Стресс-реакция как механизм реализации адаптивного потенциала особей и популяций насекомых
На правах рукописи
Беньковская Галина Васильевна СТРЕСС-РЕАКЦИЯ КАК МЕХАНИЗМ РЕАЛИЗАЦИИ АДАПТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА ОСОБЕЙ И ПОПУЛЯЦИЙ НАСЕКОМЫХ 03.00.09 – энтомология;
03.00.15 – генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
НОВОСИБИРСК - 2009
Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН.
Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор Хуснутдинова Эльза Камилевна, ИБиГ УНЦ РАН доктор биологических наук Ильиных Александр Васильевич, ИСиЭЖ СО РАН.
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Штерншис Маргарита Владимировна, НГАУ доктор биологических наук, профессор Гордеев Михаил Иванович, ИОГен РАН доктор биологических наук Грунтенко Наталья Евгеньевна, ИЦиГ СО РАН
Ведущая организация: Всероссийский НИИ защиты растений РАСХН, Санкт-Петербург-Пушкин
Защита диссертации состоится “ ” 2009 г. в ч.
на заседании диссертационного совета Д 003.033.01 при Институте систематики и экологии животных СО РАН по адресу: 630091, г.
Новосибирск, ул. Фрунзе, д. 11.
Тел./факс: (383)2170973. e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института систематики и экологии животных СО РАН.
Автореферат разослан 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Л.В. Петрожицкая
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В основе биологического разнообразия, характеризующего благополучие живого мира, лежит генетический полиморфизм – необходимое условие сохранения обилия видов и базис микроэволюционных процессов (Лобашев, Инге-Вечтомов, 1976;
Тимофеев Ресовский и др., 1977;
Снегин, 2007).
Изменения природной среды, носящие как эколого-климатический, так и антропогенный характер, предъявляют повышенные требования к способности видов, составляющих виды популяций и индивидов приспосабливаться к новым условиям, а также сохранять и расширять границы ареалов (Сергиевский, 1985;
Васильев, Васильева, 2005). Эта способность определена как адаптивный или биоэкологический (Завадский, 1968) потенциал.
От адекватности способов оценки адаптивного потенциала зависит точность и своевременность прогнозов – как долгосрочных, определяющих направленность микроэволюционных процессов, так и краткосрочных, позволяющих оценить сиюминутное состояние популяции и принять решение о мерах воздействия (Яблоков, 1987). Актуальность исследований в области прогноза состояния популяций очевидна. На сегодняшний день недостаточность методологии стала причиной непредсказуемости темпов расселения ряда видов-инвадеров, к которым относят американскую белую бабочку, вредную черепашку и колорадского жука (Reznick, Ghalambor, 2001;
Lee, 2002;
Павлюшин и др., 2005;
Фасулати, 2005). Не соответствуют прогнозам скорости формирования резистентности к средствам контроля численности в популяциях вредителей (Сухорученко, 2005), а также падения численности во многих аборигенных и эндемичных популяциях, к числу которых принадлежит и популяция среднерусской расы медоносной пчелы на территории Башкортостана (Косарев, 2006).
Адаптивный потенциал как сумма возможностей приспособления, заложенная в генофонде популяции и геноме особи, реализуется в ходе формирования онтогенетических адаптаций (Уоддингтон, 1970;
Васильев, 2007). Генетический полиморфизм обеспечивает многообразие путей адаптациогенеза, обуславливая полиморфизм адаптационный, или функциональный (Лобашев, Инге-Вечтомов, 1976).
Быстрое развитие молекулярно-генетических методов позволяет ускорить исследования генетического полиморфизма, однако для исчерпывающей оценки адаптивного потенциала этого недостаточно.
Требуется комплексный подход, сочетающий современные методы и многосторонний анализ динамики жизненных показателей на клеточном, организменном и популяционном уровнях (Сергиевский, 1987;
Шишкин, 1988;
Васильев, 2008). Адекватной моделью в исследованиях, связанных с оценкой адаптивного потенциала, может стать стресс-реакция, в ходе которой максимально реализуются потенции, как особи, так и сообществ разного уровня. Представители различных отрядов класса насекомых, отличающегося широкой экологической пластичностью, соответствуют требованиям к объектам в подобных исследованиях.
Учение о стрессе и адаптационном синдроме было создано в середине прошлого века (Селье, 1961);
представление о стресс-реакции было сформулировано несколько позднее (Горизонтов, 1973;
Погодаев, 1976), причем неоднократно повторялось, что эта реакция развивается как цепь событий, опосредованных гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системой. Отсутствие такой системы у насекомых считалось априорно доказательством невозможности развития стресс-реакции по типу теплокровных (Косицкий, 1970). Тем не менее, доказательств развития стресса у насекомых получено достаточно (Лухтанов, 1985;
Черныш, 1985;
Раушенбах, 1990). Выявлены механизмы генетического контроля отдельных звеньев стресс-реакции (Раушенбах, 1997;
Раушенбах и др., 2000;
Ченцова и др., 2007). В работах лаборатории И.Ю. Раушенбах также исследовано место стресс-реакции в процессах онтогенеза и адаптациогенеза;
определены основные маркерные характеристики стресс-реакции у дрозофилы.
Исследовалась и связь стресс-реакции с отдельными видами полиморфизма в природных популяциях D. melanogaster. Однако экономически значимые виды насекомых, к тому же принадлежащие к нескольким отрядам, до сих пор не становились объектами исследований такого рода.
Демографические показатели, считающиеся достоверными характеристиками искусственных популяций (Монастырский, Горбатовский, 1991;
Злотин, Головко, 1998), позволяют на ряде последовательных поколений сделать заключение о роли отдельных регулируемых факторов в динамике состояния искусственной популяции и предположить, какое значение могут иметь изменения эколого-климатического и антропогенного характера в жизни природных популяций. Однако, только исследования изменений границ ареала, динамики структуры природных популяций дают окончательный ответ на вопросы, связанные с прогнозом их состояния.
Сочетание методов оценки реакции на воздействия на уровне популяций, субпопуляционных групп, индивидуальных организмов и суборганизменных систем представляется наиболее перспективным подходом.
Цель работы:
Выяснение роли стресс-реакции насекомых (медоносной пчелы Apis mellifera L., комнатной мухи Musca domestica L., колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say) в реализации адаптивного потенциала особи и популяции.
Задачи исследования:
1) исследование закономерностей проявления стресс-реакции у насекомых при стрессах различной природы и модальности;
2) установление онтогенетических закономерностей проявления и развития стресс-реакции у насекомых с полным типом превращения и последствий перенесенных стрессов;
3) характеристика фаз развития стресс-реакции и ее особенности при воздействии нескольких стрессоров;
4) изучение модулирующего влияния биологически активных веществ на развитие стресс-реакции и последствия стрессов у насекомых;
5) выявление особенностей развития стресс-реакции у генетически различающихся внутривидовых групп Apis mellifera L. в условиях зоны гибридизации интродуцируемых групп с аборигенными семьями Apis mellifera mellifera;
6) анализ изменений структуры лабораторных популяций Musca domestica L. при стрессовых воздействиях и исследование процессов адаптациогенеза при селекции на устойчивость к стрессам;
7) выяснение роли стресс-реакции в проявлении полиморфизма в популяциях Leptinotarsa decemlineata Say на Южном Урале.
Научная новизна результатов исследований Впервые проведены комплексные исследования развития стресс реакции на видах насекомых, ранее не исследованных в данном аспекте. На примерах комнатной мухи, колорадского жука и медоносной пчелы показан универсальный фазовый характер стресс-реакции насекомых и сложная структура стадии реакции тревоги.
Выявлено стимулирующее действие (эффекты гормезиса) инсектицидов в летальных (диагностических) дозировках, проявляющееся в локальных популяциях L. decemlineata с высокой частотой встречаемости резистентных генотипов.
Впервые на примере A. mellifera и M. domestica показано изменение уровня транскрипционной активности генов профенолоксидазы и антибактериальных пептидов при стрессах различной природы.
Впервые установлена согласованность динамики активности отдельных компонентов фенолоксидазной системы в онтогенезе комнатной мухи и колорадского жука. Обнаружено соответствие динамики активности ферментов фенолоксидазной системы насекомых чередованию фаз стресс реакции.
Показана возможность использования характеристик фаз развития стресс-реакции насекомых для оценки состояния семей медоносной пчелы.
Впервые выявлено закономерное снижение уровня внутрипопуляционного полиморфизма с последующим его восстановлением в ряду поколений в популяциях, подвергающихся неблагоприятным воздействиям в условиях эксперимента. Продемонстрировано различие в процессах формирования адаптаций в лабораторных популяциях M.
domestica к стрессогенным воздействиям в зависимости от характера и длительности воздействия стрессоров.
Впервые установлено наличие дифференциации типов стресс-реакции у имаго колорадского жука. Обнаружена связь динамики активности фенолоксидазной системы и фенотипических характеристик имаго.
На модельной выборке имаго L. decemlineata показана возможность комплексного применения молекулярно-биологического (двунаправленная аллельспецифичная полимеразная цепная реакция), фенетического и токсикологического методов для анализа популяционной структуры вида.
Теоретическая значимость работы. Работа обобщает результаты многолетних исследований, посвященных выяснению роли стресс-реакции в формировании онтогенетических адаптаций на ранее не исследованных модельных объектах.
Предложена схема развития стресс-реакции насекомых, согласующаяся с фундаментальной схемой Селье и уточняющая структуру стадии реакции тревоги. Показан универсальный характер стресс-реакции насекомых при воздействиях разного типа, что можно считать подтверждением общности защитной реактивности в отдаленных таксонах животного мира.
Установлена роль стресса и место стресс-реакции в микроэволюционных преобразованиях популяций насекомых как механизма реализации адаптивного потенциала особи и популяции. Одновременно продемонстрирована роль стресс-реакции как преадаптивного стимула, повышающего адаптационные возможности особи и расширяющего границы адаптивного потенциала популяций насекомых.
