Структурно-функциональная организация регуляторных районов и механизмы транскрипции генов интерлейкина-5 человека и мыши
На правах рукописи
МОРДВИНОВ ВЯЧЕСЛАВ АЛЕКСЕЕВИЧ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ РАЙОНОВ И МЕХАНИЗМЫ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-5 ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ 03.00.03 – молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Кольцово - 2008
Работа выполнена в Институте цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск), университете Западной Австралии (the University of Western Australia, Perth) и Технологическом университете Перта (Curtin University of Technology, Perth, Western Australia)
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Э. Г. Малыгин доктор медицинских наук, профессор С. В. Сенников доктор биологических наук Н. Б. Рубцов
Ведущая организация:
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск
Защита диссертации состоится 26 сентября 2008 года в _ часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу:
ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559;
тел. (383) 336-74-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Автореферат разослан «» 2008 года
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Л. И. Карпенко
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования Согласно современным представлениям, основные события, ' определяющие временные и количественные характеристики экспрессии генов, происходят на уровне транскрипции. Транскрипцию генов контролируют регуляторные белки – транскрипционные факторы (ТФ), опознающие определенные последовательности ДНК. Такие последовательности – сайты связывания ТФ – представляют собой регуляторные элементы, формирующие регуляторные области генов.
Инициация транскрипции и её реализация зависят от взаимодействия ТФ с регуляторными элементами. Таким образом, набор регуляторных элементов генов программирует их экспрессию в онтогенезе, определяет тканеспецифичность экспрессии, а также способность отвечать на сигналы внешней и внутренней среды. В связи с этим исключительно важное значение имеют исследования, направленные на выявление отдельных регуляторных элементов в различных генах, изучение их свойств и идентификацию ТФ, взаимодействующих с данными элементами. Результаты таких структурно функциональных исследований позволяют перейти к изучению общих и ген специфических механизмов регуляции транскрипции и создают базу для решения других актуальных задач молекулярной биологии - выяснению принципов организации регуляторной зоны гена и раскрытию механизмов, обеспечивающих реализацию информации, заложенной в последовательностях ДНК этой зоны.
Интерлейкин-5 (ИЛ-5) - гомодимерный гликопротеин, секретируемый в основном активированными Т-лимфоцитами [Schwenger et al., 2000]. Впервые он был описан как фактор дифференцировки эозинофилов [Sanderson et al., 1985]. Впоследствии было показано, что ИЛ-5 регулирует продукцию эозинофилов, контролирует их дифференцировку, миграцию, активацию и продолжительность жизни in vivo и in vitro [Hogan, 2007]. Эозинофилия, повышенное содержание эозинофилов в периферической крови и тканях, как правило, сопровождается высоким уровнем экспрессии гена ИЛ-5. У животных, несущих инактивированый ген ИЛ-5, индуцировать эозинофилию не удаётся [Foster et al., 1996]. Таким образом, ИЛ-5 является одним из основных факторов, контролирующих созревание и функциональную активность эозинофилов.
Эозинофилы - это гранулярные лейкоциты, которые продуцируются в костном мозге и после недолгого пребывания в периферической крови мигрируют в ткани. Принято считать, что эти клетки представляют в системе иммунитета основное звено противопаразитарной защиты [Sanderson, 1992]. В норме содержание эозинофилов в организме человека незначительно, однако, при определенных патологиях их количество может увеличиваться в несколько раз. Следует отметить, что при паразитарных заболеваниях рост числа эозинофилов, как правило, способствует элиминации паразитов и является признаком адекватной реакции организма на, например, глистную инвазию [Voehringer, 2007]. В противоположность этому, при аллергии, в частности, астме, рост числа эозинофилов ассоциируется с обострением заболевания [Kiley et al., 2007]. Наличие этих клеток в легких астматиков связано с повреждением ткани, а их количество коррелирует со степенью поздней астматической реакции [Jacobsen et al., 2007]. Выявлена также негативная роль эозинофилов при развитии ряда аутоиммунных и злокачественных заболеваний [Di Stefano, Amoroso, 2005].
Широкая распространенность заболеваний, сопровождающихся эозинофилией, подчеркивает актуальность структурно-функционального картирования регуляторных районов гена ИЛ-5, идентификацию ТФ, определяющих активность отдельных элементов этих районов, и выяснение механизмов инициации и регуляции транскрипции гена. Не вызывает сомнений, что раскрытие системы контроля экспрессии гена ИЛ-5 будет способствовать дальнейшему прогрессу в понимании молекулярных механизмов патогенеза ряда серьёзнейших заболеваний.
На сегодняшний день одним из наиболее эффективных средств лечения заболеваний, сопровождающихся эозинофилией, являются препараты глюкокортикоидов [Hall, 2006;
Spahn, Szefler, 2007]. В результате применения этих средств у пациентов понижается содержание ИЛ-5 в легких и периферической крови [Charlesworth et al., 1991;
Greenfeder et al., 2001], в бронхиально-альвеолярных смывах падает количество Т-клеток, экспрессирующих мРНК ИЛ-5 [Robinson et al., 1993]. Однако, несмотря на широкое использование глюкокортикоидов в практической медицине, механизмы, лежащие в основе действия этих препаратов на экспрессию гена ИЛ-5, изучены далеко не полностью. В частности, до сих пор не выяснен механизм подавления транскрипции гена ИЛ-5 глюкокортикоидами, не определены причины возникновения устойчивости экспрессии гена ИЛ-5 к их действию [Inagaki et al.,2006;
Kocak et al., 2006]. Таким образом, изучение механизмов действия глюкокортикоидов на экспрессию гена ИЛ-5 остается актуальной темой молекулярной биологии. Данные, полученные в результате таких исследований, могут быть полезны как для решения задач академического характера, так и для развития прикладных исследований по созданию новых фармакологических препаратов для лечения заболеваний, сопровождающихся эозинофилией.
Установлено, что в Т-лимфоцитах экспрессия генов таких индукторов кроветворения и иммунного ответа, как ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13 и ГМ-КСФ часто происходит одновременно [Ansel et al., 2006;
Dean, 2006]. Вместе с тем известно, что существуют механизмы, позволяющие селективно регулировать экспрессию отдельных генов. Например, в отличие от активации экспрессии большинства генов цитокинов, запуск транскрипции гена ИЛ-5 зависит от синтеза белка de novo [Schwenger et al., 2002]. Таким образом, исследование структурно-функциональной организации регуляторных районов и механизмов транскрипции ИЛ-5 является важным шагом к пониманию как общих, так и ген-специфических механизмов регуляции экспрессии генов цитокинов.
Цель и задачи исследования Цель данной работы – исследование структурно-функциональной организации регуляторных районов и механизмов транскрипции генов ИЛ- человека и мыши. Для её достижения необходимо было решить следующие задачи:
- Выбрать клеточную модель для проведения масштабных экспериментов по структурно-функциональному картированию регуляторных районов и изучению механизмов активации и регуляции экспрессии гена ИЛ-5 человека.
- Провести структурно-функциональное картирование регуляторных районов генов ИЛ-5 человека и мыши.
- Идентифицировать белки, взаимодействующие с функционально активными элементами регуляторных районов и определить их роль в регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши.
- Выяснить основные механизмы инициации и регуляции транскрипции гена ИЛ-5 человека.
Основные положения работы, выносимые на защиту 1. Cтруктурно-функциональные карты регуляторных районов генов ИЛ- человека и мыши существенно различаются между собой. Кроме того, найдены различия в составе белковых комплексов, определяющих активность сходных по локализации, структуре и функции регуляторных элементов генов человека и мыши. Эти факты указывают на участие видоспецифических механизмов в системе регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши.
2. Консервативный лимфокиновый элемент 0 (CLE0) контролирует инициацию и уровень транскрипции гена ИЛ-5 человека. Ключевым транскрипционным фактором, определяющим активность CLE0, является AP-1. Функцию регулятора активности формирования комплекса CLE0/AP-1 выполняет одна из субъединиц фактора AP-1 белок Fra-2.
3. Клеточная активация индуцирует экспрессию гена, кодирующего белок Fra-2, который, в свою очередь, инициирует транскрипцию гена ИЛ-5.
Существует прямая зависимость между интенсивностью экспрессии генов Fra-2 и ИЛ-5 человека.
4. Мишенью дексаметазона в контексте регуляторных элементов гена ИЛ 5 человека является CLE0. При определённых условиях клеточной стимуляции дексаметазон индуцирует экспрессию гена, кодирующего белок GILZ (активируемый глюкокортикоидами белок лейциновая застежка, glucocorticoid-induced leucine zipper). Этот белок ингибирует активность CLE0 ИЛ-5, что и приводит к подавлению транскрипции гена.
5. Фактор транскрипции GATA-3 непосредственно участвует в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека. Вероятнее всего он действует как архитектурный фактор, обеспечивающий специфическую конформацию ДНК, т.е. постоянный контакт GATA-3 с соответствующими элементами генов необходим для создания функционально активной пространственной структуры промоторов.
Научная новизна исследования - Впервые проведено системное картирование функционально активных элементов регуляторных районов генов ИЛ-5 человека и мыши. В последовательности промоторов этих генов обнаружены новые уникальные элементы - РЭ1/2 и мРЭ1/2. Установлено, что регуляторные элементы РЭ1 и РЭ2 гена человека принимают участие в подавлении индуцированной транскрипции, а мРЭ1 и мРЭ2 гена мыши - в активации транскрипции.
- В составе 3'-нетранслируемой области гена ИЛ-5 мыши и найден новый позитивный регуляторный элемент, не имеющий аналогов в гене ИЛ- человека.
- В последовательности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека обнаружены новые элементы GATA, не имеющие аналогов в генах ИЛ-5 и ИЛ-4 мыши. Установлено, что данные регуляторные элементы участвуют в подавлении базальной и индуцированной транскрипции.
- Впервые идентифицированы ключевые белки, регулирующие экспрессию гена ИЛ-5 человека, и раскрыт механизм инициации и регуляции транскрипции гена. Показано, что элемент CLE0 контролирует запуск и интенсивность транскрипции гена ИЛ-5 человека. Основным фактором, регулирующим эти процессы, является белок Fra-2, входящий в состав CLE0 связывающего комплекса AP-1.
