Полиморфизм тайтина поперечно-полосатых мышц в норме, при адаптации и патологии
На правах рукописи
ВИХЛЯНЦЕВ ИВАН МИЛЕНТЬЕВИЧ ПОЛИМОРФИЗМ ТАЙТИНА ПОПЕРЕЧНО-ПОЛОСАТЫХ МЫШЦ В НОРМЕ, ПРИ АДАПТАЦИИ И ПАТОЛОГИИ 03.01.02 – Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Пущино – 2011
Работа выполнена в лаборатории Структуры и функции мышечных белков Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино.
Заслуженный деятель науки РФ,
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Подлубная Зоя Александровна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Чемерис Николай Константинович доктор биологических наук, профессор Ширинский Владимир Павлович доктор биологических наук, профессор Мошков Дмитрий Алексеевич
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН, Екатеринбург.
Защита диссертации состоится " " 2011 г. в час. мин.
на заседании совета Д 002.093.01 01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.
Автореферат диссертации разослан "_" _ 2011 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат физико-математических наук Н.Ф. Ланина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования До открытия тайтина мышечное сокращение рассматривалось с позиции взаимодействия двух типов нитей: толстых (миозиновых) и тонких (актиновых). Открытие тайтина (коннектина) (Wang et al., 1979;
Maruyama et al., 1981) не только разрушило старые представления о двунитевой структуре саркомера, но и определило интерес многих исследователей к выяснению роли этого белка в поддержании структуры и функционировании саркомера и мышцы в целом. В настоящее время известно, что тайтин – гигантский эластичный белок в саркомерах поперечно-полосатых мышц позвоночных (Labeit, Kolmerer, 1995;
Tskhovrebova, Trinick, 2010). Молекулярные массы известных изоформ тайтина (N2A, N2B и N2BA) составляют 3000000- Да (Freiburg et al., 2000;
Guo et al., 2010). Молекулы тайтина, перекрывая расстояние от М-линии до Z-диска, формируют третью филаментную систему в миофибриллах и составляют по количеству ~15% от массы саркомерных белков (Tskhovrebova, Trinick, 2010). В А-зоне саркомера тайтин связан с миозиновыми нитями. В I-диске саркомера тайтин проходит свободно, соединяя концы миозиновых нитей с Z-мембраной (Granzier, Labeit, 2004).
Исследования, проведенные за последние 20 лет, показали, что тайтин является одним из ключевых компонентов саркомера поперечно-полосатых мышц позвоночных, играющим важную роль в сборке толстых нитей, формировании высокоупорядоченной структуры саркомера, регуляции актин-миозинового взаимодействия и процессов внутриклеточной сигнализации (Granzier, Labeit, 2004;
Lange et al., 2005;
Linke, Krger, 2010;
LeWinter, Granzier, 2010;
Gautel, 2011). Однако огромная молекулярная масса тайтина, а также способность этого белка легко деградировать во время препаративных процедур сильно затрудняют исследование его структурно-функциональных свойств, вследствие чего не все свойства тайтина в норме до конца изучены. Необходимо выяснение роли тайтина в регуляции актин-миозинового взаимодействия и, в частности, вклада этого белка в Са2+-чувствительность развития силы.
Остается нерешённым вопрос о связывании тайтина с актином в саркомере и функциональной значимости такого взаимодействия. Недостаточно широко исследован изоформный состав тайтина в мышцах животных и человека, и не открыты изоформы тайтина с м.м. более 3700 кДа, хотя ген тайтина может кодировать белок с м.м. 4200 кДа (38138 аминокислотных остатка) (Guo et al., 2010). Не совсем ясно, как на уровне половины саркомера функционируют изоформы тайтина, имеющие разную длину растяжимой I-области молекулы этого белка. Несомненно, что присутствие в саркомере разных изоформ тайтина имеет важное физиологическое значение для функционирования мышцы.
Не изучена роль тайтина в мышцах при изменении условий внешней среды, включая экстремальные, в частности, при зимней спячке и микрогравитации. Интерес, проявляемый к изучению зимней спячки (гибернации) млекопитающих, определяется, прежде всего, способностью зимоспящих животных адаптироваться к неблагоприятным условиям среды за счёт снижения активности всех физиологических систем организма, включая мышечную, при сохранении контроля за согласованностью их действия (L.
Wang, 1987). Поскольку при гибернации животные длительное время пребывают в обездвиженном состоянии, после чего за несколько часов способны перейти к нормальной двигательной активности без патологических последствий, есть основания ожидать, что в мышцах зимоспящих происходят обратимые адаптационные изменения, которые могут вносить вклад в смену физиологического состояния животного. Проведённые исследования показали, что изменения структурно-функциональных свойств миозина и связанных с ним белков (С-белка, Х-белка) вносят вклад в адаптацию поперечно-полосатых мышц зимоспящих животных к условиям гибернации (Morano et al., 1992;
Лукоянова и др., 1997;
Вихлянцев и др., 2002;
Rourke et al., 2004;
Зуйкова и др., 2005;
Малышев и др., 2006). Исследования роли тайтина в адаптации мышц к условиям зимней спячки не проводились. Не изучен вклад тайтина в развитие «гипогравитационного мышечного синдрома», который наблюдается у человека и животных в условиях моделируемой или реальной невесомости.
Этот синдром проявляется в развитии атрофии скелетных позно-тонических мышц, сопровождающейся уменьшением объёма мышечных волокон, деструктивными изменениями миофибриллярного аппарата, снижением тонуса, выносливости и общей работоспособности мышц (Григорьев и др., 2004). На фоне описанных изменений выявлено снижение содержания N2A изоформы тайтина в m. soleus крысы после 14-суточного пребывания в условиях моделируемой микрогравитации (Toursel et al., 2002), что сопровождалось изменением эластичных свойств мышцы. Однако исследования возможных изменений сократительных свойств мышцы вследствие уменьшения содержания тайтина не проводились. Известны данные, свидетельствующие об атрофии сердечной мышцы человека и животных в условиях реальной или моделируемой микрогравитации (Baraska et al., 1990;
Goldstein et al., 1992;
Perhonen et al., 2001). Однако какие при этом происходят изменения качественного и количественного состава тайтина в сердечной мышце, и каково функциональное значение этих изменений, остаётся неясным. Следует обратить внимание на отличительную особенность атрофических изменений в мышцах при гибернации и микрогравитации. В отличие от негативных последствий атрофии мышц в условиях микрогравитации, приводящих к длительному нарушению сократительных свойств мышц, атрофические изменения в мышцах в период зимней спячки легко обратимы при пробуждении животного и не влекут за собой патологических последствий (Lee, at al., 2008). Однако причина подобных различий неясна.
Тайтин играет важную роль не только в физиологии, но и в патофизиологии мышц. Исследования последних лет показали, что патогенез ряда мышечных заболеваний сопровождается изменениями в изоформном составе, содержании тайтина и экспрессии гена этого белка (LeWinter, Granzier, 2010;
Ottenheijm, Granzier, 2010). Однако имеющиеся литературные данные противоречивы. В частности, выявлены противоположные изменения в содержании N2BA- и N2B-изоформ тайтина при развитии дилатационной кардиомиопатии (ДКМП) у человека (Makarenko et al., 2004;
Nagueh et al., 2004) и собаки (Wu et al., 2002;
Jaber et al., 2008). В гипертрофированном сердце спонтанно-гипертензивных крыс (SHR) выявлено уменьшение содержания N2BA-изоформы тайтина (Warren et al., 2003), тогда как при развитии гипертрофической кардиомиопатии (ГКМП) у человека не обнаружено изменений в содержании и изоформном составе этого белка (Hoskins et al., 2010). В скелетных мышцах человека при развитии миодистрофий одними авторами обнаружено уменьшение содержания тайтина (Matsumura et al., 1990;
Cullen et al., 1992), тогда как другими исследователями подобных изменений в содержании этого белка не зарегистрировано (Horowits et al., 1990). Противоречивость имеющихся литературных данных не позволяет сделать чётких заключений о роли разных изоформ тайтина в патогенезе исследуемых заболеваний. Несомненно, что для лучшего понимая роли тайтина при патологии необходимо более детальное исследование структурно функциональных свойств этого белка в норме и при адаптации. Поэтому сравнительное исследование структурно-функциональных свойств тайтина в норме и их изменений при адаптационных и патологических процессах является актуальной фундаментальной задачей и имеет важное прикладное значение.
Цель работы: исследование структурно-функциональных свойств тайтина сердечной и скелетных мышц животных и человека в норме и их изменений при адаптационных и патологических процессах.
Задачи исследования:
1. Провести электрофоретическое исследование тайтина сердечной и скелетных мышц человека и животных для выявления новых высокомолекулярных изоформ этого белка;
2. Изучить in vitro молекулярные параметры и агрегационные свойства тайтина сердечной и скелетных мышц кролика и суслика, его связывание с актиновыми и миозиновыми нитями и влияние на ферментативные и регуляторные свойства миозина;
3. Исследовать сезонные изменения изоформного состава тайтина и степени его фосфорилирования в сердечной и скелетных мышцах зимоспящих сусликов Spermophilus undulatus;
4. Изучить вклад изменений изоформного состава тайтина в развитие «гипогравитационного мышечного синдрома» в условиях моделируемой или реальной микрогравитации;
5. Оценить эффективность разных подходов, направленных на предотвращение или уменьшение развития «гипогравитационного мышечного синдрома»;
6. Изучить изменения изоформного состава тайтина в миокарде спонтанно гипертензивных крыс (SHR) при развитии гипертрофии, в миокарде человека с конечной стадией развития ДКМП и в спинной мышце человека с синдромом «ригидного человека».
Основные положения, выносимые на защиту:
1. В поперечно-полосатых мышцах человека и животных наряду с известными N2A-, N2BA- и N2B-изоформами тайтина электрофоретическими методами обнаружено присутствие более высокомолекулярных изоформ этого белка.