Концептуальные положения, выносимые на защиту:
1. Генетическая детерминированность параметров стресс-реакции насекомых позволяет использовать различные модели стрессовых ситуаций в качестве методологической базы для оценки состояния популяций насекомых.
2. Резервы скрытой изменчивости, обеспечивающие значительную часть адаптивного потенциала популяций насекомых и вида в целом, проявляются в полиморфизме типов стресс-реакции.
3. Стресс-реакция в лабораторных и природных популяциях насекомых является механизмом реализации адаптивного потенциала популяции и проявления полиморфизма.
4. Стресс-реакция в популяциях насекомых играет роль мощного преадаптивного стимула, становясь последним звеном в системе неспецифической защитной реактивности насекомых, и ее развитие предопределяет дальнейшее состояние, как отдельных особей, так и популяции в целом.
Практическая значимость работы. Разработаны экспериментальные модели стрессовых ситуаций применительно к насекомым, позволяющие охарактеризовать состояние популяций и отдельных особей. На их основе предложены тест-системы, в перспективе применимые в практике массового разведения культур насекомых, в частности, в пчеловодстве. Результаты исследований используются в практике лабораторного скрининга активности предполагаемых адаптогенов и дисадаптантов насекомых.
Показана необходимость учета отдаленных последствий стрессов при оценке состояния популяций и групп насекомых более низкого ранга, особенно при решении вопросов о применении физиологически активных веществ для профилактики и лечения пчел, а также при оценке развития резистентности в популяциях колорадского жука. Результаты работы могут быть использованы для чтений лекций по курсу «Зоология», «Экологическая физиология», «Экологическая генетика», «Генетика».
Апробация работы. Материалы диссертации прошли апробацию на конференциях: «Актуальные проблемы современной биохимии и биотехнологии» (Челябинск, 1999), «Проблемы физико-химической биологии» (Пущино, 2000), «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2000), «Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии» (Новосибирск, 2000);
на 9 совещании "Совр. состояние проблемы резистентности вредителей" (Санкт-Петербург, 2000);
на XII съезде РЭО (Санкт-Петербург, 2002);
на VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002);
на III съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002);
на Международном симпозиуме “Medico-biol.
Problems of Thermophysiology” (Минск, 2002);
на II Международной конференции «Разнообразие беспозвоночных животных на севере (Сыктывкар, 2000);
на III съезде ВОГиС (Москва, 2004);
на Международной конференции «Актуальные проблемы экологической физиологии» (Саранск, 2005), на IX Всероссийском популяционном семинаре «Особь и популяция – стратегии жизни» (Уфа, 2006);
на XIII съезде РЭО (Краснодар, 2007) и на конференции «Современные проблемы биологической эволюции» (Москва, 2007), на XXII Любищевских чтениях (Ульяновск, 2008).
Публикации. Основные результаты диссертации изложены в печатных работах, в том числе – 20 статей в рекомендованных ВАК журналах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), пяти глав с результатами собственных исследований, заключения, выводов, списка цитированной литературы, включающей работ отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на страницах и содержит 53 рисунка, 55 таблиц и приложение.
Личный вклад автора. Формулировка гипотезы и постановка задач исследования;
участие в мониторинге генофонда медоносной пчелы и резистентности к инсектицидам колорадского жука;
выполнение экспериментов в лабораторных условиях;
статистическая обработка результатов многолетних популяционных и лабораторных исследований;
формулировка всех выводов.
Благодарности. Приношу мою искреннюю благодарность за помощь в работе директору Института биохимии и генетики УНЦ РАН, академику АН РБ, доктору биологических наук, профессору В.А. Вахитову, сотрудникам лаборатории биохимии адаптивности насекомых ИбиГ УНЦ РАН кандидатам биологических наук М.Б. Удалову, М.П. Соколянской, Е.С. Салтыковой за помощь в проведении экспериментов, сотрудникам лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ИбиГ, кандидатам биологических наук Ю.М. Никонорову, А.Х. Баймиеву, доценту кафедры агроэкологии БГАУ, кандидату биологических наук Т.Л. Леонтьевой. Благодарю за предоставленный для анализов материал профессора БГАУ, доктора биологических наук Д.В. Амирханова, кандидата биологических наук, старшего научного сотрудника ВИЗР С.Р. Фасулати.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ: 02-04-97925;
02-04-97901, а также Академии наук Республики Башкортостан (гранты 1996-1998, 2002-2004 и 2007 гг.) СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Адаптивный потенциал и стратегии его реализации в популяциях насекомых Последовательность событий, ведущая к формированию адаптации и объяснение роли стресс-реакции в этих событиях для теплокровных изложены в концепции адаптациогенеза, предложенной Ф.З. Меерсоном (1984, 1991). Применительно к насекомым особое внимание привлекают к себе проблемы, связанные с формированием адаптаций к воздействию инсектицидов, токсикантов с различными механизмами действия.
В главе проведен обзор обширного объема литературных данных о разнообразии адаптаций насекомых к стрессогенным факторам абиотического и биотического характера. Изложен анализ современных представлений о стрессе и стресс-реакциях в приложении к классу Insecta.
Рассмотрены аспекты определения места стресс-реакции в процессах адаптации, приведены данные исследований механизмов реализации стресс реакций на разных уровнях организации. Особое внимание уделено обзору данных о значении фенолоксидазной системы в реализации стресс-реакции насекомых. Изложены сведения о структуре и функциях фенолоксидаз насекомых, их филогенетическом происхождении. Показано значение фенолоксидазной системы в регуляции уровня содержания биогенных аминов у теплокровных животных и отмечена недостаточность сведений о роли фенолоксидаз в метаболизме нейромедиаторов у насекомых. Освещены нерешенные вопросы теории стресса и как основная цель работы указана оценка возможности использования маркерных характеристик стресс реакции насекомых в мониторинге состояния популяций и внутрипопуляционных группировок.
Глава 2. Объекты и методы исследований Объекты исследований: 1) взрослые рабочие особи медоносной пчелы;
2) личинки, куколки и имаго комнатной мухи;
3) личинки, куколки, имаго, яйца колорадского жука.
Комнатную муху содержали в лабораторных условиях круглогодично.
Остальные виды использовали в качестве сезонных объектов.
Проведение экспериментов с воздействием стрессоров различного типа Тепловой стресс. Условия для развития теплового стресса создавали, как описано ранее (Беньковская и др., 2000, 2002, 2005). Для установления уровня чувствительности к действию повышенной температуры по методу открытого поля (Грицай и др., 1996) регистрировали локомоторную активность насекомых с интервалом 5 минут на протяжении всего периода экспозиции. После ее завершения наблюдения с ежесуточной регистрацией состояния насекомых вели в течение 7 суток. Во всех экспериментах чувствительность особей оценивали либо индивидуально, при численности группы не менее 30-50 особей в варианте, либо в 3х-кратной повторности по 10-20 особей в каждом варианте.
Холодовой стресс. Насекомых помещали (в садках или чашках Петри) в холодильную либо морозильную камеру, температуру в которой фиксировали перед началом экспозиции. Время наступления холодового оцепенения регистрировали визуально. После завершения экспозиции насекомых содержали при комнатной температуре в тех же садках и регистрировали момент первой двигательной реакции (разгибание-сгибание члеников лапок или хоботка) и время (в минутах) до восстановления нормальной локомоторной активности. Последующие наблюдения с регистрацией состояния насекомых вели на протяжении 7 суток.
Интоксикация. В предварительных экспериментах оценивали уровень чувствительности к применявшимся токсикантам. В экспериментах использовали пиретроиды: дельтаметрин, фосфорорганические инсектициды:
фосмет, малатион, бактериальный препарат битоксибациллин (БТБ), аналоги ювенильных гормонов (АЮГ): метопрен, синтез О.С. Куковинец, ИОХ УНЦ РАН, препараты альтозид, альтозар (Ciba, Швейцария), нереистоксины:
бенсултап (Takeda Chemical Industries Ltd., Япония). Все эксперименты проводили по описанным ранее методикам (Беньковская, Идрисова, 1985;
Беньковская, 1990;
Беньковская и др., 2000, 2003).
Старвация. Создание стрессовой ситуации осуществляли, удаляя из садков (чашек Петри) пищу и воду. Состояние насекомых оценивали по проявлению локомоторной активности на протяжении от нескольких часов до 15 и более суток.
Травма. Для предотвращения гибели насекомого травму покровов осуществляли путем прокола над спинным сосудом стерильной металлической иглой диаметром 0.2 мм. Для биохимических анализов собирали выступившую каплю гемолимфы. При наблюдениях за развитием стресса состояние насекомых оценивали индивидуально.
Токсический стресс, вызванный бактериальным препаратом.
Введение патогена осуществляли путем внесения бактериального препарата битоксибациллина на основе Bacillus thuringiensis (БТБ-45, ООО «Сиббиофарм») в медово-сахарный сироп (для медоносной пчелы), в субстрат развития (для комнатной мухи) и нанесением на свежие листья картофеля погружением (для колорадского жука). В серии предварительных экспериментов определяли уровни чувствительности объектов к препарату.
Для вариантов с быстрым развитием стресса выбирали концентрации, соответствующие СК50, для оценки слабых воздействий – СК5 – СК10.
Рабочие концентрации составляли в зависимости от вида и возрастной стадии от 0.1г/л до 5 г/л (Беньковская и др., 1999, 2000, 2005).
Отдаленные эффекты действия биологически активных веществ (БАВ) исследовали в экспериментах по оценке влияния на онтогенез, морфогенетические процессы и чувствительность к различным стресорным воздействиям на комнатной мухе, колорадском жуке, медоносной пчеле. В качестве БАВ использовали следующие вещества: синтетические аналоги ювенильных гормонов насекомых – метопрен (препарат альтозид) и гидропрен (препарат альтозар) (Беньковская, Идрисова, 1985;
Беньковская и др., 2000), компонентов маточного молочка медоносной пчелы (Беньковская и др., 2005), хитин и хитоолигосахариды (Беньковская и др., 2001, 2002), аскорбиновую и салициловую кислоты, фенилтиомочевину (Беньковская и др., 2002, 2006).