- Впервые показано, что механизм подавления транскрипции гена ИЛ- человека дексаметазоном связан с экспрессией глюкокортикоид индуцируемого гена, кодирующего белок GILZ. Выяснено, что этот белок блокирует активность промотора гена ИЛ-5 и его мишенью в контексте регуляторных элементов является CLE0.
- Идентифицированы белки, входящие в состав транскрипционных комплексов, участвующих в регуляции экспрессии гена ИЛ-5 мыши. В результате обнаружены существенные различия в составе факторов транскрипции, регулирующих экспрессию генов ИЛ-5 мыши и человека.
- Впервые показано, что белок GATA-3 непосредственно участвует в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека: все функционально активные элементы GATA промоторов данных генов взаимодействуют именно с этим фактором транскрипции. Впервые продемонстрировано, что элементы GATA генов цитокинов участвуют как в индукции, так и в подавлении промоторной активности.
Практическая значимость Ведущая роль ИЛ-5 в регуляции продукции и активации эозинофилов обусловливает практическую значимость исследований структурно функциональной организации регуляторных областей гена этого цитокина и механизмов, контролирующих его экспрессию. Так, на основании данных, полученных в настоящей работе можно предположить, что перспективными мишенями для фармакологических препаратов для лечения заболеваний, сопровождающихся эозинофилией, являются регуляторный элемент CLE гена ИЛ-5 человека и ядерные белки, определяющие функциональную активность этого элемента.
Практическое значение имеют также данные о различиях в структурно функциональной организации промоторов и 3’-нетранслируемых областей генов ИЛ-5 человека и мыши. Они демонстрируют, что результаты, полученные при исследовании регуляции экспрессии гена ИЛ-5 мыши, не могут адекватно отражать механизмы регуляции экспрессии ИЛ-5 человека.
И, наконец, результаты проделанной работы позволяют рекомендовать перевиваемую линию Т-клеток человека PER-117 в качестве модели для изучения механизмов активации и регуляции экспрессии генов ИЛ-5 и ИЛ- человека.
Апробация результатов диссертации и публикации Основные положения диссертации докладывались на международном симпозиуме «Интерлейкин-5, первое десятилетие» («Interleukin-5, the First Decade», Перт, Австралия, 1997), Десятом Международном иммунологическом конгрессе (Tenth International Congress of Immunology, Нью-Дели, Индия, 1998), ежегодных собраниях Биохимического Общества Великобритании (1995, 1999), международных конференциях по молекулярной и клеточной биологии в рамках программы «Keystone Symposia» (1996, 1998, 2000, 2002), международных конференциях по молекулярной и клеточной биологии, проводимых исследовательским центром Hanson Institute (Аделаида, Австралия, 1994, 1996, 1998, 2000), собраниях международного общества «International Eosinophil Society» (1997, 1999), международных школах по молекулярной и клеточной биологии (Канберра, Австралия, 1995, 1997) и других международных и национальных конференциях.
По материалам диссертации в рецензируемых отечественных и зарубежных изданиях опубликовано 20 статей.
Структура и объём работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы, содержащей результаты собственных исследований и их обсуждение, и выводов. Работа изложена на 257 страницах машинописного текста, включая 12 таблиц и 86 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 382 ссылки.
Благодарности Автор глубоко признателен профессору Colin J. Sanderson за его постоянный интерес к исследованиям, за поддержку и ценные предложения, касающиеся экспериментальной работы и интерпретации полученных данных.
На разных этапах в работе принимали участие Gretchen T. F. Schwenger, Susanne E. Peroni, Anish D. Singh, Monica Senna Salerno, Stphane Karlen, Marc A. Thomas, Rgis Fournier, Monica L. De Boer и другие сотрудники группы профессора Colin J. Sanderson – автор приносит им искреннюю благодарность.
Автор также благодарен ведущему научному сотруднику ИЦиГ СО РАН, доктору биологических наук Д. П. Фурман и старшему научному сотруднику ИЦиГ СО РАН, кандидату биологических наук А. В. Катохину за плодотворное сотрудничество при обсуждении представленных в работе результатов исследований.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выбор перевиваемой клеточной линии Экспрессия генов цитокинов – индуцибельный процесс. К началу наших исследований работа по изучению механизмов регуляции экспрессии гена ИЛ-5 человека существенно осложнялась отсутствием лимфоцитарной линии клеток человеческого происхождения, индуцибельно продуцирующей ИЛ- после стимуляции стандартными Т-клеточными активаторами. Поэтому в качестве этапа, предваряющего исследования структурно-функциональной организации промотора и механизмов регуляции экспрессии гена ИЛ- человека, был проведен поиск Т-клеточных линий человеческого происхождения, обладающих в контексте экспрессии генов лимфокинов свойствами, близкими к свойствам первичных Т-клеток. Один из основных критериев отбора линий клеток – кандидатов на роль клеточной модели нашего исследования – экспрессия в них генов ИЛ-5 и ИЛ-4 после активации культур стандартными клеточными стимуляторами.
В результате тестирования значительного числа Т-клеточных линий нам удалось найти клетки PER-117, в которых после активации происходит экспрессия генов ИЛ-5 и ИЛ-4. Как показано на рис. 1-1, в нестимулированных клетках PER-117 не удаётся выявить присутствие мРНК ИЛ-5 и ИЛ-4 (дорожка 1). Однако в образцах РНК, полученных из активированных культур, мРНК ИЛ-5 и ИЛ-4 присутствуют (дорожка 2).
Таким образом, экспрессия генов ИЛ-4 и ИЛ-5 в клетках линии PER- является индуцибельной.
Рис. 1-1. Экспрессия мРНК ИЛ-5, ИЛ-4 и -actin в интактных и активированных клетках PER-117. Клетки активированы форбол миристат ацетатом (phorbol 12 myristate 13-acetate, PMA) в комбинации с кальциевым ионофором А23187 (calcium ionophore А23187, CaI).
Определение мРНК проводилось с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) Следует отметить, что PMA активированная продукция ИЛ-5 в клетках PER-117 может быть значительно усилена с помощью ко-активаторов циклического аденозинмонофосфата (cyclic adenosine monophosphate, cAMP), CaI или анти-CD28-антител (anti-CD28 antibody, CD28) (рис. 1-2). Таким образом, аналогично продукции ИЛ-5 в первичных Т-лимфоцитах, наиболее эффективная продукция этого цитокина в клетках PER-117 достигается только с помощью стимуляции TCR-зависимого сигнального пути в комбинации с одним из дополнительных сигнальных путей клеточной активации.
Рис. 1-2. Продукция ИЛ-5 в интактных и активированных клетках PER-117:
1 – интактные культуры;
2 – стимуляция клеток с помощью PMA;
3 – PMA в комбинации с CaI;
4 – PMA в комбинации с cAMP;
5 – PMA в комбинации с CD 1 2 3 4 Важно подчеркнуть, что синтез мРНК и продукция ИЛ-5 в клетках PER 117 подавляются дексаметазоном. Интересно, что эффект дексаметазона на экспрессию гена ИЛ-5 зависит от условий клеточной активации. Дексаметазон практически полностью подавляет экспрессию этого гена в клетках, активированных PMA или PMA в комбинации с cAMP и CD28. В культурах же, стимулированных с помощью PMA в комбинации с CaI, дексаметазон лишь слабо понижает уровень синтеза мРНК и продукции ИЛ-5. Аналогичные данные были получены при исследовании эффекта дексаметазона на экспрессию гена ИЛ-5 в первичных Т-лимфоцитах человека. Эти факты в совокупности с данными по активации экспрессии гена ИЛ-5 и продукции данного цитокина в тестируемой культуре дают основания полагать, что регуляция экспрессии гена ИЛ-5 в первичных Т-лимфоцитах и клетках PER 117 осуществляется с помощью, по крайней мере, аналогичных механизмов.
Таким образом, клетки PER-117 являются хорошей моделью для изучения механизмов активации и регуляции экспрессии гена ИЛ-5 человека. Тем не менее, необходимо упомянуть, что данные о механизмах экспрессии генов, полученные при использовании этих клеток, как и любых других клеточных линий, должны быть интерпретированы достаточно осторожно, поскольку механизмы, контролирующие экспрессию генов в перевиваемых культурах, могут иметь свои особенности. Поэтому в нашей работе результаты ключевых экспериментов, проведенных с использованием клеток PER-117, всегда проверялись с помощью экспериментов, выполненных на первичных Т лимфоцитах.
2. Новые регуляторные элементы промотора гена ИЛ-5 человека Структурно-функциональное картирование регуляторных районов гена ИЛ-5 человека проводилось по следующей схеме: (i) выявление потенциальных регуляторных элементов с помощью футпринтинга и компьютерного анализа последовательности регуляторных районов;
(ii) функциональное тестирование потенциальных регуляторных элементов с использованием адресного мутагенеза и репортёрного анализа;
(iii) идентификация факторов транскрипции, участвующих в активации этих элементов, с помощью различных модификаций метода задержки ДНК-зондов в геле (electrophoretic mobility shift assay, EMSA).
В результате проделанной работы в составе регуляторной области гена, охватывающей первые 500 пар оснований промотора (п.о.), были выявлены функционально активные элементы, аналоги которых присутствуют в составе промоторов ряда других генов цитокинов. В частности, непосредственно за ТАТА-боксом между позициями -59 и -43 был локализован консервативный лимфокиновый элемент 0 (CLE0), в районе позиции -70 – элемент GATA, а в районе позиции -110 – сайт связывания NF-AT. Далее, в районах позиций - и -152 были локализованы два элемента GATA, а в районе позиции -400 ещё один элемент GATA. Столь «настойчивое» повторение этого мотива может говорить о важной роли элементов GATA в регуляции транскрипции гена ИЛ 5. Поэтому исследованию роли элементов GATA в регуляции активности промотора гена ИЛ-5 была посвящена отдельная работа, результаты которой изложены в следующем разделе.
Помимо вышеупомянутых элементов в составе исследуемого фрагмента промотора нам удалось обнаружить два новых регуляторных элемента, РЭ1 и РЭ2. РЭ1 расположен между позициями -90 и -79 в проксимальной области промотора (последовательность CCATTATTAGGC). РЭ2 находиться в дистальной части промотора между позициями -559 и - (последовательность TGGCAGTTTCCAT). Мутации последовательностей, участвующих в составе этих элементов во взаимодействии с ядерными белками, приводят к усилению активности промотора в стимулированных культурах первичных Т-лимфоцитов и клетках PER-117 (рис. 2-1 и 2-2).
