Роль динитрозильных комплексов железа в защите биомолекул и клеточных структур от окислительного, нитрозативного и карбонильного стрессов
На правах рукописи
Шумаев Константин Борисович РОЛЬ ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА В ЗАЩИТЕ БИОМОЛЕКУЛ И КЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР ОТ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО, НИТРОЗАТИВНОГО И КАРБОНИЛЬНОГО СТРЕССОВ 03.01.04 биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва 2010
Работа выполнена в лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и в лаборатории биохимии свободнорадикальных процессов ФГУ Кардиологического научно-производственного комплекса Росмедтехнологий
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Ванин Анатолий Федорович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Капрельянц Арсений Сумбатович доктор биологических наук, профессор Каламкаров Григорий Рафаэльевич доктор биологических наук, профессор Осипов Анатолий Николаевич
Ведущая организация: ФГУ Научно-исследовательский институт физикохимической медицины Федерального медико-биологического агентства
Защита состоится « » мая 2010 года в часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1.
Автореферат разослан «_» 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В соответствии с современными представлениями усиленная продукция активных форм кислорода и азота вызывает комплекс патологических процессов и ответных реакций организма, обозначаемых соответственно окислительным и нитрозативным стрессами. [Halliwell, Chirico, Grisham et al., 1999;
Pacher et al., 2007]. В свою очередь накопление активных карбонильных соединений (альдегидов и кетонов), способных, как и активные формы кислорода и азота, вызывать структурные и функциональные изменения биомолекул, приводит к карбонильному стрессу [Goldin et al., 2006;
Schalkwijk 2007]. В связи с этим в последние годы возрос интерес к поиску антистрессовых соединений, способных продлить человеческую жизнь.
Основным предшественником активных форм кислорода (АФК) является анион-радикал супероксида. Образование активных форм азота определяется оксидом азота (NO) – простой молекулой, продуцируемой в биологических системах ферментативным путём [Schmidt, Murad, 1991]. Оксид азота выполняет функции одного из универсальных регуляторов биохимических и физиологических процессов. Например, NO вызывает расслабление гладких мышц сосудов, предотвращает агрегацию тромбоцитов, участвует в защите от патогенов, является нейромедиатором, регулирует программируемую гибель и пролиферацию клеток, а также играет важную роль в секреторной и репродуктивной системе [van Faassen, Vanin, 2007;
Thomas et al., 2008]. Такое разнообразие обусловлено образованием физиологически активных метаболитов NO и его взаимодействием c различными молекулярными мишенями [Wink, Mitchell, 1998;
Каламкаров и др., 2007;
Осипов и др., 2007;
Vanin, 2008]. Среди этих метаболитов особое место занимают S-нитрозотиолы и динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) с тиолсодержащими лигандами. Оба этих метаболита вовлечены в реализацию многих физиологических функций NO. Важнейшими из них являются активация гемсодержащей гуанилатциклазы, ингибирование митохондриальных белков и регуляция активности ряда факторов транскрипции. Кроме того, S-нитрозотиолы и ДНКЖ, связанные с альбумином и гемоглобином, считаются основными формами транспорта и депонирования NO в кровеносной системе млекопитающих [Stamler et al., 1992;
Muller et al., 2002;
Vanin, Manukhina, 2007].
Известно, что в условиях окислительного и нитрозативного стрессов NO может выступать в качестве антиоксиданта, способного, например, подавлять процессы свободнорадикального окисления липидов [Bloodsworth et al., 2000;
Schafer et al., 2002]. С другой стороны, при взаимодействии NO с супероксидом и молекулярным кислородом образуются активные формы азота, являющиеся сильными окислителями – пероксинитрит и диоксид азота [Pryor et al., 2006]. Эти процессы препятствуют функционированию NO как сигнальной молекулы. В настоящее время изучены реакции некоторых АФК с S-нитрозотиолами.
Однако взаимодействие активных форм кислорода с динитрозильными комплексами железа до начала нашей работы практически не исследовалось.
Между тем, положительное физиологическое действие этих комплексов при различных патологиях [Vanin, 2008] позволяет предположить, что ДНКЖ способны защищать компоненты биосистем от АФК, продуцируемых в условиях окислительного стресса.