Оценку ферментативной активности проводили по описанным методикам (Беньковская и др., 2000, 2005, 2006).
Ингибиторный анализ in vivo и in vitro: ингибитор тирозиназы фенилтиомочевину (ФТМ) и ингибитор сериновых протеиназ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) наносили топикально по 0. мкл/особь на личинок второго возраста;
по 0.5 мкл/особь на личинок третьего возраста и по 1 мкл/особь на личинок четвертого возраста. Через 24 часа личинок рассаживали индивидуально и помещали в лунки листовые диски с нанесенными рабочими растворами бактериального препарата. В контрольном варианте давали чистый корм. Ингибиторный анализ in vitro включал использование ингибитора тирозиназы фенилтиомочевины и ингибитора лакказы азида натрия, вносившихся как раздельно, так и совместно в реакционную смесь в концентрации 0.001 М.
Методика электрофоретического изучения активности фенолоксидазы. Электрофорез белкового препарата проводили в 7.5% полиакриламидном геле (ПААГе) по Дэвису (Davis, 1962). После окончания электрофореза гель помещали в инкубационную среду для окрашивания, которая содержала 0.4 % DOPA (L--3,4-дигидроксифенилаланин, Merck) и 0.15 % пара-фенилендиамина. Окрашивание проводили при 37оС в течение 30 минут.
Определение уровня содержания катехоламинов. Проводили в гомогенатах как целых особей, так и отдельных органов и тканей, при соотношении количества биоматериала и экстрагирующего буфера (трис НС1 0.05 М, рН 7.2) 1:20 по модифицированной нами методике Н.А.
Вилковой и др. (1993).
Дизайн праймеров для проведения полимеразной цепной реакции при изучении полиморфизма A. mellifera и определении уровня экспрессии гена профенолоксидазы осуществлен Ю.М. Никоноровым (Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, Уфа).
Определение уровня экспрессии гена профенолоксидазы и антибактериальных пептидов. Уровень транскрипционной активности гена профенолоксидазы и генов антибактериальных пептидов у пчел оценивали с помощью метода дот-блот-гибридизации с иммобилизованной тотальной РНК пчел. Тотальную РНК выделяли из пчел методом экстракции смесью гуанидинизотиоцианат-фенол-хлороформ (Chomсzynski, Sacchi, 1987). Для оценки транскрипционной активности генов АБП в качестве ДНК-зондов использовались клонированные фрагменты данных генов (Львов, 2002) и клонированный фрагмент гена профенолоксидазы Tineidae sp., предоставленный Ю. М. Никоноровым. Оценку уровня мРНК осуществляли по интегральной площади пиков на рентгенограмме, полученной путем сканирования рентгеновской пленки в проходящем свете на денситометре «Chromoscan 3» (Joyce Loebel, Англия). Для контроля в образцах, наносимых на гибридизационный фильтр, определяли содержание тотальной РНК. Ген 18S рРНК был выбран в качестве нормировочного для оценки уровня мРНК генов профенолоксидазы и антибактериальных пептидов.
Концентрацию белка в гомогенатах определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951), либо по методу Бредфорда (Скоупс, 1985). Расчеты концентрации белка в гомогенатах производили с использованием калибровочной концентрационной кривой, построенной для растворов бычьего сывороточного альбумина.
Математическую обработку результатов исследований проводили на ПЭВМ IBM PENTIUM с использованием параметрических и непараметрических критериев различия (критерий Стьюдента, критерий Фишера, критерий 2, критерий Краскелла-Уоллеса), корреляционного и дисперсионного анализа (Лакин, 1990). Уровни внутрипопуляционного разнообразия оценивали, рассчитывая среднее число вариаций µ и долю редких вариаций h с их выборочными ошибками sµ и sh (Животовский, 1982).
Для графического анализа данных использовали функции программы Excel 2003.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Глава 3. Физиолого-биохимические характеристики стресс реакции у насекомых Изменения жизнеспособности насекомых при стрессах.
Наиболее очевидные последствия перенесения стрессов у насекомых, как и у других животных - изменения жизнеспособности, обусловленные интенсивностью и длительностью воздействий. Негативные эффекты стрессогенных воздействий изучены и у теплокровных, и у насекомых очень тщательно;
однако в наших экспериментах наблюдались изменения, свидетельствующие об адаптивном характере стресс-реакций у насекомых..
Воздействие токсикантов. Токсический стресс, вызванный химическими инсектицидами. В цикле токсикологических экспериментов выявлены эффекты стимуляции жизнедеятельности насекомых (Беньковская и др., 2002, 2006). Вне зависимости от химической структуры применявшихся ксенобиотиков, их дозировки, не вызывавшие летальных эффектов, приводили к ускорению онтогенетических процессов, повышению жизнеспособности личинок и плодовитости имаго.
Сублетальные дозировки инсектицидов, относящихся к различным классам соединений, повышают толерантность к резким изменениям температуры – как к холодовому, так и к тепловому стрессу (табл. 1).
Таблица 1. Влияние предварительного воздействия сублетальными дозами химических инсектицидов на чувствительность к экстремальным температурам у имаго колорадского жука Варианты Смертность через 7 Смертность через предварительных суток после суток после теплового обработок холодового стресса стресса контроль 50.0 + 1.2 % 73.3 +1.5 % фосмет 1.2 +0.04 %** 10.2 + 1.3 %** -цигалотрин 1.8 + 0.1 %** 0.5 +0.01 %** Указаны средние значения с ошибкой. ** – достоверность различия с контрольным вариантом Р 0.99.
Анализ выборочных данных по оценке фенотипической структуры популяции колорадского жука на территории Башкортостана (Удалов, 2006), показал, что в локальных популяциях присутствует определенная доля особей, реагирующих на действие инсектицида как на стимулятор. В центральной группе в 2006 г. эта доля составляла 0.15, увеличившись с г в 7.5 раз, а в периферической за тот же период эта доля возросла в 12 раз (Р 0.99). Видимо, это следует расценивать, как реакцию на переставшее быть чрезвычайным воздействие особей, чей генотип содержит мутации, ответственные за специфическую устойчивость.
Изменения локомоторной активности насекомых в ходе стресс реакции. Генотипические основы проявления стресс-реакции связаны с функциональными особенностями центральной нервной системы, и на организменном уровне эта связь выражается в изменениях локомоторной активности. Модель теплового стресса позволила выяснить, что изменения локомоторной активности у каждого из тестированных видов имеют свои особенности, но общие черты отражают универсальный характер развивающейся реакции (рис. 1).
Тепловой стресс. Универсальный характер развивающейся реакции (рис. 1) подтверждается наличием положительной корреляции между количество А движений за минуту, среднее -5 0 1 5 10 15 20 время экспозиции, мин Apis mellifera L.
Количество движений за минуту, среднее Musca domestica L.
0 1 2 3 4 5 6 7 10 время экспозиции, мин Количество движений за минуту, среднее Leptinotarsa decemlineata Say 0 1 3 5 10 15 время экспозиции, мин Рисунок 1. Изменения локомоторной активности у имаго медоносной пчелы, комнатной мухи и колорадского жука при тепловом стрессе (экспозиция при +50°С;
Р0.95).
средними значениями количества движений за минуту (коэффициент корреляции Пирсона между видами составил 0.574-0.914). Характерной общей чертой является также отрицательная корреляция между значениями локомоторной активности и их коэффициентами вариации для каждого из видов (– 0.71;
– 0.82 и – 0.49 для A. mellifera, M. domestica, L. decemlineata соответственно). Отрицательная корреляция между значениями активности и их коэффициентами вариации означает, по-видимому, что достижение максимальных значений активности в условиях теплового стресса возможно лишь в рамках, определенных геномом вида.
Сходный профиль изменений локомоторной активности зарегистрирован также при травме покровов и при интоксикации, вызванной у имаго колорадского жука обработкой инсектицидами;
при стрессе, вызванном старвацией у взрослых рабочих пчел. Воспроизводящийся фазный характер профиля изменений двигательной активности у изучаемых нами видов насекомых позволяет предположить, что динамика ферментов, участвующих в метаболизме нейромедиаторов, в частном случае – катехоламинов, также будет иметь фазный характер.
Динамика активности ферментов фенолоксидазной системы в ходе стресс-реакции. В наших экспериментах на имаго Apis mellifera L. при температурных стрессах отмечены закономерные воспроизводящиеся изменения активности ДОФА-оксидазы (рис.2 ), достоверно коррелирующие с динамикой локомоторной активности (коэффициент корреляции составил 0.78 при Р0.95).
Рисунок 2. Изменения локомоторной активности (А) и активности ДОФА-оксидазы (Б) у имаго A. mellifera L. при тепловом стрессе (экспозиция при +50°С;
Р0.95) Изучение динамики активности ферментов фенолоксидазного комплекса и уровня катехоламинов при тепловом стрессе на разных стадиях онтогенеза колорадского жука позволило продемонстрировать не только наличие взаимосвязи между этими параметрами, но и сам процесс становления фенолоксидазной системы метаболизма катехоламинов в онтогенезе этого вида.
Расчеты коэффициента корреляции (при k=5) для динамики каждого показателя между отдельными органами и тканями и построение корреляционной системы показали (рис. 3), что на стадии личинки наиболее тесной связью отличается динамика активности тирозиназы и уровня катехоламинов в тканях головы и кишечника. У куколки количество тесных корреляций выше, причем это касается преимущественно активности тирозиназы и ДОФА-оксидазы. Корреляции динамики показателей у имаго отличаются тем, что особенно четко выделяются те органы и ткани, в которых при тепловом стрессе усиленно происходит биосинтез катехоламинов – голова, стенка кишечника, жировое тело, покровы.