2. Способность тайтина связываться in vitro с актиновыми нитями и его активирующий эффект на Са2+-чувствительность актин-активируемой АТФазы миозина указывают на участие тайтина в регуляции актин миозинового взаимодействия в мышцах.
3. Изменения в изоформном составе тайтина в сердечной и скелетных мышцах сусликов Spermophilus undulatus при зимней спячке направлены на сохранение содержания более высокомолекулярных изоформ тайтина при уменьшении (в ~1.3-1.5 раза) содержания известных изоформ этого белка.
Адаптационное значение сохранения более высокомолекулярных изоформ тайтина заключается в поддержании саркомерной структуры и необходимого уровня сократительной активности мышц сусликов в разные периоды гибернации.
4. Развитие «гипогравитационного мышечного синдрома» и патологических процессов (гипертрофия сердечной мышцы дилатационная кардиомиопатия, синдром «ригидного человека») в поперечно-полосатых мышцах человека и крысы сопровождается уменьшением (в ~1.5-2.5 раза) содержания известных N2A-, N2BA- и N2B-изоформ тайтина, а также уменьшением (в ~2-5 раз) содержания или полным разрушением более высокомолекулярных изоформ этого белка.
Научная новизна работы Разработан метод ДСН-электрофореза в крупнопористом горизонтальном геле и модифицированы известные методы ДСН-электрофореза в вертикальных гелях для исследования полиморфизма гигантского белка тайтина. С помощью этих методов получены новые данные, показывающие, что в поперечно-полосатых мышцах млекопитающих наряду с известными N2A-, N2BA- и N2B-изоформами тайтина присутствуют более высокомолекулярные изоформы этого белка. Проведено сравнительное исследование вклада изменений изоформного состава тайтина в изменения структурно-функциональных свойств в мышцах млекопитающих при адаптации к экстремальным условиям среды (гибернация, микрогравитация) и при развитии патологических процессов (гипертрофия сердечной мышцы, дилатационная кардиомиопатия, синдром «ригидного человека»). В поперечно полосатых мышцах зимоспящих сусликов Spermophilus undulatus в период гибернации обнаружено уменьшение содержания известных изоформ тайтина при сохранении содержания новых, более высокомолекулярных изоформ этого белка. Обнаруженные изменения в содержании тайтина не сопровождались нарушением структурно-функциональных свойств мышц гибернирующих животных. Сделано заключение об адаптационном значении сохранения в мышцах гибернирующих сусликов более высокомолекулярных изоформ тайтина для поддержания упорядоченной структуры миофибриллярного аппарата и необходимого уровня сократительной активности мышц при спячке и пробуждении, что способствует выходу животного из состояния гибернации без патологических последствий. В мышцах человека и животных при развитии патологических процессов и в m. soleus человека и крысы при развитии «гипогравитационного мышечного синдрома» наряду с уменьшением содержания известных изоформ тайтина обнаружено разрушение более высокомолекулярных изоформ этого белка, что сопровождалось нарушением структурно-функциональных свойств мышц. Сделано заключение о том, что главную роль в поддержании структурно-функциональных характеристик мышц играют открытые нами более высокомолекулярные изоформы тайтина, а не N2A-, N2BA- и N2B-изоформы этого белка.
Получены другие важные фундаментальные результаты, расширяющие наши представления о роли тайтина в мышцах. Обнаружена способность тайтина поперечно-полосатых мышц связываться in vitro с актиновыми нитями, а также активирующий эффект тайтина на Са2+-чувствительность актин-активируемой АТФазы миозина. Полученные результаты указывают на участие тайтина в регуляции актин-миозинового взаимодействия в мышцах.
Обнаружено увеличение степени фосфорилирования тайтина, выделенного из скелетных мышц спящих сусликов, что приводит к снижению активирующего влияния этого белка на актин-активируемую АТФазную активность и Са2+ чувствительность миозина in vitro. Сделано предположение о вкладе фосфорилирования тайтина в ингибирование сократительной активности скелетных мышц сусликов в период гибернации. Эти данные также свидетельствуют о важной роли тайтина в регуляции мышечного сокращения.
В предсердиях и желудочках сердца сусликов в период осенней подготовки животных к спячке, а также на протяжении всего гибернационного сезона выявлено двукратное увеличение доли длинных (более эластичных) изоформ тайтина. Адаптационное значение выявленных изменений заключается в повышении эластичности сердечной мышцы сусликов с целью усиления сократительного ответа миокарда для выброса более густой крови из камер сердца в период спячки и при пробуждении животного. Выявлено снижение (в ~5 раз) экспрессии гена тайтина в миокарде зимоспящих сусликов на всех фазах гибернационного цикла (спячка, пробуждение, межбаутная активность, вход в спячку), что можно рассматривать как адаптацию, направленную на минимизацию энергетических затрат в период гибернации. При развитии гипертрофии сердечной мышцы у спонтанно-гипертензивных крыс (SHR) обнаружено увеличение экспрессии гена тайтина в миокарде 15-недельных крыс и снижение экспрессии гена этого белка в миокарде 26-недельных крыс.
Полученные результаты расширяют наши представления о молекулярных механизмах развития патологических изменений в гипертрофированной сердечной мышце.
Научная и практическая значимость работы Полученные данные вносят вклад в формирование современных представлений о структурно-функциональных свойствах тайтина в мышце в норме, при адаптации и патологии. Разработанные электрофоретические методы, позволяющие выявлять более высокомолекулярные интактные изоформы тайтина, открывают новые возможности для дальнейших исследований вклада этих форм тайтина в функционирование мышцы в норме и при развитии адаптационных и патологических процессов. Изучение адаптационных изменений изоформного состава тайтина в мышцах зимоспящих сусликов помогло понять причины нарушений структурно функциональных свойств в мышцах человека и животных при развитии патологических процессов. Полученные результаты имеют большое практическое значение, поскольку тестирование изменений качественного и количественного состава тайтина в мышцах может быть использовано в медицинской практике с целью диагностики развития патологических процессов и оценки эффективности подходов к их коррекции. Результаты исследований по связыванию тайтина с актином и влиянию тайтина на Са2+ чувствительность актин-активируемой АТФазы миозина важны для лучшего понимания механизма актин-миозинового взаимодействия в мышце в норме и могут быть полезны для выяснения причин нарушения сократительных свойств мышцы при развитии патологии. Данные об изменении экспрессии гена тайтина в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс линии SHR могут быть использованы в диагностике развития гипертрофии сердечной мышцы.
Результаты работы используются при чтении курса лекций по биофизике и биохимии мышечного сокращения и биологической подвижности студентам и слушателям на биологических факультетах МГУ и ПущГУ.
Апробация работы Результаты исследований и основные положения работы были представлены и обсуждены на многих российских и международных конференциях, в частности, на: 29-ой, 31-37-ой Европейских мышечных конференциях (Berlin, Germany, 2000;
Lunteren, Netherlands, 2002;
Montpellier, France, 2003;
Isola d'Elba, Italy, 2004;
Hostobagy, Hungary, 2005;
Heidelberg, Germany, 2006;
Stockholm, Sweden, 2007;
Keble College, Oxford, England, 2008);
Международных симпозиумах “Biological motility” (Пущино, 2001, 2004;
2006;
2008;
2010);
Международных симпозиумах по термофизиологии (Минск, Беларусь, 2000, 2002);
Всероссийских конференциях с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2002, 2008);
Всероссийских школах-конференциях по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва, 2003, 2005, 2010);
24-27-ом Международных гравитационных физиологических съездах (Santa-Monica, USA, 2003, Moscow, Russia, 2004, Cologne, Germany, 2005;
Angers, France, 2008);
Конференциях молодых ученых, посвященных дню космонавтики (Москва, 2004, 2005, 2008);
Пущинских конференциях молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2001-2006, 2009, 2010);
Международной конференции «Стресс и висцеральные системы» (Минск, Беларусь, 2005);
XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005» (Москва, 2005);
I и II Съездах физиологов СНГ (Сочи, 2005;
Кишинев, Молдова, 2008);
15-ой Международной конференции “Human in Space” (Graz, Austria, 2005);
15-ом Международном биофизическом конгрессе (Montpellier, France, 2005);
Международной конференции «Медико-биологические аспекты действия физических факторов» (Минск, Беларусь, 2006);
Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007);
Международном Междисциплинарном симпозиуме «От Экспериментальной Биологии к Превентивной и Интегративной Медицине (EXB+PIM’07) (Судак, Украина, 2007);
Joint British-Russian young scientists workshop “Muscles:
structure, function and regulation” (Yekaterinburg, Russia, 2007);
4-ом и 5-ом Международном Междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2008, 2009);
7-ом Европейском биофизическом конгрессе (Genova, Italy, 2009);
30-ом и 34-ом FEBS конгрессах (Budapest, Hungary, 2005;
Prague, Czech Republic, 2009);
Конференции молодых научных сотрудников ИТЭБ РАН «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2009);
Международной научно-практической конференции «Человек и животные» (Астрахань, 2010);
ХVIII, XX, XXI Съездах физиологов России (Казань, 2001;
Москва, 2007;
Калуга, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 92 печатных работы, в том числе 29 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных изданиях.
Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 235 страницах, содержит 42 рисунка и 28 таблиц. Список цитируемой литературы включает 449 источников.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Экспериментальный и клинический материал Для выделения тайтина с целью изучения in vitro его структурно функциональных свойств были использованы быстрая скелетная мышца psoas и медленная скелетная мышца soleus кролика породы Шиншилла, скелетные мышцы спины, верхних и нижних конечностей зимоспящего якутского суслика Spermophilus undulatus, а также левый желудочек сердца этих животных.