Основной результат карбонильного стресса гликирование и гликоокисление белков под действием метилглиоксаля, малонового диальдегида и других активных карбонильных соединений. Предполагается, что продукты неферментативного гликирования могут влиять на активность NO-синтазы, а также перехватывать оксид азота [Goldin et al., 2006], однако механизм этих процессов остается не ясным. Исходя из вышесказанного, мы полагаем, что проявление цитопротекторных (антиоксидантых) и цитотоксических свойств NO зависит от взаимодействия его метаболитов с интермедиатами окислительного и карбонильного стресса. В то же время эти реакции являются пересечением ключевых регуляторных путей в клетках и тканях живых организмов. Таким образом, особенно актуальным представляется исследование молекулярных механизмов нормальных и патологических процессов, происходящих в биологических системах с участием динитрозильных комплексов железа, АФК и карбонильных соединений.
Цель и задачи исследования:
Целью работы было изучение механизмов антиоксидантного и регуляторного действия ДНКЖ в биологических системах в условиях окислительного, нитрозативного и карбонильного стрессов.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать взаимодействие содержащих низкомолекулярные тиолы динитрозильных комплексов железа с АФК и пероксинитритом. Выяснить влияние этих реакций на физиологическое действие ДНКЖ.
2. Исследовать взаимодействие между динитрозильными комплексами железа, связанными с гемовыми и негемовыми белками и интермедиатами окислительного и нитрозативного стресса.
3. Изучить антиоксидантные и прооксидантные свойства метаболитов оксида азота в системах, моделирующих различные аспекты окислительного стресса.
4. Выявить особенности формирования и деструкции ДНКЖ в биологических системах, в том числе в митохондриях и бактериальных клетках.
5. Исследовать взаимодействие физиологически активных метаболитов оксида азота с редокс-активными интермедиатами карбонильного стресса.
6. Выяснить возможность образования новых типов ДНКЖ, связанных с продуктами взаимодействия активных карбонильных соединений с аминокислотами.
Научная новизна работы.
В представленной работе впервые обнаружено взаимодействие супероксида с различными типами ДНКЖ, приводящее к деструкции этих комплексов. Определена константа скорости реакции альбуминовых ДНКЖ с супероксидом. Установлено, что распад динитрозильных комплексов под действием гидропероксида водорода катализируется ионами железа, не входящими в эти комплексы. Показано, что гемовая группа катализирует взаимодействие ДНКЖ с гидропероксидом водорода и органическими гидропероксидами. В то же время, эффективность деструкции гемоглобиновых ДНКЖ под действием пероксинитрита существенно ниже, чем у комплексов, связанных с альбумином. Сравнение антиоксидантного действия физиологических производных NO в различных модельных системах показало, что содержащие глутатион ДНКЖ гораздо эффективнее, чем GSNO, восстанавливают оксоферрильную форму миоглобина и ингибируют окислительную деструкцию каротина. Предложен механизм взаимодействия глутатионовых ДНКЖ с оксоферрильной формой гема. Впервые показано антиоксидантное действие нитрита и нитроксильного аниона при перекисном окислении гомогената миокарда крысы. В этой модели окислительного стресса установлено, что нитроксильный анион и связанные с альбумином ДНКЖ ингибируют деструкцию коэнзима Q. В разработанной модели окислительного стресса в культуре E. coli обнаружено протекторное действие GS-NO. В этом исследовании выявлена корреляция между образованием ДНКЖ в бактериальных клетках и защитным действием GS-NO. Доказано, что источником ионов железа при формировании ДНКЖ может быть ферритин и митохондрии. Выяснен механизм образования супероксидного радикала в ходе реакции L-лизина с активным карбонильным соединением метилглиоксалем.
Обнаружено, что в этих условиях S-нитрозотиолы стимулируют образование свободных радикалов шиффовых оснований и метилглиоксаля. В условиях, моделирующих карбонильный стресс, обнаружены новые типы ДНКЖ, связанные с продуктами реакций аминокислот с метилглиоксалем. Полученные оригинальные результаты позволили сформулировать гипотезу о функционировании ДНКЖ и S-нитрозотиолов в качестве регуляторов динамического равновесия защитных и деструктивных процессов при окислительном, нитрозативном и карбонильном стрессе.
Научно-практическая значимость работы.
