Динамика экспрессии генов сегментации у дрозофилы

На правах рукописи

Мария Георгиевна Самсонова ДИНАМИКА ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ СЕГМЕНТАЦИИ У ДРОЗОФИЛЫ 03.00.28 - биоинформатика

Автореферат диссертации на соискание учной степени e доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2008

Работа выполнена в отделе компьютерной биологии Центра перспективных исследований Санкт Петербургского государственного политехнического университета.

Научный консультант: Сергей Георгиевич Инге-Вечтомов доктор биологических наук, профессор, академик РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л.В.Омельянчук доктор биологических наук, профессор А.А.Миронов доктор биологических наук, профессор А.П.Перевозчиков

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится “” 2008 г. на заседании диссертацион ного совета по защите диссертаций на соискание учной степени доктора биологических наук e (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10.

тел. (383)333-12-78, e-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан “” 2008 г.

Учный секретарь диссертационного совета, e доктор биологических наук А.Д. Груздев 1

Общая характеристика работы

Работа посвящена исследованию механизмов детерминации сегментов 1 в морфогенетическом поле сегментации у плодовой мушки дрозофилы.

Морфогенетическое поле является основным элементом онтогении, и, как физически обособ ленная область, формируется в результате сложных координированных взаимодействий со ставляющих его компонент - генов, транскриптов и белков. Эти взаимодействия приводят к тому, что каждая клетка поля становится детерминированной, выбирая один из многих воз можных путей развития (Белоусов, 2005). Детерминация сегментов происходит в морфогене тическом поле, представляющем собою ту часть эмбриона, из которой в будущем разовьется зародышевая полоска (Корочкин, 2002;

Gilbert, 2003), и приводит к определению положения границ парасегментов (Martinez-Arias and Lawrence, 1985). Физическими компонентами мор фогенетического поля сегментации являются гены сегментации и их продукты (см. раздел 2.1).

Выполненный комплекс исследований был ориентирован на создание оригинальных ме тодов получения количественных данных из изображений картин экспрессии генов, изучение особенностей динамики экспрессии генов сегментации, математическое моделирование экс прессии генов gap в циклах 13 и 14А, а также создание атласа пространственно-временной экспрессии генов.

1.1 Актуальность темы Несмотря на большой объем информации о регуляторных взаимодействиях генов сегмента ции (Akam, 1987;

Ingham, 1988;

Корочкин, 2002), знания о механизмах регуляции этих генов, и в особенности, о механизмах экспрессии генов gap, являются далеко не полными. Это, с одной стороны объясняется неполнотой экспериментальных данных о регуляторных взаимо действиях, с другой - методологическими трудностями, которые возникают, когда вывод о регуляторном взаимодействии у многоклеточного организма делается на основе качественно го анализа экспрессии гена у мутантов. Кратко эти трудности можно обозначить как проблемы непротиворечивости, уникальности и полноты предполагаемого регуляторного механизма.

Для доказательства непротиворечивости гипотетического регуляторного механизма тре буется учет вклада всех регуляторов исследуемого гена. Современные экспериментальные ме тоды, однако, имеют ограниченную возможность одновременного анализа влияния всех регу ляторов на данный ген, поскольку они основаны на анализе картин экспрессии у мутантов, а получение организмов с мутациями более чем в трех регуляторах часто является непростой задачей. Более того, генная сеть у мутантов по определению состоит из неполного, или де фектного набора регуляторных взаимодействий генов. Таким образом, выводы о структуре генной сети дикого типа приходится делать на основании данных многих экспериментов с мутантами. Непротиворечивость же выявленных взаимодействий может быть продемонстри рована только при проверке их в интактном развивающимся организме, содержащем полный набор регуляторов.

Другая проблема, возникающая при интерпретации картин экспрессии у мутантов, состо ит в доказательстве уникальности механизма взаимодействия, т.е. доказательстве того, что данное регуляторное взаимодействие является прямым, а не опосредованным. Такие доказа тельства требуют проведения дополнительных экспериментов.

И наконец, существует фундаментальная проблема демонстрации полноты выявленных регуляторных взаимодействий. Действительно, необходимость материнских генов и генов gap - физических компонент морфогенетического поля сегментации - для правильной экспрессии генов gap не означает достаточности этого набора генов. В принципе доказательство доста Сегменты - последовательно чередующиеся морфологические структуры тела дрозофилы точности выявленного регуляторного механизма невозможно без реконструкции системы ab initio из отдельных, хорошо контролируемых компонентов. Очевидно, что современные экс периментальные методы не позволяют провести такую реконструкцию, и, следовательно, она должна быть проведена in silico с помощью математического моделирования и численных расчетов (Ратушный et al., 2005).

Другой вопрос, один из самых важных в эмбриологии, состоит в выяснении механизма детерминации клеток и частей зародыша. В основе этого механизма лежит активация тех или иных генов в разных клетках, что приводит к возникновению пространственно неоднородной картины экспрессии генов ("узора"или так называемого паттерна). У дрозофилы детермина ция сегментов определяет положение парасегментных, а не сегментных границ. Образование парасегментов предшествует формированию сегментов на более поздних стадиях развития.

В морфогенетическом поле сегментации сегментный препаттерн образуют полосы экспрессии генов segment polarity (Lawrence and Johnston, 1989;

Martinez-Arias and Lawrence, 1985;

Ingham and Martinez-Arias, 1992;

Жимулев, 2003).

Классическое объяснение механизмов детерминации было предложено в 1969 году Л.Вол пертом, сформулировавшим теорию позиционной информации (Wolpert, 1969;

Wolpert, 1989).

Согласно этой теории судьба клетки определяется ее положением в определенном простран ственном поле зародыша, в котором существует градиент концентрации некой сигнальной молекулы, называемой морфогеном. Считывание информации о градиенте морфогена и ее ин терпретация приводят к дифференциации клеток в том или ином направлении в зависимости от уровня концентрации морфогена.

У дрозофилы продукт материнского координатного гена bcd является классическим при мером морфогена (Driever and Nsslein-Volhard, 1988b;

Driever and Nsslein-Volhard, 1988a;

u u Ephrussi and St Johnston, 2004). Проведенные в последнее время генетические и теоретиче ские исследования указывают на то, что действие одного лишь морфогена Bcd недостаточно для возникновения прострвнственно неооднородной картины экспрессии генов в бластодерме дрозофилы. В нашей работе исследована динамика позиционирования областей экспрессии генов сегментации, и на основе полученных данных обсуждается адекватность концептуаль ной модели Л.Волперта для объяснения механизмов формирования сегментного препаттерна в бластодерме дрозофилы.

Понимание принципов организации и функционирования морфогенетического поля сег ментации требует детального количественного описания динамики каждой из его компонент.

Несмотря на высокую разрешающую способность, метод ДНК чипов так же, как и многие другие методы количественной оценки экспрессии генов (количественный PCR, CAT assays), имеет ограниченное применение для решения этой задачи. Дело в том, что все эти методы используют гомогенаты клеток и, таким образом, теряют информацию об экспрессии генов в пространстве. Перспективным является использование иммунофлуоресцентного маркирова ния биологических макромолекул в сочетании с лазерной конфокальной микроскопией, кото рая позволяет получать качественные цифровые изображения картин экспрессии генов, гото вые для извлечения количественных данных об экспрессии путем компьютерной обработки.

Очевидно, что качество математического моделирования зависит от качества эксперимен тальных данных. Как было отмечено Х.Китано (Kitano, 2002) идеальный набор данных дол жен быть исчерпывающим по полноте оцениваемых компонент, измеряемых параметров и по охвату временной динамики, точным в количественном отношении, а также систематическим.

Последнее означает, что способ получения данных разных типов должен допускать их со гласованную интеграцию. Хотя эти требования очевидны, в настоящее время лишь немногие наборы данных им удовлетворяют и, поэтому, получение такого набора данных по экспрессии генов сегментации имеет важное значение.

Эффективное использование количественных данных по экспрессии генов сегментации требует организации набора данных в виде базы данных, что обеспечит эффективное хранение и выборку информации, а также облегчит анализ данных, нацеленный на выявление новых биологических закономерностей изучаемого процесса и формулировку новых гипотез для их направленной проверки в экспериментах. Отметим, что по своей сути такая база данных будет пространственно-временным атласом экспрессии генов, поскольку она хранит количественную информацию об экспрессии в разных точках морфогенетического поля и в разные моменты времени.

1.2 Цели работы Цели диссертационной работы состояли в том, чтобы:

1. Разработать новый конвейерный метод количественной оценки уровня экспрессии глав ных компонент морфогенетического поля сегментации у дрозофилы - генов сегментации - на основе изображений, полученных с помощью конфокальных микроскопов. Этот ме тод должен включать сегментацию изображений, удаление фонового сигнала, определе ние возраста эмбриона, пространственную регистрацию картин экспрессии и интеграцию данных.

2. Получить исчерпывающий по полноте, точный в количественном отношении и систе матический набор количественных данных об экспрессии генов сегментации в каждом ядре каждого индивидуального эмбриона, а также эталонные, интегрированные данные об экспрессии каждого из 14 генов сегментации в каждой области эмбриона в разные моменты времени;

3. Изучить динамику формирования областей экспрессии генов в морфогенетическом поле сегментации путем оценки положения каждой области в разные моменты времени;

4. Создать математическую модель механизмов регуляции экспрессии генов gap в цикле деления ядер 14А. Примененить эту модель для in silico реконструкции сети генов gaр и выявления механизмов, обеспечивающих сдвиги границ областей экспрессии этих генов;

5. Для облегчения работы теоретиков и биологов с данными создать пространственно временной атлас экспрессии генов сегментации в виде реляционной базы данных, до ступной в сети Интернет.