Суслики содержались в условиях вивария ИБК РАН (Пущино) в индивидуальных клетках при естественном фотопериоде. Обеспечивались пищей, водой и гнездовым материалом ad libitum. Для выделения тайтина были использованы мышцы сусликов разных физиологических состояний: летних активных (май-сентябрь);
гибернирующих (спящих) (конец ноября-март, температура сердечной мышцы 2-5С, продолжительность баута спячки 7- суток) и пробуждающихся (температура сердечной мышцы 15-32С, ректальная температура 10-27С, время пробуждения 1.5-2.5 часа) животных.
Подготовку сусликов к эксперименту и контроль их физиологического состояния проводили совместно с сотрудниками лаборатории механизмов природных гипометаболических состояний ИБК РАН.
Для исследования изоформного состава тайтина в поперечно-полосатых мышцах млекопитающих в норме были использованы отдельные мышцы спины, брюха, передних и задних конечностей кролика, суслика, крысы (линия Wistar Kyoto), мыши (линия С57BL/6) и монгольской песчанки (Meriones unguiculatus), сердечная мышца этих животных, а также m. soleus, m. quadriceps femoris и m. vastus lateralis человека.
Для изучения сезонных изменений изоформного состава тайтина в сердечной и скелетных мышцах, а также экспрессии гена тайтина в миокарде зимоспящих сусликов использовали животных разных физиологических состояний: летних активных (май-сентябрь);
осенних активных (октябрь середина ноября);
гибернирующих (конец ноября-март, температура сердечной мышцы 2-5С, продолжительность баута спячки 7-14 суток);
пробуждающихся (температура сердечной мышцы 20-32С, время пробуждения 1.5-2.5 часа);
зимних активных (активность от нескольких часов после пробуждения до двух суток) и входящих в спячку (температура сердечной мышцы 15-30С).
Для исследований изменений изоформного состава тайтина, а также экспрессии гена этого белка в левом желудочке сердца спонтанно гипертензивных крыс (линия SHR) были использованы 2 возрастные группы этих животных: 15-недельные, на ранних сроках развития гипертрофии, и 26 недельные, с выраженной гипертрофией сердца. В качестве контрольных животных использовались крысы линии Wistar Kyoto в возрасте 17 недель.
Экспериментальные животные были предоставлены питомником корпуса Биомедицинских исследований ФИБХ РАН (Пущино).
Для исследования изменений тайтина в мышцах человека при патологии был использован следующий клинический материал: биопсии левого желудочка сердца с диагностированной конечной стадией ДКМП (IV стадия, NYHA), n=4;
биопсии скелетной мышцы, выпрямляющей позвоночник, от трёх пациентов с синдромом «ригидного человека». Продолжительность развития заболевания более двух лет. Данный клинический материал был предоставлен Научным Центром сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН и ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росздрава (биопсии левого желудочка сердца) и Клиникой нервных болезней им. А.Я.
Кожевникова ММА им. И.М. Сеченова (биопсии скелетной мышцы пациентов с синдромом «ригидного человека»). Клиникой нервных болезней также были предоставлены биопсии мышц m. quadriceps femoris и m. vastus lateralis человека, используемые в качестве контроля. Взятие экспериментального материала было одобрено этическим комитетом РАМН.
Для изучения изменений тайтина в мышцах человека и животных в условиях микрогравитации были использованы аутопсийные образцы m. soleus крыс, а также биопсии m. soleus человека, взятые до и после проведения экспериментов по моделированию условий гравитационной разгрузки. В работе также использовались аутопсийные образцы скелетных мышц m. soleus и m. tibialis anterior и левого желудочка сердца монгольской песчанки (Meriones unguiculatus), взятые до и после 12-суточного пребывания животных в условиях космического полёта на борту искусственного спутника Земли «Фотон-М3». Песчанки были отловлены в Монголии и содержались в виварии ГНЦ РФ – ИМБП РАН (Москва).
Выделение и очистка белковых препаратов Тайтин из сердечной и скелетных мышц кролика и суслика выделяли по методу (Soteriou et al., 1993). Для изучения влияния тайтина поперечно полосатых мышц кролика и зимоспящего суслика на структурные и функциональные свойства миозиновых нитей использовали миозин из сердечной или скелетных мышц кролика. Методики получения миозина описаны в работах (Offer et al., 1973, скелетный миозин) и (Margossian, 1985, сердечный миозин). Актин из скелетных мышц кролика выделяли по методу, описанному в работе (Pardee, Spudich, 1982).
Измерение АТФазной активности актомиозина в присутствии тайтина АТФазная активность реконструированного актомиозина кролика измерялась по выходу неорганического фосфата с использованием колориметрического метода на основе красящего агента малахитового зеленого (Lanzetta et al., 1979). Реакцию инициировали добавлением миозиновых нитей, предварительно сформированных в присутствии или в отсутствие тайтина, к раствору, содержащему необходимые количества актина и АТФ. Соотношение миозина к тайтину по весу составляло 4:1. Расчет Са2+ чувствительности актин-активируемой АТФазной активности миозина производился по формуле (Lehman, Szent-Gyorgyi, 1975): Са2+ чувствительность (%) = 100·[(АТФазаСа) - (АТФазаЕГТА)] / АТФазаЕГТА, где АТФазаЕГТА - АТФазная активность при рСа 7.5;
АТФазаСа - АТФазная активность при рСа 4.6.
Электронно-микроскопические исследования Для приготовления электронно-микроскопических образцов использовали препараты белков с концентрацией 0.05-0.1 мг/мл. Электронно микроскопические исследования проводили, используя негативно окрашенные образцы. Одиночные выпрямленные молекулы тайтина получали по методу (Tskhovrebova, Trinick, 1997).
Гель-электрофорез белков в присутствии ДСН и денситометрия Для обнаружения изоформ тайтина и их изовариантов с молекулярной массой более 3000 кДа, применялись крупнопористые полиакриламидные мини-гели (810 см) с добавлением агарозы по методу (Tatsumi, Hattori, 1995) с нашими модификациями. Методика приготовления таких гелей заключалась в следующем: к раствору, содержащему определенное количество акриламида (соотношение акриламида к бис-акриламиду 36.5:1.0), додецилсульфата натрия (ДСН), трис-HCl буфера, рН 8.9–9.0 и нагретому до температуры 40°С, добавляли расплавленную агарозу до концентрации 0.5–0.6%. Конечная концентрация акриламида составляла 2.0–2.3%, ДСН – 0.1%, трис-HCl буфера – 0.375 М. Полимеризация инициировалась добавлением 0.058% тетраметилэтилендиамина и 0.075% персульфата аммония. Полученный раствор максимально быстро заливали между двух охлаждённых (а не нагретых, как принято) вертикально расположенных стёкол, вставляли гребёнку и в течение первых 15 минут полимеризовали при температуре 5–6°С.
Этого времени было достаточно для застывания агарозы, после чего полимеризацию акриламида проводили в течение 2–3-х часов при комнатной температуре (а не при 5–6 °С). Описанные модификации способствовали лучшему фокусированию тайтиновых полос в геле. Однако в таких гелях, из-за их небольшого размера, редко удавалось разделить изоварианты изоформ тайтина, вследствие их малых различий в электрофоретической подвижности.
Для лучшего разделения в геле высокомолекулярных форм тайтина нами была разработана методика электрофореза в крупнопористом горизонтальном полиакриламидном геле с добавлением агарозы. Для формирования горизонтального геля, раствор, нагретый до 40°С и содержащий все необходимые добавки, включая акриламид и агарозу (см. методику приготовления агарозного мини-геля), заливали в камеру для горизонтального электрофореза. Конечная концентрация полиакриламида в горизонтальном геле составляла 1.0–1.3%, агарозы – 0.6–0.8%. В течение первых 15–20 минут полимеризация проводилась при температуре 5–6°С, затем в течение 3.0–3. часов при комнатной температуре. В горизонтальном геле значительно возросла электрофоретическая подвижность тайтина, что немало важно как для выявления изовариантов тайтиновых изоформ, мало отличающихся по электрофоретической подвижности, так и для более точных оценок их молекулярной массы. Однако более сильная диффузия полос тайтина в горизонтальном геле по сравнению с вертикальным мини-гелем затрудняла проведение подобных оценок. Для решения этой проблемы мы использовали вертикальный полиакриламидный (1.9–2.3%) агарозный гель размером 14.516.0 см. Методика приготовления вертикального агарозного геля большого размера не отличалась от методики приготовления вертикального мини-геля с добавлением агарозы (см. выше). Следует только отметить, что для предотвращения проскальзывания сформированного геля между стёклами (под действием силы тяжести), предварительно заливалась 8% полиакриламидная пробка (высотой 1.0–1.5 см).
Нами был также изменен процесс приготовления электрофоретических проб. Известно, что перед проведением электрофореза для лучшей солюбилизации белков и предотвращения их агрегации электрофоретические пробы кипятят в течение нескольких минут. С целью предотвращения протеолиза тайтина эндогенными протеазами при нагревании мышечной пробы в солюбилизирующий раствор добавляют протеолитические ингибиторы леупептин и Е64, что, однако, не исключает разрушающего действия на тайтин температур выше 57°С (Granzier, Wang, 1993). В наших экспериментах образцы скелетных мышц инкубировались в течение 40–60 мин минут при температуре 25–30°С в солюбилизирующем растворе, содержащем 10 мM трис-HCl, 1% ДСН, 10% глицерина, 6 мM ЭДТА, 80 мM ДТТ, 8– мкг/мл леупептина, 8–10 мкг/мл Е64, рН 6.8–7.0. Денатурацию белковых препаратов тайтина также проводили без дополнительного нагревания, инкубируя пробы в течение 30–40 минут при температуре 25–30°С в солюбилизирующем растворе, содержащем 12 мМ трис-HCl, 0.5% ДСН, 5% глицерина, 16 мМ ДТТ, рН 6.8–7.0. Денатурацию миозина и актина проводили в течение 2–3 минут при 95–100°С в том же солюбилизирующем растворе.