Куколка Личинка 2 2 1 – общий гомогенат;
2 – голова;
3 – кишечник;
4 – гемолимфа;
5 – жировое тело;
6 – покровы;
7 – содержимое зоба.
Рисунок 3. Положительные Имаго корреляции:
уровня содержания катехоламинов (А), активности тирозиназы (Б) и 2 ДОФА-оксидазы (В) в органах и тканях колорадского жука (Р0.95) при тепловом стрессе А Б В Толщина линии отражает степень корреляции (0.5r0.98).
Для использования в дальнейшей работе характеристик, связанных с динамикой активности тирозиназы и ДОФА-оксидазы были получены данные об активности этих ферментов на протяжении постэмбрионального онтогенеза комнатной мухи (рис. 4) и колорадского жука. Были обнаружены фазоспецифический характер изменений и согласованность их в онтогенезе, а также различия в функциональной значимости этих ферментов;
выявлены критические периоды онтогенеза комнатной мухи, соответствующие периодам резкого снижения или возрастания активности как тирозиназы, так и ДОФА-оксидазы. Отмечено, что именно в эти периоды, предшествующие либо совпадающие с морфофизиологическими трансформациями особенно наглядно демонстрируется как индивидуальная, так и групповая (возрастная) изменчивость в пределах нормы реакции (Беньковская и др., 2002, 2003, 2006).
0, 0, 0, 0, 123 4567 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 0, 0, 0, 1 23 45 6 78 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Рисунок 4. Динамика тирозиназной (а) и ДОФА-оксидазной (б) активностей в онтогенезе комнатной мухи По оси абсцисс: 1-4 – 4;
6;
8;
10-е сутки личиночного развития соответственно;
5 – фаратный пупарий;
6-8 – 4;
12;
24-й час куколочного развития;
9-12 – 2;
4;
6;
8-е сутки стадии куколки;
13 – фаратные имаго;
14 22 – 1;
5;
10;
15;
20;
25;
30;
45-е сутки стадии имаго соответственно. По оси ординат – активность в ед. акт./мин· мг белка, доверительные интервалы рассчитаны для Р 0.99.
Изменения транскрипционной активности генов профенолоксидазы у комнатной мухи и медоносной пчелы и антибактериальных пептидов медоносной пчелы при стрессах. Экспрессия гена профенолоксидазы у личинок комнатной мухи. При экспозиции личинок в условиях повышенной (+ 40°С), либо пониженной (+ 8°С) температуры, либо в субстрате с добавлением БТБ (0.02%) определяли уровень транскрипционной активности гена ПФО, активность ДОФА-оксидазы, а также оценивали влияние кратковременных температурных воздействий и длительного воздействия препарата на выживаемость преимагинальных стадий.
Результаты показали, что транскрипционная активность гена ПФО повышается в первые минуты ответной реакции независимо от природы воздействующего фактора (рис. 5).
Уровень мРНК, усл. ед.
10 мин 30 мин 15 мин 60 мин контроль 4 часа 24часа тепловой стресс холодовой токсический стресс стресс Рисунок 5. Уровень мРНК гена профенолоксидазы у личинок комнатной мухи при стрессах различной природы.
Тепловой стресс – экспозиция при + 40°С;
холодовой стресс – экспозиция при + 8°С;
токсический стресс – добавление в субстрат БТБ в концентрации 0.02%.
Звездочками отмечено достоверное (Р0.95) отличие от контроля.
Экспрессия гена профенолоксидазы при токсическом стрессе, вызванном бактериальным препаратом БТБ у медоносной пчелы. Изменения ДОФА-оксидазной активности и уровня экспрессии гена профенолоксидазы по мере смены стадий стресса наблюдались у пчел среднерусской и кавказской рас, при токсическом стрессе, вызванном БТБ. Выраженные различия между расами в динамике показателей отмечались на ранних стадиях развития защитного ответа. Наблюдавшийся здесь всплеск ДОФА оксидазной активности, скорее всего, отражает участие дифенолоксидазы в снижении титра выброшенных в гемолимфу биогенных аминов.
А.m. mellifera А A.m. caucasica 2, Уровень мРНК относительно контроля 1, 0.25 0.5 1 4 24 36 0, 0 время после введения БТБ, час Б А.m. mellifera A.m. caucasica относительно активности оксидазы, контроля Уровень ДОФА 00 0.25 0.5 1 4 24 36 время после введения БТБ, час Рисунок 6. Динамика экспрессии гена профенолоксидазы (А) и ДОФА-оксидазной активности (Б) у пчел среднерусской и кавказской рас при воздействии БТБ (0.5%). Показатели А и Б приведены относительно уровня в контроле (принят за 1. Р0.95) Изменение уровня экспрессии генов антибактериальных пептидов в ходе развития защитного ответа наблюдалось уже через 15 мин после введения токсиканта в организм насекомых. Неспецифический этап стресса, вызванного бактериальным препаратом, демонстрирует сходный для Apis mellifera mellifera и Apis mellifera caucasica характер усиления транскрипционной активности гена дефензина (табл. 2).
Таблица 2. Уровень мРНК генов антибактериальных пептидов (относительно уровня 18S мРНК) у пчёл Apis mellifera mellifera и Apis mellifera caucasica при обработке БТБ Время после обработки, ч Пептид Раса 0.25 0.5 1 A. m. mellifera 0.59±0.11 0.72±0.10 0.68±0.17 0.57±0. Гимено птецин A. m. caucasica 3.15±0.61** 0.69±0.19 0.97±0.10 1.02±0.04** A. m. mellifera 0.80±0.13 1.10±0.09 1.69±0.18 2.07±0. Абецин A. m. caucasica 2.01±0.29* 1.41±0.18 1.15±0.10* 1.35±0.11* A. m. mellifera 1.34±0.14 0.89±0.05 0.93±0.03 0.94±0. Дефензин A. m. caucasica 1.41±0.15 0.95±0.02 0.82±0.08 1.85±0.16** Звёздочками обозначены уровни мРНК генов АБП A. m. caucasica, достоверно отличающиеся от соответствующих величин A. m. mellifera (*– Р0.95;
** – Р0.99) Модели развития стресс-реакции при действии одного и нескольких стрессоров. Стресс-реакция насекомых, как показали результаты наших экспериментов, имеет фазный характер (рис.7).
Первая фаза ответной реакции, как отмечено ранее (Clegg, 1974;
Голиков, Голиков, 1987) выражается в снижении возбудимости и реактивности, проявляющемся на организменном уровне в снижении подвижности и интенсивности обмена, а на клеточном уровне – во временном подавлении биосинтеза нуклеиновых кислот и основной массы белков.
Приспособительный смысл этой фазы заключается в стремлении к сохранению биохимического гомеостаза путем снижения интенсивности физиологических и биохимических процессов. Переход от латентной фазы к фазе острой реакции тревоги осуществляется через некий переломный момент, на всех кривых развития адаптационных реакций совпадающий с минимумом каждого конкретного показателя (Серавин, 1957;
Голиков, 1968;
Бергер, 1977). Сложный характер латентной фазы стадии реакции тревоги проявился в полной мере при сочетании стресса, обусловленного старвацией, имеющего эндогенный характер, с развивающимся на его фоне токсическим стрессом, вызванным химическими либо бактериальными инсектицидами.
Профиль динамики ферментов в обобщенном виде воспроизводит характерную кривую изменения состояния организма при стрессе как в варианте со старвацией, так и в варианте с токсическим стрессом. Профиль динамики активности ферментов, полученный в экспериментах с единственным стрессогенным фактором, наблюдается также тогда, когда действие второго стрессора (БТБ) совпадает с началом эндогенного стресса, вызванного голоданием – старвацией на протяжении 24 часов (рис. 7 А).
24 часа 28 часов 36 часов 24 часа 2828часов 36 часов 36часов 24 часа часов А 24 часа 24 часа 28 часов 36 часов 36 часов 28 часов Б 1 2 3 4 55 22 2 3 3 44 4 5 2 3 Сплошная кривая – изменения 24 часа 28 часов 36часов 36 часов показателей активности ферментов 24 часа 28 часов В фенолоксидазного и гидролазного комплексов в ходе развития стресса старвации;
пунктирная кривая – изменения показателей активности тех же ферментов в ходе развития токсического стресса (действие 1 2 3 4 2 3 4 бактериального препарата).
Рисунок 7. Развитие стресс-реакции при различных временных сочетаниях стрессогенных воздействий.
А – второй стрессор (пунктирная кривая) начинает действовать одновременно с первым;
Б – второй стрессор начинает действовать в критический момент завершения латентной фазы на стадии реакции тревоги;
В – второй стрессор начинает действовать на стадии адаптации.
При совпадении начала действия второго стрессора с моментом наименьшей активности ферментов – своеобразным «критическим минимумом» стресса старвации, завершающим начальную, латентную фазу реакции тревоги, в наших экспериментах - 28-часовой точкой старвации (рис.
7, Б), суммарное воздействие двух стрессоров оказывается исключительно неблагоприятным, что подтверждается максимальными значениями смертности (Р 0.95), зарегистрированными для этого периода старвации.
36-часовая точка в развитии стресса старвации совпадает, как нам представляется, с завершением стадии адаптации и переходу к стадии истощения (рис. 7, В). Таким образом, становится очевидным, что реакция тревоги как фаза стресс-реакции неоднородна. Она подразделяется на несколько фаз, последовательно сменяющих одна другую: 1) латентная фаза, 2) критический минимум, 3) фаза реабилитации и 4) фаза мобилизации (рис.
8).
1 2 3 4 стрессор переход на новый эустресс Уровень уровень жизненных стрессор показателей в активном состоянии возврат к исходному Уровень уровню жизненных показателей в состоянии дистресс диапаузы продление латентной фазы 1 – латентная фаза стадия реакции тревоги гибель 2 – период реабилитации 3 – период мобилизации 4 – стадия резистентности 5 – стадия истощения - момент перехода от латентной к острой фазе реакции тревоги Рисунок 8. Фазы развития стресс-реакции у насекомых (на примере медоносной пчелы).