Из вышеизложенного следует, что физиологические производные оксида азота играют чрезвычайно важную роль как в нормальных условиях существования человеческого организма, так и при патологических состояниях, сопровождающихся окислительным, и карбонильным стрессом (к таким патологиям относятся атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, диабет, нейродегенеративные заболевания, катаракта, рак, и др.). Полученные в диссертационном исследовании экспериментальные данные позволяют лучше понять роль ДНКЖ и других метаболитов оксида азота в процессах модификации биологических молекул активными формами кислорода и карбонильными соединениями и могут быть использованы для оптимизации применения препаратов доноров оксида азота (нитроглицерин и другие пролонгированные нитраты). Результаты исследования антиоксидантного действия динитрозильных комплексов железа, а также влияния АФК на сосудорасширяющее действие ДНКЖ имеют важное значение для разработки на основании этих комплексов новых полифункциональных фармакологических препаратов. Разработаны новые экспериментальные модели для исследования окислительного, нитрозативного и карбонильного стресса, в том числе с использованием экспрессирующей легоглобин культуры E. coli.
Апробация работы.
Результаты исследований докладывались на двенадцати российских и международных конференциях и симпозиумах: XI Международной конференции по химии органических и элементоорганических пероксидов (Москва, 2003), III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), II Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии (Москва, 2005), IV, V и VI научно практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск. 2005, 2007, 2009), XIV, XV и XVI международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармокологии и экологии» (Украина, Гурзуф, 2006, 2007 и 2008), 4-ой международной крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Украина, Судак, 2008), VIIth International Workshop on EPR (ESR) in Biology and Medicine (Poland, Krakow, 2007), международной научной конференции и восьмом съезде Белоруссокого общественного обединения фотобиологов и биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Беларусь, Минск, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 статей в рецензируемых изданиях, из них 21 в отечественных и 4 в международных.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, четырёх глав, посвященных результатам и их обсуждению, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 332 страницах, содержит рисунков и 5 таблиц. Список цитируемой литературы включает источник.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Синтез S-нитрозотиолов, ДНКЖ и пероксинитрита. Sнитрозоглутатион (GS-NO) и S-нитрозоцистеин синтезировали, смешивая эквимолярные концентрации NaNO2 и восстановленного глутатиона или цистеина в кислой среде.
Динитрозильные комплексы железа с глутатионом или цистеином в диамагнитной димерной форме получали, смешивая в сосуде Тунберга растворы FeSO4 и тиолов (молярное соотношение 1:2) в атмосфере оксида азота. ДНКЖ, связанные с фосфатными анионами, синтезировали аналогично, пропуская газообразный NO через раствор FeSO4 (5 мМ) в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0). Динитрозильные комплексы железа с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и метгемоглобином получали, добавляя к раствору белков ДНКЖ, связанные с фосфатными анионами.
Пероксинитрит получали, смешивая охлажденные растворы 1 М NaNO2 и 1 М Н2О в 0,3 М H2SO4, после чего быстро добавляли равный объём 1,4 М NaOН. Избыток Н2О2 убирали добавлением к реакционной смеси MnO2. Полученные препараты хранили при температуре жидкого азота. Концентрацию ДНКЖ определяли методом ЭПР, а концентрации GS-NO и ONOO- оптической спектроскопией по поглощению при 338 и 302 нм, соответственно.
Выделение митохондрий. Митохондрии выделяли из сердец крыс. Животных усыпляли, используя 20% раствор уретана (1,8 мг/кг массы животного). Затем быстро извлекали сердце и помещали в охлажденную (4С) среду выделения.
Cостав среды выделения: 300 мM сахарозы, 10 мM HEPES, 0,5 мM EDTA, рН 7.4.
Измельченную ткань переносили в гомогенизатор (стекло-тефлон), добавляли 2530 мл среды выделения в соотношении 1:8 и гомогенизировали 2-3 минут.
Осаждение митохондрий проводили центрифугированием в два этапа. Полученный осадок митохондрий суспендировали в среде выделения, содержащей БСА, и в течение эксперимента хранили во льду. Концентрация белка в суспензии митохондрий определялась методом Лоури и составляла 30-35 мг/мл.
Продукция супероксидного анион-радикала. Для генерации супероксида в ряде экспериментов использовали ферментативную систему ксантин ксантиноксидаза. В качестве источника супероксида также использовали митохондрии, в которых продукцию О2• индуцировали антимицином А.
Образование супероксида в этих экспериментальных моделях оценивали с помощью спиновой ловушки TIRON (4,5диоксибензол1,3дисульфат натрия). Кинетические параметры образования О2• определяли по восстановлению супероксидом цитохрома с или нитросинего тетразолия, а также по индуцированной этим свободным радикалом хемилюминесценции люцигенина.
