максимальной нитрогеназной активностью (Fix ++ ) и 109 лишенных ее растений (Fix –). Анализ раз вития этих растений в полевых опытах показал, что отбор на повы шенную нитрогеназную активность сопровождался усилением раз вития козлятника, а также ускорением его перехода в генеративную фазу (табл. 16). Хотя полученные данные носят предварительный характер (Fix ++ растения сравнивали с растениями фенотипа Fix –, а не со всем исходным сортом), результаты работы позволили нам за щитить методику отбора растений с повышенной симбиотической эффективностью, основанную на использовании ацетиленового ме тода, патентом России (№2083089 от 10.06.1997 г.). Возможность использования созданного исходного материала в селекции козлят ника была показана в последующих работах (Raig et al., 2001).

Рисунок 5. Межсортовое варьирование люцерны по симбиотической активно сти. Симбиотические признаки 99 сортов и дикорастущих форм Medicago sativa (60), M. varia (27), M. falcata (12) изучены в стерильных микровегетационных опытах при инокуляции штаммом СХМ1. А – нитрогеназная активность: мкМ С2Н4 на растение в сутки. Б – симбиотическая эффективность: прибавка массы растений, мг (Provorov, Simarov, 1990).

Таблица 14. Симбиотические свойства самофертильных линий люцерны, полу ченных из сорта Омская 192 (Квасова и др., 1994) Признаки Омская 192 Линии* Число линий, отклоняющихся от исход ного сорта** + – Р МК 104±8,7 129±6,5 14 (8) 4 0, МИ 235±6,9 204±7,8 4 14 (9) 0, dM% +126 +64 2 16 0, НА 4,9±0,27 5,0±0,28 9 (3) 9 (1) 0, Р0 – вероятность нулевой гипотезы о том, что линии в среднем не отличают ся от исходного сорта. В скобках указаны количества линий с достоверным от клонением от сорта Омская 192 (*средние рассчитывали для 21 линии;

**из рас четов исключены 3 линии, в которых наблюдали выщепление Fix– растений).

МИ – масса инокулированных растений (штамм СХМ1), МК – масса контрольных (не инокулированных) растений, dM% – прибавка (%) массы растений над контролем без инокуляции, НА – нитрогеназная (ацетилен-редуктазная) активность.

Таблица 15. Корреляционный анализ симбиотических признаков самофертиль ных линий люцерны (Квасова и др., 1994) Сопоставляемые признаки Коэффициенты Вероятность на корреляции личия связи* dM% – НА (для разных линий) + 0,17 0, МИ – НА (для разных линий) + 0,24 0, МИ – НА (для индивидуальных растений + 0,55* 0, в линии) МИ – масса инокулированных растений, dM% – прибавка (%) массы растений от инокуляции, НА – нитрогеназная (ацетилен-редуктазная) активность.

Таблица 16. Продуктивность растений козлятника, различающихся по способности к азотфиксации, в полевом опыте на 2-й год вегетации (Метлицкая и др., 1995) Признаки Фенотипы растений t-критерий Fix– Fix++ Стьюдента* Масса растений (г на 1 м2) 732±83,5 1351±154,5 3,52 (Р0 0,05) Высота растений, см 54,8±3,1 70,3±3,9 3,10 (Р0 0,05) % мощно развитых растений 35,0±7,5 62,7±6,7 2,74 (Р0 0,01) % растений, сформировавших плоды 52,5±7,9 82,3±5,3 3,12 (Р0 0,01) Итак, полученные данные показали, что со стороны как макро симбионта, так и микро-симбионта азотфиксирующая активность и сим биотическая эффективность характеризуются разными параметрами из менчивости, а значит их генетический контроль существенно различает ся. Поскольку растительный и бактериальный партнеры выполняют в азотфиксирующем симбиозе разные функции (ризобии фиксируют азот, бобовые обеспечивают нитрогеназу энергией и осуществляют ассимиля цию аммония), важным является сопоставление размаха изменчивости нитрогеназной активности и симбиотической эффективности, наблюдае мого со стороны растений и бактерий. Для такого сопоставления мы про вели опыты, в которых либо один сорт растений инокулировали набором из различающихся по происхождению штаммов ризобий, либо набор из различающихся по происхождению сортов инокулировали одним и тем же штаммом. Оказалось (табл. 17), что хотя нитрогеназная активность является признаком бактерий, ее изменчивость в равной степени зависит от генотипов обоих партнеров, тогда как варьирование симбиотической эффективности определяется в основном генотипом растений. Таким об разом, именно растение-хозяин является тем партнером, который оказы вает решающее влияние на эффективность симбиоза, и генетическое улучшение растений, проводимое параллельно с селекцией или генетиче ским конструированием бактерий, является обязательным условием по вышения симбиотической эффективности.

Таблица 17. Сопоставление межсортового варьирования растений с межштаммовым варьированием бактерий по симбиотическим признакам (Проворов, Симаров, 1992) Растение- Взято в опыт Коэффициенты вариации (%) хозяин по:

Сортов растений Штаммов бактерий НА dM% Люцерна 1 36 30±3,5 35±4, 99 1 22±2,2 48±4,8* 34 1 20±2,5 63±7,9* Донник 1 36 28±3,3 26±3, 8 1 24±6,0 99±23,7* *Коэффициент вариации по величине прибавки массы растений (dM%) достоверно выше, чем по нитрогеназной активности (НА).