Эффекты перенесения стресса на преимагинальных стадиях развития. Стрессы, перенесенные на ранних онтогенетических стадиях, оказывают существенное влияние на формирование ответной реакции имаго насекомых, что показано на примере колорадского жука (Беньковская и др., 2000) и комнатной мухи (Беньковская и др., 2006).
Устойчивость к перенесению теплового стресса имаго колорадского жука и имаго комнатной мухи зависела в наших экспериментах не только от стадии онтогенеза насекомых, но и от совпадения или несовпадения стрессогенного воздействия с критическими периодами чувствительности к действующему фактору. В цикле экспериментов с личинками младших и старших возрастов, имаго колорадского жука установлено, что однократное воздействие на преимагинальных стадиях токсиканта (БТБ, пиретроиды, нереистоксины) в дозе, не превышающей СК 50, повышает устойчивость развившихся имаго к тепловому стрессу (30 мин, +43°С;
Р 0.95), причем этот эффект тем очевиднее, чем старше особи, переносящие воздействие токсикантов.
Несколько последовательно перенесенных стрессов, как показывают результаты в вариантах с двукратным воздействием токсикантов, снижают адаптивный потенциал особи (Р 0.95) и, соответственно, устойчивость к стрессам на имагинальной стадии.
Глава 4. Особенности стресс-реакции, связанные с процессами интродукции и внутривидовой гибридизации в семьях медоносной пчелы на территории Республики Башкортостан Последствия гибридизации семей, относящихся к разным подвидам, проявляются как дисгармоничная изменчивость, обусловленная расщеплением сложных полигенных систем, разрушением адаптивных генных комплексов.
Использование метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволило выявить различия в структуре межгенного участка мтДНК медоносной пчелы, что было использовано нами для оценки генетического полиморфизма в семьях Apis mellifera на территории Башкортостана (Никоноров и др., 1998).
Даже при сравнительно небольшой выборке, описанный выше метод позволяет охарактеризовать каждую семью по вариабельности локуса COI COII (рис. 9) и может быть предложен для анализа расового происхождения Рисунок 9. Результаты электрофоретического 11 2 2 4 55 66 7 88 99 4 7 разделения продуктов, полученных при амплификации локуса COI-COII мтДНК пчелы Apis mellifera L.
Образцы 1-7 - A.m.
mellifera.
Образцы 8-10 - A.m.
caucasica.
по материнской линии A. mellifera. В Иглинском районе на племенных пасеках были выявлены семьи, заявленные как чистопородные с принадлежностью к A.m. mellifera, и тем не менее содержащие мтДНК A.m.
caucasica. В дальнейшем проверка расовой принадлежности семей медоносной пчелы по мтДНК использовалась как обязательный компонент во всех экспериментах.
Особенности стресс-реакции в интродуцируемых семьях Apis mellifera. Использование аскорбиновой кислоты (АК) в качестве активного модулятора стресс-реакции (рис. 10) позволило выявить значительные различия между аборигенными и интродуцируемыми семьями в реактивности и сбалансированности функций компонентов фенолоксидазной системы (Беньковская и др., 2002;
Салтыкова и др., 2007).
A уровня, усл. ед.
относительно контрольного активность 0 5 10 15 20 30 - -200 время экспозиции, мин Б уровня, усл. ед.
относительно контрольного активность -100 0 5 10 15 20 30 - - ДОФА-оксидаза время экспозиции, мин Тирозиназа Рисунок 10. Расовые различия в активности фенолоксидаз у Apis mellifera L. при тепловом стрессе на фоне влияния аскорбиновой кислоты. А – A. m. mellifera., Б – A.m. caucasica.
Особенности стресс-реакции в гибридных семьях Apis mellifera.
Реакция на токсикант (БТБ, 0.5%) у пчел разных рас сопровождается значительно различающимися изменениями активности тирозиназы.
Максимальные значения подъемов в ходе стресс-реакции отмечены для пчел кавказской расы (Р 0.95), при этом профиль динамики активности характерен именно для стрессовой реакции. Изменения активности тирозиназы у пчел среднерусской расы имеют противоположную направленность. Динамика активности тирозиназы у гибридных особей часто несходна ни с одним из описанных паттернов. Судя по полученным результатам, это также является следствием дисбаланса генетических комплексов у гибридных особей пчел.
На основе показателей стресс-реакции у рабочих пчел для оценки физиологического состояния семей предлагается система лабораторного диагностикума и приводятся результаты его апробации.
Глава 5. Модели формирования устойчивости к стрессогенным воздействиям в лабораторных линиях комнатной мухи Выявление фенотипической структуры исходной лабораторной линии. Ранее нами было показано соответствие профиля динамики активности ферментов фенолоксидазного комплекса насекомых, в частности – ДОФА-оксидазы, фазам развития стресс-реакции (Беньковская и др., 1999, 2002;
Сухорукова, 2002). Анализ популяционной структуры исходной линии по значениям активности ДОФА-оксидазы у личинок начала III возраста проводили для потомства 21 пары мух, отобранных сразу после выхода из пупариев. При оценке вариационного ряда полученных значений удалось выделить 6 классов со статистически значимыми (Р0.95) различиями средних величин (табл. 3).
Таблица 3. Средние значения активности ДОФА-оксидазы (усл. ед.
/мг.белка мин) у личинок начала III возраста в потомстве 21 пары комнатной мухи (лабораторная популяция) Дисперсия (2) Классы Активность Коэффициент вариации (Сv, %) 1 0.004 0.0000035 46. 2 0.0192 0.000042 33. 3 0.047 0.000081 19. 4 0.085 0.000015 4. 5 0.118 0.00004 5. 6 0.369 0.000225 4. При оценке фенотипического состава по признаку чувствительности к воздействию стрессогенных факторов в исходной популяции нам удалось выделить также до 5 различающихся групп особей. Дифференциацию ответа в популяции можно продемонстрировать на примере тестирования чувствительности личинок к применявшимся стрессорам в градиенте интенсивности воздействия, с определявшимися заранее значениями смертности (табл. 4).
Ожидаемая смертность, рассчитанная для вариантов третьей группы, превышает фактическую;
проверка достоверности различия между ожидаемой и фактической величиной показала, что для этой градации фактора различия значимы при Р 0.95. Таким образом, вероятная доля особей, выживших, несмотря на потенциально смертельную дозу фактора, составляет 0.05 ± 0.01. Для этих особей наблюдается эффект стимуляции жизнеспособности, т.е. адаптивный ответ на воздействие токсиканта. Такое состояние, в физиологии описываемое как эустресс (Селье, 1972), характерно для особей, способных адаптироваться в течение индивидуального развития Вероятно, в этой группе должны встречаться особи, у которых в генотипе сочетание гетерозиготных локусов адаптивно значимых генов оптимально.
Эта группа составляет основу той части популяции, которая может считаться устойчивой. Наличие таких особей в гетерогенной популяции может стать гарантией быстрого роста устойчивости.
Таблица 4. Выделение фенотипических групп по признаку «чувствительность – устойчивость к воздействиям» в исходной чувствительной лини Cooper Musca domestica L.
№ Смертность Средняя Проявление Доля Значение в %, фактическая группы в интервал смертность, общей (р) доли выборке 1 0 - 10 0.271 Спонтанная 0.271 263. ±0.006 смертность (0.001) 2 15 - 25 0,57 Гиперчувст- 0.299 363. ±0.098 вительность (0.001) 3 30 - 40 0.227 Адаптивная 0.051 249. ±0.047 реакция (0.001) 4 45 - 85 0.59 Линейная 0.319 78. ±0.049 зависимость (0.001) «доза – эффект» 5 95-100 0.94 Устойчивость 0.06 12. ±0.01 (0.001) Оценка уровней сформировавшейся устойчивости (резистентности и кросс-резистентности) в линиях Musca domestica. При достижении поколения сопоставление характеристик чувствительности к воздействующим факторам дало следующие результаты (табл. 5).
Результаты показали, что при воздействии токсикантов на насекомых формируется кросс-резистентность не только к токсикантам других типов, но возрастает устойчивость организма к воздействию резких изменений температуры. Таким образом, интенсивное применение инсектицидов в борьбе с насекомыми-вредителями ведёт к формированию устойчивости к химическим веществам, ускоряющемуся под влиянием климатических факторов.
Таблица 5. Чувствительность к воздействующим факторам в лабораторных популяциях комнатной мухи после 30 поколений отбора на устойчивость к стрессорам Линия Высокая Низкая Концентрация Концентрация температура, температура, БТБ, % малатиона, % °С °С S, +40°С +5°С 0.0047± 0.0168 ± чувствительная 0.0008 0. R-h 0.96* 3.46 7.87 1. Селектируе R-c 1.29 4.91 5.32 1. R-b 1.28 2.21 12.55 2. мые R-m 4.8 6.91 8.72 33. * – начиная с 20-го поколения до 40% личинок переживают при тестировании температуру +60°С.
Изменения активности фенолоксидазной и гидролазной систем, сопровождающие формирование устойчивости к стрессам.
В процессе формирования устойчивости к стрессорам различного типа ферменты могли изменить уровень активности, и в 20-м поколении мы проверили, связаны ли эти изменения с изменением уровня устойчивости.
Изменения показателей резистентности мы сопоставили с изменениями уровней ферментативной активности в ряду поколений, рассчитав коэффициенты корреляции для этих процессов (табл. 6).
Таким образом, разнообразие физиолого-биохимических адаптаций свидетельствует как о различных путях адаптациогенеза в изолированных линиях, так и о высоком уровне адаптивного потенциала, проявляющегося в полиморфизме этих изменений.
Изменения демографических характеристик в селектируемых линиях комнатной мухи. Если в исходной S-линии за определенный промежуток времени Т проходит развитие N стадий онтогенеза, то значение скорости развития Vs выразится отношением Vs = Ns/Ts.