Методы оценки свободнорадикального окисления. Окисление -каротина инициировали добавлением 20 мкг/мл миоглобина в инкубационную смесь, содержавшую 0,1 М К,Na-фосфатный буфер (рН 7,4), гидрозоль -каротина (7, мкМ), мицеллы 15-гидропероксида арахидоновой кислоты (25 мкМ). Скорость окислительной деструкции -каротина определяли при 25°C на спектрофотометре Hitachi-557 (Япония) по падению оптической плотности при 450 нм.
Перекисное окисление в гомогенате сердца крыс инициировали добавлением метмиоглобина и гидропероксида трет-бутила в концентрации 30 и 400 мкМ соответственно. В отобранных аликвотах гомогената (1мл) окисление останавливали добавлением бутилгидрокситолуола и ДТПА до конечной концентрации 10 мкМ и мкМ соответственно. К этим аликвотам добавляли 2 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл 0,67% раствора ТБК, после чего смесь помещали в водяную баню на минут. После этого образцы охлаждали и центрифугировали. Измерение вторичных продуктов ПОЛ (ТБК-реактивных продуктов) проводили в надосадочной жидкости по -1 - оптическому поглощению при 532 нм ( = 1,56 10 М см ), в качестве базовой линии использовали отрезок спектра между 515-550 нм. Содержание коэнзимов Q9 и Q10 в гомогенате миокарда крыс определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с электрохимическим детектированием на оборудовании фирмы «Environmental Sciences Associate, Inc.», (США).
Окислительный и нитрозативный стресс в культурах E.coli. В работе использовали клетки Escherichia coli штамма TB-1, модифицированного плазмидой pEMBL18+::SyLba со встроенным геном Lba сои, полученного сотрудниками Автономного университета штата Морелос (Мексика) и Университета штата Небраска (США). В качестве контроля использовали аналогичный штамм без плазмиды. Окислительный и нитрозативный стресс у бактерий инициировали добавлением в культуру E. coli гидропероксида трет-бутила, и донора оксида азота S-нитрозоглутатиона, соответственно. Эти соединения в различных концентрациях вносили в среду на ранней стадии логарифмической фазы роста, через 3 ч с момента засева (А600 = 0,120,15).
ЭПР спектроскопия. Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре E-109Е фирмы Varian (США) при комнатной температуре (~25°C). Условия регистрации спектров ЭПР: СВЧ мощность 5 мВт, СВ частота 9,15 ГГц, амплитуда высокочастотной модуляции 0,05 мТл для TIRON, СВЧ мощность 10 мВт, амплитуда ВЧ модуляции 0,1 мТл для аддуктов спиновой ловушки ДЕПМПО.
Спектры ЭПР различных типов ДНКЖ и свободнорадикальных интермедиатов реакции Майара записывали при СВЧ мощности 20 мВт и амплитуде ВЧ модуляции от 0,1 мТл до 0,4 мТл. Образцы помещали в стеклянные капилляры или газопроницаемые тефлоновые капилляры фирмы PTFE 22 (Zeus Industrial Products, Inc. США). В последнем случае запись спектров проводили при непрерывной продувке азотом или воздухом. В ряде экспериментов образцы замораживали, и спектры регистрировались при температуре жидкого азота (77 К).
Опыты на изолированных фрагментах аорты крыс. Эксперименты проводили в растворе Кребса при постоянной температуре 37С. Изометрическое напряжение кольцевых фрагментов аорты регистрировали преобразователем UC- после сокращения, вызванного стандартной концентрацией норадреналина (10-7 М).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Взаимодействие динитрозильных комплексов железа с активными формами кислорода и азота.
Одной из наиболее изученных реакций оксида азота является его реакция с супероксидным анион-радикалом (O2•). Взаимодействие оксида азота с супероксидом является важнейшим фактором, влияющим на уровень NO в организме и соответственно на сигнальную функцию этой молекулы. С использованием спиновой ловушки ДЕПМПО показано, что содержащие тиолы ДНКЖ (рис. 1 А) перехватывают O2• образующийся в ходе декомпозиции супероксида калия. В условиях ферментативной продукции O2• в системе содержащей ксантин и ксантиноксидазу наблюдалось снижение уровня детектируемых ЭПР динитрозильных комплексов железа (рис. 1 Б).
A Б NO+ RS + Концентрация ДНКЖ, мкМ Fe NO+ RS Fe2+ + NO + RS- + NO FeNO RS-NO 0 4 8 В рем я, м ин Рис. 1. А Структура тиолсодержащих ДНКЖ (равновесие между ДНКЖ, оксидом азота, S-нитрозотиолами и тиолами). Б Кинетика разрушения глутатионовых ДНКЖ в ходе ферментативной генерации O2•. Состав реакционной среды: (1) - 0, М K,Na-фосфатный буфер, (pH 7.4), 0,25 мМ глутатионовых ДНКЖ, ксантиноксидаза (0,2 ед./мл), 1 мМ ксантина;
(2) - то же, что (1) + каталаза ( ед./мл);
(3) – то же что (1) + каталаза (600 ед./мл) и супероксиддисмутаза (150 ед./мл).