1.3 Объекты и методы исследования Основным объектом исследования являлись 1580 эмбрионов мух дикого типа (Oregon-R), окра шенные методом непрямого иммунофлуоресцентного маркирования для выявления белковых продуктов материнских координатных генов bicoid (bcd) и caudal (cad), генов gap Krppel (Kr), u knirps (kni), giant (gt), hunchback (hb), tailless (tll) и генов pair-rule even-skipped (eve), fushi tarazu (ftz), hairy (h), runt (run), odd-skipped (odd), sloppy-paired (slp) и paired (prd). Примерно половина из этих эмбрионов была также прокрашена на гистоновые белки для подсвечива ния областей изображения, относящихся к ядрам. 4490 изображений картин экспрессии выше перечисленных генов сегментации у эмбрионов были получены в лаборатории проф. Райни ца (Университет Стони Брук, США) с помощью конфокальных микроскопов Leica TCS4D и Leica TS-SP2. Эти изображения имеют размер 1024 x 1024 пикселей;

для записи сигнала используется восьмибитовый формат и настройки микроскопа, уменьшающие уровень шума в регистрируемом сигнале, а также процедура сканирования, позволяющая получить согла сованные данные по экспрессии одного гена в индивидуальных эмбрионах, сканированных в разных экспериментах (Kosman et al., 1997;

Kosman et al., 1998). Для сканирования выбирались эмбрионы разного возраста, начиная с 10 цикла дробления ядер и кончая гаструляцией.

Для извлечения количественных данных из изображений наряду с оригинальными мето дами, разработанными в данной работе, использовали стандартные методы обработки изобра жений (Gonzalez and Woods, 2002).

Поскольку экспрессия генов сегментации, главным образом, является функцией положения ядра вдоль передне-задней (A-P) оси, ее распределение по телу эмбриона достаточно хорошо может быть представлено в одном измерении. Ввиду этого, достаточным представляется ана лиз количественных данных из центральной 10% (по оси y) полоски, вырезанной в направлении A-P, т.е. вдоль оси x. Таким образом, каждому ядру сопоставляется лишь его x-координата, и картины экспрессии имеют вид графиков, отражающих изменение экспрессии генов вдоль оси x. Для описания областей одномерной картины экспрессии генов использовали аппрокси мацию квадратичными сплайнами или быстрое избыточное двоичное вейвлет-преобразование с автоматическим определением требуемого уровня декомпозиции картины экспрессии и ви зуальным контролем качества автоматического выделения признаков. Для уменьшения раз мерности вектора признаков применяли факторный анализ.

Сдвиги областей экспрессии генов оценивали с помощью дисперсионного анализа. Для вы яснения механизмов взаимодействия генов в сети генов gap, а также для объяснения механиз мов сдвигов областей экспрессии этих генов проводили математическое моделирование;

пред сказанные регуляторные взаимодействия и гипотезы сопоставляли с литературными данными и данными эксперимента. Для создания пространственно-временного атласа экспрессии генов использовали реляционную СУБД IBM DB2, для реализации вэб-интерфейса пользователя применяли такие технологии, как HTML, JSP, Java-сервлеты, Java-апплеты и Java-скрипты.

1.4 Научная новизна работы В настоящей работе впервые • разработан конвейерный метод получения количественных данных по экспрессии генов сегментации из конфокальных изображений картин экспрессии этих генов. Метод вклю чает 5 процедур, а именно, сегментацию изображений, удаление фонового сигнала, опре деление возраста эмбриона, пространственную регистрацию картин экспрессии и инте грацию данных, которые можно применять последовательно и по отдельности;

• получен полный, точный и систематический набор количественных данных об экспрессии генов сегментации в каждом ядре каждого из 1580 индивидуальных эмбрионов, а также интегрированные данные об экспрессии каждого из 14 генов сегментации;

• показано, что области экспрессии генов сегментации, локализованные в будущей заро дышевой полоске, по мере своего формирования в цикле 14А смещаются к переднему полюсу эмбриона;

• предложена математическая модель для предсказания механизмов регуляции экспрес сии генов gap в цикле 14А, правильно воспроизводящая временную динамику экспрессии этих генов, степень перекрывания соседних областей экспрессии, а также воспроизводя щая сдвиги границ областей экспрессии генов gap в ходе цикла 14А;

• исследованы механизмы сдвигов центральной области экспрессии Kr, а также задних областей экспрессии kni и gt по направлению к переднему концу эмбриона;

• создан пространственно-временной атлас экспрессии генов сегментации в виде реляци онной базы данных FlyEx, доступной по сети Интернет.

1.5 Основные положения, выносимые на защиту 1. Компьютерная обработка цифровых изображений картин экспрессии генов, полученных с помощью конфокального микроскопа и иммунофлуоресцентного маркирования биоло гических макромолекул, может быть использована для получения количественных дан ных по экспрессии генов in situ.

2. Количественное описание пространственно-временной динамики компонент морфогене тического поля сегментации необходимо для понимания механизмов его функциониро вания.

3. Сдвиги областей экспрессии генов сегментации важны для позиционирования областей экспрессии генов-мишеней и играют важную роль в формировании сегментного пре паттерна.

4. Материнские гены bcd,cad и гены gap Kr, kni, gt, hb, tll не только необходимы, но и достаточны для правильной экспрессии генов gap в будущей зародышевой полоске.

5. Позиционная информация в бластодерме дрозофилы задается динамически меняющейся во времени комбинацией концентраций продуктов материнских и зиготических генов. В каждый момент времени эта комбинация определяется не только материнскими морфо генами, но и сдвигами границ областей экспрессии генов сегментации из-за регулятор ных взаимодействий. Это толкование подразумевает активный, а не пассивный способ интерпретации градиента морфогена и размывает границу между формированием и ин терпретацией позиционной информации.

1.6 Практическое значение работы Научно-практическая значимость работы состоит в том, что в ней впервые разработан и успеш но применен метод конвейерной обработки картин экспрессии генов сегментации с целью по лучения количественных данных по экспрессии генов. Метод был успешно адаптирован для обработки данных по экспрессии генов сегментации на уровне мРНК (Janssens et al., 2006), для обработки оптических срезов изображений картин экспрессии генов в ядрах эмбриона дрозофилы, а также для маскирования экспрессирующих областей и получения количествен ных данных по экспрессии генов в раннем развитии коралла Acropora millepora и морского анемона Nematostella vectensis (Kozlov et al., 2007). Все это позволяет считать разработанный метод важным инструментом извлечения количественной информации из изображений картин экспрессии генов. Отметим также, что в силу универсальности большинства процедур разра ботанный метод может с небольшими модификациями применяться для обработки широкого спектра биологических изображений и, таким образом, представляет интерес для широкого круга ученых в области молекулярной биологии.

В качестве одной из процедур конвейерного метода предложен новый метод определения возраста эмбриона в цикле развития 14А, основанный на анализе динамичных картин экс прессии гена eve, окрашенного у всех эмбрионов, и стандартизации этих картин экспрессии относительно возраста эмбриона, определенного в эксперименте. Этот метод позволяет ав томатизировать процедуру предсказания возраста, делает ненужным трудоемкое определение возраста экспериментальным путем и, таким образом, является важным усовершенствованием метода определения возраста эмбриона дрозофилы в раннем эмбриогенезе.

Количественные данные по экспрессии генов сегментации, полученные в данной работе, уникальны по охвату временной динамики, точны, имеют клеточное разрешение и получе ны в результате систематических и масштабных экспериментов, проводимых в одной лабо ратории и с использованием одних и тех же стандартизованных методов. Эта особенность сделала полученные данные исключительно востребованными мировым сообществом, исполь зующим их как в теоретических исследованиях, так и для изучения механизмов сегментации, см. например, Holloway et al., 2003;

Pereanu and Hartenstein, 2004;

Diambra and da Costa, 2005;

Aegerter-Wilmsen et al., 2005;

Isalan et al., 2005;

Ludwig et al., 2005;

Holloway et al., 2006;

Krishna et al., 2005;

Ochoa-Espinosa et al., 2005;

Perkins et al., 2006;

Yucel and Small, 2006;

Zinzen and Papatsenko, 2007;

Bergmann et al., 2007.

Созданный пространственно-временной атлас экспрессии генов сегментации FlyEx явля ется открытым ресурсом, широко используемым мировым сообществом биологов и биоинфор матиков. Так например, в 2006 году общее количество обращений к FlyEx составило более 260000.

В работе исследуется центральный вопрос эмбриологии - механизмы детерминации клеток и частей зародыша в морфогенетических полях. Помимо этого, выполненные исследования имеют важное значение для лучшего понимания медицинских аспектов развития, а совокуп ность разработанных методов и моделей формирует, в конечном итоге, методологическую базу для реконструкции генной сети организма при отсутствии или ограниченном использовании мутагенеза.