В наших экспериментах в исходной линии скорость онтогенеза оказалась ниже ожидаемой и составила 0.125±0.005 стадии/сутки. Во всех селектированных линиях эта величина существенно выше: 0. стадии/сутки для линий R-h и R-c, для линии R-b она составила 0. стадии/сутки, и самая высокая скорость 0.25 стадии/сутки была у линии R-m (при уровнях отличия от исходной группы Р 0.95). Достоверные отличия значений скорости развития во всех селектируемых линиях от исходной – свидетельство того, что давление стрессоров, независимо от типа воздействия, ведет к ускорению онтогенетических процессов.
Таблица 6. Корреляционные отношения между изменениями уровня устойчивости к стрессорам различного типа (ПР ) и уровня ферментативной активности у личинок комнатной мухи (III стадия, 20-е поколение селекции;
Р 0.95).
Ферменты Лини Обра зцы Кислая Неспецифические Сериновые Тирозиназа ДОфА и фосфатаза эстеразы протеиназы оксидаза 0.614 0.884 0.814 0.169 0. R_b гомогенат R Общий – 0.527 – 0.929 – 0.289 – 0.612 – 0. m 0.782 0.84 0.067 0.074 0. R-c – 0.394 – 0.208 – 0.234 – 0.227 – 0. R-h – 0. 0.398 0.819 0.802 0. R_b – 0. 0.724 0.358 0.15 0. головы R-m Гемолимфа Ткани – 0.339 – 0.373 – 0. 0.835 0. R-c – 0.489 – 0.674 – 0.356 – 0.383 – 0. R-h 0 0.758 0.947 0.511 0. R_b R – 0.831 – 0.485 – 0. 0 0. m – 0.263 – 0.37 – 0.352 – 0. 0. R-c – 0.412 – 0.688 – 0.461 – 0. 0. R-h 0.908 0.272 0.889 0.579 0. R_b кишечника R Стенка – 0. 0.832 0.832 0.837 0. m – 0.537 – 0.617 – 0.378 – 0. 0. R-c – 0.479 – 0.148 – 0.266 – 0. 0. R-h 0.531 0.598 0.766 0.445 0. R-b Покровы R – 0.013 – 0. 0.911 0.972 0. m – 0.197 – 0.394 – 0. 0.039 0. R-c – 0.289 – 0.349 – 0.32 – 0.003 – 0. R-h Серым цветом выделены варианты с высоким уровнем положительной или отрицательной корреляции.
Жизнеспособность в каждой линии определяется как выживаемостью в ходе онтогенеза, так и продолжительностью жизни на стадии имаго (табл. 7).
Продолжительность жизни имаго в каждой линии колеблется в допустимых пределах, а разброс данных по выживаемости очень велик. Как видно, на стадии пупария разброс данных по выживаемости для каждой линии минимален;
выше всего эта величина для S-линии. По всей видимости, этот эффект можно считать проявлением стабилизирующего действия отбора, проходящего в линиях под давлением стрессогенных факторов.
Все представленные в разделе «выживаемость» таблицы 7 данные подтверждают адаптивный характер изменений в линиях R-c и R-b и подчеркивают тот факт, что за несомненный рост устойчивости к действию стрессора в линии R-h этой группе приходится расплачиваться очень высокой ценой – снижением жизнеспособности развивающихся особей.
Сравнивая данные по плодовитости с общей длительностью репродуктивного периода и с продолжительностью жизни имаго, можно сказать с большой уверенностью, что в линиях R-h и R-b приобретение устойчивости к селектирующему агенту сопряжено с заметным снижением плодовитости (Р 0.95), тогда как в линиях R-c и R-m укороченный период жизни имаго и замедленное созревание компенсируются увеличением плодовитости, что особенно наглядно демонстрирует средняя величина плодовитости 1 самки за 1 сутки репродуктивного периода. Таким образом, утрата части адаптивного потенциала в линиях R-c и R-m, что отразилось на общей продолжительности жизни имаго, компенсируется повышением плодовитости.
Таблица 7. Выживаемость на разных стадиях онтогенеза в 25-м поколении лабораторных линий Musca domestica L.
Продолжитель- Выживаемость, % Средний вес ность жизни (коэффициент вариации %) Линия пупария, имаго, сутки. На всей На стадии На мг (с (коэффициент преимагинальной личинки стадии ошибкой) вариации %) стадии пупария S 55 (10.2) 20.35 (90.17) 25.7 (79.4) 60.75 6.95±0. (38.27) R-h 68 (18.5)* 5.57 (44.38)* 11.2 (89.19) 54.7 7.8±0.4* (15.63) R-c 43 (9.0)* 24.07 (61.19) 28.8 (48.96) 90.33* 6.6±0. (8.17) R-b 79 (16.3)* 28.7 (76.6) 35.85 (67.36) 70.75* 11.5±0.75* (19.36) R-m 44 (8.5)* 47.05(0.11)* 31.05(12.56) 66.05 8.3±0.7* (12.79) * – достоверное отличие от S-линии. Р 0.95.
Динамика фенотипической структуры лабораторных линий в процессе формирования устойчивости. Количество выделенных нами фенотипически различающихся групп (см. табл. 4) в линиях, подвергавшихся стрессогенным воздействиям, независимо от типа фактора закономерно изменялось: расчет величины внутрипопуляционного разнообразия µ показал, что за первые 10 поколений селекции уровень внутрипопуляционного разнообразия резко снижался, но к 20 поколению отмечалось его восстановление (рис. 11). Вероятно, что восстановление уровня внутрипопуляционного разнообразия связано со стимулирующими эффектами стресса, повышающими жизнеспособность части популяции, гетерогенной по своему составу, и не подвергающейся элиминации при исследованных нами типах воздействий.
µ исходное 11 28 поколение Рисунок 11. Изменения уровня внутрипопуляционного разнообразия при направленном отборе на устойчивость к стрессорам.
µ – средний уровень показателя внутрипопуляционного разнообразия с ошибкой, рассчитанный для всех селектированных линий, Р 0.99.
Глава 6. Генетический и фенотипический полиморфизм в популяциях Leptinotarsa decemlineata Say на территории Республики Башкортостан и реализация адаптивного потенциала вида Формирование популяции Leptinotarsa decemlineata Say на территории Башкортостана и эколого-климатические адаптации вида к региональным условиям Предуралья Башкирии. Впервые колорадский жук в Башкирии был обнаружен в 1976 году, в двух районах – Кумертауском и Архангельском, в очагах общей площадью 22 га (Обзор..., 1976). В году, по данным республиканской станции защиты растений, он был зарегистрирован во всех районах республики, кроме Белокатайского (Прогноз появления и распространения вредителей..., 1978). В настоящее время вид постоянно присутствует во всех районах республики, и в соответствии с современной классификацией зон натурализации вида на территории России и стран СНГ (Вилкова и др., 2005), территория Республики Башкортостан относится ко второй зоне, для которой характерна натурализация вида и начало процессов его интеграции в местные агроэкосистемы.
Отмеченная нами лабильность сроков фенологических явлений, отсутствие периода покоя летом у имаго I летней генерации и наступление летней диапаузы у перезимовавших жуков, способность самок уходить в зимнюю диапаузу с запасом спермы, а также развитие только одной полной генерации за сезон в большей части районов Башкирии могут, по-видимому, считаться особенностями биологии и фенологии вида в региональных условиях. В целом фенологические данные говорят о чрезвычайно высокой адаптивности вида. Несмотря на многократные интенсивные обработки растений картофеля инсектицидами, численность вредителя на территории Республики Башкортостан не снизилась до порогового уровня вредоносности (Беньковская, 1990). При пробных маршрутных учетах на товарной плантации картофеля летом 2007 года заселенность растений в период бутонизации составила от 85 до 100%, а плотность личинок при этом колебалась от 25 до 60 экз / куст, что сопоставимо с данными 1983-1989 гг.
Формирование резистентности к инсектицидам в локальных популяциях вида. Ежегодный токсикологический анализ чувствительности перезимовавших имаго к инсектицидам, проводившийся в 2003-2006 гг.
позволил выявить мозаичный характер распространения резистентности в популяциях вида (табл.8) и высокий уровень полиморфизма по показателю чувствительности-устойчивости к действию спектра инсектицидов с различным механизмом действия.
Таблица 8. Уровни чувствительности перезимовавших имаго колорадского жука к инсектицидам в локальных популяциях на территории Республики Башкортостан (2006 г).
Район Смертность с поправкой на контроль, % после применения ДК (доверительные интервалы при Р 0.95) Дельтаметрин Мала Тиамет Ацетам Фипронил тион оксам иприд Уфимский 43.8±4.2 81.3±2.4 93.8±3. Бурзянский 50.0±4.9 10.0±2.5 88.9±2.9 33.3±0.5 94.4±2. Стерлибашевский 15.8±1.2 21.1±2.0 99.9±0.1 52.1±5.3 Кармаскалинский 20.0±5.6 25.0±5.1 100 90.0±8.2 95.0±4. Илишевский 47.4±2.6 42.0±4.9 100 78.9±1.1 95.0±5. Аургазинский 16.7±2.0 11.1±2.3 94.8±1.2 72.2±6.8 Архангельский 5.0±0.5 0.0 94.1±8.9 64.7±4.8 Миякинский 40.0±3.9 13.3±1.1 100 Генетический и фенотипический полиморфизм в популяциях колорадского жука. Фены рисунка имаго колорадского жука стали предметом пристального внимания и детального изучения еще с начала ХХ века (Tower, 1906). В достаточно большом количестве работ, посвященных изменчивости этого признака, все авторы делят фены на группы, соответствующие отделам тела: 1) рисунок головы, 2)пронотума (переднеспинки), 3) элитр (надкрыльев), 4) брюшка и 5) ног. В наших исследованиях использованы первые четыре группы (рис. 12).