3. Популяционно-генетические модели симбиоза Для выяснения закономерностей эволюции мутуалистического симбиоза необходимо создание и сопряженный анализ экспериментальных и мате матических моделей, описывающих коэволюцию партнеров, которая ос нована на координированном действии в их популяциях естественного отбора. На примере бобово-ризобиального симбиоза мы проанализирова ли две группы моделей, которые позволяют исследовать связь эффектив ности симбиоза со специфичностью, проявляемой при взаимодействии партнеров, а также с уровнем их полиморфизма.

3.1. Экспериментальные модели Признаком, непосредственно отражающим коэволюционные процессы в системе симбиоза, является специфичность взаимодействия партнеров, которая в настоящее время активно изучается на молекулярно генетическом уровне (Овцына, Тихонович, 2004). Однако связь эффек тивности мутуализма со специфичностью взаимодействия партнеров ос тается мало изученной. Ранее Л.М.Доросинский (1970) показал, что при взаимодействии различных видов бобовых (соя, люпин) со штаммами Bradyrhizobium japonicum наибольшая эффективность симбиоза достига ется при максимально выраженной специфичности взаимодействия рас тений и бактерий. Для того, чтобы выяснить, проявляется ли эта связь на внутривидовом уровне, на котором действует естественный отбор, мы с использованием методики двухфакторного дисперсионного анализа про анализировали данные о сорто-штаммовых взаимодействиях партнеров в различных бобово-ризобиальных системах. Этот подход позволил нам разложить общее варьирование признаков симбиоза на 4 составляющие, которые соответствуют аддитивным действиям сортовых и штаммовых генотипов, их неаддитивному взаимодействию (оно непосредственно характеризует специфичность симбиоза), а также эффектами “случай ных” факторов. В каждой системе эффективность симбиоза определяли по двум показателям – массе растений и общему накоплению в них азота, причем второй показатель повышается при инокуляции ризобиями более значительно, чем первый (раздел 2.1.1). Оказалось, что в пяти различных симбиосистемах накопление азота более жестко контролируется геноти пами партнеров и в большей степени зависит от специфичности их взаи модействия, чем масса растений (табл. 18).

Связь между специфичностью и эффективностью симбиоза подтверди лась также при сопоставлении систем, образуемых люцерной и горохом, либо люцерной при выращивании на разных типах почвы (рис. 6). В обоих случаях наиболее эффективный симбиоз (у люцерны по сравнению с горо хом, либо у люцерны при выращивании на серозёме по сравнению с черно зёмом) формируется при максимальном проявлении специфичности взаимо действия генотипов растений и бактерий. Выявленная связь между эффек тивностью и специфичностью симбиоза показывает, что координированная селекция партнеров должна быть направлена на подбор штаммов ризобий, используемых для инокуляции определенных сортов бобовых (или групп родственных сортов), то есть на создание высоко комплементарных сочета ний генотипов партнеров.

Важное значение для разработки методов координированной селекции партнеров имеет выяснение природы “случайного” варьирования, которое во многих опытах оказывает большее влияние на признаки симбиоза, чем гено типы партнеров (табл. 18, рис. 6).

Таблица 18. Вклады генотипов симбиотических партнеров в общее варьирование показателей эффективности бобово-ризобиального симбиоза Система Параметры MИ Nобщ Ссылки Medicago sativa (M. dX +12,9 +14,4 Provorov et varia) – al., С 37,7 41, Sinorhizobium Ш 11,4 11, meliloti СШ 0 7, Z 50,9 39, dX +4,3 +9,8 Танривердиев и др., С 38 Ш 11 СШ 0 Z 51 dX +3,1 +15,1 Проворов и др., 1994а С 54,1 26, Ш 18,7 24, СШ 4,4 39, Z 22,8 9, Pisum sativum – dX +27,0 +33,8 Фесенко и Rhizobium др., 1995;

С 30,8 31, leguminosarum bv. Fesenko et al., Ш 14,9 13, viceae СШ 5,4 8, Z 48,9 46, Vicia villosa – dX +16,1 +30,2 Курчак и др., Rhizobium С 20,1 7, leguminosarum bv. Ш 15,9 2, viceae СШ 0 53, Z 64,0 37, Vigna radiata – dX +40,0 +55,0 Саимназаров Bradyrhizobium sp. и др., С 60,4 53, (Vigna) Ш 32,4 35, СШ 4,7 10, Z 2,5 1, Arachis hypogaea – dX +53,1 +90, Bradyrhizobium sp. С 9,1 10, (Arachis) Ш 77,8 81, СШ 1,2 1, Z 12,0 6, dX – относительная прибавка (%) при инокуляции, средняя для всех комбинаций “сорт-штамм”. В каждом опыте общее варьирование признака разложено путем двухфакторного дисперсионного анализа на составляющие: С – аддитивное действие сортов растений, Ш – аддитивное действие штаммов бактерий, СШ – их неаддитив ное взаимодействие, Z – случайное варьирование (Тихонович, Проворов, 1998).

Обычно это варьирование связывают с действием неконтролируемых факторов внешней среды, однако мы предположили, что его важным источ ником может быть также генетический полиморфизм растительных популя ций, который затрудняет поиск комбинаций “сорт-штамм”, обеспечивающих высокую эффективность симбиоза.

Рисунок 6. Вклады партнеров в изменчивость признаков, определяющих эф фективность симбиотических систем. А – различные виды бобовых: люцерна, об разующая высокоэффективный симбиоз (1);

горох, образующий малоэффективный симбиоз (2). Б – люцерна на бедной сероземной почве, где образуется высокоэффек тивный симбиоз (1);

на богатой черноземной почве, где образуется малоэффективный симбиоз (2) (Проворов, Тихонович, 2003;

Provorov, Tikhonovich, 2003).