Следовательно, новые элементы обладают способностью подавлять активность промотора гена ИЛ-5 человека. Поскольку функции РЭ1 и РЭ проявляются только в условиях клеточной стимуляции, эти элементы участвуют в репрессии индуцированной активности промотора гена ИЛ-5.
РЭ Рис. 2-1. А - замены в последовательности РЭ1;
Б - экспрессия репортёрных конструкций, содержащих замены в последовательности РЭ1, в PMA/cAMP активированных клетках PER-117.
Пояснения: репортёрная конструкция -281/+18 несёт фрагмент гена ИЛ- человека, расположенный между позициями -281 и + Относительная активность люциферазы (%) Рис. 2-2. Экспрессия базовой (-508/+18) и модифицированных (пК1м, пК3м и пК1/3м) репортёрных конструкций, несущих замены в последовательности РЭ2, в PMA/CaI активированных клетках PER-117. Приведены данные трёх независимых экспериментов:
эксперимент 1;
- 2;
- 3.
Активность люциферазы в стимулированных культурах выражена относительно активности люциферазы в нестимурованных культурах Регуляторные области многих генов цитокинов содержат элементы, участвующие в блокаде базальной и индуцированной активности промоторов [Blom et al., 2006]. Довольно часто репрессорные элементы расположены в проксимальной части промоторов в непосредственной близости от регуляторных последовательностей, участвующих в активации транскрипции [Tsuruta et al., 1998]. Один из обнаруженных нами репрессорных элементов, РЭ1, обладает «классической» локализацией: 3’-область этого элемента граничит с блоком GATA/CLE0, а 5’-область с блоком GATA/NF-AT, активаторами транскрипции гена ИЛ-5. Расположение же второго репрессора, РЭ2, несколько необычно, - он удалён от насыщенного регуляторными элементами проксимального промотора более чем на 300 п.о.
Идентификация репрессорных элементов существенно дополняет структурно-функциональную карту промотора гена ИЛ-5 и позволяет по новому взглянуть на возможные механизмы регуляции экспрессии гена. Так, учитывая локализацию РЭ2, можно предположить, что в реализации механизмов регуляции транскрипции этого гена существенную роль играет пространственная структура промотора.
При идентификации факторов транскрипции, входящих в состав ДНК белковых комплексов РЭ1 и РЭ2, было выяснено, что оба элемента взаимодействуют с фактором YY1 (рис. 2-3) – многофункциональным ядерным белком, способным как активировать, так и репрессировать промоторы различных генов [Shi et al., 1997].
Проба РЭ Проба РЭ Рис. 2-3. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с РЭ1 и РЭ2 с использованием EMSA. А: РЭ1 - факторы транскрипции Oct1 и YY1 участвуют в образовании комплексов C1 и C3;
Б: РЭ2 - факторы транскрипции NF-AT и YY входят в состав комплексов K1 и K Следует отметить, что YY1 участвует в регуляции экспрессии генов ряда цитокинов и действует при этом как репрессор транскрипции [Ye et al., 1996a;
Ye et al., 1996b]. В состав ДНК-белковых комплексов РЭ1 входит также фактор Oct-1. В некоторых случаях этот белок проявляет свойства репрессора промоторной активности [Hoppe-Seyler et al., 1991;
Delhase et al., 1996], однако, в основном он выполняет функции активатора транскрипции [Scholer et al., 1991]. Вместе с YY1 в состав ДНК-белковых комплексов РЭ2 входит фактор транскрипции NF-AT. Согласно данным различных авторов, NF-AT является активатором транскрипции и играет важную роль в регуляции экспрессии многих генов цитокинов, в число которых входит и ИЛ-5 [De Boer et al., 1999].
Таким образом, в число факторов, взаимодействующих с РЭ1 и РЭ2, входят репрессор активности промоторов генов цитокинов YY1 и два активатора транскрипции этих генов, Oct-1 и NF-AT. Можно предположить, что в составе ДНК-белковых комплексов РЭ1 и РЭ2 YY1 сохранил свою функцию репрессора, однако, функции Oct-1 и NF-AT неясны. В пределах каждого регуляторного элемента мотив связывания YY1 перекрывается с мотивами связывания Oct-1 или NF-AT. Интересно, что такие комбинации транскрипционных факторов являются уникальными. Не исключено, что эта уникальность может отражать особые механизмы регуляции транскрипции гена ИЛ-5.
3. Роль фактора транскрипции GATA-3 в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 и ИЛ-4 человека Как упоминалось в разделе 2, на сравнительно небольшом расстоянии от старта транскрипции в составе промотора гена ИЛ-5 человека расположены три элемента GATA, ещё один такой сайт находится в дистальной области промотора. К началу нашей работы роль элементов GATA в регуляции активности промоторов генов ИЛ-5 человека оставалась неясной, что и послужило мотивацией для следующей работы.
3.1. Функции GATA-3-связывающих элементов в регуляции активности промотора гена ИЛ-5 человека При идентификации белков, формирующих комплексы с элементами GATA промотора гена ИЛ-5, было выяснено, что сайты -70, -152 и - взаимодействуют с транскрипционным фактором GATA-3 (рис. 3-1). Сайт GATA-128 промотора гена ИЛ-5 не формирует комплексы с ядерными экстрактами из клеток PER-117.
При оценке функциональной активности элементов GATA, расположенных в промоторе гена ИЛ-5 человека, было обнаружено, что элементы GATA-70 и GATA-152 участвуют в активации промотора, GATA 128 не обладает функциональной активностью, а GATA-400 принимает участие в подавлении базальной и индуцированной активности промотора (рис. 3-2).
Проба GATA- Проба GATA-70 Проба GATA- Рис. 3-1. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с мотивами GATA гена ИЛ-5 человека. Олигонуклеотиды, соответствующие мотивам GATA в районах позиций -70, -152 и -400, обозначены -70, -152 и -400. Олигонуклеотиды, содержащие консенсусные мотивы связывания факторов GATA, Octamer, C/EPB, AP-1 и AP-2, обозначены GATA, Octamer, C/EPB, AP-1 и AP- В Б А Проба GATA- 1 5 1 3 4 Рис. 3-2. Влияние замен в последовательности сайтов GATA-70 (А), GATA-128(Б), GATA-152(Б) и GATA-400 (В) на активность промотора гена ИЛ-5 человека:
экспрессия репортёрных конструкций в нестимулированных (чёрные столбцы) и PMA/cAMP-активированных (серые столбцы) клетках PER-117. Репортёрные конструкции: 1 – базовая (-508/+18);
2 - мутация сайта GATA-70;
3 - мутация сайта GATA-128;
4 - мутация сайта GATA-152;
5 - мутация сайта GATA-400 в кодирующей цепи, 6 – в некодирующей цепи, 7 – в двух цепях Таким образом, в результате тестирования функциональной активности четырех элементов GATA промотора гена ИЛ-5 человека были получены данные, указывающие на то, что фактор GATA-3 непосредственно участвует в регуляции транскрипции гена ИЛ-5 человека. Действительно, единственный неактивный в отношении регуляции транскрипции элемент, GATA-128, не взаимодействует с GATA-3. Остальные элементы связывают этот фактор и обладают определёнными функциями в контексте тестируемого фрагмента промотора гена ИЛ-5. Элементы GATA-70 и GATA-152 являются активаторами транскрипции, элемент GATA-400 проявляет свойства репрессора базальной и индуцированной активности промотора. Полярное различие функций элементов GATA, находящихся в составе одного промотора, явление необычное. Является ли это особенностью промотора гена ИЛ-5 или элементы GATA промоторов других генов лимфоцитарных цитокинов обладают такими же характеристиками? Чтобы ответить на этот вопрос мы исследовали роль элементов GATA в регуляции активности промотора гена ИЛ-4 человека.
3.2. Функции GATA-3-связывающих элементов в регуляции активности промотора гена ИЛ-4 человека В результате компьютерного анализа регуляторной области гена ИЛ- человека, расположенной между позициями -1075 и +66, было обнаружено несколько потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов семейства GATA. При тестировании этих сайтов в экспериментах по определению белок связывающей активности было выяснено, что элементы, расположенные между позициями -274/-269 и -860/-852, взаимодействуют с ядерными белками из клеток PER-117 и первичных Т-лимфоцитов. Сайты были названы GATA(-)274 и GATA(-)860. Было установлено, что в состав ДНК-белковых комплексов, образованных этим элементами и ядерными экстрактами входит фактор транскрипции GATA-3.
При функциональном тестировании элемента GATA(-)274 было показано, что этот сайт участвует в активации промотора гена ИЛ-4 человека.
Однако при исследовании функциональной активности дистального элемента GATA были получены совершенно иные результаты. Мутация последовательности GATA(-)860 и делеция фрагмента ДНК, содержащего этот элемент, существенно увеличивали эффективность экспрессии репортёрных конструкций. Активность люциферазы в клетках, трансфицированных конструкциями пИЛ4GATA(-)860мут и пИЛ4GATA( )860дел, в 3-7 раз превышала активность репортёрного белка в клетках, трансфицированных пИЛ4бк (рис. 3-3).
Рис. 3-3. Активность люциферазы в культурах клеток PER-117 и Jurkat, трансфицированных Клетки PER-117 конструкциями, экспрессирующим репортёрный ген под контролем промотора гена ИЛ-4 человека.
Конструкции:
1, пИЛ4бк - содержит фрагмента гена ИЛ- человека, расположенный между позициями -1075 и +60;
2, пИЛ4(-)860мут отличается от пИЛ4бк мутацией мотива GATA в Клетки Jurkat последовательности элемента GATA(-)860, мутация блокирует белоксвязывающую активность сайта;
3, пИЛ4(-)860дел содержит фрагмента гена ИЛ-4 человека, расположенный между позициями –744 и +60.