Рисунок 12. Основные группы фенов рисунка покровов у имаго колорадского жука.
А – рисунок темени, Б – затылка, В – пронотума (переднеспинки), Г – элитр (надкрыльев).
Установленный рядом исследователей высокий уровень фенетического полиморфизма у имаго колорадского жука, изучавшегося ранее по описаниям отдельных фенов и их вариаций, привел нас к предположению о полиморфизме по степени меланизации покровов. Мы выделили два альтернативных фенотипа – ахромистов и меланистов, а также промежуточный тип. Для них установлены существенные различия как по уровню содержания катехоламинов, и динамике активности фенолоксидазной системы, так и по динамике локомоторной активности при стрессах различной природы (Беньковская и др., 2004;
Беньковская, 2006).
Генетические основы и фенотипические проявления устойчивости колорадского жука к инсектицидам. Для Уфимского района в 2005 году цифра смертности при применении ДК малатиона составляла всего 2.5%. Для установления распределения частот встречаемости аллелей гена AChE мы провели ДНК-типирование 98 образцов колорадского жука из локальной популяции Уфимского района Башкортостана (Беньковская и др., 2008).
Анализ данных генотипирования имаго колорадского жука по наличию мутации гена AChE, показал, что в модельной локальной популяции не выявлены особи с генотипом SS дикого типа, обуславливающим нативный уровень чувствительности вида к ФОС (рис. 13).
Особи, несущие гомозиготный генотип RR, соответствующий наличию мутации, составили в анализируемой выборке долю, равную 0.79;
носители гетерозиготного генотипа SR – равную 0.21.
При оценке взаимосвязи между фенетическим полиморфизмом имаго по степени меланизации рисунка покровов (Беньковская и др., 2004) и генетическим полиморфизмом по наличию мутации гена AChE установлено, что распределение частот встречаемости мутантного аллеля между фенотипами неравнозначно. Среди А-типа (ахромистов), в данной выборке представленного долей 0.15, доля гетерозигот составляет 0.43, гомозигот RR – 0.57 соответственно. Для особей, относящихся к меланистам, соотношение резко сдвинуто в сторону преобладания RR-генотипов: их доля составляет 0.85. Проверка нулевой гипотезы с применением критерия Стьюдента для k60 и 5-% уровня значимости подтвердила неслучайный характер смещения распределения SR- и RR-генотипов в фенотипах П и М.
Рисунок 13. Электрофореграмма ПЦР-фрагментов гена AChE колорадского жука. Результаты bi-PASA-анализа.
RR – резистентные гомозиготы (фрагмент длиной в 126 п.о.), SR – гетерозиготы (фрагменты длиной в 206 и 126 п.о.). Фрагмент длиной в п.о. – продукт ПЦР с участием двух внешних праймеров.
Достаточно большое количество гетерозигот с мутацией гена AChE среди ахромистов – результат наличия именно у этих особей компонента конститутивной устойчивости, возможно, связанного с повышенной плотностью покровов (эндокутикулярного слоя) и кишечного эпителия. На основе полученных данных нами выдвинуто предположение об участии в формировании рисунка двух независимых генетических систем, котролирующих биосинтез меланина и плотность покровов. При отсутствии интенсивных внешних воздействий на какую-либо локальную выборку достаточно большого объема соотношение между частотами встречаемости ахромистов, промежуточного типа (объединяющего многообразные вариации сочетаний рисунка пронотума и головы) и меланистов может быть близким к соотношению 1:2:1.
Для проверки предположения о таком соответствии частотного распределения фенотипов был предпринят анализ выборки имаго летней генерации сбора 2007 года на картофельной плантации в Миякинском районе Башкортостана. Распределение частот фенов было оценено как с ранжированием по трем морфотипам – ахромисты, промежуточный тип и меланисты, так и по каждой феноморфе с помощью критерия 2 (Лакин, 1990). В таблице 9 приведены результаты проверки гипотезы о соответствии ожидаемому распределению частот морфотипов. Рассчитанное для фактического распределения значение 2 при k=2 и Р 0.99 означает достоверное соответствие теоретически рассчитанному распределению.
Таблица 9. Распределение частот морфотипов имаго колорадского жука в локальной популяции Миякинского района (летняя генерация, без обработок инсектицидами) Морфотипы Ахромисты Промежуточный Меланисты Всего особей Фактические 255 567 233 частоты, (0.244) (0.543) (0.223) Ожидаемые 261 522 частоты, ’ (0.250) (0.50) (0.250) 2 =7.021 St =7. Полученные нами данные подтверждают предположение о том, что выявленные закономерности – свидетельство существования независимо наследуемых генетических комплексов, контролирующих биосинтез меланина и плотность покровов имаго. Таким образом, фенотипический полиморфизм в популяциях колорадского жука можно считать проявлением полиморфизма по типу стратегий адаптациогенеза Факторы поддержания экспансии вида. Экспансия вида, носящая характер экологического взрыва, позволяет предположить, что в настоящее время высокая скорость распространения вида и одновременно – внутривидовой дифференциации и формирования демовой структуры популяций может поддерживаться всеми известными формами отбора.
Полиморфизм стратегий адаптациогенеза, находящий отражение в полиморфизме по типу стресс-реакции и обеспеченный высоким уровнем генетического полиморфизма, наряду с высокой экологической пластичностью и уровнем адаптивного потенциала видимо, следует считать основными факторами поддержания экспансии вида на территории евразийского материка. Экспансия может быть расценена, как проявление стресс-реакции на видовом уровне.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Итоги нескольких циклов исследований позволяют сформулировать концепцию роли стресса и стресс-реакций в реализации адаптивного потенциала насекомых.
Стресс-реакция в экспериментальных условиях на «чрезвычайный» действующий фактор развивалась на всех уровнях организации – на клеточном (транскрипционная активность ряда генов, активность ферментов фенолоксидазного и гидролазного комплексов), организменном (локомоторная активность) и популяционном (изменения демографических характеристик и уровней чувствительности/устойчивости, смещение баланса частот фенетических характеристик). Максимальные и минимальные значения параметров, регистрируемых в ходе развития стресс-реакции насекомых, могут служить для оценки уровня адаптивного потенциала.
Средние значения этих величин имеют видовую специфику, а размах изменчивости позволяет оценить степень гетерогенности исследуемых популяций.
При условии совпадения во времени нескольких чередующихся стрессорных воздействий формирование ответа в период реабилитации и мобилизации нарушает нормальное развитие адаптивной реакции. Стресс реакция развивается по синтоксическому пути, что приводит к дистрессу – явлениям декомпенсации нарушений, чрезмерной кратковременной интенсификации метаболизма, углубляющей дисбаланс, и как следствие – к развитию патологических процессов, заканчивающихся гибелью особи и нарушениями популяционной структуры.
Стресс-реакция на воздействие, переживаемое насекомыми в онтогенезе однократно на преимагинальной стадии, может стать пусковым сигналом для формирования онтогенетических адаптаций, способных в ряду поколений закрепляться на уровне генотипа. Пути адаптациогенеза для отдельных структурных элементов популяции могут быть различными, а специфика воздействующего фактора и пространственная изоляция ускоряют процесс формирования адаптаций, что удалось показать в экспериментах по формированию устойчивости к стресорным воздействиям разной модальности в лабораторных популяциях комнатной мухи.
Стресс-реакция, слагающаяся из латентной фазы, периода реабилитации, периода мобилизации (составные части стадии реакции тревоги), стадий резистентности и истощения, на каком бы уровне она ни проявлялась, имеет закономерный профиль динамики регистрируемых показателей. Параметры реакции позволяют использовать модели стрессовых ситуаций для оценки состояния как особи, так и популяций и групп более низкого ранга, что было проверено на семьях медоносной пчелы Apis mellifera L. Полученные в экспериментах результаты свидетельствуют о неблагоприятном эффекте гибридизации, приведшей к дисбалансу и разрушению сложившихся коадаптированных к различным эколого климатическим условиям генетических комплексов и, таким образом, об отрицательном эффекте повышенного в условиях зоны гибридизации уровня гетерозиготности.
Выявление адаптационного полиморфизма особей Leptinotarsa decemlineata Say в условиях температурных и токсических стрессов в сочетании с анализом фенотипической структуры локальных популяций вида на территории Республики Башкортостан дает основания считать стресс мощным преадаптивным стимулом, поддерживающим состояние экспансии вида при расселении на новых для него территориях. Полиморфная пространственно-временная структура популяций позволяет сохранять высокий уровень адаптивного потенциала даже в неблагоприятных условиях фронта расселения.
ВЫВОДЫ 1. Общность фазного характера стресс-реакции насекомых и соответствие ее схеме развития стресс-реакции для теплокровных позвоночных показана на примерах колорадского жука, комнатной мухи и медоносной пчелы. Установлена сложная структура стадии реакции тревоги в ходе развития стресс-реакции насекомых. Успех перенесения нескольких последовательных стрессогенных воздействий у насекомых определяется совпадением фаз развития предыдущей и последующей стресс-реакции.
2. Воздействие стрессоров в интенсивности, соответствующей сублетальным дозировкам, вызывает эффект гормезиса – стимуляции жизнеспособности и плодовитости насекомых, как в лабораторных, так и в природных популяциях.
3. Эффекты метизации рас (подвидов) A. m. mellifera и A. m.
caucasica в семьях медоносной пчелы на территории Республики Башкортостан в зоне гибридизации проявляются в снижении устойчивости к неблагоприятным воздействиям и жизнеспособности как результат разрушения коадаптированных генетических комплексов родительских генотипов. Параметры стресс-реакции позволяют оценить состояние семей и расовую принадлежность.
4. Несбалансированность компонентов защитной неспецифической реакции в условиях экспериментальных стрессов у особей медоносной пчелы из интродуцируемых на территории Республики Башкортостан семей южных рас (подвидов) свидетельствует о развитии стресса, вызванного незавершенными процессами акклиматизации.