Чистоту выделенных препаратов тайтина сердечной и скелетных мышц кролика и суслика проверяли с помощью ДСН-гель-электрофореза в 7% полиакриламидном геле по методу (Fritz et. al., 1989), а также в 2.0–2.3% полиакриламидном мини-геле с агарозой. Чистоту выделенных препаратов миозина и актина скелетных мышц кролика проверяли с помощью ДСН-гель электрофореза в 13% полиакриламидном геле по методу (Laemmli, 1970).
Денситометрию проводили с помощью компьютерной программы Total Lab 1.11. В качестве стандартов для оценки молекулярной массы изоформ тайтина были использованы полосы тяжелых цепей миозина (205 кДа), небулина (770– 890 кДа), тайтина-2 (2100–2400 кДа) (Maruyama et al., 1984;
Wang et al., 1991;
Kruger et al., 1991;
Granzier, Wang, 1993). Содержание тайтина оценивали по отношению к содержанию тяжелых цепей миозина. В таблицах приведены средние арифметические величины соотношений интегральных плотностей соответствующих белковых полос на гелях и их ошибки. Статистическую обработку проводили с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Значимыми считали различия с уровнем достоверности p0.05.
Вестерн-блоттинг тайтина Вестерн-блоттинг тайтина проводили по методу (Towbin et al., 1970) с нашими модификациями. Перенос белка из полиакриламидных гелей на нитроцеллюлозные мембраны после электрофореза проводили в трис– глицин/метанольном буфере с добавлением ДСН при силе тока 0.8 мА/см2 в течение 48-72 часов при постоянном охлаждении. В качестве первичных антител использовали: AB5 (к участку молекулы тайтина в А-диске, расположенному около М-линии саркомера), ВD6 (к участку молекулы тайтина, расположенному на границе А-диска и I-области саркомера), 9D10 и Т11 к участкам I-зоны тайтина, Z1/Z2 (к N-концу молекулы тайтина, расположенному в Z-диске саркомера). В качестве вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, использовали антитела против IgG мышей (“Sigma”) или кролика («Имтек», Москва). Белковые полосы выявляли с помощью 3,3'-диаминобензидина.
Фосфорилирование in vitro тайтина сердечной и скелетных мышц сусликов Фосфорилирование in vitro очищенных препаратов тайтина сердечной и скелетных мышц сусликов проводили в присутствии радиоактивного изотопа -[32Р]АТФ с использованием каталитической субъединицы протеинкиназы А (ICN Biochemicals, Cat. number 195812) согласно методу, описанному в работе (Takano-Ohmuro et al., 1992). Для контроля фосфорилирования белковых препаратов применяли метод авторадиографии, с использованием рентгеновской пленки Retina (Германия).
Исследование экспрессии тайтина методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Изучение сезонных изменений экспрессии гена тайтина в сердечной мышце зимоспящих сусликов, а также в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс проводили методом количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (qRT-PCR).
Выделение геномной ДНК из образцов миокарда Выделение геномной ДНК осуществляли классическим фенол хлороформным способом (Sambrook et al., 1989, http//:www.molbiol.ru).
Выделение тотальной РНК и проведение реакции обратной транскрипции РНК из ткани миокарда была выделена с использованием набора Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Kit BIO-RAD (США), согласно протоколу изготовителя. Выровненные по концентрации РНК (100 нг/мкл) использовали для реакции обратной транскрипции, с помощью набора MINT-Universal cDNA synthesis kit («Евроген», Россия). Качество полученных препаратов оценивали электрофоретическим методом в 0.8% агарозном геле с 2.2 М формальдегида.
Количественная ПЦР Праймеры для qRT-PCR синтезировали на основе последовательности гена тайтина сердечной мышцы крысы (Opitz et al., 2004). Реакцию проводили на амплификаторе ДТ-322 («ДНК-Технология», Россия), используя набор Tersus PCR kit («Евроген», Россия), с применением SYBR Green I (“Invitrogen”, США) в качестве флуоресцентного зонда. Реакционная смесь (20 мкл) содержала 2–4 мкл кДНК, по 4 пмоль каждого праймера, 0.1 мМ каждого dNTP, стандартный буфер («Евроген», Россия), 1 мкл SYBR Green I (разведение 1:3000) и 1 U Taq-полимеразы («Евроген», Россия). Программа амплификации для всех пар праймеров была следующей: предварительная денатурация при 94C – 2 минуты;
далее 30–40 циклов: 94C – 20 секунд, 58C – 20 секунд, 72C – 20 секунд. Флуоресцентный сигнал регистрировали в конце каждого цикла в течение 15 секунд. Количественный анализ уровня экспрессии проводили при помощи программы q_PCR («ДНК-Технология», Россия).
Относительное количество синтезированных ампликонов гена тайтина (ttn) рассчитывали по методу 2-Ct, описанному в работе (Livak, Schmittgen, 2001), где Ct – пороговый цикл реакции или точка пересечения графика накопления ДНК и пороговой линии. Расчеты Ct проводили по формуле Ct = Ct(контроль) Ct(опыт), а каждое значение Ct рассчитывали по формуле Ct = Ct(Ttn) Ct(-актин). В качестве референсного гена использовали ген -актина. Статистическую обработку проводили с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Значимыми считали различия с уровнем достоверности p0.05.
Фракционирование ДНК методом электрофореза в полиакриламидном геле Продукты амплификации разделяли в 5% полиакриламидном геле (Sambrook et al., 1989). Для визуализации фронта ДНК использовали смесь красителей бромфенолового синего и ксиленцианола. Электрофорез проводили при напряжении 200-250 В и силе тока 70-110 мА. Использовали буфер TBE (89 мМ Tris-HCl, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА, pH 8.0) После разделения фрагментов гель окрашивали бромистым этидием и визуализировали на трансиллюминаторе.
Клонирование фрагментов ПЦР в pAL-TA вектор С целью клонирования фрагментов ПЦР в pAL-TA вектор полученные после электрофоретического разделения (см. выше) фрагменты ДНК экстрагировали из геля по методике, описанной в (Sambrook et al., 1989). Для клонирования был использован pAL-TA вектор («Евроген», Россия) – аналог pGEM-T Easy для быстрого клонирования продуктов ПЦР. Лигирование проводили с использованием Т4 ДНК лигазы и подходящего для нее лигазного буфера фирмы “Fermentas“ (Литва) в соответствии с протоколом производителя. Для трансформации были использованы клетки E. coli Top (“Invitrogen”, США). Выросшие клоны проверяли на наличие вставок с помощью ПЦР с праймерами, один из которых был специфичен к промотору фага Т7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'), находящемуся в векторе, а второй – к последовательности клонируемого фрагмента. Программа амплификации была следующей: 94C–2 минуты (предварительное плавление), далее 30–35 циклов по программе: 94C–20 сек, 54C–20 сек, 72C–20 сек.
Флуоресцентный сигнал регистрировали в конце каждого цикла в течение секунд. Продукты амплификации разделяли в 5% полиакриламидном геле.
Выделение плазмиды и секвенирование Трансформанты, содержащие вектор со вставкой искомого фрагмента ДНК, пересевали в жидкую среду LB (100 мкг/л ампициллина), растили до поздней стационарной фазы и затем выделяли плазмиду с помощью щелочного лизиса [http://www.molbiol.ru/protocol/04_02.html]. Нуклеотидная последовательность вставленных в вектор фрагментов ДНК была секвенирована в ЗАО «Евроген» (Москва).
Моделирование условий гравитационной разгрузки Эксперименты по моделированию условий гравитационной разгрузки у крыс, а также эксперименты с применением различных подходов, направленных на уменьшение или предотвращение негативного влияния микрогравитации на m. soleus, были проведены в ГНЦ РФ – ИМБП РАН (лаборатория миологии, рук. д.б.н. Шенкман Б.С.) и в Казанском государственном университете (КГУ) им. В.И. Ленина-Ульянова (кафедра физиологии, к.б.н. Балтина Т.В.). Результаты проведенных исследований опубликованы в совместных работах. В качестве модели гравитационной разгрузки у человека использовали 7-суточную «сухую» иммерсию по методу (Шульженко, Виль-Вильямс, 1975). Все эксперименты по моделированию условий гравитационной разгрузки у человека были проведены в ГНЦ РФ – ИМБП РАН (г. Москва).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ГЛАВА 1. ИЗУЧЕНИЕ ИЗОФОРМНОГО СОСТАВА ТАЙТИНА В СЕРДЕЧНОЙ И СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦАХ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ В НОРМЕ 1.1. Электрофоретическое изучение изоформного состава тайтина в сердечной и скелетных мышцах человека и животных Тайтин (коннектин) был открыт электрофоретическим методом двумя независимыми группами исследователей, которые на электрофореграммах скелетных мышц кролика и цыпленка, полученных в 3–4% полиакриламидном геле, полимеризованном в вертикальной трубке, обнаружили две неизвестных белковых полосы с молекулярной массой более 1000 кДа (Wang et al., 1979;
Maruyama et al., 1981). Белки оказались иммунологически идентичными и получили название тайтин-1 (-коннектин) и тайтин-2 (-коннектин), последний из которых, как показано позже, является протеолитическим фрагментом тайтина-1 (-коннектина) (Maruyama et al., 1984;
K. Wang et al., 1984;
Itoh et al., 1986). По первоначальным оценкам молекулярная масса интактного тайтина-1 (Т1) и его фрагмента тайтина-2 (Т2) в зависимости от их электрофоретической подвижности в геле составила ~1400 кДа и ~1200 кДа соответственно (Wang et al., 1984). Однако более точные оценки их молекулярной массы с использованием в качестве стандарта «сшитых» поперечными связями тяжелых цепей миозина показали, что м.м. - и коннектина может составлять ~2800 кДа и ~2100 кДа соответственно (Maruyama et al., 1984). Дальнейшие электрофоретические исследования тайтина, проведённые с использованием аппаратов для ДСН-электрофореза с вертикальным расположением пластинки геля, заполимеризованного между двумя стёклами, выявили на электрофореграммах поперечно-полосатых мышц животных в 3-12% полиакриламидном геле различия в электрофоретической подвижности Т1 (Wang et al., 1988;
1991;
Horowits, 1992;
Tatsumi, Hattori, 1995;
Trombits et al., 1995;
Granzier, Irving, 1995;
Spierts et al., 1997). На основании полученных данных было сделано предположение о существовании изоформ тайтина (Wang et al., 1991;
Horowits, 1992). В зависимости от электрофоретической подвижности изоформ Т1 в градиентном геле были получены следующие значения их молекулярных масс: ~2400-2500 кДа (сердечная мышца) и ~2800-2900 кДа (скелетные мышцы) (K. Wang et al., 1991;
Granzier, Wang, 1993).