Обозначения: нс - нестимулированные культуры;
PMA, cAMP, CaI, CD28 – культуры, стимулированные соответствующими активаторами Важно отметить, что мутация GATA(-)860 и делеция этого элемента увеличивают активность репортёрных плазмид не только в стимулированных, но и в нестимулированных культурах PER-117 и Jurkat. Это означает, что элемент GATA(-)860 участвует в репрессии как базальной, так и индуцированной активности промотора ИЛ-4. Поскольку GATA(-) взаимодействует с фактором транскрипции GATA-3 в интактных культурах и клеточная активация мало влияет на интенсивность этого взаимодействия, можно заключить, что данный фактор является компонентом механизма, сдерживающего базальную активность промотора ИЛ-4 и подавляющего индуцированную транскрипцию гена.
Итак, при исследовании функциональной активности GATA-3 связывающих элементов генов ИЛ-4 и ИЛ-5 человека были получены неоднозначные результаты. Так, установлено, что мотивы GATA-860 гена ИЛ 4 и GATA-400 гена ИЛ-5 участвуют в репрессии индуцированной и базальной активности промоторов. Таким образом, складывается впечатление, что GATA-3 может действовать как транскрипционный репрессор ИЛ-4 и ИЛ-5.
Однако это заключение противоречит нашим же данным о позитивной роли GATA-3-связывающих элементов в активации транскрипции этих генов.
Действительно, GATA-70 и GATA-152 промотора ИЛ-5, также как и GATA 274 промотора ИЛ-4 являются активаторами транскрипции. Кроме того, супрессорный эффект GATA-3 на транскрипцию ИЛ-4 и ИЛ-5 не согласуется с устоявшимися представлениями о важнейшей роли этого белка в экспрессии генов цитокинов в T-хелперах типа 2 (Tх2) [Murphy, Reiner, 2002].
Возникшее противоречие можно разрешить с помощью модели, в которой GATA-3 рассматривается как архитектурный фактор, обеспечивающий специфическую конформацию ДНК. В этом случае постоянный контакт GATA-3 с соответствующими элементами гена необходим для создания функционально активной пространственной структуры промотора. Разрушение одного из сайтов связывания GATA- будет вести к частичному изменению такой структуры, что может выражаться в изменении эффективности действия активаторов или репрессоров транскрипции, действующих как через регуляторные элементы промотора, так и через последовательности, расположенные в других областях кластера генов Tх2 цитокинов. В наших экспериментах были использованы фрагменты промоторов, содержащие комплекс регуляторных элементов, среди которых есть репрессоры и активаторы. Вполне вероятно, что мутация дистального мотива GATA резко понижает или отменяет действие транскрипционных репрессоров, например, РЭ1 и РЭ2 гена ИЛ-5 (раздел 2) и P2 NRE, NRE-I и NRE-II гена ИЛ-4 [Li-Weber et al., 1992]. В отличие от этого, мутации GATA сайтов, расположенных в проксимальных областях промоторов, ослабляют эффект активаторов транскрипции, например, CLE0 ИЛ-5 [Stranick et al., 1995;
Thomas et al., 1999] и элемента P гена ИЛ-4 [Aune et al., 2001]. Такая модель действия GATA-3 полностью согласуется с общепринятыми представлениями об участии этого белка в инициации реконструкции хроматина для формирования транскрипционного профиля Tх2 и регуляции экспрессии генов Tх2 цитокинов.
4. Идентификация белков, регулирующих активность консервативного лимфокинового элемента 0 (CLE0) генов ИЛ-5 человека и мыши Идентификацию белков, взаимодействующих с CLE0 гена ИЛ- человека, проводили с помощью EMSA ядерных экстрактов из клеток PER 117 и олигонуклеотида CLE0о, последовательность которого соответствовала последовательности промотора гена ИЛ-5 человека между позициями -59 и 38. Ядерные экстракты были получены из интактных клеток и культур PER 117, активированных PMA в комбинации с CaI.
Как показано на рис. 4-1А, ядерные экстракты из нестимулированных клеток и CLE0о формируют два комплекса, CI и CIII (дорожка 1). Активация клеток не влияет на образование комплекса CI, однако значительно усиливает формирование CIII (дорожка 2). Клеточная стимуляция индуцирует также и образование третьего ДНК-белкового комплекса CII (дорожка 2).
Формирование этого комплекса полностью зависит от стимуляции клеток PER-117.
Б А Рис. 4-1. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с CLE0 гена ИЛ- человека. А - EMSA с использованием конкурентных олигонуклеотидов (CLE0о, олигонуклеотиды, содержащие консенсусные мотивы связывания факторов транскрипции AP-1, Octamer и NF-AT). Б - EMSA с использованием антител к факторам транскрипции (пояснения в тексте) Антитела, специфические к белку Oct-1, полностью блокируют формирование комплекса CI (рис. 4-1Б, дорожка 2), а антитела к фактору Oct-2 изменяют электрофоретическую подвижность комплекса CIII (дорожка 3). Следовательно, Oct-1 входит в состав комплекса CI, а CIII содержит Oct-2.
Как показано на рис. 4-1Б, антитела, распознающие все белки семейства Jun (a-Jun) значительно подавляют интенсивность формирование комплекса CII (дорожка 4). Среди антител, специфических к индивидуальным белкам Jun, сходным эффектом обладают только антитела к Jun D (дорожка 7).
Антитела, распознающие все белки семейства Fos, также значительно подавляют формирование комплекса CII (дорожка 8). Среди антител, специфических к индивидуальным белкам Fos, подобным образом действуют только антитела к Fra-2 (дорожка 12). Следовательно, комплекс CII содержит фактор транскрипции AP-1, состоящий из белков Jun D и Fra-2.
Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что ядерные белки клеток PER-117 и CLE0 ИЛ-5 человека формируют комплексы, содержащие транскрипционные факторы AP-1 (Jun D/Fra-2), Oct-1 и Oct-2.
Такие же комплексы формируют с CLE0 ИЛ-5 человека и ядерные белки первичных Т-клеток здоровых доноров.
Для верификации белоксвязывающих мотивов CLE0 ИЛ-5 человека были использованы олигонуклеотиды, содержащие замены в последовательности CLE0 (рис. 4-2A).
А Рис. 4-2. Верификация белок связывающих мотивов CLE0 ИЛ- человека:
А - олигонуклеотиды, содержащие замены последовательности CLE0;
Б – влияние замен в Б последовательности CLE0 на формирование ДНК-белковых комплексов.
В EMSA использованы ядерные экстракты из интактных (-) и активированных (+) клеток PER- Как показано на рис. 4-2Б, замена триплета AAA, расположенного между позициями -58 и -56, на CTC (проба Мl) приводит к значительному подавлению взаимодействия пробы с факторами Oct-1 и Oct-2, но не влияет на формирование комплекса AP-1(CII). Замена TCA на CTC между позициями 51 и -49 (проба M3) не оказывает влияния на формирование Oct-1 и Oct- содержащих комплексов, однако, эта мутация значительно подавляет формирование комплекса AP-1. В олигонуклеотиде M4 сохранена целостность всех мотивов взаимодействия CLE0 с факторами транскрипции, входящими в состав CI-III. Таким образом, можно заключить, что хотя мотивы связывания факторов Octamer и AP-l в составе последовательности CLE0 ИЛ-5 человека перекрываются (проба M2), это не помешает созданию изменённых вариантов CLE0, образующих комплексы только с одним из транскрипционных факторов.
Для оценки функциональной значимости белоксвязывающих мотивов CLE0 ИЛ-5 человека на основе базовой конструкции -281/+18, несущей фрагмент гена ИЛ-5 человека, расположенный между позициями -281 и +18, были выполнены плазмиды Octmut, APlmut и Controlmut, содержащие те же замены, что и олигонуклеотиды Ml, M3 и M4 (рис. 4-2A).
Мутации CLE0 не влияют на активность репортёрных конструкций в нестимулированных клетках. Однако после клеточной стимуляции активность экспрессии плазмид, содержащих замены в последовательности CLE0, включая Controlmut, составила всего 10 % от активности экспрессии конструкции -281/+18 (рис. 4-3). Эти данные указывают на то, что мутации в пределах CLE0 приводят к практически полной потере активности промотора.
Следовательно, вся последовательность CLE0 - белоксвязывающие мотивы и участки, не вовлечённые в прямое взаимодействие с факторами транскрипции, - играет важнейшую роль в активации промотора гена ИЛ-5 человека.
Рис. 4-3. Экспрессия репортёрных конструкций, содержащих замены в последовательности CLE0 ИЛ-5 человека, в клетках PER-117.
Пояснения в тексте Роль AP-1 в регуляции экспрессии генов цитокинов изучена достаточно подробно. Как следует из названия этого фактора – активирующий белок 1, AP-1 является активатором транскрипции. В противоположность этому, данные о роли факторов Octamer в регуляции экспрессии цитокинов неоднозначны и не позволяют связать эти белки только с одной функцией в отношении контроля транскрипции различных генов. Присутствие Oct-1 и Oct-2 в транскрипционном комплексе CLE0 нами обнаружено впервые и функция данных белков в регуляции активности промотора гена ИЛ- человека не ясна.
В экспериментах по исследованию роли транскрипционных факторов Oct-1 и Oct-2 в активации CLE0 ИЛ-5 помимо репортёрных конструкций были также использованы экспрессионные векторы pCG-Oct-1 и pCG-Oct-2, содержащие кДНК Oct-1 и Oct-2. Экспрессия данных плазмид в клетках PER 117 и Jurkat ведёт к существенному повышению содержания белков Oct-1 и Oct-2 в ядерных экстрактах, полученных из этих культур. Показано, что избыточная продукция факторов Oct-1 и Oct-2 приводит к усилению активности промотора гена ИЛ-5 человека. Таким образом, факторы Oct-1 и Oct-2 действуют как активаторы транскрипции этого гена. Следует отметить, что белок Oct-2 обладает более значительным эффектом, чем Oct-1.
При идентификации белков, взаимодействующих с CLE0 гена ИЛ- мыши, было установлено, что этот элемент обладает сходной белоксвязывающей активностью с CLE0 ИЛ-5 человека. В состав комплексов, образованных CLE0 ИЛ-5 мыши и ядерными белками из перевиваемой Т клеточной линии мыши EL4 и из первичных Т-лимфоцитов мыши, входят транскрипционные факторы Oct-1, Oct-2 (рис. 4-4, дорожки 2 и 3) и AP-1.