5. На моделях формирования устойчивости к разнотипным стрессогенным воздействиям в лабораторных популяциях комнатной мухи установлен закономерный характер снижения внутрипопуляционного разнообразия на протяжении 10 поколений селекции и последующее восстановление этого уровня при продолжении селекции. Стресс-реакция на преимагинальных стадиях развития комнатной мухи исполняет роль преадаптивного стимула, обуславливающего наряду с отбором изменения популяционной структуры и способствующего реализации адаптивного потенциала особи и популяции.
6. Формирование устойчивости к стрессогенным воздействиям в лабораторных популяциях комнатной мухи сопровождается формированием физиолого-биохимических адаптаций, частный характер которых свидетельствует о полиморфизме путей реализации адаптивного потенциала в исходной группе (популяции).
7. Высокий адаптивный потенциал вида Leptinotarsa decemlineata Say (изменение вольтинности;
приуроченность стадий развития летней генерации к фенофазам развития картофеля и установлению среднесуточных температур, соответствующих температурному оптимуму вида;
способность самок уходить в зимнюю диапаузу с запасом спермы) обуславливает характер расселения на территории Республики Башкортостан, соответствующий экспансии.
8. В основе происходящих на территории РБ микроэволюционных процессов в популяции колорадского жука, выражающихся в формировании локальных популяций, различающихся фенотипической структурой как по фенетическим признакам рисунка покровов, так и по чувствительности к действию инсектицидов и колебаний температуры, лежит высокий уровень генетического полиморфизма, реализуемый в полиморфизме стратегий адаптациогенеза.
9. Скорость расселения колорадского жука и микроэволюционных преобразований, способствующих поддержанию высокой численности вида в агроценозах картофеля, позволяют сделать заключение о стресс индуцируемой эволюции вида, в которой основными движущими силами являются высокий уровень адаптивного потенциала и антропогенные воздействия.
Основные публикации по теме диссертации:
Журналы списка ВАК, рекомендованные для публикации основных материалов докторских диссертаций:
1. Никоноров Ю.М., Беньковская Г.В., Поскряков А.В., Николенко А.Г., Вахитов В.А., 1998. Контроль чистопородности пчелосемей Apis mellifera mellifera L. с использованием метода полимеразной цепной реакции в условиях Южного Урала. // Генетика. № 11.
1574-1577.
2. Беньковская Г.В., Поскряков А.В., Николенко А.Г., 2000.
Влияние метопрена на переносимость теплового шока в онтогенезе колорадского жука. // Агрохимия.. №12. С.58-61.
3. Беньковская Г.В., Салтыкова Е.С., Поскряков А.В., Николенко А.Г., 2001. Влияние хитина и его производных на онтогенез колорадского жука.// Агрохимия.№6. С.73-77.
4. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Поскряков А.В., Николенко А.Г., 2001. Влияние хитосахаридов на медоносную пчелу Apis mellifera L. // Агрохимия. №2. С.70-73.
5. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Поскряков А.В., Николенко А.Г., 2002. Влияние хитосахаридов на биохимические процессы медоносной пчелы при экстремально высокой и низкой температурах // Агрохимия. №3. С. 62-66.
6. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Поскряков А.В., Сухорукова О.В., Николенко А.Г., 2003. Экспрессия фенолоксидазной системы при использовании хитосахаридов в качестве иммуномодуляторов // Журнал эволюционной биохимии и физиологии.. N 4. С.346-350.
7. Удалов М.Б., Поскряков А.В., Беньковская Г.В., Николенко А.Г., 2003. Молекулярно-биологические методы мониторинга резистентности к инсектоакарицидам в популяциях членистоногих. // Агрохимия. № 6. С. 81 – 88.
8. Гайфуллина Л.Р., Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Николенко А.Г., 2004. Иммунные реакции личинок и имаго колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say) при применении препарата биологической защиты картофеля // Агрохимия. №9. С. 1-7.
9. Беньковская Г.В., Удалов М.Б., Поскряков А.В., Николенко А.Г., 2004. Феногенетический полиморфизм колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say и его чувствительность к инсектицидам на территории Башкирии // Агрохимия. №12. C.
23-28.
10. Беньковская Г.В., Николенко А.Г., Салтыкова Е.С.,. Ишмуратова Н.М., Харисов Р.Я., Ишмуратов Г.Ю., 2005. Адаптогенное действие препарата биосил на медоносную пчелу и комнатную муху // Агрохимия. №3. С. 74-78.
11. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Гайфуллина Л.Р., Новицкая О.П., Поскряков А.В., Николенко А.Г., 2005. Реакция отдельных физиологических барьеров при бактериальной инфекции у различных рас медоносной пчелы Apis mellifera // Журнал эволюционной биохимии и физиологии.Т.41. № 3. С.254-258.
12. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Сухорукова О.В., Удалов М.Б., Поскряков А.В., Николенко А.Г., 2005. Внутривидовые различия гуморального защитного ответа у медоносной пчелы Apis mellifera // Журнал эволюционной биохимии и физиологии.
Т.41. №4. С.314-318.
13. Салтыкова Е.С., Львов А.В., Беньковская Г.В., Поскряков А.В., Николенко А.Г., 2005. Межрасовые различия экспрессии генов антибактериальных пептидов абецина, гименоптецина, дефензина у пчел Apis mellifera mellifera и Apis mellifera caucasica // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. Т.41. №5.
С.404-407.
14. Соколянская М.П. Беньковская Г. В., Николенко А. Г., 2005.
Динамика формирования резистентности личинок комнатной мухи к стресс-факторам различной природы. / Агрохимия. № 9.
С.70-75.
15. Соколянская М.П., Медведева Н.И., Флехтер О.Б., Беньковская Г.В., Николенко А.Г., Галин Ф.З., 2005. Антифидантная активность аллобетулина и его производных в отношении личинок колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata)//Агрохимия. №12. С.48-50.
16. Беньковская Г.В., Салтыкова Е.С., Сухорукова О.В., Николенко А.Г., 2006. Метаболическая регуляция двух типов фенолоксидазной активности в онтогенезе комнатной мухи // Онтогенез. Т. 37. № 2. С. 142-148.
17. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Николенко А.Г., 2007.
Внутривидовые различия в механизмах формирования защитных процессов у медоносной пчелы Apis mellifera // Журнал эволюционной биохимии и физиологии.Т.43. №2. С.162-167.
18. Беньковская Г.В., Удалов М.Б., Хуснутдинова Э.К., 2008.
Генетическая основа и фенотипические проявления резистентности колорадского жука к фосфорорганическим инсектицидам // Генетика. Т.44. №5. С.638-644.
19. Беньковская Г.В., Соколянская М.П., 2008. Чувствительность к тепловому стрессу имаго комнатной мухи лабораторных линий, селектированных инсектицидами и абиотическими факторами // Агрохимия.. №3. С. 52-56.
20. Беньковская Г.В., Леонтьева Т.Л., Удалов М.Б., 2008.
Резистентность колорадского жука к инсектицидам на Южном Урале // Агрохимия.. №8. С. 55-59.
Статьи в журналах, сборниках, монографиях:
1. Никоноров Ю.М., Беньковская Г.В., Поскряков А.В., Николенко А.Г., 1998. Структура межгенного участка CO-I CO-II как генетический маркер Apis mellifera // Материалы междунар.
Симпозиума "Молекулярная генетика и биотехнология". Минск.
С.76-78.
2. Беньковская Г.В., Никоноров Ю.М., Сухорукова О.В., Львов А.В., Николенко А.Г., 1999. Экспрессия гена профенолоксидазы у медоносной пчелы как компонент защитной реакции на инфекцию // Актуальные проблемы современной биохимии и биотехнологии. Челябинск: ЧГМА. С. 68-70.
3. Беньковская Г.В., 2006. Дифференциация жизненных стратегий и фенотипы имаго Leptinotarsa decemlineata Say // Особь и популяция. Материалы IX Всероссийского популяционного семинара. Уфа, 2-6 октября 2006 г. Уфа. Ч.1. С.
23-28.
4. Leontieva T.L., Benkovskaya G.V., Udalov M.B. and Poscryakov A.V., 2006. Insecticide resistance level in Leptinotarsa decemlineata Say population in the South Ural // Resistant Pest Management Newsletter. Vol. 15. No. 2 (Spring 2006). Р. 25- 26.
5. Benkovskaya G.V., Udalov M.B., Nikolenko A.G. and Leontieva T.L., 2006. Temporal and toxicological dynamics in the cover spot patterns of the Colorado Potato Beetle in South Ural. // Resistant Pest Management Newsletter. Vol. 15. No. 2 (Spring 2006).Р. 13- 15.
6. Udalov M.B., Benkovskaya G.V.and Leontieva T.L., 2006.
Population structure of Colorado Potato Beetle Leptinotarsa decemlineata Say in the South Urals // Resistant Pest Management Newsletter. Vol. 16. No. 1. P. 25- 7. Удалов М.Б., Lindstrom L., Серебров В.В., Умаров И.А., Никоноров Ю.М., Беньковская Г.В., 2008. Микроэволюционные процессы в формирующихся популяциях колорадского жука // Любищевские чтения. 2008. Современные проблемы эволюции (сборник докладов). Т.1. Ульяновск: УлГПУ. С. 249-252.
8. Беньковская Г.В., Никоноров Ю.М., 2008. Полиморфизм рисунка покровов имаго колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say (Coleoptera: Chrysomelidae) на Южном Урале // Любищевские чтения. 2008. Современные проблемы эволюции (сборник докладов). Т.2. Ульяновск: УлГПУ. С. 198-204.
9. Udalov M.B., Benkovskaya G.V., 2008. Application of bi-PASA and development of PCR -REN for detection of point mutation 980AG in AChE gene of Colorado Potato Beetle in South Ural’s local population // Resistant Pest Management Newsletter. Vol. 17.
No. 2 (Spring 2008). Р. 15- 16.