Открытие изоформ тайтина произошло в 1995 году после секвенирования гена тайтина и определения последовательности его кДНК (Labeit, Kolmerer, 1995). Дальнейшие исследования показали, что транскрипты тайтина скелетных мышц содержат экзон N2A-уникальной последовательности, расположенной в I-области тайтина. Транскрипты тайтина сердечных мышц содержат экзон N2B-уникальной последовательности, но могут содержать и N2A-экзон. По названию уникальных последовательностей, присутствующих в тайтине скелетных или сердечных мышц, и были названы изоформы тайтина:
N2A, N2B и N2BA (Labeit, Kolmerer, 1995). К настоящему времени установлено, что в медленной скелетной мышце soleus животных и человека экспрессируется длинный вариант N2A-изоформы тайтина (м.м. 3700 кДа), а в быстрой мышце psoas – короткий вариант N2A-изоформы (м.м. 3400 кДа) (Freiburg et al., 2000;
Bang et al., 2001;
Labeit et al., 2006). В разных отделах сердца взрослых животных и человека экспрессируются две основные изоформы тайтина: короткая N2B-изоформа, с молекулярной массой 2970 кДа, и длинная N2BA-изоформа, с молекулярной массой её вариантов от 3200 до 3350 кДа (Freiburg et al., 2000;
Bang et al., 2001). Дальнейшие электрофоретические исследования, проведённые с использованием 2.0–2.5% полиакриламидного вертикального геля с добавлением агарозы или градиентного 2.5–9.0% полиакриламидного вертикального геля, выявили на электрофореграммах скелетных и сердечных мышц животных и человека полосы Т1 с разной электрофоретической подвижностью, которые были приняты за N2A-, N2BA- и N2B-изоформы этого белка (Helmes et al., 1999;
Trombitas et al., 2000;
Cazorla et al., 2000;
Bell et al., 2000;
Freiburg et al., 2000;
Trombitas et al., 2001;
Neagoe et al., 2003;
Warren et al., 2003;
2004;
Makarenko et al., 2004;
Opitz et al., 2004;
Nagueh et al., 2004;
Lahmers et al., 2004;
Greaser et al., 2005;
Prado et al., 2005;
Greaser et al., 2008;
Udaka et al., 2008;
Jaber et al., 2008).
Поскольку методом Вестерн-блоттинга с использованием антител к разным участкам молекулы тайтина (в том числе к N- и С-концам) была подтверждена интактность N2A-, N2BA- и N2B-изоформ тайтина, выявляемых электрофоретическим методом (Cazorla et al., 2000;
Nagueh et al., 2004;
Lahmers et al., 2004) их стали считать интактными изоформами тайтина с м.м. 3000– 3700 кДа. Однако оценки молекулярной массы этих форм тайтина в зависимости от их электрофоретической подвижности в геле не проводились.
С использованием модифицированной нами методики крупнопористого 2.0–2.3% полиакриламидного вертикального геля с добавлением агарозы мы провели исследование изоформного состава тайтина в поперечно-полосатых мышцах человека и животных (кролик, суслик, крыса, мышь). Наряду с известными N2A-, N2BА-, N2B-изоформами тайтина, а также Т2, на электрофореграммах мышц исследуемых животных и человека было выявлено присутствие более высокомолекулярных изоформ этого белка (рис. 1, дорожки 1-3), что подтверждается данными Вестерн-блоттинга (рис. 1, дорожки 4-6).
При этом на электрофореграммах скелетных мышц животных и человека часто присутствовали две новых высокомолекулярных формы тайтина (рис. 1, дорожка 3), однако содержание одной из них (Т3800) было незначительное. С использованием в качестве стандартов молекулярной массы тяжёлых цепей миозина (ТЦМ, 205 кДа), небулина (700-900 кДа), Т2 (2400 кДа), а также N2A изоформы тайтина (3700 кДа) скелетных мышц млекопитающих мы показали, что молекулярные массы новых изоформ тайтина могут составлять ~3800 кДа в сердечной и ~3800-3900 кДа в скелетных мышцах человека и животных (рис.
1). Содержание новых изоформ тайтина (% от общего содержания тайтина) по нашим подсчетам составило в среднем 30–40% в скелетных и 10–30% в сердечных мышцах.
Рис. 1. Изоформный состав тайтина в сердечной и скелетных мышцах млекопитающих.
Электрофорез проведён в вертикальном мини-геле (810 см) с содержанием агарозы 0.55% и полиакриламида 2.0-2.3%. Электрофореграммы с денситометрическими профилями: 1 – m. soleus (суслик);
2 – левый желудочек сердца (суслик);
3 – m. soleus (человек). Вестерн-блоттинг: 4 – левый желудочек сердца (кролик);
5 – m. soleus (человек);
6 – предсердие (суслик). Вестерн-блоттинг тайтина проведён с использованием моноклональных антител BD6 (4) и AB5 (5,6). Указаны белковые полосы: Т2-фрагментов, N2B-, N2BA- N2A-изоформ тайтина, новых, более высокомолекулярных изоформ тайтина с м.м. ~3800-3900 кДа (Т3800, Т3900).
Вероятность существования изоформ тайтина с м.м. более 3700 кДа не исключается, поскольку ген тайтина может кодировать белок с м.м. 4200 кДа (Bang et al., 2001;
Guo et al., 2010). Однако экспрессия геном тайтина изоформ этого белка с молекулярной массой более 3700 кДа в мышцах до сих пор не показана, что ставит под сомнение их существование. Поскольку ранее высказывалось предположение о возможной агрегации Т1 и Т2 (Granzier, Wang, 1993), мы не исключали вероятности того, что высокомолекулярные формы тайтина, обнаруженные нами, являются продуктом агрегации известных форм этого белка. Существовала также и вероятность агрегации тайтина с нуклеиновыми кислотами (Макаренко И.В., персональное сообщение). Проведённая нами окраска гелей бромистым этидием не выявила присутствия в новых, более высокомолекулярных изоформах тайтина нуклеиновых кислот (данные не показаны). Однако эти данные не исключили вероятности агрегирования разных форм тайтина с образованием более высокомолекулярных форм этого белка, выявляемых в геле. Полагая, что молекулярные массы агрегатов тайтина должны значительно превышать полученные нами значения (3800–3900 кДа), мы задались целью выявить бльшие различия в электрофоретической подвижности обнаруженных нами новых изоформ этого белка. Для достижения этой цели была разработана методика ДСН-электрофореза в крупнопористом полиакриламидном (1.0– 1.3%) геле с агарозой с использованием аппарата с горизонтальным расположением геля. Результаты электрофоретического тестирования изоформного состава тайтина в мышцах млекопитающих с использованием горизонтального геля с добавлением агарозы, представленные на рисунке 2, показали существенные различия в электрофоретической подвижности новых изоформ тайтина.
Рис. 2. Изоформный состав тайтина в поперечно-полосатых мышцах млекопитающих. Электрофорез проведён в горизонтальном полиакриламидном геле с содержанием полиакриламида 1.3% и агарозы 0.6%.
Электрофореграмма: 1 – m. vastus lateralis (человек);
2 – m. soleus (кролик);
3 – левый желудочек сердца (суслик);
4 – m. psoas (кролик). Для оценки молекулярных масс новых изоформ тайтина были использованы значения молекулярных масс следующих белков: ТЦМ (205 кДа), небулина m. psoas кролика (800 кДа) и небулина скелетной мышцы человека (900 кДа) (Kruger et al., 1991;
Granzier, Wang, 1993).
Указаны белковые полосы: тяжёлых цепей миозина (ТЦМ), небулина (белка тонких нитей) Т2-фрагментов, известных N2B- и N2A-изоформ тайтина, новых, более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина с м.м. ~3200-3700 кДа.
С использованием в качестве стандартов молекулярной массы ТЦМ (205 кДа), небулина скелетных мышц животных (800 кДа) и человека (900 кДа) были проведены оценки м.м. новых, более высокомолекулярных изоформ тайтина, а также известных изоформ этого белка (N2A, N2B, N2BA) и T2. Результаты этого исследования оказались весьма неожиданными (рис. 2). В частности, по нашим оценкам значения м.м. известных N2B- и N2A-изоформ тайтина, которые принимают на гелях за интактные изоформы, составили ~2400– кДа (рис. 2), что соответствует значениям м.м. изоформ Т1, выявляемых в градиентном 3-12% полиакриламидном вертикальном геле (Wang et al., 1991;
Granzier, Wang, 1993). Значения молекулярных масс новых изоформ тайтина по нашим оценкам составили: 3230–3300 кДа в левом желудочке сердца суслика, 3380–3500 кДа в m. psoas кролика, 3600–3680 кДа в m. soleus кролика и 3650– 3730 кДа в m. vastus lateralis человека (рис. 2). Заметим, что полученные значения м.м. открытых нами более высокомолекулярных изоформ тайтина с большой точностью совпали со значениями м.м. N2B (~3000 кДа), N2BA (3200–3350 кДа) и N2A (3400–3700 кДа) изоформ тайтина, образующихся в результате альтернативного сплайсинга и экспрессирующихся в мыщцах (Freiburg et al., 2000;
Bang et al., 2001). Учитывая эти результаты мы сделали предположение о том, что открытые нами более высокомолекулярные изоформы тайтина являются интактными изоформами этого белка, тогда как известные его изоформы (N2A, N2BA, N2B), выявляемые на гелях, являются лишь фрагментами интактных изоформ тайтина. Результаты других наших электрофоретических исследований подтверждают это предположение. В частности, при использовании полиакриламидных (1.9–2.1%) вертикальных гелей с агарозой размером 14.516.0 см (рис. 3), а не мини-гелей (810 см) (рис. 1) на электрофореграммах сердечной мышцы животных в наших исследованиях обнаружено присутствие двух полос новых форм тайтина с м.м.