Однако составы комплексов AP-1 CLE0 ИЛ-5 человека и мыши различаются, последний образован белками FosB и JunB (дорожки 4 и 6).
Рис. 4-4. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с CLE0 ИЛ-5 мыши.
EMSA ядерных экстрактов из активированных клеток EL4 и олигонуклеотидной пробы, соответствующей CLE0 ИЛ-5 мыши, с использованием антител к факторам транскрипции. Стрелкой указан дополнительный комплекс (дорожки 3, 4 и 6) 1 2 3 4 5 6 Определение роли факторов Oct-1 и Oct-2 в регуляции транскрипции гена ИЛ-5 мыши было также проведено с использованием репортёрных и экспрессионных конструкций. В результате было установлено, что избыточная продукция факторов Oct-1 и Oct-2 в клетках EL4 приводит к усилению активности промотора гена ИЛ-5 мыши. Однако в отличие от системы регуляции экспрессии гена человека, где ведущая роль принадлежит белку Oct-2, при активации экспрессии гена мыши эффект Oct- представляется более мощным, чем Oct-2.
Результаты, полученные при проведении идентификации факторов транскрипции, определяющих активность CLE0 ИЛ-5, позволили существенно пополнить наши знания о системе регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши. Установлено, что в интактных клетках CLE ИЛ-5 взаимодействует с белками, принадлежащими к семейству факторов транскрипции Octamer, - широко распространенным Oct-1 и лимфоцит специфическим Oct-2. Клеточная стимуляция значительно усиливает связывание Oct-2 и CLE0, но не влияет на взаимодействие этого элемента с Oct-1. Оба фактора являются активаторами транскрипции генов и обладают определённой видовой «тропностью». Для гена человека более мощным активатором является Oct-2, для гена мыши - Oct-1.
Следует отметить, что стимуляция клеток индуцирует взаимодействие CLE0 с фактором AP-1. Субъединичный состав AP-1 также представляется видоспецифичным: CLE0 ИЛ-5 человека связывает комплекс белков Jun D и Fra-2, CLE0 ИЛ-5 мыши - FosB и JunB.
5. Регуляторные элементы гена ИЛ-5 мыши Изложенные выше данные указывают на возможность участия в системе регуляции транскрипции генов ИЛ-5 человека и мыши видоспецифических механизмов. Если это действительно так, то структурно-функциональная организация регуляторных районов этих генов может существенно различаться. Для проверки этого предположения был проведен поиск новых регуляторных элементов гена ИЛ-5.
5.1. Новые регуляторные элементы промотора гена ИЛ-5 мыши С помощью компьютерного анализа промотора гена ИЛ-5 мыши были обнаружены потенциальные регуляторные элементы, гомологичные РЭ1 и РЭ2 гена ИЛ-5 человека. Новые элементы были названы мРЭ1 и мРЭ2.
Аналогично РЭ1 и РЭ2 они расположены между позициями -79/-90 и -459/ 470 соответственно. Оба элемента содержат идентичные инвертированные повторы в 3 п.о., фланкирующие специфические для каждого элемента последовательности размером 5 п.о.
Функциональная Таблица 1. Последовательности модифицированных мРЭ активность потенциальных и мРЭ2, находящихся в составе репортёрных конструкций регуляторных элементов была исследована с помощью адресного мутагенеза и репортёрного анализа. В этой работе мы использовали базовую конструкцию mIL5wt-Luc, содержащую первые 1700 п.о. промотора гена ИЛ-5 мыши [Campbell et al., 1987]. На основе данной конструкции была создана коллекция репортёрных плазмид с различными заменами в последовательности промотора (таблица 1).
Как показано на рис. 5-1, мутация в левом плече мРЭ1 приводит к значительному снижению активности промотора. Мутация левого плеча элемента мРЭ2 также существенно понижает активность промотора. Однако замены в правых плечах элементов мРЭ1 и мРЭ2 оказывают незначительное влияние на активность промотора. Слабое влияние на активность промотора оказывает и замена пары нуклеотидов, расположенной выше инвертированных повторов мРЭ1 и мРЭ2.
Рис. 5-1. Экспрессия репортёрных конструкций, содержащих замены в последовательности мРЭ1 и мРЭ2, в клетках EL4. Пояснения в тексте Полученные данные позволяют заключить, что левые части палиндромных последовательностей мРЭ1 и мРЭ2 входят в состав регуляторных элементов, участвующих в активации промотора гена ИЛ- мыши. Таким образом, мРЭ1 и мРЭ2 выполняют функции, противоположные функциям РЭ1 и РЭ2, аналогов этих элементов промотора гена ИЛ-5 человека.
5.2. Новый регуляторный элемент 3'-нетранслируемой области гена ИЛ- мыши В результате компьютерного анализа последовательности гена ИЛ- мыши в области расположения сайта полиаденилирования был обнаружен потенциальный регуляторный район. В последовательности этого района между позициями +4539 и +4578 расположены четыре прямых повтора ATGAATGA (рис. 5-2). Первый и последний повторы отделены от двух центральных повторов четырьмя нуклеотидами и последовательность этого фрагмента гена в целом выглядит симметричной. Весьма существенно, что фрагмент содержит мотивы, имеющие сходство с последовательностями канонических сайтов связывания факторов транскрипции AP-1, Octamer, GATA и c-Ets. Как описано в предыдущих разделах, AP-1, Oct-1, Oct-2 и GATA-3 являются важнейшими факторами, регулирующими транскрипцию гена ИЛ-5 человека. Поэтому логично было предположить, что данный район 3'-нетранслируемой области может участвовать в регуляции транскрипции гена ИЛ-5 мыши.
Рис. 5-2. Схема фрагмента гена ИЛ-5 мыши в составе базовой репортёрной конструкции.
Обозначения: HindIII (H)/BamHI (B) - фрагмент гена ИЛ-5 мыши [Campbell et al., 1988];
регуляторные элементы гена ИЛ-5 мыши - CLE0, мРЭ1, мРЭ1 и м3' ПЭ (РС I/III, повторы ATGAATGA обведены);
- экзоны, alu пов-ры – alu повторы;
репортёр - ген люциферазы. Конструкция выполнена на основе вектора p-Poly-III Косвенное подтверждение того, что последовательность, содержащая прямые повторы ATGAATGA, может содержать регуляторные элементы, было получено в результате футпринтинга 3'-нетранслируемой области гена ИЛ-5 мыши. Оказалось, что кодирующая и некодирующая цепи ДНК этого фрагмента гена обладают способностью взаимодействовать с ядерными белками клеток EL4. Район связывания с ядерными белками 3' нетранслируемой области, содержащий повторы ATGAATGA, обозначен как м3’-ПЭ (рис. 5-2). Делеция этого района из базовой репортёрной конструкции, содержащей фрагмент гена ИЛ-5 мыши размером 9.5 kb (рис. 5-2), приводила к 3-х кратному падению уровня экспрессии репортёрного гена (таблица 2).
Эти данные однозначно свидетельствуют о том, фрагмент гена, расположенный между позициями +4539 и +4585 содержит новый регуляторный элемент, принимающий участие в активации транскрипции гена ИЛ-5 мыши.
Таблица 2. Результаты пяти независимых экспериментов по исследованию экспрессии базовой конструкции и конструкции с делецией повторов ATGAATGA в активированных При идентификации факторов транскрипции, входящих в состав ДНК белковых комплексов м3’-ПЭ, были использованы ядерные экстракты из клеток EL4 и первичных лимфоцитов мыши. Оказалось, что Oct-1 участвует в формировании комплекса C1, AP-1 в формировании C2, а Oct-2 входит в состав C3 (рис. 5-3).
Рис. 5-3. Идентификация ядерных белков, взаимодействующих с м3’-ПЭ.
EMSA ядерных экстрактов из активированных клеток EL4 и олигонуклеотидной пробы, соответствующей м3’-ПЭ, с использованием антител к факторам транскрипции При проведении компьютерного анализа последовательности 3' нетранслируемой области гена ИЛ-5 человека мы не обнаружили мотивов, обладающих сходством с м3’-ПЭ. Футпринтинг 3'-нетранслируемой области гена человека также не выявил сайтов, взаимодействующих с ядерными белками Т-клеток. Негативный результат был получен и при компьютерном скрининге последовательностей интронов гена ИЛ-5 человека.
Таким образом, результаты проведенных исследований продемонстрировали наличие существенных различий в функциональной и структурной организации регуляторных областей генов ИЛ-5 мыши и человека. Ярким примером функциональных различий структурно схожих районов промоторов являются элементы мРЭ1/2 и РЭ1/2. Действительно, последовательности и локализация этих элементов весьма консервативны для генов ИЛ-5 мыши и человека. Однако в контексте промотора гена мыши мРЭ1/2 действуют как активаторы транскрипции, в составе промотора гена человека они выполняют функции транскрипционного репрессора. Очевидно, что причиной полярного различия функций являются регуляторные белки, взаимодействующие с этими элементами. К сожалению, нам не удалось идентифицировать факторы, активирующие мРЭ1/2. Однако данные предварительного анализа позволяют предположить, что такими факторами могут быть NF-kB подобные белки. Участие белков семейства NF-kB в активации экспрессии генов цитокинов хорошо документировано [Kulms et al., 2006]. Таким образом, данные предварительного анализа факторов транскрипции, активирующих мРЭ1/2, согласуются с результатами функционального тестирования этих элементов промотора.
Кроме того, следует обратить внимание, что состав и локализация регуляторных элементов генов мыши и человека существенно различается.
Так, в 3'-нетранслируемой области гена мыши расположен позитивный регуляторный элемент;
3'-нетранслируемая область гена человека не содержит аналогов этого элемента. Элемент GATA-400, обнаруженный в составе промотора гена человека (раздел 3.1), не имеет аналогов в последовательности гена мыши. В последовательности гена человека между позициями -244 и - локализован сайт связывания белков Octamer, участвующий в активации промотора [Mordvinov, Sanderson, 2001]. В соответствующем районе промотора гена мыши такой сайт отсутствует.
Вышеизложенные факты указывают на то, что механизмы регуляции экспрессии генов ИЛ-5 мыши и человека, по крайней мере, не идентичны.