1.7 Апробация работы Результаты диссертационной работы были доложены на конференциях: Computational Cell Biology Workshop [CSHL 2007] (Cold Spring Harbor, USA, 2007);

Санкт-Петербургской между народной конференции по нанобиотехнологии, пленарный доклад, (Санкт-Петербург, 2006);

3 Workshop on Data Integration for the Life Sciences [DILS2006] (Hinxton, UK);

1, 3, 4 и International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure [BGRS’1998, 2002, 2004, 2006], в 2006 г. - приглашенный доклад (Новосибирск, 1998, 2002, 2004 и 2006);

3 и 4 TICSP Workshop on Computational Systems Biology, приглашенные доклады (Tampere, Finland, 2005 и 2006);

2, 3 и 4 International Symposium on Networks in Bioinformatics, в 2005 и 2006 г.г. - приглашенные доклады, [ISNB 2005, 2006, 2007] (Amsterdam, the Netherlands, 2005, 2006 и 2007);

NETTAB 2005 workshop, Workows management: new abilities for the biological information overow (Naples, Italy, 2005);

2d Integrative Bioinformatics Workshop, приглашенный доклад, (Bielefeld, Germany, 2005);

42, 44, 45 и 46 Annual Drosophila Research Conferences, (Washington DC, San Diego, Washington DC и Chicago, USA, 2001, 2003, 2004 и 2005);

Intl. Moscow Conference on Computational Molecular Biology (Moscow, Russia, 2003);

7, и 11 Int. Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology [ISMB99, ISMB02, ISMB03], в 1999 г. - премия SGI за лучший доклад на конференции, (Heidelberg, Germany, 1999;

Edmonton, Canada, 2002;

Brisbane, Australia, 2003);

Computation in Cells: EPSRC Emerging Computing Paradigms Workshop, приглашенный доклад, (Hertfordshire, UK, 2000) и т.д.

С использованием материалов диссертации автором сделано 2 приглашенных доклада в Lawrence Berkeley National Laboratory, USA (2002 и 2006 гг.), доклад на Московском семи наре по биоинформатике (2006), приглашенные доклады в 2003 г. в Genetics Department, Cambridge University (UK) и в Bioinformatics Research Centre, University of Glasgow (UK), при глашенные доклады в 2005 г. на Вioinformatiсs Сolloquium, Georg-August-Universitat Gottingen (Germany) и на Waterman Seminars, the Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK, Germany), приглашенный доклад в Laurence H. Baker Center for Bioinformatics and Biological Statistics Seminar Series, Iowa University, USA (2001), а также 2 приглашенных лекции на the Les Houches Summer School "Multiple Aspects of DNA and RNA: from biophysics to bioinformatics"(2004). Также сделаны 3 приглашенных доклада на семинарах Dagstuhl: 3d Dagstuhl Seminar for Information and Simulation Systems for the Analysis of Gene Regulation and Metabolic Pathways (2001);

Dagstuhl Seminar 04281 "Integrative Bioinformatics - Aspects of the Virtual Cell (2004), Dagstuhl Seminar 03051, "Information and Process Integration: A Life Science Perspective"(2003) и многих других семинарах. Сделан также доклад на семинаре, организованном фирмой Leica, "Современные конфокальные микроскопы фирмы Leica и их применение в биологии"(Санкт-Петербург, 2006).

Кроме того результаты работы обсуждались на Санкт-Петербургском семинаре по ком пьютерной биологии, на семинарах кафедр эмбриологии и генетики Санкт-Петербургского го сударственного университета и были включены в лекцию на Международной школе-семинаре BGRS "Эволюция, системная биология и суперкомпьютерные вычисления в биоинформати ке"в 2005 г. (Новосибирск, Россия).

1.8 Публикации По материалам диссертации опубликовано 45 научных работ (все в соавторстве), в том числе 23 статьи в реферируемых научных журналах.

2 Структура диссертационной работы Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов и библиографии (229 наименования). Ее полный объем составляет 165 страниц, количество рисунков 44.

2.1 Содержание работы Во Введении объясняются актуальность и цели работы, ее научная новизна, практическая значимость. Сформулированы положения, выносимые на защиту. Приведена информация об апробации работы, количестве публикаций автора, описана структура диссертации.

Первая глава “Cовременные представления о детерминации сегментов у дрозо филы” является обзором литературы.

У дрозофилы морфологически различимые границы сегментов формируются гораздо позд нее того времени, когда происходит детерминация сегментов. Формированию границ сегментов предшествует кратковременное появление границ парасегментов, которые возникают во вре мя удлинения зародышевой полоски посередине каждого будущего сегмента (Campos-Ortega and Hartenstein, 1985). Детерминация сегментов приводит к определению положения границ парасегментов (Martinez-Arias and Lawrence, 1985) и происходит в морфогенетическом поле, представляющем собою на стадии синцитиальной бластодермы и в цикле деления ядер 14А ту часть эмбриона, из которой разовьется зародышевая полоска (Gilbert, 2003).

Ранний этап развития дрозофилы включает стадию дробления и синцитиальную бласто дерму. Стадия синцитиальной бластодермы продолжается с цикла деления ядер 10 по цикл деления 13. В это время ядра, мигрировавшие на периферию, образуют упорядоченный слой энергид (энергида - ядро, ассоциированное с участком цитоплазмы), прилегающий к поверх ности эмбриона. Цикл деления ядер 14 - первый цикл последующей стадии, называемой кле точной бластодермой. Часть цикла 14, предшествующая гаструляции, называется циклом де ления 14А. Во время цикла 14А ядра удлиняются вдоль собственной базально-апикальной оси и, вскоре после этого, начинается инвагинация мембран, которая обособляет ядра в отдельные клетки. Важно, что вплоть до полного образования клеточной мембраны каждая формирую щаяся клетка сообщается с ниже расположенным желтком посредством цитоплазматических каналов. Это делает возможным обмен белками между соседними энергидами в течение всей стадии синцитиальной бластодермы и цикла деления 14А.

Главные физические компонены морфогенетического поля сегментации суть гены сегмен тации - идентифицированы, клонированы (Akam, 1987;

Ingham, 1988) и подразделены на че тыре группы. Материнские координатные гены (Nsslein-Volhard et al., 1987) экспрессируются u материнским геномом и влияют на развитие переднего, заднего или терминальных районов эмбриона. Гены других групп gap, pair-rule и segment polarity являются зиготическими, т.е.

экспрессируются геномом эмбриона (Nsslein-Volhard and Wieschaus, 1980).

u Большинство материнских координатных и зиготических генов сегментации кодируют транскрипционные факторы, которые регулируют экспрессию зиготических генов сегмента ции. Таким образом, гены сегментации образуют сеть взаимодействующих друг с другом генов регуляторов. Анализ фенотипов двойных мутантов выявил иерархию регуляторных взаимо действий в этой генной сети (см. обзоры Akam, 1987;

Ingham, 1988), в соответствии с которой гены более высоких уровней (например, материнские координатные гены) регулируют гены более низких уровней (например, гены gap), а не наоборот. Помимо этого выявлены суще ственные регуляторные взаимодействия между генами, принадлежащими к одному уровню иерархии.

Во второй главе "Материал и методы" приведена информация об объекте и методах исследования.

В третьей главе "Метод получения количественных данных по экспрессии генов сегментации" рассмотрен оригинальный метод, а также лежащие в основе него алгоритмы, разработанные для количественной оценки уровня экспрессии генов сегментации на основе изображений, полученных с помощью конфокального микроскопа. Предложенный метод об работки является конвейерным и включает 5 базовых процедур: сегментацию изображений, удаление фонового сигнала, определение возраста эмбриона, пространственную регистрацию картин экспрессии и интеграцию данных. Описана точность каждой из разработанных проце дур.

Результаты представлены в статьях A3, A5, A6, A8, A9, A15, A16, A17, A19, A20, A21, A22, A25, A29, A31, A36, A38, A40, A42, A43, А45.

Сегментация изображений включает четыре этапа: (1) приведение экспериментального изображения к стандартной ориентации, так чтобы передний конец эмбриона находился сле ва, а спинная часть сверху;

(2) выделение области, занимаемой объектом на изображении, и отсечение пустой области по краям;

(3) построение "ядерной маски"эмбриона, то есть бинар ного изображения, в котором только пиксели в границах ядер имеют ненулевую интенсив ность;

(4) вычисление координат центроидов ядер и средней интенсивности флуоресценции в каждом ядре для каждого канала микроскопа, т.е. для каждого продукта сканированного гена. Среднюю интенсивность флуоресценции считаем пропорциональной уровню экспрессии гена (Kosman et al., 1997).

Этап приведения изображения в стандартную ориентацию начинается с построения одно го изображения на основе усреднения двух оптических срезов для каждого из трех генных продуктов, регистрируемых у одного эмбриона. Для изображений, прокрашенных на гисто новые белки, используемые в качестве ядерных маркеров, на основе этих двух срезов строим пиксельный максимум. Далее для каждого эмбриона создаем грубую маску путем констру ирования попиксельного максимального изображения из четырех изображений, полученных в разных каналах микроскопа, и применения к этому изображению порогового и медианных фильтров, а также нескольких циклов эрозии и дилатации (Gonzalez and Woods, 2002). Мас ка эмбриона используется для вычисления угла, на который надо повернуть эмбрион, и для удаления случайных пикселей на границах.

На втором этапе строится гладкая маска эмбриона, которая в точности повторяет его фор му. Для этого создаем новое изображение пиксельного максимума на основе предварительно повернутых и обрезанных изображений и к полученному изображению применяем последо вательно выравнивание гистограммы, медианный и пороговый фильтры. К полученному би нарному изображению применяем трансформацию эвклидова расстояния, медианный и по роговый фильтры, что приводит к созданию маски с очертаниями, более соответствующими натуральным контурам эмбриона. С помощью алгоритма Шена-Кастана (Shen and Castan, 1986), заполнения и эрозии получаем новую гладкую маску всего эмбриона и используем ее для обрезания изображений, полученных во всех каналах микроскопа.