~3300–3400 кДа (рис. 3, дорожка 1).
Рис. 3. Интактные N2A-, N2BA- и N2B-изоформы тайтина в поперечно полосатых мышцах суслика.
Электрофорез проведен в вертикальном геле размером 14.516.0 см с содержанием агарозы 0.55% и полиакриламида 1.9%.
1 – левый желудочек сердца суслика;
2 – m. soleus суслика.
На электрофореграммах скелетных мышц человека и животных мы всегда наблюдали только одиночную полосу новой формы тайтина с м.м. ~3600- кДа (рис. 3, дорожка 2). Полученные результаты согласуются с данными о коэкспрессии двух (N2BA и N2B) изоформ тайтина с м.м. ~3000-3400 кДа в сердечной мышце и экспрессии одного изоварианта N2A-изоформы тайтина с м.м. ~3400-3700 кДа в скелетных мышцах млекопитающих (Freiburg et al., 2000;
Bang et al., 2001;
Greaser et al., 2005) и подтверждают наше предположение о том, что новые, более высокомолекулярные изоформы тайтина являются интактными N2A-, N2BA- и N2B-изоформами этого белка.
Рис. 4. Вестерн-блоттинг с антителами Z1/Z2 и АВ5 к N- и С-концам молекулы тайтина. 1,4 – m.
soleus суслика, 2,3 – левый желудочек сердца суслика.
Результаты проведённого Вестерн-блоттинга тайтина с антителами к N- и С концам молекулы этого белка, показавшие окраску указанными выше антителами новых изоформ тайтина (рис. 4, дорожки 1-4, см полосы “Интактный тайтин”) при отсутствии окраски антителами к N-концу молекулы тайтина известной N2BA-изоформы этого белка (рис. 4, дорожка 2), с одной стороны подтверждают правильность нашего предположения. Однако с другой стороны, полученные результаты, показавшие окраску указанными выше антителами известных N2B- и N2A-изоформ тайтина (рис. 4, дорожки 1-4), противоречат нашему предположению о том, что эти формы тайтина являются фрагментами и указывают на то, что они тоже являются интактными изоформами этого белка. Таким образом, анализируя полученные результаты, можно сделать следующее заключение. В поперечно-полосатых мышцах животных и человека наряду с известными интактными изоформами тайтина (в частности, N2A и N2B) присутствуют более высокомолекулярные интактные изоформы этого белка. Учитывая данные о коэкспрессии двух изоформ тайтина (N2BA и N2B) на уровне половины саркомера в сердечной мышце (Trombits et al., 2001), можно полагать, что новые, более высокомолекулярные изоформы тайтина вместе с известными изоформами этого белка также коэкспрессируются в отдельно взятом саркомере. Вопрос о том, каким образом разные по длине интактные изоформы тайтина располагаются и функционируют в саркомере, требует дальнейших исследований. Однако можно предположить, что более длинные (с бльшими м.м., ~3200-3700 кДа) новые изоформы тайтина располагаются в саркомере от М-линии до Z-диска, тогда как более короткие (с меньшими м.м., ~2400-2900 кДа) известные изоформы тайтина не перекрывают полностью расстояние в половину саркомера. Такое предположение вполне допустимо, учитывая данные об экспрессии в саркомерах сердечной мышцы млекопитающих короткого варианта N2B-изоформы тайтина Novex-3 с м.м.~700 кДa (Bang et al., 2001).
Показано, что N-конец Novex-3 расположен в Z-диске саркомера, а С-конец, предположительно, связывается в I-зоне саркомера с обскурином.
Предполагается, что присутствие в саркомере укороченных изоформ тайтина Novex-3, не достигающих А-зоны саркомера, и длинных изоформ тайтина, пересекающих половину саркомера, может приспосабливать молекулы тайтина к трехтяжевой и двутяжевой симметриям толстых и тонких нитей (Bang et al., 2001).
Однако, несмотря на полученные результаты и сделанное заключение, мы до конца не были уверенными в том, что новые изоформы тайтина не являются результатом агрегации его более низкомолекулярных форм. В этом случае протеолитическое расщепление тайтина, сопровождающееся увеличением содержания его фрагментов, должно приводить к увеличению содержания более высокомолекулярных агрегатов этого белка. С целью проверки этого предположения нами были проведены эксперименты по протеолитическому расщеплению тайтина в мышечной ткани под действием эндогенных протеаз.
Для этого небольшие кусочки мышечной ткани весом 20-30 мг выдерживались в течение 30-120 минут при температуре 25-30°С. По истечении заданного времени от мышечного образца брались кусочки весом 2-3 мг и помещались в солюбилизирующий раствор, содержащий ДСН, для экстракции белков с целью их дальнейшего электрофоретического тестирования. Результаты этого исследования представлены на рисунке 5.
Рис. 5. Изменения содержания тайтина в мышцах суслика под действием эндогенных протеаз.
Электрофорез проведен в вертикальном мини-геле с содержанием агарозы 0.55% и полиакриламида 2.1 %. Электрофореграмма: 1 – m. soleus (контроль);
2 – m. soleus (протеолиз, 1 час);
3 – левый желудочек сердца (контроль);
4 – левый желудочек сердца (протеолиз, 30 мин.). Указаны белковые полосы: тяжёлых цепей миозина;
Т2-фрагментов тайтина;
N2B-, N2BA- и N2A-изоформ тайтина;
тайтина с м.м. ~3300 кДа (Т3300);
новых, более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина.
Протеолитические изменения в тайтине m. soleus суслика под действием эндогенных протеаз в течение 1 часа сопровождались уменьшением (в 6-7 раз) содержания новой изоформы интактного тайтина и двукратным уменьшением содержания известной N2A-изоформы этого белка (рис. 5, дорожки 1-2). Эти изменения сопровождались появлением на электрофореграммах Т2-фрагмента, а также полосы тайтина с м.м. ~3300 кДа (Т3300), которая, предположительно, является продуктом деградации более высокомолекулярного интактного тайтина. Протеолитические изменения в тайтине сердечной мышцы суслика под действием эндогенных протеаз в течение 30 минут сопровождались уменьшением содержания в 2-3 раза новых интактных изоформ тайтина, а также известной N2BA-изоформы этого белка. При этом наблюдалось увеличение содержания известной N2B-изоформы тайтина и его Т2 фрагментов (рис. 5, дорожки 3-4). Поскольку общее содержание тайтина (относительно содержания ТЦМ) в исследуемых мышцах в результате протеолиза не изменялось можно утверждать, что деградация более высокомолекулярных форм тайтина (в частности, новых изоформ этого белка, а также известных N2A- и N2BA-изоформ тайтина) приводила к увеличению содержания более низкомолекулярных форм этого белка (в частности, N2B и Т2). Во-первых, полученные нами результаты показывают, что новые изоформы тайтина не являются агрегатами более низкомолекулярных форм этого белка (в частности, агрегатами Т1 и Т2, Granzier, Wang, 1993). Во вторых, учитывая увеличение содержания известной N2B-изоформы тайтина в процессе протеолитической деградации этого белка (рис. 5, дорожки 3-4), полученные результаты подтверждают наше предположение о том, что новые, более высокомолекулярные формы тайтина являются интактными изоформами этого белка, тогда как известные изоформы тайтина являются его фрагментами. Окраску N2B-полосы тайтина антителами к N- и С-концам молекулы этого белка, полученную методом Вестерн-блоттинга (рис. 4, дорожки 2-3), можно объяснить тем, что в этой полосе присутствуют фрагменты интактных изоформ, содержащие как один, так и другой концы молекулы тайтина.
Протеолитические изменения в тайтине левого желудочка сердца суслика под действием эндогенных протеаз в течение двух часов сопровождались полной деградацией новых интактных изоформ тайтина и известной N2BA изоформы этого белка, а также уменьшением содержания (в ~2 раза) известной N2B-изоформы тайтина. При этом наблюдалось значительное увеличение содержания (в 5-7 раз) Т2-фрагментов тайтина (данные не показаны). В m.
soleus после двухчасового протеолиза наблюдалось практически полное разрушение новой интактной изоформы тайтина и тайтина с м.м. ~3300 кДа (Т3300), что сопровождалось появлением большого содержания Т2-фрагмента (данные не показаны). Однако при этом не было выявлено ожидаемого более значительного снижения содержания известной N2A-изоформы тайтина, содержание которой хоть и было снижено (в ~1.5 раза) по сравнению с контрольной мышцей, но было выше, чем в m. soleus после одночасового протеолиза (рис. 5, дорожки 1-2). Полученный результат можно объяснить тем, что в полосе известной N2A-изоформы тайтина (как и в N2B-изоформе, рис. 5, дорожка 4) содержатся фрагменты разрушения более высокомолекулярной интактной изоформы этого белка.
Таким образом, результаты проведённых экспериментов подтверждают наше предположение о том, что известные изоформы тайтина, выявляемые электрофоретическими методами, могут являться фрагментами более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина. Почему эти формы тайтина были открыты в наших исследованиях? Ниже приведены результаты, в которых предлагаются ответы на этот вопрос.