Очевидно, различные виды нашли отличающиеся пути тонкой регуляции продукции ИЛ-5. Таким образом, экспериментальные данные, полученные при использовании клеток мыши, не всегда могут адекватно отражать механизмы регуляции экспрессии ИЛ-5 в клетках человека.
6. Механизмы регуляции транскрипции гена ИЛ-5 человека ИЛ-5 принадлежит к семейству индукторов кроветворения и иммунного ответа, членами которого являются также ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-13 и ГМ-КСФ [Lampinen et al., 2004]. Гены, кодирующие эти белки, расположены на участке q31 хромосомы 5 человека и соответствующем районе 11-ой хромосомы мыши [McKenzie et al., 1993;
Willman et al., 1993]. В активированных Т лимфоцитах (субпопуляции Тх0 и Тх2) эти гены могут экспрессироваться одновременно [Abbas et al., 1996;
Stranick et al., 1997] и в литературе часто встречается выражение «активация экспрессии локуса Тх2 цитокинов» [Ansel et al., 2006;
Dean, 2006]. Однако есть факты, указывающие на то, что помимо системы инициации экспрессии всех генов данного локуса, существуют регуляторные механизмы, позволяющие адресованно индуцировать экспрессию отдельных генов, в частности, экспрессию гена ИЛ-5. Так, при скрининге аллореактивных Т-клеточных клонов, абсолютное большинство которых продуцировало широкий спектр лимфокинов, были обнаружены клоны, продуцирующие только ИЛ-5 [Warren et al., 1985]. При изучении эффекта цитокинов на первичные Т-клетки было показано, что стимуляция лимфоцитов с помощью ИЛ-2 индуцирует синтез мРНК ИЛ-5 и не влияет на экспрессию генов ИЛ-4 и ГМ-КСФ, ближайших соседей ИЛ-5 по локусу 5q - хромосомному локусу Тх2 цитокинов [Bohjanen et al., 1990]. При работе с Т клетками периферической крови пациентов, страдающих инфекционно аллергической формой бронхиальной астмы, установлено, что эти клетки секретируют повышенное количество ИЛ-5, в то время как уровень продукции других лимфокинов остаётся на низком уровне [Corrigan et al., 1992]. Таким образом, ген ИЛ-5 далеко не всегда ко-экспрессируется с генами других Тх цитокинов. Это подразумевает существование селективного контроля экспрессии отдельных генов лимфокинов или, по крайней мере, специфического контроля экспрессии гена ИЛ-5.
6.1. Механизм инициации транскрипции гена ИЛ-5 человека Инициация экспрессии большинства генов лимфокинов, в частности, активация синтеза мРНК не зависит от синтеза белка de novo. К этому большинству относятся и гены цитокинов, расположенные в локусе 5q31.
Исключением является лишь ген ИЛ-5. В ряде работ было показано, что индукция синтеза мРНК ИЛ-5 в первичных Т-клетках невозможна без синтеза белка de novo [Van Straaten et al., 1994;
Stranick et al., 1995;
Naora et al., 1995].
Рис. 6-1. Влияние CHX на синтез мРНК ИЛ-4, ИЛ-5 и -actin в интактных и активированных клетках PER-117 (пояснения в тексте) Важно отметить, что зависимость инициации экспрессии гена ИЛ-5 от синтеза белка de novo сохранена и в клетках PER-117. Как показано на рис. 6 1, с помощью ОТ-ПЦР не удаётся обнаружить мРНК ИЛ-5 или ИЛ-4 в интактных клетках PER-117 (дорожка 1). Стимуляция клеток с помощью PMA в комбинации с CaI индуцирует синтез этих мРНК (дорожка 2).
Ингибитор белкового синтеза циклогексимид (cycloheximid, CHX) полностью блокирует активацию синтеза мРНК ИЛ-5, но не влияет на синтез мРНК ИЛ- (дорожка 3). Не влияет CHX и на синтез мРНК ИЛ-3, ИЛ-13 и ГМ-КСФ в клетках PER-117. Таким образом, инициация транскрипции гена ИЛ-5 в клетках PER-117 и первичных Т-клетках проходит, скорее всего, по сходным сценариям и наша клеточная модель может быть использована для исследования механизмов специфической регуляции экспрессии ИЛ-5.
Как упоминалось, CLE0 играет исключительно важную роль в активации промотора гена ИЛ-5 (рис. 4-2). Следовательно, мы вправе предположить, что именно с этим элементом с наибольшей вероятностью должны взаимодействовать регуляторные белки, участвующие в инициации экспрессии гена ИЛ-5.
Экспрессия ИЛ-5 в клетках PER-117 может быть активирована с помощью реагентов, стимулирующих различные сигнальные пути (рис. 1-2).
Не исключено, что условия клеточной стимуляции влияют на белковый состав транскрипционного комплекса CLE0. В этом случае наиболее вероятным кандидатом на роль основного активатора транскрипции гена будет фактор, взаимодействие которого с CLE0 индуцируется в условиях всех используемых нами вариантов клеточной стимуляции.
При идентификации факторов транскрипции, связывающих CLE0 ИЛ- человека при различных условиях клеточной активации, было выяснено, что Oct-1-содержащий комплекс является конститутивным и образуется как в реакциях с ядерными белками из нестимулированных клеток, так и при исследовании экстрактов из активированных клеток (рис. 6-2). Следует отметить, что ни один из использованных вариантов клеточной стимуляции не влияет на интенсивность формирования Oct-1-содержащего комплекса.
Рис. 6-2. Влияние условий клеточной стимуляции и CHX на кинетику формирования комплексов CLE0 ИЛ- человека и ядерных белков из культур PER- (авторадиограммы с ядерными экстрактами, полученными из CHX-обработанных клеток, были переэкспонированы по сравнению с другими авторадиограммами) Комплекс, содержащий фактор транскрипции AP-1, является индуцибельным. Условия клеточной активации не влияют на субъединичный состав этого комплекса - во всех случаях он состоит из белков JunD и Fra-2.
Комплекс, содержащий Oct-2, также является индуцибельным, однако, он формируется не при всех условиях клеточной стимуляции. Так, этот комплекс не образуется при PMA/cAMP активированной экспрессии ИЛ-5 (рис. 6-2).
Таким образом, индуцибельным компонентом транскрипционного комплекса CLE0, присутствующим при всех условиях клеточной стимуляции, является AP-1. Эти данные говорят о ключевой роли данного фактора в регуляции экспрессии гена ИЛ-5.
При исследовании кинетики формирования комплекса AP-1 было обнаружено, что интенсивность его образования зависит от условий клеточной стимуляции (рис. 6-2). PMA является слабым индуктором взаимодействия CLE0 с белками. Интенсивность формирования PMA активированного комплекса AP-1 нарастает медленно и достигает максимума только после 12 часов клеточной стимуляции. PMA в комбинации с cAMP индуцирует AP-1 гораздо быстрее – максимум интенсивности формирования комплекса в этом случае приходится на интервал между 6 и 12 часами клеточной стимуляции. Затем интенсивность формирования комплекса существенно снижается. Комплекс AP-1, индуцированный PMA в комбинации с CaI, достигает максимальной интенсивности после 12 часов клеточной стимуляции и остаётся на этом уровне, по крайней мере, следующие 6 часов.
Существует ли корреляция между кинетикой формирования комплекса AP-1 и экспрессией гена ИЛ-5 в клетках PER-117? Чтобы ответить на этот вопрос, мы провели денситометрический анализ комплекса AP-1, индуцированного различными комбинациями клеточных стимуляторов, и определили кинетику продукции ИЛ-5 при этих условиях клеточной стимуляции.
На основании полученных данных можно заключить, что интенсивность формирования комплекса AP-1 прямо пропорциональна интенсивности продукции ИЛ-5 клетками PER-117 (рис. 6-3). Активация клеток с помощью одновременного использования PMA, cAMP и CaI обеспечивает наиболее высокий уровень индукции комплекса AP-1 (рис. 6-2) и самый высокий уровень экспрессии ИЛ-5 – более 500 пг/мл после 12 часов клеточной стимуляции.
Рис. 6-3. Кинетика продукции ИЛ-5 культурами PER-117 при различных условиях клеточной стимуляции (линии, левая ось) и кинетика формирования комплекса AP-1 CLE0 ИЛ-5 человека (столбцы, правая ось). Значения плотности комплекса AP-1 выражены как отношение денситометрических характеристик комплекса AP-1 к денситометрическим данным комплекса Oct-1 CLE0 ИЛ- CHX полностью подавляет образование комплексов AP-1 и Oct-2 (рис.
6-2), что указывает на зависимость их образования от синтеза белка de novo.
Однако, в отличие от AP-1, формирование Oct-2 содержащего комплекса CLE0 не коррелирует с экспрессией ИЛ-5 в клетках PER-117. Продукция ИЛ- регистрируется ещё до появления этого комплекса. Следовательно, ведущую роль в инициации транскрипции гена ИЛ-5 играют, вероятно, белки, входящие в комплекс AP-1.
Проверка этого предположения была начата с исследования влияния клеточной активации на синтез белков, взаимодействующих с CLE0 ИЛ-5.
Как показано на рис. 6-4, ядерные белки из интактных и активированных в различных условиях клеток, содержат Oct-1. Первые 12 часов клеточная активация не влияет на уровень содержания Oct-1, однако, затем содержание этого фактора снижается (дорожки 1-13).
Белки Jun D и Fra-2 не были обнаружены в ядрах интактных клеток. Все использованные варианты клеточной активации индуцируют появление этих факторов в составе ядерных белков. Однако сигнал Fra-2 регистрируется только после 6 часов клеточной стимуляции (рис. 6-4, дорожки 3, 7 и 11), в то время как сигнал Jun D появляется уже после 2 часов стимуляции (дорожки 2, 6 и 10). CaI и cAMP усиливают PMA-индуцированный синтез Fra-2 (сравните дорожки 3-5, 7-9 и 11-13) и не влияют на синтез Jun D.
Рис. 6-4. Влияние клеточной активации на кинетику синтеза белков, взаимодействующих с CLE0 ИЛ-5 человека.