На третьем и четвертом этапах строится так называемая ядерная маска на основе изоб ражения, прокрашенного на гистоновые белки, если оно имеется, или же на основе пиксель ного максимума экспрессии трех остальных генов. Сначала для усиления контраста и уточне ния границ ядер применяем локальное выравнивание гистограммы, удаляем гранулированный шум алгоритмом Кримминса и проводим несколько циклов медианной фильтрации. Далее, после инвертирования значений всех пикселей, создается изображение водораздела. Область водораздела определяется как территория, занятая одним ядром и ограниченная линией ши риной в один пиксель. Каждая область водораздела характеризуется уникальным значением градации серого цвета. В результате применения эрозии и порогового фильтра это изображе ние преобразуется в бинарное, где границы водораздела имеют значение 0. После умножения этого бинарного изображения на изображение пиксельного максимума или изображение ги стоновых белков, каждое ядро отделяется от соседних ядер границей из нулевых пикселей.

Эта операция позволяет разделить некоторые ядра, слившиеся на изображении. В заверше ние эрозия с последующим преобразованием расстояния (Vincent et al., 1997) и пороговым фильтром позволяют удалить из маски посторонние пятна, не являющиеся ядрами эмбриона.

Полученная бинарная маска используется для извлечения количественных данных об экс прессии генов. Координаты центроида каждого ядра вычисляются с помощью инвариантов моментов (Hu, 1962). Наложение маски на изображения, полученные в каждом канале мик роскопа, позволяет вычислить средние концентрации продуктов всех сканированных генов в каждом ядре.

Конечный результат представляет собой таблицу, содержащую (x,y) координаты каждого ядра в процентах от длины и ширины эмбриона, а также усредненную интенсивность флуо ресценции, или относительный уровень экспрессии для каждого из сканированных у данного эмбриона генов. Разработанная процедура извлечения количественной информации из биоло гических изображений реализована в оригинальном пакете ProStack (Processing of Stacks) для визуального построения сложных процедур обработки данных и изображений.

Качество построения ядерной маски обычно контролируется визуально путем ее наложе ния на изображение, полученное при сканировании гистонов, или на пиксельный максимум изображений, полученных в других каналах микроскопа. Для автоматизации нами предложен численный метод контроля качества ядерной маски, основанный на том, что разброс интенсив ностей для пикселей внутри ядра должен быть меньше, чем таковой между пикселями внутри ядра и вне его.

Удаление фонового сигнала. Хорошо известно, что наряду со специфическим окрашивани ем, методы иммунофлуоресцентного маркирования биологических образцов in situ приводят к появлению неспецифического сигнала, называемого фоном. Возникновение этого сигнала вызвано многими факторами, из которых важная роль принадлежит первичным и вторич ным антителам. Неспецифический фон может быть убран вручную для каждого конкретного слайда путем установки значения оффсета. Однако, очевидно, что простой установкой офф сета невозможно добиться удаления фона из всех картин экспрессии всех генов ввиду того, что для каждой картины требуются свои установки для удаления фона.

Очевидно, что даже незначительный уровень фона исказит численное значение уровня экспрессии гена. Более того, уровень фона варьирует от эмбриона к эмбриону и от экспери мента к эксперименту, что не позволяет провести сравнение данных, полученных в разных экспериментах.

Разработанный нами метод удаления фонового сигнала основан на наблюдении, что уро вень флуоресценции в нуль-мутантах, окрашенных на отсутствующий белок, хорошо аппрок симируется двумерным параболоидом (или, в более общем случае, выпуклой поверхностью второго порядка). Этот параболоид очень близок к симметричному относительно осей x и y.

Основная идея метода удаления фона состоит в определении неэкпрессирующих областей эм бриона, которые используются для аппроксимации фонового сигнала, чтобы затем удалить его масштабированием картины экспрессии.

Неэкспрессирующие области - участки эмбриона, в которых данный ген не экспрессируется в большинстве ядер - для каждого гена первоначально определяются на основе тщательного визуального изучения картин экспрессии во всех эмбрионах. Затем неэкспрессирующие об ласти уточняются на двумерной картине экспрессии каждого эмбриона. При этом, в силу искривления полос экспрессии вдоль оси y, их необходимо выпрямить.

Фоновый сигнал аппроксимируется квадратичным параболоидом по опорным точкам, вы деленным из неэкспрессирующих областей эмбриона с выпрямленными полосами. Процедура применяется последовательно ко всем изображениям картин экспрессии, полученным у одно го эмбриона. Большие неэкспрессирующие области следует разбивать на несколько областей с несущественной вариацией фона. Опорными точками считаются точки, в которых уровень ин тенсивности флуоресценции на превышает заданного порогового значения, примерно равного 2/3 разброса значений экспрессии в области.

Параболоид S(x, y) = 11 x2 +22 y 2 +12 xy +1 x+2 y +0, аппроксимирующий фон, стро ится при помощи итеративной оптимизационной процедуры. Окончательно фон удаляется из всего эмбриона линейным отображением интенсивности, которое преобразует значения флуо ресценции равные или меньше уровня фона в ноль, а максимально возможную флуоресценцию (255) саму в себя. Преобразование имеет вид ai S(xi, yi ) (n) ai = max 255, 0, i = 1... N, (1) 255 S(xi, yi ) В результате получаем нормированную картину экспрессии, в которой каждое ядро характе (n) (n) ризуется вектором vi = {xi, yi, ai }, i = 1,... N.

Важно подчеркнуть, что масштабирование нормализованных интенсивностей в диапазоне [0,255] необходимо в силу зависимости фона от выбора первичных и вторичных антител и отсутствия такой зависимости у уровня экспрессии гена.

Процедура удаления фона из широких картин экспрессии генов hb и cad, а также генов pair-rule на ранних стадиях дает лучший результат при допущении симметричности по оси x начального приближения параболоида. Ген bcd представляет собой специальный случай, по скольку для него задняя граница экспрессии не определена. Хорошо известно, что концентра ция белка Bcd распределена по экспоненциальному градиенту с максимумом в антериорном конце и достигает фонового уровня в постериорной трети эмбриона (Driever and Nsslein u Volhard, 1988b;

Driever and Nsslein-Volhard, 1988a). Мы нормируем картину экспрессии bcd, u добиваясь экспоненциальности нормированной картины.

Подтверждение обоснованности предложенного метода удаления фонового сигнала можно получить путем визуальной инспекции картин экспрессии. Слабым местом визуальной оценки является неявное предположение о том, что ни один из генов сегментации не имеет равномер но низкого уровня экспрессии в районах, лежащих вне пространственно органиченных обла стей экспрессии. Однако, при анализе данных, полученных при окрашивании одного и того же белка разными первичными и вторичными антителами, становится очевидно, что группы антисывороток разного качества дают одни и те же пространственно органиченные области экспрессии, но разные уровни фона. Более того, метод удаления фонового сигнала был тща тельно тестирован на мутантных эмбрионах, гомозиготных по нуль-мутации в каком-либо из генов eve, gt, kni или Kr и окрашенных для выявления продукта мутантного гена. Карти ны экспрессии у таких мутантов после удаления фона трансформируются в нулевой уровень экспрессии во всем эмбрионе.

Визуальная оценка картин экспрессии показывает, что метод удаления фона дает хорошие результаты для эмбрионов, относящихся к циклу 14А. Типичные результаты удаления фона Рис. 1: Результаты удаления фона из индивидуальных картин экспрессии ряда генов. За ис ключением случаев, когда цикл деления ядер указан, все остальные картины экспрессии по лучены в эмбрионах, принадлежащих циклу 14А. Ненормализованные картины экспрессии изображены белыми кружками;

картины экспрессии после удаления фонового сигнала пока заны черными кружками;

параболоид, аппроксимирующий фон, изображен сплошной линией.

из картин экспрессии bcd, hb, Kr, eve, run и h на этой стадии приведены на рис. 1. Для кар тин экспрессии генов gap и pair-rule на ранних стадиях точность метода значительно ниже.

В циклах деления 10–12 картины экспрессии этих генов характеризуются очень низким уров нем интенсивности флуоресценции, присутствующей практически во всех частях эмбриона.

На рис. 1 приведены типичные картины экспрессии eve и kni в цикле 12 и результат удале ния фона. Интерпретация таких картин неоднозначна: возможно, что весь сигнал обусловлен неспецифической флуоресценцией и зиготическая экспрессия генов отсутствует.

Определение возраста эмбриона. Поскольку окрашивание и сканирование эмбрионов осу ществлялось без учета их возраста, необходимы специальные методы для определения времени развития. В силу того, что циклы делений с 10 по 13 являются непродолжительными по вре мени, для определения возраста эмбриона на этом промежутке времени достаточен подсчет количества ядер. Однако, цикл деления 14А занимает около 50 минут и, поэтому простой под счет количества ядер недостаточен. Предложенный для решения этой задачи эксперименталь ный метод требует использования одного из каналов микроскопа для получения изображений мембран. Он основан на измерении степени инвагинации мембраны у фиксированных эмбри онов и использовании стандартной кривой, описывающей временную динамику инвагинации мембран in vivo, для определения возраста эмбриона (Merrill et al., 1988).