Супероксиддисмутаза (СОД) и каталаза существенно снижали скорость деструкции глутатионовых ДНКЖ (рис. 1, кривые 2 и 3), что является доказательством участия в этом процессе O2• и пероксида водорода, возникающего при дисмутации этого радикала. При распаде ДНКЖ высвобождаются ионы железа, которые способны катализировать образование гидроксильного радикала в реакции Фентона:
• Fe 2+ + H2O2 Fe 3+ + OH + OH (1).
Действительно, в присутствии хелатора ионов двухвалентного железа (ДТПА) Н2О2 не вызывает существенной деструкции глутатионовых ДНКЖ, тогда как в отсутствие хелатора происходит распад динитрозильных комплексов (рис. 2.).
g=2, Б А 316 320 324 317 322 Магнитное поле, мТл Магнитное поле, мТл Рис. 2. Деструкция глутатионовых ДНКЖ под действием пероксида водорода.
А – (1) спектр ЭПР 0,2 мМ ДНКЖ в 0,2 М HEPES-буфере (рН 7,4), (2) то же через 8 мин и (3) через 16 мин после добавления 0,4 мМ Н2О2. Б – (1) спектр ЭПР ДНКЖ в реакционной среде, содержавшей 0,5 мМ ДТПА, (2) то же через 16 мин после добавления 0,4 мМ Н2О ДНКЖ, связанные с бычьим сывороточным альбумином (БСА-ДНКЖ) или метгемоглобином (Hb-ДНКЖ), также разрушались в ходе ферментативной генерации O2• (рис. 3 и 4). При заданной концентрации ксантиноксидазы скорость распада белковых ДНКЖ снижалась по мере увеличения концентрации вводимой в раствор СOД. Константа скорости реакции БСА-ДНКЖ (kДНКЖ) с супероксидом:
d[ДНКЖ]/dt = kДНКЖ[ДНКЖ][O2•-] (2), гемоглобиновые ДНКЖ, мкМ альбуминовые ДНКЖ, мкМ 100 0 2 4 6 8 10 12 0 4 8 12 Время, мин Время, мин Рис. 4. Кинетика разрушения Hb-ДНКЖ Рис. 3. Кинетика разрушения БСА-ДНКЖ в под действием O2•-. (1) К,Na-фосфатный • условиях ферментативной генерации O2.
буфер (0,15 М, рН 7,4), Hb-ДНКЖ ( (1) БСА-ДНКЖ (390 мкM), ДТПА (1,6 мМ), мкМ), ДТПA (1,6 мМ), ксантин (3,5 мМ), ксантиноксидаза (0,6 ед./мл), ксантин (3, ксантиноксидаза (0,6 ед./мл);
(2) то же, что мМ);
(2) то же, что и (1) + COД (25 ед./мл);
и (1) + СOД (100 ед./мл);
(3) то же, что и (1) (3) то же, что и (1) + COД (400 ед/мл);
(4) + СOД (400 ед./мл);
(4) то же, что и (2) + кинетика спонтанного распада БСАДНКЖ.
каталаза (600 ед./мл);
(5) кинетика спонтанного распада Hb-ДНКЖ.
была рассчитана с использованием известной константы скорости реакции дисмутации анионов супероксида, катализирумой СOД (kСОД = 2 109 М-1с-1):
d[O2-.]/dt= kСОД[СОД] [O2•-] (3), и следующей системы уравнений:
d[O2•-]/dt= P – kСОД[СОД] [O2•-] – kДНКЖ[DNIC][O2•-] (4), d[ДНКЖ]/dt = –kДНКЖ[ДНКЖ][O2•-] (5), d[СОД]/dt = 0 (6), где Р – скорость продукции O2• в системе ксантиноксидаза-ксантин.