Пояснения в тексте Oct-2 присутствует в ядрах интактных клеток. Клеточная стимуляция с использованием только PMA или PMA в комбинации с CaI ведёт к увеличению содержания этого фактора в составе ядерных белков (рис. 6-4, дорожки 1-5 и 10-13). Важно отметить, что CaI существенно усиливает действие PMA. Интересно, что cAMP таким эффектом не обладает. Первые часов клеточная стимуляция с помощью PMA в комбинации с cAMP не влияет на содержание Oct-2 в ядрах клеток PER-117. К 18-ти часам в ядерных фракциях, полученных из этих культур, содержание Oct-2 снижается.
На основании полученных данных можно заключить, что в результате активации клеток PER-117, независимо от условий стимуляции, происходит инициация синтеза de novo AP-1-формирующих белков Jun D и Fra-2. Эти данные хорошо согласуются с результатами исследования формирования активного ДНК-белкового комплекса CLE0, обеспечивающего транскрипцию гена ИЛ-5 (рис. 6-2). Таким образом, результаты проведённых экспериментов указывают на ключевую роль Jun D и Fra-2 в механизме зависимости экспрессии гена ИЛ-5 от синтеза белка de novo. Действительно, остальные участники ДНК-белкового комплекса CLE0 ИЛ-5, факторы транскрипции Oct 1 и Oct-2, постоянно присутствуют в ядрах клеток PER-117. После 12 часов стимуляции клеток, содержание Oct-1 снижается. Эффект клеточной активации на синтез Oct-2 зависит от условий стимуляции. Активация с помощью только PMA или PMA в комбинации с CaI усиливает синтез этого белка, в то время как стимуляция PMA в комбинации с cAMP приводит к снижению содержания Oct-2. Эти факты указывают на то, что механизм зависимости экспрессии гена ИЛ-5 от синтеза белка de novo не связан с продукцией факторов Oct-1 и Oct-2.
Суммируя вышеизложенное, можно утверждать, что в значительной мере, если не полностью, механизм зависимости активации экспрессии гена ИЛ-5 от синтеза белка de novo базируется на зависимости инициации транскрипции гена от синтеза de novo субъединиц CLE0 ИЛ-5 связывающего фактора AP-1. Несомненно, что этот механизм представляет собой весьма важный, но далеко не единственный уровень контроля инициации экспрессии гена ИЛ-5. Вполне вероятно, что очередной уровень системы контроля может опираться на механизмы регуляции экспрессии генов Jun D и Fra-2. Каков индивидуальный вклад механизмов регуляции экспрессии каждого из этих генов в систему контроля инициации экспрессии гена ИЛ-5?
Чтобы ответить на этот вопрос мы провели исследование синтеза мРНК Jun D и Fra-2 в клетках PER-117. Как видно на рис. 6-5, интактные клетки PER-117 содержат мРНК Jun D и не содержат мРНК Fra-2 (дорожка 1).
Клеточная стимуляция с помощью PMA в комбинации с CaI инициирует синтез мРНК Fra-2 и усиливает синтез мРНК Jun D (дорожка 2). Эти данные говорят о конститутивном характере экспрессии гена Jun D и индуцибельном Fra-2.
Рис. 6-5. Влияние двухчасовой стимуляции с помощью PMA в комбинации с CaI на синтез мРНК Jun D и Fra- в клетках PER- Итак, данные экспериментов по исследованию синтеза мРНК и белков Jun D и Fra-2 позволяют представить следующую схему инициации транскрипции гена ИЛ-5. В результате клеточной стимуляции происходит активация экспрессии гена Fra-2 и трансляции мРНК Jun D. Вероятно, нестимулированные клетки содержат значительное количество мРНК Jun D, что приводит к наработке в активированных клетках избыточного количества белка, необходимого для сборки CLE0 ИЛ-5 связывающего фактора AP-1.
Для проверки этого предположения мы провели ингибиторный анализ экспрессии репортёрной конструкции -509/+44, несущей ген люциферазы под контролем промотора гена ИЛ-5 человека, с использованием антисмысловых РНК Fra-2 и Jun D. Источником антисмысловых РНК служили плазмиды, несущие фрагменты кДНК Fra-2 и Jun D в обратной ориентации, pSI-аFra-2 и pSI-аJun D. Эти конструкции были выполнены на основе экспрессионного вектора pSI, использованного при проведении ингибиторного анализа в качестве контрольной плазмиды.
Рис. 6-6. Влияние антисмысловых РНК Fra-2 и Jun D на активность промотора гена ИЛ-5 человека (кратности индукции определена относительно уровня активности люциферазы в нестимулированных клетках, трансфицированных репортёрной плазмидой и вектором pSI) Как показано на рис. 6-6, в результате экспрессии конструкции, кодирующей антисмысловую последовательность к мРНК Fra-2, активность люциферазы существенно снижается по сравнению с уровнем люциферазы в лизатах клеток, трансфицированных контрольным вектором. При экспрессии конструкции, кодирующей антисмысловую последовательность к мРНК Jun D, такого эффекта не наблюдалось. Эти результаты поддерживают предположение об избыточном содержании мРНК Jun D в активированных Т клетках и ещё раз свидетельствуют о том, что белком, регулирующим интенсивность формирования комплекса AP-1, и, соответственно, уровень экспрессии гена ИЛ-5 является Fra-2.
Результаты исследований, изложенные в данном разделе, позволяют утверждать, что ключевым транскрипционным фактором, контролирующим инициацию экспрессии гена ИЛ-5 человека, является AP-1. Действительно, данные экспериментов по изучению кинетики взаимодействия CLE0 с ядерными белками и влияния условий клеточной стимуляции на это взаимодействие демонстрируют, что именно AP-1-содержащий комплекс формируется первым, независимо от условий активации клеток. Более того, существует прямая корреляция между кинетикой формирования комплекса AP-1 и активностью экспрессии гена ИЛ-5 в клетках PER-117. Таким образом, можно заключить, что AP-1 контролирует не только инициацию транскрипции гена, но и уровень её активности. Следовательно, существует прямая зависимость между условиями клеточной стимуляции, определяющими активность экспрессии гена ИЛ-5, и интенсивностью синтеза, по крайней мере, одной из субъединиц AP-1.
Нам удалось показать, что такой субъединицей является Fra-2. CaI и cAMP усиливают PMA-индуцированный синтез Fra-2 и не влияют на синтез Jun D. Интересно, что индукция экспрессии гена Fra-2 полностью зависит от клеточной стимуляции - интактные клетки PER-117 не содержат мРНК Fra-2.
Здесь уместно вспомнить, что активация экспрессии гена ИЛ-5 невозможна без синтеза белка de novo. Это ставит ген ИЛ-5 в особое положение по сравнению с другими генами цитокинов и позволяет говорить о существовании уникальной системы запуска экспрессии ИЛ-5. Согласно нашим данным такая уникальная система базируется на жестком контроле инициации транскрипции ИЛ-5. Жесткость заключается в том, что клеточная активация инициирует экспрессию Fra-2, который в свою очередь запускает экспрессию ИЛ-5. Роль Fra-2 как фактора, лимитирующего как инициацию, так и уровень активности экспрессии гена ИЛ-5 была подтверждена в экспериментах с использованием антисмысловых РНК Fra-2 и Jun D.
Следует отметить, что полученные данные могут иметь существенное значение не только при планировании дальнейших академических исследований регуляции экспрессии гена ИЛ-5, но и при проведении прикладных работ, направленных на создание нового поколения фармакологических препаратов для лечения астмы и других аллергических заболеваний, сопровождающихся эозинофилией.
6.2. Механизм подавления экспрессии гена ИЛ-5 человека дексаметазоном В настоящее время для лечения астмы и других аллергических заболеваний, сопровождающихся эозинофилией, активно используются синтетические глюкокортикоиды, в частности, дексаметазон. В результате применения этих препаратов у пациентов понижается содержание ИЛ-5 в легких и периферической крови [Charlesworth et al., 1991;
Greenfeder et al., 2001]. В бронхиально-альвеолярных смывах снижается также и количество Т клеток, экспрессирующих мРНК ИЛ-5 [Robinson et al., 1993]. Однако, несмотря на широкое использование глюкокортикоидов при лечении аллергических заболеваний, механизмы, лежащие в основе действия этих препаратов на экспрессию гена ИЛ-5, изучены далеко не полностью.
Известно, что дексаметазон обладает способностью активировать механизмы, понижающие эффективность экспрессии генов цитокинов на транскрипционном, посттранскрипционном и даже посттрансляционном уровнях [Peppel et al., 1991;
Adcock et al., 2001]. Не исключено, что эффект дексаметазона на продукцию ИЛ-5 является результатом суммарного действия всех перечисленных механизмов. Однако регуляция экспрессии гена ИЛ-5 происходит на транскрипционном уровне, поэтому вероятнее всего, что основными мишенями дексаметазона в случае ИЛ-5 является именно механизмы транскрипции.
Глюкокортикоиды регулируют транскрипцию генов как с использованием механизма прямого воздействия на промоторную активность гена-мишени, так и опосредовано, активируя экспрессию белка, обладающего свойствами транскрипционного регулятора гена-мишени. Происходит это следующим образом: после проникновения в клетку глюкокортикоиды образуют комплекс с цитоплазматическим глюкокортикоидным рецептором (ГР). Этот комплекс, который чаще называют активированный ГР, перемещается в ядро, где он действует уже как фактор транскрипции.
Промоторы ряда генов содержат регуляторные элементы, при взаимодействии с которыми активированный ГР способен инициировать, усиливать или подавлять транскрипцию этих генов [Hayashi et al., 2004;
Barnes, 2006].
Необходимо отметить, что согласно проведённому нами и другими авторами компьютерному анализу последовательности гена ИЛ-5 человека, его регуляторные области не содержат элементов, связывающих активированный ГР. Следовательно, весьма маловероятно, что эффект глюкокортикоидов, в частности, дексаметазона на экспрессию ИЛ- достигается в результате прямого взаимодействия активированного ГР с промотором гена. Скорее всего ингибирующее действие дексаметазона на транскрипцию ИЛ-5 осуществляется либо с помощью белка репрессора, экспрессия которого инициирована или усилена этим глюкокортикоидом в активированных Т-клетках, либо в результате подавления активированным ГР экспрессии факторов, обеспечивающих транскрипцию ИЛ-5.