Мы разработали новый метод определения возраста эмбриона в цикле деления ядер 14А, основанный на анализе высоко динамичных картин экспрессии гена eve, окрашенного у всех эмбрионов, и стандартизации этих картин экспрессии относительно возраста эмбриона, опре деленного в эксперименте. Этот метод позволяет автоматизировать процедуру предсказания возраста, исключает трудоемкое определение возраста экспериментальным путем и, таким образом, значительно улучшает метод определения возраста эмбриона дрозофилы в раннем эмбриогенезе.

В качестве первого шага в разработке метода все эмбрионы, принадлежащие циклу де ления 14А, были распределены путем визуального анализа картин экспрессии eve по восьми временным классам. Поскольку эмбрионы были сканированы без учета их возраста, разум но предположить равномерное распределение возраста в выборке эмбрионов, принадлежащих циклу 14А. Так как все восемь временных классов содержат примерно одинаковое количество эмбрионов и цикл деления 14А занимает около 50 минут развития, можно считать, что каж дый класс по длительности соответствует примерно 6.5 минутам. Классификация эмбрионов, основанная на анализе динамики картин экспрессии гена eve, хорошо согласуется со степенью инвагинации мембран.

Для предсказания возраста эмбриона по картине экспрессии использовано обобщение ме тода SVM (Support Vector machine) на случай регрессионного оценивания (Vapnik, 1995;

Smola and Scholkopf, 1998). Метод предсказания возраста включает три этапа: (1) формирование обу чающей выборки эмбрионов, каждый элемент которой характеризуется набором характерных признаков, описывающих картину экспрессии, и экспериментально определенным возрастом;

(2) построение регрессионной функции по обучающей выборке;

(3) предсказание возраста для эмбрионов, не включенных в обучающую выборку и не имеющих экспериментальных данных о степени инвагинации мембраны.

В качестве обучающей выборки была использована группа из 103 эмбрионов, принадле жащих временным классам 3 - 8. Каждый эмбрион обучающей выборки был охарактеризован многомерным вектором, компонентами которого являются возраст эмбриона и 13 параметров, равных экстремумам экспрессии гена eve. Возраст был определен путем измерения степени инвангинации мембран на дорсальной стороне каждого из эмбрионов и использования стан дартной кривой (Merrill et al., 1988).

Малый размер обучающей выборки (103 эмбриона) по сравнению с размером вектора при знаков (13) может повлечь недостоверное предсказание и отсутствие устойчивости при измене нии параметров алгоритма. Для уменьшения размерности вектора признаков был использован факторный анализ. После применения факторного анализа к выборке из 501 эмбриона, отно сящихся к циклу 14А, была получена совокупность из 13 новых факторов. Важно, что для эмбрионов обучающей выборки, первые два фактора имеют значительную корреляцию с воз растом, 92% и 25% соответственно. Это позволило надежно предсказывать возраст, учитывая в векторе черт только первые три фактора, и увеличило скорость сходимости.

В результате подбора параметров, дающих наилучшее совпадение регрессионной функ ции с экспериментальными данными, было установлено, что модели со скалярным ядром и полиномиальным ядром второго порядка лучше всего согласуются с данными.

Результаты оценки точности предсказания возраста, осуществленной путем последователь ного исключения одного эмбриона из обучающей выборки и использования оставшихся эмбри онов в качестве рабочей выборки для предсказания возраста исключенного эмбриона, показа ли, что обе модели имеют примерно одинаковую точность в случае использования в векторе черт одного, двух или трех факторов. Ошибка предсказания возраста составляет около двух минут развития. Это хороший результат, если принять во внимание, что возраст эмбрионов в обучающей выборке находится в пределах от 20 до 50 минут с начала цикла деления 14А.

Таким образом, для аккуратного предсказания возраста эмбрионов, не включенных в обучаю щую выборку, достаточно только трех факторов. Чтобы провести различие между моделями, примем во внимание, что расчеты в задаче со скалярным ядром сходится гораздо быстрее (на пример, для трех факторов за 59 итерации против 197) и, следовательно, скалярная модель оказывается более предпочтительной.

Модели со скалярным ядром и полиномиальным ядром второго порядка были исполь зованы для предсказания возраста 398 эмбрионов, не принадлежащих обучающей выборке, причем вектор признаков был составлен из трех факторов. Предсказанные возрасты хорошо коррелировали с классификацией эмбрионов по временным классам.

Регистрация картин экспрессии генов сегментации. Использованные для получения дан ных конфокальные микроскопы позволяют получать у одного эмбриона картины экспрессии только трех генов. Нас же интересует пространственно-временная динамика экспрессии всех генов, контролирующих формирование препаттерна сегментации. В силу индивидуальной ва риабельности размеров эмбрионов, информацию об относительном расположении картин экс прессии разных генов в пространстве невозможно получить простым совмещением картин экспрессии у индивидуальных эмбрионов, окрашенных антителами к разным белкам. Чтобы решить эту задачу, данные, полученные для индивидуальных эмбрионов, должны быть при ведены к общей системе координат с помощью процедуры регистрации.

В данной работе был разработан метод регистрации, основанный на выделении контроль ных точек в изображении и на преобразовании координат для максимально полного совмеще ния этих точек в разных изображениях (Brown, 1992). В качестве контрольных точек обычно используют какие-либо характерные признаки изображений. Поскольку в нашем исследова нии все эмбрионы были сканированы для выявления экспрессии гена eve и картина экспрессии этого гена сильно меняется во времени, в качестве контрольных точек использовали характер ные признаки этой картины - экстремумы одномерной картины экспрессии, полученной путем экстракции данных из 10% центральной полосы эмбриона.

Регистрация изображений производится посредством масштабирования двумерных картин экспрессии вдоль оси абсцисс с помощью аффинного преобразования, минимизирующего сум марное расстояние между x-координатами всех экстремумов на разных картинах и средним положением соответствующих экстремумов по всем регистрируемым изображениям. Число экстремумов варьирует в зависимости от класса. В качестве функционала качества использо вана метрика, основанная на вычислении эвклидова расстояния.

Точность регистрации оценивали по величине стандартных отклонений положений экстре мумов от среднего значения локализации соответствующего экстремума у эмбрионов одного и того же временного класса. Точность метода регистрации выше у эмбрионов из поздних временных классов и уменьшается от центра эмбриона к периферии. У эмбрионов временного класса 8 точность регистрации в центральной 10% полосе находится в пределах 0.22–0.47%.

В других участках эмбриона эти значения колеблются от 0.29 до 4.42% и во многих случаях бывают меньше 1%. Поскольку диаметр одного ядра в центре эмбриона приблизительно равен 1% длины эмбриона (ДЭ), а на периферии примерно в 1.5 раза больше, полученные значения свидетельствуют о высокой точности регистрации.

Конструирование интегрированных картин экспрессии генов сегментации. Главной це лью пространственной регистрации и удаления фона является построение карты взаимного расположения областей экспрессии всех генов сегментации для множества эмбрионов одина кового возраста. Области экспрессии каждого гена на карте будут представлены своей “эта лонной” или “интегрированной” картиной экспрессии, которая характеризуется средними для всего временного класса значениями интенсивности флуоресценции. Идеальная интегриро ванная картина экспрессии данного гена могла бы быть построена в гипотетической ситуации, когда все эмбрионы имели бы одинаковую ядерную структуру, т.е. состояли бы из множества ядер с одинаковыми для всех эмбрионов координатами. В таком случае средние интенсивности флуоресценции могли бы быть вычислены независимо в каждом ядре. Однако, на самом деле количество и положение ядер в разных эмбрионах, а также плотность распределения ядер внутри каждого индивидуального эмбриона непостоянны. Поэтому должна быть вычислена усредненная ядерная структура картины экспрессии, учитывающая эти особенности. Эта зада ча решена путем определения пространственной плотности распределения ядер, что позволило вычислить среднее значение диаметра ядра в каждой точке усредненного эмбриона.

Конструирование двумерных интегрированных картин экспрессии мы выполнили, исполь зуя регистрированные данные, и для эмбрионов каждого временного класса. Для этого каждо му ядру каждого индивидуального эмбриона ставили в соответствие ядро усредненной ядерной структуры картины экспрессии, имеющее наиболее близкие координаты, после чего вычисля ли среднюю интенсивность флуоресценции по всем индивидуальным ядрам, отнесенным к данному среднему ядру.

Интегрированная картина экспрессии а Интегрированная картина экспрессии в gt, Kr, eve Индивидуальный эмбрион б gt, Kr, kni gt, Kr, eve Рис. 2: Атлас экспрессии генов во временном классе 8. а. Интегрированные картины экспрессии gt, Kr и eve;

б.картина экспрессии тех же генов у индивидуального эмбриона того же класса;

в. интегрированная картина экспрессии Kr, kni и gt в виртуальном эмбрионе.

Пример интегрированной двумерной картины экспрессии генов gt, Kr и eve у эмбрионов восьмого временного класса представлен на рис. 2а. Сравнение этой картины с картиной экс прессии тех же генов у индивидуального эмбриона класса 8 (рис. 2б) показывает, что инте грированная картина в целом правильно передает основные особенности экспрессии индиви дуальных генов, включая форму и размер областей экспрессии. Представленная на этом же рисунке картина экспрессии генов Kr, kni и gt (рис. 2в) интересна тем, что среди использован ных в данной работе эмбрионов не было эмбрионов, одновременно окрашенных для выявления экспрессии этих генов. Картируя интегрированные картины экспрессии на усредненную ядер ную структуру, теперь можно создавать так называемые "виртуальные эмбрионы"с новыми комбинациями генов для визуализации взаимного расположения их областей экспрессии.