С помощью метода, основанного -1, на восстановлении цитохрома с в -1, реакционной среде, содержавшей 3,5 мМ ксантина и 0,6 ед./мл ксантиноксидазы, +1) -2, была определена величина Р, равная ~4, ДНКЖ 10-7 M/с. В этой реакционной среде -(P/V -2, были установлены значения начальной -3, tg~220 скорости деструкции БСА-ДНКЖ (VДНКЖ = –[ДНКЖ]/dt) в присутствии различных -3, концентраций СОД. Построенная на -4, основании этих данных зависимость 0,000 0,005 0,010 0, [СОД]/[ДНКЖ ] [СОД]/[ДНКЖ] от –(P/VДНКЖ + 1) носила Рис. 5. Зависимость отношения линейный характер, причем тангенс угла скорости образования супероксида наклона этой прямой равен ~ 220 (рис. 5).
к скорости деструкции БСА ДНКЖ (–(P/VДНКЖ + 1)) от Система уравнений (4-6) решается при отношения концентраций СОД и квазистационарной концентрации O2•, БСА-ДНКЖ ([СOД]/[ДНКЖ]).
т.е. если уравнение (6) равно нулю. В этих условиях концентрация супероксида определяется выражением:
[O2•-](t) = Р/(kСОД[СОД] + kДНКЖ[ДНКЖ](t)) (7).
Подставляя это выражение в уравнение (5) находим, что P/(d[ДНКЖ]/dt) + 1 = –kСОД[СОД]/kДНКЖ[ДНКЖ]) (8).
В то же время из уравнения (8) получаем, что:
tg = –([СOД]/[ДНКЖ])/(P/VДНКЖ – 1) = –kСОД/kДНКЖ (9).
Исходя из величины kСOD можно расчитать константу реакции O2•- с БСА-ДНКЖ:
kДНКЖ = –kСОД/tg 107 M-1с-1 (10).
Определение константы скорости реакции Hb-ДНКЖ с супероксидом было затруднительно из-за достаточно сложного характера взаимодействия гемоглобина с продуктами этой реакции. Следует отметить, что каталаза усиливала защитное действие СOД на Нb-ДНКЖ в присутствии ДТПА, ингибирующего реакцию Фентона (рис. 4, кривые 2 и 4). Таким образом, распад этих комплексов в системе ксантиноксидазаксантин мог быть обусловлен воздействием на Нb-ДНКЖ как O2•, так и непосредственно пероксида водорода. На рисунке 6 приведены кинетические кривые (А) и концентрационные зависимости (Б) деструкции Hb-ДНКЖ под действием пероксида водорода и гидропероксида трет-бутила (t-BOOH). Последний оказывал более сильное действие, при этом кинетическая кривая была близка к экспоненциальной зависимости (рис. 6А, кривая 1). Для пероксида водорода эта зависимость имела более сложный характер: быстрый распад примерно половины Hb-ДНКЖ сменялся плато (рис. 6А, кривая 2). При эквимолярном соотношении обоих типов гидропероксидов и Hb-ДНКЖ концентрация последнего снижалась на 55 и 70 % в присутствие пероксида водорода и t-BOOH, соответственно (рис. 6Б).
гемоглобиновые ДНКЖ, мкМ гемоглобиновые ДНКЖ, мкМ А Б 200 100 0 0 2 4 6 8 10 12 0 1 2 Время, мин гидропероксиды, мМ Рис. 6. А кинетика деструкции гемоглобиновых ДНКЖ в присутствии 0,2 мМ tBOOH (1) или H2O2 (2). Спонтанный распад Hb-ДНКЖ (3).
Б деструкция Hb-ДНКЖ под действием различных концентраций t-BOOH (1) и H2O2 (2). Кроме того реакционная среда содержала К,Na-фосфатный буфер (0,15 М, рН 7,4) и ДТПА (1,6 мМ). Концентрация метгемоглобина составляла 17 мг/мл (300 мкМ).
В реакциях гемоглобина и метмиоглобина с органическими гидропероксидами образуется оксоферрильная форма гемовой группы (гемFe+4=O), катион-радикал порфиринового кольца, а также алкокси- (RO•) и алкилпероксильные (ROO•) радикалы:
гемFe+3 + ROOH гем-Fe+4=O + RO• + H+ (11), гемFe+3 + ROOH гем•+Fe+4=O + ROH (12), гем•+Fe+4=O + ROOH гемFe+4=O + ROO• + H+ (13), гемFe+4=O + ROOH гемFe+3OH + ROO• (14).