В задачи данного этапа нашей работы входили идентификация регуляторных элементов гена ИЛ-5 человека, активность которых подавляется дексаметазоном, и исследование механизма этого подавления. В частности, наше внимание было сфокусировано на решении вопроса о том, является ли эффект дексаметазона следствием прямого действия глюкокортикоида на факторы, участвующие в активации транскрипции ИЛ-5, или в данном случае задействованы белки-посредники, ингибирующие взаимодействие факторов транскрипции и регуляторных элементов гена.
Для определения участка промотора, содержащего дексаметазон чувствительные регуляторные элементы гена ИЛ-5, были использованы репортёрные конструкции, экспрессирующие люциферазу под контролем различных по размеру фрагментов промотора гена ИЛ-5 человека.
Репортёрные конструкции транфицировали в клетки PER-117, часть клеток обрабатывали дексаметазоном. Обработанные глюкокортикоидом и контрольные культуры активировали различными комбинациями клеточных стимуляторов и после 16-ти часовой инкубации в стандартных условиях определяли в них уровень активности люциферазы.
В результате проведения этой серии экспериментов было установлено, эффект дексаметазона на экспрессию конструкций, содержащих первые 2000, 1300, 509 и 60 (конструкция CLE0/TATA) п.о. промотора гена ИЛ-5 зависит от условий клеточной активации. Дексаметазон практически полностью подавляет экспрессию репортёрного гена в клетках, активированных PMA или PMA в комбинации с cAMP и CD28. В культурах же, стимулированных PMA в комбинации с CaI, дексаметазон не влияет на активность экспрессии этого гена (рис. 6-7). Эти данные согласуются с результатами, полученными при определении чувствительности экспрессии гена ИЛ-5 к действию дексаметазона в первичных Т-лимфоцитах человека и клетках PER- (раздел 1) и ещё раз указывают на то, что в определённых условиях клеточной активации дексаметазон не влияет на активность промотора гена ИЛ- человека.
Рис. 6-7. Активность люциферазы в культурах PER-117, трансфицированных конструкциями, содержащими первые 2000 (А), 1300 (Б), 509 (В) и 60 (Г, конструкция CLE0/TATA) п.о. промотора гена ИЛ-5 человека. Обозначения: К – нестимулированные культуры;
PMA, PMA/CaI и т.д. – стимуляция различными комбинациями клеточных активаторов;
белые столбцы – без дексаметазона;
заштрихованные столбцы – обработка дексаметазоном Поскольку дексаметазон обладал практически одинаковым эффектом на экспрессию репортёрных конструкций, использованных в данных экспериментах, можно заключить, что мишенью дексаметазона в контексте промотора гена ИЛ-5 является CLE0, регуляторный элемент, обеспечивающий экспрессию минимальной плазмиды CLE0/TATA.
При проведении данной работы было показано, что CLE0 выполняет функции ключевого регуляторного элемента промотора гена ИЛ-5 человека (раздел 4). Не исключено, что механизм подавления экспрессии гена ИЛ- дексаметазоном может включать ингибирование формирования транскрипционного комплекса CLE0. В ходе экспериментальной работы было выяснено, что аналогично действию дексаметазона на продукцию ИЛ-5, синтез мРНК этого цитокина и активность ИЛ-5 промотора в составе репортёрных плазмид, эффект этого глюкокортикоида на формирование белковых комплексов CLE0 зависит от условий клеточной активации.
Нарушения взаимодействия CLE0 и факторов транскрипции возникают в клетках, стимулированных PMA или PMA в комбинации с cAMP и CD28, в то время как в PMA/CaI активированных культурах дексаметазон не оказывает влияния на ДНК связывающую активность CLE0 (рис. 6-8).
Рис. 6-8. Влияние дексаметазона (Декс) на белоксвязывающую активность элемента CLE0 ИЛ- человека (авторадиограммы с ядерными экстрактами, полученными из PMA/cAMP стимулированных клеток, были переэкспонированы по сравнению с другими авторадиограммами) На основании представленных выше данных можно предположить, что чувствительность или устойчивость транскрипции гена ИЛ-5 к действию дексаметазона зависит от спектра веществ, синтез которых индуцирует этот глюкокортикоид в клетках при различных условиях клеточной активации.
Вполне возможно, что в реализации репрессорного механизма важную роль играет белок (или белки), синтез которого успешно проходит в PMA, PMA/cAMP и PMA/CD28 стимулированных культурах. В отличие от этого, клеточная активация с помощью PMA в комбинации с CaI отменяет глюкокортикоидзависимый синтез белка, подавляющего транскрипцию гена ИЛ-5, или экспрессия такого белка в PMA/CaI стимулированных культурах значительно понижена. В подобных условиях механизм подавления экспрессии гена ИЛ-5 эффективно реализоваться не может.
Ранее было показано, что в Т-клетках дексаметазон индуцирует экспрессию белка GILZ [D'Adamio et al., 1997]. Интересно, что GILZ обладает способностью взаимодействовать с фактором транскрипции AP-1.
Предполагается, что в основе дексаметазонзависимого механизма подавления TCR-индуцированной экспрессии генов ИЛ-2 и рецептора ИЛ-2 лежит прямое взаимодействие GILZ с AP-1. В результате этого взаимодействия AP-1 теряет свою ДНК-связывающую и, как следствие, регуляторную активность [Mittelstadt et al., 2001]. Эти факты позволяют предположить, что в основе дексаметазонзависимого механизма подавления транскрипции гена ИЛ- также лежит прямое взаимодействие GILZ с AP-1.
Проверку данного предположения мы начали с исследования возможности индукции синтеза мРНК GILZ в клетках PER-117. Установлено, что синтез этой мРНК происходит только в обработанных дексаметазоном культурах, стимулированных PMA или PMA в комбинации с cAMP и CD28.
В нестимулированных клетках или культурах, обработанных дексаметазоном и активированных PMA в комбинации с CaI, обнаружить мРНК GILZ не удаётся (рис. 6-9). Таким образом, условия индукции мРНК GILZ дексаметазоном совпадают с условиями, при которых экспрессия гена ИЛ- чувствительна к действию этого глюкокортикоида. Использование CaI в качестве ко-активатора приводит к блокаде PMA-индуцированного синтеза мРНК GILZ.
Рис. 6-9. Влияние дексаметазона (Декс) на синтез мРНК GILZ в культурах PER-117, стимулированных различными комбинациями клеточных активаторов Полученные данные указывают на прямую корреляцию между синтезом мРНК GILZ и эффектом дексаметазона на экспрессию гена ИЛ-5, что косвенно подтверждает предположение о возможном участии белка GILZ в реализации дексаметазонзависимого механизма подавления транскрипции ИЛ-5.
Для того чтобы получить прямые свидетельства влияния GILZ на активность промотора гена ИЛ-5, мы использовали репортёрный анализ в комбинации с эктопической экспрессией данного белка. В результате были получены данные, демонстрирующие, что в PMA/cAMP-стимулированных клетках PER-117 GILZ подавляет активность промотора гена ИЛ-5 (рис. 6-10).
Аналогичные результаты получены и при проведении экспериментов с использованием PMA/CD28-стимулированных клеток.
Рис. 6-10. Влияния GILZ на экспрессию репортёрных конструкций, содержащих первые 509 (А, плазмида -509/+44) и 60 (Б, плазмида CLE0/TATA) п.о.
промотора гена ИЛ-5 человека в нестимулированных (Н/клетки) и PMA/cAMP активированных культурах PER-117. Для эктопической продукции GILZ использована конструкция pcDNA3.1-GILZ, содержащая кДНК GILZ. В контрольных экспериментах данная конструкция была заменена на плазмиду pcDNA3.1-LacZ, содержащую кДНК LacZ, и базовый вектор pcDNA3. Следует отметить, что ингибирующий эффект GILZ на экспрессию конструкции -509/+44 практически не отличается от эффекта этого белка на активность конструкции CLE0/TATA. Это подтверждает данные, полученные в экспериментах по определению мишени дексаметазона в контексте промотора гена ИЛ-5, и указывает на то, что GILZ полностью блокирует активность CLE0.
Роль GILZ как ингибитора активности CLE0 ИЛ-5 была подтверждена с помощью экспрессии репортёрной конструкции CLE0/TATA в PMA/CaI стимулированных клетках PER-117. Как упоминалось выше, в этих условиях клеточной активации дексаметазон не индуцирует экспрессию гена GILZ и, очевидно, как следствие, не влияет на экспрессию репортёрных плазмид в клетках PER-117. Однако избыточная продукция GILZ ингибирует активность конструкции CLE0/TATA в PMA/CaI-стимулированных клетках PER-117 (рис.
6-11). Таким образом, в условиях блокады экспрессии гена GILZ с помощью CaI эктопическая продукция этого белка приводит к подавлению активности CLE0 ИЛ-5.
Рис. 6-11. Влияния GILZ на экспрессию репортёрной конструкции CLE0/TATA в нестимулированных и PMA/CaI-активированных культурах PER-117.
Пояснения к обозначению экспрессионных конструкций в подписи рис. 6- Ещё одно доказательство того, что подавление активности CLE0 ИЛ- является следствием именно эктопической продукции GILZ, было получено в экспериментах с использованием культуры клеток Jurkat. Дело в том, что эти клетки не содержат функционально активный глюкокортикоидный рецептор [Northrop et al., 1992]. Следовательно, в культуре Jurkat дексаметазон не может инициировать активность какого-либо механизма, модифицирующего транскрипцию генов. Действительно, обработка клеток Jurkat дексаметазоном при любых условиях клеточной стимуляции не влияет на активность экспрессии репортёрных конструкций, использованных в данном исследовании (рис. 6-12А). Однако эктопическая продукция белка GILZ ингибирует активность конструкции CLE0/TATA в PMA/CaI стимулированных клетках Jurkat (рис. 6-12Б). Аналогичные результаты получены для PMA/cAMP- и PMA/CD28-стимулированных клеток Jurkat.
Данные результаты ещё раз указывают на то, что GILZ обладает способностью подавлять транскрипцию гена ИЛ-5, в частности, ингибировать активность CLE0, ключевого регуляторного элемента промотора.
Рис. 6-12А. Влияния дексаметазона на экспрессию конструкции CLE0/TATA в PMA/cAMP-стимулированных культурах Jurkat. Б. Влияния GILZ на экспрессию конструкции CLE0/TATA в PMA/CaI-стимулированных культурах Jurkat.