Для конструирования одномерных интегрированных картин экспрессии генов сегментации координаты ядер каждой отрегистрированной одномерной картины экспрессии группирова лись вдоль оси x по R интервалам. Затем внутри каждого интервала вычислялось среднее значение интенсивности флуоресценции по всем эмбрионам данного временного класса. Чис ло R выбиралось из тех соображений, что в центральной части эмбриона диаметр одного ядра составляет примерно 1% от его длины, и, следовательно, R должно быть равно 100 для того, чтобы правильно смоделировать ядерную структуру картины экспрессии. Одномерные инте грированные картины экспрессии материнских генов во временном классе 3, генов gap и генов pair-rule во временном классе 8 изображены на рис. 3.

Разработанные нами методы были применены для получения количественных данных об экспрессии генов сегментации в каждом ядре каждого из 1580 индивидуальных эмбрионов (рис. 4 и рис. 5), а также эталонных, интергрированных данных об экспрессии каждого из 14 генов сегментации в каждой области эмбриона в разные моменты времени. Полученные данные имеют разрешение по пространству в одно ядро и разрешение по времени около 6. минут развития.

В четвертой главе "Динамическая природа позиционной информации" обсужда ются механизмы формирования сегментного препаттерна в бластодерме дрозофилы в свете новых, полученных нами данных о динамике формирования областей экспрессии генов сег ментации. Эти результаты представлены в статьях A1, A2, A10, A30, A33.

а bcd cad 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 б Интенсивность флуоресценции Kr hb kni tll gt 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 h в eve run ftz 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 г slp prd odd 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Длина эмбриона, % Рис. 3: Одномерные интегрированные картины экспрессии материнских генов во временном классе 3 (а), генов gap (б) и генов pair-rule (в,г) во временном классе Согласно классической теории, предложенной в 1969 году Л.Волпертом (Wolpert, 1969;

Wolpert, 1989), судьба клетки определяется ее положением в определенном пространственном поле зародыша, в котором существует градиент концентрации некой сигнальной молекулы, называемой морфогеном. Считывание информации о градиенте морфогена и ее интерпрета ция приводят к дифференциации клеток в том или ином направлении в зависимости от уровня концентрации морфогена. В соответствии с новой, уточненной концепцией, для классифика ции молекулы в качестве морфогена (Wolpert, 1989;

Gurdon and Bourillot, 2001) должно вы полняться несколько условий: морфоген должен быть распределен по пространству в форме постепенно меняющегося градиента, перемещаться и действовать на больших расстояниях, а также исключительно и непосредственно обуславливать зависящую от порога индукцию по крайней мере двух разных состояний экспрессии генов в клетках-мишенях.

Важно, что уточненная концепция морфогена и понятие позиционной информации осно ваны на четком разграничении между формированием и интерпретацией позиционной инфор мации. В основу этих концепций заложена статическая система координат, налагаемая на аб солютно пассивную ткань-мишень в каждый момент развития после достижения градиентом стационарного состояния. Результаты анализа динамики формирования областей экспрессии генов сегментации, полученные в данной работе, демонстрируют абсолютную неадекватность такой концептуальной модели для описания механизмов формирования паттерна в бластодер ме дрозофилы.

Рис. 4: Картины экспрессии материнских генов и генов gap в начале (временной класс 1 (Т1)) и конце (временные классы 7 или 8 (Т7 или Т8)) цикла 14А. Для каждого гена и временного класса приведены двумерная и одномерная картины экспрессии у типичного индивидуального эмбриона.

Для изучения динамики формирования областей экспрессии генов в морфогенетическом поле сегментации каждая область была охарактеризована небольшим числом характерных признаков (см. раздел 1.3). В качестве таких признаков выбирали положения максимумов экспрессии, а также x-координаты точек, в которых уровень экспрессии достигал некого по рогового значения, например 50% от максимального уровня.

Мы установили, что большинство областей экспрессии генов сегментации статистически значимо меняют свое положение по мере формирования. Особенно велики сдвиги центральной области экспрессии Kr, а также задних областей экспрессии gt, kni и hb (рис. 4). Эти области сдвигаются от заднего конца эмбриона к переднему. Так например, задние границы областей экспрессии Kr, gt и kni смещаются примерно на 5, 6 и 15 ядер соответственно (табл. 1) 2.

диаметр ядер, расположенных вдоль центральной переднезадней оси, приблизительно равен 1% ДЭ Рис. 5: Картины экспрессии генов pair-rule в начале (временной класс 1 (Т1)) и конце (времен ной класс 8 (Т8)) цикла 14А. Для каждого гена и временного класса приведены двумерная и одномерная картины экспрессии у типичного индивидуального эмбриона.

Таблица 1: Сдвиги областей экспрессии генов gap во времени.

Область gt ant hb ant Признак A пик 2 пик 3 P P (141) (61) (145) (144) (173) Интервал 1–8 5–8 1–8 1–8 1– Сдвиг -1.43 * 0.64 * -5.53 0.06 * -0. Область Kr cent kni post gt post hb post Признак A P A P A P A P (261) (261) (134) (134) (137) (137) (136) (136) Интервал 1–8 1–8 1–8 1–8 1–8 1–8 3–8 3– Сдвиг 1.02 5.23 1.6 6.32 6.38 15.21 2.02 4. Для каждой области экспрессии приведены величины сдвигов передней (A) и задней (P) границ. Для передней области экспрессии gt приведены также сдвиги положения пиков области экспрессии 2 (на том интервале, где она существует) и области экспрессии (рис. 4). Сдвиги положительны, если движение областей экспрессии происходит от зад него концу к переднему, сдвиги в обратном направлении имеют отрицательные значения.

Интервалы времени исчисляются во временных классах. Для каждой области экспрес сии в скобках указан объем выборки эмбрионов, использованной для вычисления сдвига.

Звездочкой отмечены сдвиги, не являющиеся статистически значимыми. "ant", "cent"и "post"обозначены области экспрессии, расположенные в передней, центральной и задней частях эмбриона соответственно.

Границы передней области экспрессии гена gt (рис. 4) не сдвигаются, и эта область не сужается со временем. Однако, во временном классе 4 у левой границы этой области на чинает формироваться новая область (пик 2). Образование новой области сопровождается сдвигом "родительской области"(пик 3) на пять ядер в направлении, противоположном дви жению остальных областей экспрессии генов gap, т.е. к заднему концу эмбриона (табл. 1). В интервале с первого по восьмой временной классы крутизна задней границы передней обла сти экспрессии hb увеличивается. В указанном интервале времени эта граница сдвигается в направлении к заднему концу эмбриона приблизительно на 0.9 ядер, однако сама передняя область экспрессии hb не меняет своего положения (табл. 1).

Большинство областей экспрессии генов pair-rule тоже изменяют свое положение в ходе цикла 14А и статистически значимо смещаются к переднему полюсу эмбриона (табл. 2). За исключением h и odd полоса 1 генов pair-rule либо не двигается, либо сдвигается очень незна чительно. Полоса 1 h сдвигается по направлению к заднему концу, а полоса 1 odd - к переднему, причем последний сдвиг коррелирует с образованием полосы 2. Наиболее значительные сдвиги обнаружены для полос 7 eve, h и run, причем эта полоса у eve смещается примерно на пять ядер.

Таблица 2: Сдвиги областей экспрессии генов pair-rule во времени.

ген / область 1 2 3 4 5 6 eve в.к. 3–8 3–8 3–8 3–8 4–8 4–8 3– (N=654) сдвиг 0.47 1.94 1.97 3.44 3.21 2.62 5. ftz в.к. 3–8 3–8 3–8 4–8 3–8 4–8 5– (N=158) сдвиг 0.20 * 1.27 1.72 1.86 2.27 3.84 1.01 * h в.к. 3–8 3–8 3–8 4–8 4–8 4–8 4– (N=105) сдвиг -2.18 1.54 3.61 1.11 2.61 3.25 3. odd в.к. 3–8 4–8 3–8 5–8 3–8 3–8 – (N=85) сдвиг 2.41 1.13 * 2.98 0.92 3.65 2.66 – run в.к. 3–8 4–8 3–8 5–8 3–8 3–8 5– (N=65) сдвиг 0.20 * 1.66 2.81 2.56 1.57 3.41 3. В качестве характерных признаков использовано максимальное значение интен сивности флуоресценции в каждой полосе. Промежутки времени, для которых вычислены сдвиги, начинаются с момента появления полосы и исчисляются во временных классах (в.к.). Объем выборки N приведен для каждого гена. Сдвиги для полосы 7 odd не приводятся, поскольку она формируется в самом конце цик ла 14A. Сдвиги положительны, если движение областей происходит от заднего концу к переднему, сдвиги в обратном направлении имеют отрицательные зна чения. Звездочкой отмечены сдвиги, не являющиеся статистически значимыми.

Анализ сдвигов областей экспрессии гена eve у 120 эмбрионов, у которых точный возраст был определен путем измерения степени инвагинации мембран и использования стандартной кривой (Merrill et al., 1988), показал, что в ходе цикла 14А полосы eve сдвигаются к переднему полюсу эмбриона непрерывно, хотя скорость движения полос 5 и 6 менее равномерна, чем таковая у полосы 7.

Движение не крайних, расположенных внутри картин экспрессии полос генов pair-rule, чаще всего коррелирует с образованием новой области экспрессии. Так например, полоса odd сдвигается очень сильно во временных классах с 3 по 5, когда от е задней границы е отпочковывается полоса 2. Сходным образом, образование полосы 7 odd во временных классах 5 - 7 сопровождается сначала сужением полосы 6 в интервале между временными классами и 7, за которым следует сильный сдвиг пика этой полосы во временных классах 7 - 8.