1.2. Влияние нагревания и кипячения электрофоретических проб на содержание тайтина Известно, что с целью лучшей солюбилизации белков в растворе, содержащем ДСН, а также для предотвращения возможной белковой агрегации проводится кипячение электрофоретических проб в течение нескольких минут перед проведением электрофореза. Многие исследователи тайтина также проводят кипячение электрофоретических проб перед тестированием этого белка методом ДСН-гель-электрофореза (Granzier, Irving, 1995;
Cazorla et al.
1999;
Trombitas et al., 2000;
Tatsumi et al., 2001;
Wu et al., 2002;
Neagoe et al., 2002;
2003;
Hunter et al., 2003;
Opitz et al., 2004;
Lahmers et al., 2004;
Prado et al., 2005;
Van Heerebeek et al., 2006;
Jaber et al., 2008). При этом чтобы исключить вероятность протеолиза тайтина эндогенными мышечными протеазами при нагревании мышечного ДСН-экстракта, в солюбилизирующий раствор добавляются ингибиторы протеаз, в частности, леупептин или Е-64. Однако было показано, что кипячение электрофоретических проб приводит к разрушению тайтина, что сопровождается уменьшением содержания этого белка на электрофореграммах поперечно-полосатых мышц (King, Kurth, 1980;
Granzier, Wang, 1993;
Warren et al. 2003). Учитывая это, авторы рекомендовали исследователям, проводящим электрофоретическое изучение тайтина, не кипятить электрофоретические пробы, а только нагревать их при температуре 57-65°С (Granzier, Wang, 1993;
Warren et al. 2003). Подобная термическая обработка электрофоретических проб, по данным этих авторов, не сопровождается температурными артефактами в содержании тайтина, а также необходима для лучшей экстракции тайтина из мышечной ткани и для разрушения возможно формирующихся более высокомолекулярных агрегатов этого белка (Granzier, Wang, 1993). Не исключая до конца вероятность того, что более высокомолекулярные изоформы тайтина, обнаруженные нами, могут быть агрегатами этого белка, разрушение которых должно происходить при 57 65°С (Granzier, Wang, 1993), мы изучили влияние нагревания и кипячения электрофоретических проб (экстрактов мышечной ткани, полученных после 40-минутной инкубации мышц в солюбилизирующем буфере, содержащем ДСН), на содержание в них тайтина (рис. 6). Наши электрофоретические исследования показали, что 20-минутное выдерживание при 60-65°С ДСН экстрактов мышечной ткани сердечной или скелетных мышц сопровождалось уменьшением (в ~2 раза) содержания, но не разрушением новых изоформ тайтина (рис. 6а), что не согласуется с данными зарубежных авторов (Granzier, Wang, 1993). Разрушение новых, более высокомолекулярных изоформ тайтина, сопровождающееся их отсутствием на электрофореграммах изученных мышц, наблюдалось после предварительного нагревания электрофоретических проб в течение 5-10 минут при 75-80°С (данные не показаны). При этом наблюдалось, также, и значительное снижение (в 2-3 раза) содержания известных N2A-, N2B и N2BA-изоформ тайтина.
Рис. 6. Влияние нагревания и кипячения ДСН-экстрактов мышечной ткани (электрофоретических проб) на содержание тайтина. Электрофорез проведен в вертикальном мини-геле с содержанием агарозы 0.55% и полиакриламида 2.1 %.
а – электрофореграмма левого желудочка сердца суслика. Справа приведены денситометрические профили полос тайтина. б – электрофореграмма предсердия суслика. Сверху приведены денситометрические профили полос тайтина. Указаны белковые полосы:
тяжёлых цепей миозина;
Т2-фрагментов тайтина;
N2B- и N2BA-изоформ тайтина;
новых, более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина.
Предварительная инкубация мышечных образцов проводилась в течение 30- минут при комнатной температуре (+20 25°С) в солюбилизирующем буфере, содержащем 10 мM трис-HCl, 1% ДСН, 10% глицерина, 80 мM ДТТ, 8-10 мкг/мл леупептина и/или Е64, рН 6.8–7.0.
Полученные результаты, показывающие, что разрушение новых изоформ тайтина происходит наряду со значительным уменьшением содержания известных изоформ этого белка при температуре +80°С, не подтверждают «агрегатную» версию (Granzier, Wang, 1993) происхождения обнаруженных нами более высокомолекулярных изоформ тайтина. Следует обратить внимание на другой важный результат, полученный нами, который показал, что рекомендуемая зарубежными авторами предварительная термическая обработка электрофоретических проб при 60-65°С также как и кипячение сопровождается появлением артефактов в содержании тайтина. В частности, 20-минутное выдерживание при 60-65°С ДСН-экстрактов мышечной ткани сердечной мышцы суслика сопровождалось изменением в соотношении известных N2BA- и N2B-изоформ тайтина на электрофореграммах этой мышцы (рис. 6а, см. денситограммы). Рекомендуемая нами максимальная температура нагревания электрофоретических проб, при которой на электрофореграммах исследуемых мышц не было выявлено изменений в содержании тайтина, составляет 35°С.
Кипячение электрофоретических проб приводило к уменьшению (в 3- раз) содержания известных N2A-, N2B- и N2BA-изоформ тайтина, а также разрушению более высокомолекулярных изоформ этого белка, что регистрировалось нами на электрофореграммах сердечной и скелетных мышц животных (рис. 6б). При этом была выявлена прямая зависимость между продолжительностью кипячения электрофоретической пробы и снижением содержания известных изоформ тайтина (рис. 6б).
Таким образом, результаты наших исследований показали, что не только кипячение, но и рекомендуемое зарубежными авторами (Granzier, Wang, 1993;
Warren et al. 2003) нагревание электрофоретических проб при 60-65°С сопровождается появлением артефактов в содержании тайтина, выявляемых электрофоретическими методами. По нашим данным максимальная температура нагревания электрофоретических проб, при которой исключаются артефакты в содержании тайтина, составляет 35°С. При этом температура 25 30°С является оптимальной для проведения ДСН-экстракции белков из мышечной ткани с целью дальнейшего электрофоретического тестирования тайтина. Учитывая полученные нами результаты можно говорить о необходимости критического пересмотра имеющихся в научной литературе данных о качественном и количественном составе тайтина в мышцах человека и животных в норме и его изменениях при адаптационных и патологических процессах.
ГЛАВА 2. ИЗУЧЕНИЕ IN VITRO СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ТАЙТИНА СЕРДЕЧНОЙ И СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ КРОЛИКА И СУСЛИКА В НОРМЕ Обнаружение нами в поперечно-полосатых мышцах животных и человека более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина определило наш интерес к изучению in vitro их структурно-функциональных свойств.
Результаты этих экспериментов описаны ниже.
2.1. Электронно-микроскопическое изучение молекулярных параметров и агрегационных свойств молекул тайтина сердечной и скелетных мышц кролика и суслика Первые электронно-микроскопические исследования молекулярных параметров (формы и размеров молекул) тайтина скелетных мышц животных были проведены в середине 80-х годов прошлого века (Trinick et al., 1984;
Wang et al., 1984;
Maruyama, 1986). Было показано, что молекула тайтина имеет вид длинной гибкой нити диаметром 3-4 нм с глобулярной головкой на одном конце. Бльшая часть молекул тайтина имела длину 600-700 нм (Trinick et al., 1984;
Wang et al., 1984;
Maruyama, 1986). Однако разброс длин выделенных молекул тайтина составлял ~0.2-1.1 микрона (Wang et al., 1984), что свидетельствовало о значительной деградации тайтина во время выделительных процедур. Один из первооткрывателей коннектина (тайтина) К.
Маруяма писал: «К настоящему моменту все наши попытки выделить интактную молекулу альфа-коннектина оказались безуспешны…. Всё, что было выделено группами из Японии, Великобритании и США является протеолитическими продуктами – бета-коннектином» (Maruyama, 1986). В последующие годы попытки выделения интактных изоформ тайтина не прекращались и, по заявлению ряда авторов, интактный тайтин (а именно, Т или альфа-коннектин) был успешно выделен из сердечной и скелетных мышц кролика (Kimura et al., 1992;
Soteriou et al., 1993;
Suzuki et al., 1994;
Tskhovrebova, Trinick, 1997;
Leake et al., 2004), а также из сердечной мышцы быка (Pan et al., 1994). Поводом для такого утверждения послужили результаты измерений длины одиночных выпрямленных молекул тайтина, полученных методом электронной микроскопии, которые показали, что средняя длина молекул тайтина составляет 850-950 нм (Tskhovrebova, Trinick, 1997). При этом длина отдельных молекул тайтина была 1.0-1.2 мкм. Успешное выделение интактного тайтина связано с использованием при выделении этого белка ингибиторов Са2+-зависимых протеаз (леупептина и Е-64). Однако разброс длин выделенных молекул тайтина оставался высоким и составлял 0.7-1. микрона (Tskhovrebova, Trinick, 1997).
Рис. 7. Электронные микрофотографии одиночных выпрямленных молекул тайтина скелетных мышц кролика в растворе 0.5 M KCl, 10 мМ имидазол, 50% глицерин, рН 7.0, полученных методом кругового оттенения платиной.
Шкала – 200 нм.
Основной нашей целью в этой серии экспериментов являлось выделение новых, более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина, обнаруженных нами в поперечно-полосатых мышцах человека и животных, и изучение их структурно-функциональных свойств. Для этого мы провели выделение и очистку тайтина из быстрой (m. psoas) и медленной (m. soleus) скелетных мышц кролика, из скелетных мышц спины и нижних конечностей суслика, а также из сердечной мышцы этих животных по методу (Soteriou et al., 1993), позволяющему получать интактный тайтин. По данным электронной микроскопии при низких значениях ионной силы (0.12) тайтин образует плотные пучки линейных фибрилл или аморфные агрегаты, что согласуется с данными других авторов (Koretz et al., 1993). Одиночные выпрямленные молекулы тайтина сердечной и скелетных мышц кролика и суслика имеют вид длинной гибкой нити диаметром 3-4 нм с глобулярной головкой на одном конце (рис. 7), что согласуется с литературными данными для тайтина кролика (Tskhovrebova, Trinick, 1997). По нашим данным длина одиночных молекул тайтина поперечно-полосатых мышц кролика и суслика варьировала в диапазоне 0.6-1.1 мкм, однако большинство молекул имело длину 800-900 нм, что также согласуется с литературными данными для интактного Т (Tskhovrebova, Trinick, 1997). Разброс в длинах молекул тайтина можно объяснить вероятностью запыления металлом концевых частей тайтиновых молекул при подготовке препаратов к электронной микроскопии.