Известно, что NO взаимодействует с алкокси- и алкилпероксильными радикалами, причём константы скорости этих диффузионно-контролируемых реакций чрезвычайно высоки, достигая ~2 109 М-1с-1 [O’Donnell, Freeman, 2001;
Schafer et al., 2002], что в десятки раз больше аналогичной константы реакции оксида азота с оксоферрильной формой гемоглобина (2,4 107 М-1с-1) [Herold, Rehmann, 2003]. В связи с этим можно ожидать, что распад гемоглобиновых ДНКЖ под действием tBOOH определяется образующимися из него алкокси- и алкилпероксильными радикалами. Использование спиновой ловушки ДЕПМПО показало, что в ходе реакции метгемоглобина с tBOOH возникает тиильный радикал, по-видимому, в результате окисления остатка цистеина -93. Однако при взаимодействии гидропероксида трет-бутила и связанного с ДНКЖ метгемоглобина выход свободнорадикальных интермедиатов снижается. Этот факт свидетельствует о том, что Hb-ДНКЖ перехватывают свободные радикалы реагирующие с SH-группой цистеина -93.
При взаимодействии гемоглобина с H2O2 образуются оксоферрильная и перферрильная формы гема (гем•+Fe+4=O) окисляющие аминокислотные остатки белка. При этом образуются ассоциированные с белковой цепью свободные радикалы (рис. 7), которые могут быть причиной окислительной модификации гемоглобина и деструкции связанного с этим белком ДНКЖ.
Кинетика гибели Hb-ДНКЖ в присутствии пероксида водорода указывает на относительно короткое (не более 1-2 мин) время генерации этих радикальных интермедиатов (рис. 6). Сигнал ЭПР, возникающий при добавлении Н2О2 к гемоглобину (рис. 7, спектр 3), скорее Hb-ДНКЖ всего принадлежит свободному радикалу тирозинового или триптофанового остатков [Burkitt, 2002;
Svistunenko, 2005].
Известно, что в человеческом миоглобине Hb-ДНКЖ + 1 мM H 2O может происходить внутримолекулярное окисление остатка Cys феноксильным радикалом Tyr103 с Hb + 1 мM H 2O 3 образованием тиильного радикала [Witting, Mauk, 2001]. Исходя из этого, 310 320 330 340 мы полагаем, что ДНКЖ связанные с Магнитное поле, мТл цистеином -93, также окисляются Рис. 7. Спектры ЭПР ДНКЖ, связанных с метгемоглобином (1), свободным радикалом остатка тирозина.
смеси этих ДНКЖ с Н2О2 (2) или Вместе с тем, в разрушении Hb-ДНКЖ смеси метгемоглобина с Н2О2 (3).
может участвовать O2•-, образующийся в Концентрации метгемоглобина и Н2О в реакционной смеси составляли гемовом кармане при взаимодействии соответственно 0,3 мМ и 1 мМ.
пероксида водорода c феррил Регистрацию проводили при 77 К.
гемоглобином [Nagababu, Rifkind, 2000].
Окислительная модификация гемоглобина приводит к возникновению перекрестных сшивок между его субъединицами [Romero, 2003].
Действительно, с использованием SDS-электрофореза было обнаружено образование димерных цепей метгемоглобина после его обработки различными концентрациями Н2О2 (рис. 8А, электрофореграммы 2 и 3). Формирование таких димеров является следствием образования дисульфидной связи между остатками цистеинов и димеризации свободных радикалов тирозина. Под действием высокой концентрации пероксида водорода (1600 мкM) уменьшается интенсивность полос субъединиц гемоглобина и их димеров, что может быть следствием фрагментации белковой цепи (рис. 8А, электрофореграмма 4).
32 кДа 16 кДа А Б В Рис. 8. Образование димеров субъединиц метгемоглобина при его окислительной модификации пероксидом водорода и влияние Hb-ДНКЖ на этот процесс. Образцы для электрофореза содержали: А - метгемоглобин (280 мкM) после добавления мкМ(2), 800 мкM (3) или 1600 мкМ (4) пероксида водорода;
Б - то же, что и А, но с метгемоглобином связаны ДНКЖ (380 мкМ);
В - то же что и А, но к метгемоглобину вначале добавлены разрушенные ДНКЖ, а затем Н2О2.
ДНКЖ предотвращают окислительную модификацию связанного с ними гемоглобина (рис. 8Б, электрофореграммы 2 и 3). При концентрации пероксида водорода, эквимолярной или более низкой (400 и 800 мкM), чем концентрация Hb-ДНКЖ (780 мкM), почти полностью ингибируется образование димеров субъединиц гемоглобина. В случае высокой концентрации Н2О2 (1600 мкM) наблюдалось образование димеров белковых цепей, но ДНКЖ уменьшали фрагментацию гемоглобина (рис. 8Б, электрофореграмма 4). Таким образом, Hb-ДНКЖ могут действовать как сайт-специфические протекторы, защищающие белок, с которым они связаны, от окислительной модификации.