Поскольку недавно было продемонстрировано движение ядер в бластодерме эмбриона (Keranen et al., 2006), а также вследствие того, что большинство генов сегментации кодируют транскрипционные факторы, представляется важным произвести оценку вклада морфогене тических движений ядер в сдвиги областей экспрессии этих генов. С этой целью у живых эмбрионов оценили на дорсальной и вентральной сторонах сдвиги трех ядер, положение ко торых примерно совпадает с местом формирования головной бороздки (cf) (ядро 31), с поло жением максимума полосы 3 h в момент ее образования во временном классе 3 (ядро 51) и с положением задней границы центральной области экспрессии Kr во временном классе 1 (ядро 62).

62 а T 6.5 мин. cf задняя граница Kr 31 51 62 б T 19.5 мин. полоса 3 h cf 31 47 51 57 62 в 1111 T 52 мин.

полоса 3 h задняя граница Kr cf A-П Интенсивность флюоресценции 250 h во временном классе г run во временном классе h во временном классе run во временном классе h максимум полосы во временных классах 3 и run минимум между 50 полосами 2 и 3 во временных классах 3 и 20 25 30 35 40 45 50 55 % Длины Эмбриона Рис. 6: Движение ядер in vivo в сравнении со сдвигами областей экспрессии. Панели (а), (б), и (в) - соответствующие указанным моментам времени кадры фильма, демонстрирующего дор сальную сторону живого эмбриона. (г) - одномерные графики картин экспрессии run и h во временных классах 3 и 8. Овалами, нарисованными пунктирной линией, в (в) обозначены по ложения задней границы Kr и полосы 3 h во временном классе 8. Сходные результаты были получены на дорсальной и вентральной сторонах 15 эмбрионов. (г) показано, что положения максимума полосы 3 h и минимума межполосного промежутка 2/3 run сдвигаются относи тельно друг друга в интервале между временными классами 3 и 8.

Оказалось (рис.6), что в ходе цикла 14А ядра 51 и 62 сдвигаются к переднему концу эм бриона на расстояние, соответствующее половине диаметра ядра. Дальнейшие доказательства того, что обнаруженные в данной работе сдвиги областей экспрессии не обусловлены движе нием ядер, можно получить, рассмотрев поведение межполосного промежутка 2/3 гена run и полосы 3 h. В конце цикла 14А, во временном классе 8, картины экспрессии этих генов строго комплементарны и, следовательно максимум экспрессии h и минимум экспрессии run локализуются в одном месте (ядре). Однако, как следует из рисунка 6, на ранних стадиях этого цикла межполосный промежуток 2/3 run и полоса 3 h локализуются в разных местах эмбриона. Таким образом, в ходе цикла 14А межполосный промежуток 2/3 run и полоса 3 h сдвигаются относительно друг друга. Очевидно, что это явление не может быть обусловлено движением ядер.

Эти факты, а также данные об асимметричном расположении областей локализации мРНК генов сегментации относительно областей локализации соответствующих белков (cм. пятую главу), свидетельствуют о том, что сдвиги областей экспрессии в будущей зародышевой по лоске являются следствием регуляции активности генов и не обусловлены движением ядер.

Эти сдвиги по порядку величины совпадают с размерами полос экспрессии генов pair-rule (3–5 ядер) и, следовательно, очень важны для позиционирования областей экспрессии генов мишеней и для формирования сегментного препаттерна.

Важно, что в противоположность ядрам, расположенным в будущей зародышевой полос ке, ядро 31, расположенное в месте формирования головной бороздки, сдвигается к заднему концу эмбриона примерно на расстояние равное 2 ядрам (рис.6). Этот сдвиг совпадает по направлению и сопоставим по величине с размерами сдвигов областей экспрессии генов сег ментации, локализованных в головном отделе эмбриона (см. рис. 4 и рис. 5). Таким образом, не исключено, что сдвиги областей экспрессии генов сегментации в головном отделе могут быть обусловлены движением ядер.

Как известно, градиент Bcd был первым морфогенетическим градиентом, который уда лось увидеть непосредственно в эксперименте (Driever and Nsslein-Volhard, 1988b;

Driever u and Nsslein-Volhard, 1988a). Однако, следует отметить, что помимо Bcd в бластодерме дро u зофилы существует второй материнский градиент Hb, и что определение положения границ областей экспрессии генов-мишеней происходит в результате синергетического взаимодействия этих двух градиентов (Driever and Nsslein-Volhard, 1988b;

Simpson-Brose et al., 1994;

Reinitz u et al., 1995). Кроме того, в нашей работе показано, что концентрация морфогена Bcd непосто янна и сильно меняется во времени, а области экспрессии генов gap и pair-rule, являющихся мишенями действия материнских градиентов, меняют свое положение по мере развития. Все это означает, что позиционную информацию в бластодерме дрозофилы нельзя рассматривать как некое постоянное, заданное концентрацией морфогена позиционное число. Наоборот, дан ные о движении областей экспрессии генов-мишеней свидетельствуют о том, что позиционная информация не является статичной, а постоянно и быстро меняется. Как показано в пятой главе диссертации (см. ниже), сдвиги и уточнение границ экспрессии генов gap происходят за счет взаимной регуляции этих генов и не зависят от действия материнских градиентов и диффузии продуктов генов gap между ядрами. Материнские градиенты и гены gap сов местно определяют положение границ экспрессии генов pair-rule, которые тоже сдвигаются по мере развития. Разумно предположить, что такие сдвиги влияют на положение полос экспрес сии генов segment polarity и, тем самым, на положение парасегментных границ (Ingham and Martinez-Arias, 1992).

В свете всего выше сказанного, позиционную информацию в бластодерме дрозофилы сле дует рассматривать как динамически меняющуюся во времени комбинацию концентраций про дуктов материнских и зиготических генов. В каждый момент времени эта комбинация опреде ляется не только материнскими морфогенами, но и сдвигами границ областей экспрессии генов сегментации в результате регуляторных взаимодействий. Эта трактовка подразумевает актив ный способ интерпретации градиента морфогена и размывает границу между формированием и интерпретацией позиционной информации.

Пятая глава "Регуляторные взаимодействия в сети генов gap" посвящена резуль татам математического моделирования механизмов регуляции экспрессии генов gap в цикле 14А. Для доказательства существования в эмбрионе дрозофилы предсказанных регулятор ных механизмов использованы известные из литературы данные. Исследован также механизм, обеспечивающий сдвиги границ областей экспрессии генов gap.

Этот материал изложен в работах A4, A10, A11, А18, A24, A28, A34, A37, A41, A44.

Моделируется экспрессия генов в сети, включающей гены bcd, cad, hb, Kr, gt, kni, и tll, для чего используется метод, названный методом генных сетей (gene circuits) и впервые пред ложенный в (Mjolsness et al., 1991;

Reinitz et al., 1995). В модели рассматривается поведение системы в цепочке ядер, расположенной вдоль центральной оси эмбриона в направлении A–P и заключенной в интервале между координатами, равными 35% и 92% ДЭ. Поведение ядер во времени моделируется с помощью трех последовательных процессов: интерфаза, митоз и деление. Митоз отличается от интерфазы только отсутствием синтеза белка. Деление ядра является дискретным во времени.

a Внутреннее состояние i-го ядра определяется набором концентраций vi транскрипцион ных факторов, кодируемых генами сегментации с индексами a. Изменение концентраций во a времени dvi /dt зависит от интенсивности трех процессов, происходящих в течении интерфазы синтеза, диффузии и распада белка, представленных суммой слагаемых в правой части следующего нелинейного дискретного уравнения реакции-диффузии:

a dvi N = Ra g ab b a Bcd + ha b=1 T vi + m vi dt (2) +Da (n) (vi1 vi ) + (vi+1 vi ) a a a a a vi, a где a = 1,..., N и N число зиготических генов в модели.

Величины T ab в (2) представляют матрицу коэффициентов регуляторных взаимодействий Bcd и характеризуют регуляторное действие продукта гена b на экспрессию гена a. vi описывает концентрацию морфогена Bcd в ядре i. Регуляция белком Bcd активности гена a описывается параметром ma. Параметр ha характеризует регуляторный вклад других материнских фак торов транскрипции, равномерно распределенных в бластодерме эмбриона. Относительная интенсивность синтеза описывается с помощью сигмоидной функции регуляции–экспрессии g(ua ) = 2 ua / (ua )2 + 1 + 1, где ua = N T ab vi + ma vi + ha есть суммарный вклад 1 b Bcd b= регуляторов в экспрессию гена a. Максимальная интенсивность синтеза продукта гена a обо значена через Ra. Параметр a есть скорость распада продукта гена a и соотносится с пе риодом 1/2 полураспада данного белка по формуле 1/2 = ln 2/a. Коэффициент диффузии a a Da (n) обратно пропорционален квадрату расстояния между соседними ядрами.