С помощью ДСН-электрофореза в 7% полиакриламидном геле по методу (Fritz et al., 1989) с нашими модификациями, а также Вестерн-блоттинга была подтверждена интактность выделенного нами тайтина (рис. 8). Полученные результаты согласуются с данными других авторов, которые, используя выше указанный электрофоретический метод, показали, что молекулы тайтина, выделенные как из скелетных мышц кролика (Soteriou et al., 1993), так и сердечной мышцы быка (Pan et al., 1994) со средней длиной ~800-900 нм, являются интактными молекулами этого белка, электрофоретическая подвижность которых соответствует таковой для интактного Т1. Однако поскольку 7% полиакриламидные гели непригодны для исследования высокомолекулярных изоформ интактного тайтина, мы провели электрофоретический анализ очищенных препаратов тайтина в 2% полиакриламидном вертикальном мини-геле с добавлением агарозы.
Результаты этого исследования оказались неожиданными.
Рис. 8. Электрофоретическое тестирование очищенного препарата тайтина в 7% полиакриламидном геле по методу (Fritz et al., 1989) с нашими модификациями и Вестерн блоттинг.
Электрофореграмма: 1 – m. soleus кролика;
2 – очищенный препарат тайтина m. soleus кролика.
Вестерн-блоттинг (3) препарата очищенного тайтина m. soleus кролика с моноклональными антителами Т11 (Sigma) к участку молекулы тайтина, расположенной в I-зоне саркомера. ТЦМ – тяжёлые цепи миозина;
Т1 – интактный тайтин-1;
Т2 – протеолитический фрагмент Т1.
Было обнаружено, что электрофоретическая подвижность тайтина, выделенного как из быстрой (m. psoas), так и медленной (m. soleus) скелетных мышц кролика, а также из скелетных мышц суслика, соответствует электрофоретической подвижности Т2-фрагментов тайтина с м.м. ~2000- кДа (данные не показаны). Электрофоретическим методом в выделенных препаратах тайтина скелетных мышц указанных животных не было обнаружено присутствия известной N2A-изоформы тайтина, а также более высокомолекулярной интактной изоформы этого белка. Препараты сердечного тайтина содержали ~95% Т2-фрагментов и ~5% известной N2B-изоформы этого белка. Перефразируя слова К. Маруямы, можно сказать, что к настоящему моменту все наши попытки выделить новые, более высокомолекулярные интактные изоформы тайтина оказались безуспешны.
Более того, можно сделать заключение о том, что до сих пор остаются безуспешными попытки выделения известных (N2A, N2BA, N2B) изоформ тайтина в количестве, достаточном для изучения их структурно функциональных свойств. Наши результаты показывают, что все in vitro исследования структуры и функции тайтина проведены на препаратах этого белка, состоящих на ~95% из Т2-фрагментов с незначительным содержанием (~5%) известных изоформ этого белка (в частности, N2B).
Таким образом, вследствие невозможности выделения открытых нами более высокомолекулярных интактных изоформ тайтина, изучение их структурно-функциональных свойств является пока невыполнимой задачей.
Однако мы впервые провели сравнительные in vitro исследования функциональных свойств (в частности, влияния на АТФазную активность и Са2+-чувствительность актомиозина) Т2-фрагментов, выделенных из сердечной и скелетных (m. psoas и m. soleus) мышц кролика, а также изучили связывание этих форм тайтина с актином. Результаты этих исследований представлены ниже.
2.2. Влияние тайтина поперечно-полосатых мышц кролика и суслика на структуру миозиновых нитей и на АТФазную активность и Са2+ чувствительность реконструированного актомиозина Миозин поперечно-полосатых мышц кролика и суслика при диализе в условиях, близких к физиологическим, образует биполярные веретенообразные нити с осевым периодом ~14 нм, свойственным толстым нитям in vivo.
Добавление тайтина как сердечной, так и скелетных мышц исследуемых животных приводит к пучкованию миозиновых нитей, что указывает на in vitro связывание этих белков, которое имеет место и в мышце. Наши электронно микроскопические наблюдения подтверждают данные других авторов о связывании тайтина с миозиновыми нитями (Kimura et al., 1984;
Maruyama, 1986). Результаты этих исследований совместно с данными о локализации тайтина в саркомере (Frst et al., 1988;
1989), а также с данными о связывании тайтина c лёгким меромиозином, формирующим ствол миозиновых нитей (Houmeida et al., 1995), указывают на структурную роль этого белка в мышцах позвоночных.
С целью проверки предположения об участии тайтина в регуляции актин миозинового взаимодействия в мышце мы провели эксперименты по его влиянию на основные свойства реконструированного актомиозина (АМ):
АТФазную активность и Са2+-чувствительность. Из литературных данных известно, что при =0.08 тайтин скелетных мышц цыплёнка оказывает незначительный активирующий эффект на АТФазу АМ (Kimura et al., 1984).
Однако при условиях, близким к физиологическим, подобных исследований с тайтином скелетных, а также сердечных мышц проведено не было. Более того, не было исследовано влияние тайтина поперечно-полосатых мышц на Са2+ чувствительность актомиозиновой системы. На этом свойстве АМ следует остановиться более подробно. Известно, что in vivo запуск сокращения скелетных и сердечных мышц инициируется присоединением Са2+ к тропонину С тропонин-тропомиозинового комплекса, локализованного на тонких нитях (Ebashi, Endo, 1968). Как следствие, исследователи Са2+-регуляции мышечного сокращения акцентируют основное внимание на тонких нитях и уточняют ту или иную модель регуляции «актинового типа». В то же время, роль миозина в регуляции сокращения поперечно-полосатых мышц позвоночных до сих пор не выяснена. Предполагается, что в этих мышцах он выполняет «модулирующую» функцию, т.е., не имея принципиального значения при Са2+-запуске сокращения, он способен при определенных условиях контролировать динамику сократительного акта. Полученные в нашей лаборатории данные показали, что при физиологической ионной силе (=0.12) и рН 7.0 актин активируемая АТФаза миозина поперечно-полосатых мышц обладает Са2+ чувствительностью при изменении рСа от 7.5 до 4.6 (Малышев и др., 2010). В частности, Са2+-чувствительность актин-активируемой АТФазы скелетного миозина в большинстве случаев составляла 30-50% (т.е. наблюдалась активация в ~1.3-1.5 раза актин-активируемой АТФазной активности миозина in vitro при увеличении концентрации Са2+ в растворе). Электронно микроскопические исследования эффектов Са2+ на структурное поведение миозиновых мостиков показали, что скелетный и сердечный миозин обладают также и структурной Са2+-чувствительностью (Podlubnaya et al., 1999;
2000).
Она выражается в отходе миозиновых мостиков от ствола реконструированной нити при изменении рСа от 7.5 до 4.6, в результате чего нарушается осевая периодичность в расположении ярусов миозиновых мостиков на поверхности нити (переход «порядок-беспорядок»).
Мы изучили влияние тайтина сердечной и скелетных мышц кролика и суслика на основные свойства реконструированного актомиозина: АТФазную активность и Са2+-чувствительность. Показано, что в присутствии тайтина как сердечной, так и скелетных (m. psoas, m. soleus) мышц кролика и суслика наблюдается увеличение АТФазной активности АМ в ~1.2-1.7 раза. При этом только в присутствии тайтина скелетных мышц исследуемых животных наблюдалось увеличение Са2+-чувствительности актин-активируемой АТФазы миозина. Необходимо отметить, что активирующий эффект тайтина на основные свойства АМ проявлялся только в том случае, когда миозиновые нити формировались диализом (=0.12) в присутствии тайтина. В случае добавления тайтина к сформированным нитям миозина непосредственно перед измерением ферментативной активности и Са2+-чувствительности миозина наблюдался ингибирующий эффект тайтина на эти свойства АМ. Учитывая эти результаты можно предположить, что обнаруженный нами активирующий эффект тайтина на основные свойства реконструированного актомиозина связан не с прямым влиянием самого тайтина на заряд или структуру миозиновых мостиков, а проявляется через опосредованное участие тайтина в формировании миозиновых нитей с более нативной структурой, чем таковая у нитей, состоящих из одного миозина. Однако непосредственного влияния тайтина на движение миозиновых мостиков в реконструированных нитях миозина исключить нельзя. В поддержку этого предположения можно привести данные in vitro экспериментов, показывающие связывание FnIII доменов А-области тайтина с субфрагментом-1 миозина (Muhle-Goll et al., 2001). Авторами высказывается предположение, что это связывание может вносить вклад в снижение Са2+-чувствительности актомиозинового взаимодействия при укорочении мышцы.
Итак, обнаруженное нами влияние тайтина на основные функциональные свойства миозина подтверждает предположение об участии этого белка в регуляции актин-миозинового взаимодействия в мышце. Ниже приведены результаты наших исследований по связыванию тайтина с актиновыми нитями, которые также подтверждают важную роль тайтина в регуляции мышечного сокращения.
2.3. Взаимодействие тайтина поперечно-полосатых мышц кролика и суслика с Ф-актином Ранее было высказано предположение, что тайтин способен слабо связываться с тонкими нитями (Maruyama et al., 1987;
Funatsu et al., 1993).