Концентрации белков, обусловленные материнской экспрессией генов hb и cad (“материн ские градиенты”), используются как начальные условия для уравнений в цикле 13. Значения всех параметров находятся путем подгонки решения модели к экспериментальным данным по экспрессии в 9 последовательных моментах времени - цикле 13 и 8 временных классах цикла 14А, т.е. решается обратная задача математического моделирования. Минимизируется функ ционал качества, равный сумме квадратов разностей между экспериментальными данными и результатами расчета по модели:

(vi (t)model vi (t)data )2 + Epenalty, a a E= (3) где Epenalty - штрафная функция. Суммирование проводится по всем имеющимся данным Nd, то есть, по всем измеренным концентрациям белка для всех генов a, всех ядер i и всех вре менных классов t. Для нахождения параметров модели использовалась параллельная версия стохастического метода оптимизации - метода численного отжига Лама (PLSA). Этот метод подробно описан в Metropolis et al., 1953;

Kirkpatrick et al., 1983;

Lam and Delosme, 1988a;

Lam and Delosme, 1988b;

Reinitz et al., 1995;

Chu, 2001. Так как PLSA имеет стохастическую природу, а функционал качества имеет много локальных минимумов, то оптимальные значе ния параметров, найденные в результате нескольких проходов алгоритма, могут отличаться даже при сходных значениях функционала. В нашей работе каждый численный эксперимент заключался в нахождении 66 параметров для системы из 348 дифференциальных уравнений, а один цикл работы алгоритма занимал на кластере из 10 процессоров Intel Xeon–2.4GHz от до 160 часов в зависимости от начального приближения.

В результате расчетов было отобрано 10 сетей, картины экспрессии в которых находились в хорошем соответствии с данными. Распределение различных коэффициентов матрицы ре гуляторных взаимодействий в сетях не одинаково, но для большинства параметров устойчива тенденция к определенному типу регуляторного взаимодействия.

На рис. 7 приведены данные о характере взаимодействия материнских генов и генов gap.

Видно, что гены bcd и cad в основном активируют гены gap, а активность hb, kni, gt, Kr регу лируется по принципу автоактивации. Гены gap либо не взаимодействуют, либо репрессируют друг друга. Исключением является действие Gt на hb. Наиболее сильная взаимная репрессия наблюдается между парами генов gt и Kr, а также между hb и kni, причем области активности этих генов не перекрываются. Продукт терминального гена gap tll репрессирует все другие гены gap, кроме hb.

а bcd cad hb Kr gt kni tll hb 0/0/10 0/0/10 0/0/10 0/10/0 0/2/8 10/0/0 1/8/ Kr 0/0/10 0/0/10 9/1/0 0/0/10 10/0/0 9/1/0 10/0/ gt 0/0/10 0/0/10 9/0/1 10/0/0 0/3/7 1/9/0 10/0/ kni 3/0/7 0/0/10 10/0/0 6/4/0 9/1/0 0/0/10 10/0/ Значение параметра 0. б в 0. 0. -0. -0. m m T T T T T T T T T T T T Kr Kr Kr Kr Kr Kr Kr kn kn kn kn kn kn kn i i i i i i i ca hb Kr gt kn tll Kr kn ca hb gt tll d i i d Значение параметра 0. г д 0. 0. -0. -0. m m T T T T T T T T T T T T gt gt gt gt gt gt hb hb hb hb hb hb gt hb kn tll ca hb Kr gt ca hb Kr gt kn tll i d d i Рис. 7: Распределение коэффициентов матрицы регуляторных взаимодействий. а. Класси фикация параметров по типу взаимодействия. Строки - гены-мишени a, столбцы - гены регуляторы b (см. уравнение (2)). Значения параметров T и m 0.005 классифицирова лись как репрессия регулятором b действия гена-мишени a, значения в интервале от -0. до 0.005 классифицировались как отсутствие взаимодействия, а значения параметров 0. классифицировались как активация. Числа соответствуют числу сетей, в которых данное зна чение параметра означает репрессию/отсутствие взаимодействия/активацию соответственно.

Обычным шрифтом выделены взаимодействия, классифицированные в большинстве сетей как активация, курсив означает отсутствие взаимодействия, жирный шрифтом отмечены взаимо действия, классифицированные как репрессия. б-д. Графики разброса значений параметров m и T при регуляции экспрессии Kr (б), kni (в), gt (г) и hb (д).

Помимо анализа матрицы регуляторных взаимодействий, с целью выявления специфиче ских регуляторных взаимодействий, обуславливающих формирование границ областей экс прессии генов-мишеней, был проведен графический анализ комбинированного вклада разных регуляторов (T ab vi и ma vi ) в регуляцию гена-мишени.

b Bcd Графический анализ показал, что Bcd вносит весомый вклад в активацию передних обла стей активности gt и hb, а также центральной области экспрессии Kr. Cad оказывает активи рующее действие на экспрессию kni и gt в задней половине эмбриона. Более того, Cad вносит относительно большой вклад в активацию Kr в центральной области эмбриона, а также в активацию экспрессии hb в передней половине эмбриона на ранних стадиях развития.

Взаимно репрессирующие взаимодействия генов gap локализованы в пространстве. На помним, что Kr и gt имеют непересекающиеся области экспрессии в бластодерме (рис. 3, 8a).

Во всех сетях Gt репрессирует Kr (рис. 7а,б). Это взаимодействие определяет положение как передней, так и задней границ области активности Kr в цикле 14A (рис. 8в). Области актив ности hb и kni пересекаются с областью активности Kr (рис. 3, рис. 8б). В большинстве сетей Hb и Kni репрессируют Kr, однако эти воздействия являются более слабыми, чем действие Gt (рис. 7а,б). Kni участвует в определении положения задней границы центральной области активности Kr, а Hb - передней.

Рис. 8: Анализ действия репрессоров, определяющих положение границ области экспрессии Kr. (а и б) Решения уравнений модели в позднем цикле 14A. (в и г) Профили репрессии для Kr в позднем цикле 14A. Суммарный вклад регуляторов uKr показан сплошной черной линией как функция положения вдоль продольной оси эмбриона в процентах. Закрашенные области показывают индивидуальный вклад регуляторов. Горизонтальные пунктирные линии огра ничивают уровни регуляции, ниже которых экспрессия меньше 10%(нижняя линия) и, выше которого больше 90% (верхняя линия) от максимального уровня. Вертикальные пунктирные линии ограничивают области на продольной оси, где ua ниже 10% уровня активности. Стрел ка в в указывает на незначительный уровень дерепрессии Kr в отсутствии Gt. Звездочки в г показывают насколько сдвинется граница области экспрессии Kr в отсутствии Hb и Kni.

Результаты графического анализа комбинированного вклада разных регуляторов в регу ляцию остальных генов gap (hb, kni и gt) хорошо согласуются с результатами анализа коэф фициентов матрицы регуляторных взаимодействий (рис. 7).

Таким образом, нами обнаружено пять базовых регуляторных механизмов, обеспечиваю щих взаимное расположение областей экспрессии генов gap в эмбрионе (рис. 9):

• активация экспрессии генов gap под действием Bcd и Cad, распространяющаяся на ши рокие области эмбриона;

• автоактивация генов gap;

• сильная репрессия по принципу обратной связи между генами gap с неперекрывающи мися областями экспрессии;

• асимметричная репрессия между генами gap, чьи области экспрессии перекрываются • репрессия по принципу прямой связи экспрессии генов gap в задней части эмбриона под действием терминального гена tll.

Рис. 9: Схематическое представление топографии сети генов gap. Области экспрессии генов hb, kni, gt, Kr и tll показаны в виде прямоугольников. Передняя часть эмбриона слева. Схема основана на данных, представленных на рисунке 7a, причем показаны только те взаимодей ствия, которые наблюдались в 9 сетях gap из 10. Репрессия между генами показана в виде соединительных линий с усиками. Цвет фона обозначает области, испытывающие активирую щее действие белков Bcd (темно-серый) и Cad (светло-серый).

Анализ результатов численного моделирования динамики экспрессии генов gap позволяет выявить регуляторные механизмы, обуславливающие сдвиги границ областей экспрессии этих генов. Отметим, что численное моделирование является в настоящее время единственно до ступным способом решения этой проблемы в силу невозможности изучения ее генетическими методами, поскольку мутанты, у которых такие сдвиги отсутствуют, пока не получены.

Решение модельной задачи, соответствующее найденным оптимальным значениям пара метров, с высокой точностью воспроизводит сдвиги областей экспрессии генов gap в будущей зародышевой полоске эмбриона. Более того, исследование поведения модели показало, что синтез белка происходит исключительно в передней половине каждой из исследуемых обла стей (центральной области экспрессии Kr, областей экспрессии kni и gt в задней половине эмбриона), тогда как в задней части областей экспрессии преобладает процесс распада соот ветствующих белков. Синтез белка в передней части и распад белка в задней части каждой из областей, действуя совместно, сдвигают эти области по направлению к переднему полюсу эмбриона.

Гипотеза об асимметричном расположении зон синтеза белка по отношению к областям экспрессии, сформулированная на основании моделирования, была подтверждена эксперимен тальными методами. Было показано, что в цикле 14А области распределения концентраций мРНК Kr, kni и gt не симметрично локализованы относительно областей распределения кон центраций соответствующих белков и сдвинуты относительно последних по направлению к переднему концу эмбриона. Более того, области распределения концентраций мРНК этих ге нов так же, как и области распределения концентраций белка, смещаются в ходе цикла 14А к переднему полюсу эмбриона.

Решение уравнений модели без диффузии (c нулевыми значениями параметра Da ), соот ветствующее найденным оптимальным значениям параметров, воспроизводит во времени и пространстве сдвиги областей экспрессии. Таким образом, диффузия не оказывает существен ного влияния на сдвиги областей экспрессии генов gap.

Для объяснения механизмов сдвига областей экспрессии Kr, kni и gt был проведен графи ческий анализ регуляции экспрессии этих генов в области сдвига и в прилегающих областях.