В отличие от Hb-ДНКЖ, Н2О2 и гидропероксид трет-бутила в среде с ДТПА не вызывают заметного разрушения БСА-ДНКЖ-1 вплоть до концентрации обоих гидропероксидов на порядок превышающей содержание белковых ДНКЖ.
В то же время альбуминовые ДНКЖ оказались более чувствительными к действию пероксинитрита (ONOO), чем Hb-ДНКЖ. Для разрушения последних были необходимы концентрации ONOO почти на порядок большие, чем в случае БСА-ДНКЖ (рис. 10А,Б). Это различие, по-видимому, обусловлено защитным действием гемовых групп гемоглобина. Согласно [Romero et al., 2003] ONOO, связываясь с гемом, окисляет его с образованием оксоферрильной формы гемоглобина или изомеризуется в нитрат.
альбуминовые ДНКЖ (БСА-ДНКЖ), мкМ А Б гемоглобиновые ДНКЖ, мкМ 0,0 0,2 0,4 0,6 0, 0 1 2 3 4 5 пероксинитрит, мМ пероксинитрит, мМ Рис. 10. Деструкция Hb-ДНКЖ (A), БСА-ДНКЖ (Б) под действием различных концентраций пероксинитрита в К,Na-фосфатном буфере (0,2 М, рН 7,4), содержавшем ДТПА (1,6 мМ). Концентрации Hb-ДНКЖ и БСА-ДНКЖ равны 380 и 390 мкМ соответственно.
Около 70% БСА-ДНКЖ распадается при эквимолярных концентрациях динитрозильных комплексов и пероксинитрита. Этот результат согласуется с данными исследования [Jourd’heuil et al., 2001] в котором показано, что примерно 35% протонированного пероксинитрита (ONOOН) распадается с образованием таких активных окислителей, как OH• и диоксид азота (NO2•).
2. Антиоксидантные и прооксидантные свойства оксида азота и его метаболитов в различных модельных системах.
-каротина Окисление эмульсии инициировали добавлением метмиоглобина в инкубационную смесь, содержавшую мицеллы гидропероксида арахидоновой кислоты. Эта экспериментальная система позволяет исследовать взаимодействие глутатионовых ДНКЖ и GS-NO непосредственно со свободнорадикальными интермедиатами реакций 1114.
Из результатов, представленных на рис. 11, видно, что и глутатионовые ДНКЖ и S-нитрозоглутатион существенно подавляют окисление -каротина, однако ДНКЖ были почти на порядок эффективнее, чем GS-NO.
Уровень окисления -каротина, % 100 Б А 60 40 20 0 0 200 400 600 800 0 20 40 60 [GS-NO], мкM [ДНКЖ], мкM Рис. 11. Ингибирование окисления -каротина в зависимости от концентрации GSNO (A) и глутатионовых ДНКЖ (Б). Инкубационная среда содержала 7, мкМ -каротина, 5 мкМ 15-гидропероксида арахидоната и, после инициации окисления, 20 мкг/мл метмиоглобина. Снижение концентрации -каротина через 20 мин после инициации окисления в отсутствие метаболитов NO принято за 100 %.
Причём, в отличие от GS-NO, предварительная инкубация мицелл гидропероксида арахидоновой кислоты с ДНКЖ усиливает антиоксидантное действие последних. Поскольку динитрозильные комплексы железа и S-нитрозоглутатион являются донорами оксида азота, можно предположить, что NO действует в исследуемой системе как антиоксидант. Известно, что NO проявляет свойства классического антиоксиданта, перехватывая алкоксильные и пероксильные радикалы, в результате чего обрываются цепные реакции перекисного окисления. При этом образуется аддукт (алкилпероксинитрит), близкий по структуре к пероксинитриту, и нитропроизводные липидов [Padmaja, Huie, 1993;
Rubbo et al., 1994;
O’Donnell, Freeman, 2001]:
ROО• + NO• ROONO [RО• + NO2•] RONO2 (15), RO• + NO• RONO (16).
Нельзя исключить, что ДНКЖ могут непосредственно реагировать с радикалами липидов с образованием продуктов, которые не вызывают окисления -каротина. В этом случае в ингибировании процессов свободнорадикального окисления могут участвовать и тиольные лиганды ДНКЖ. Предложенный механизм позволяет объяснить большую по сравнению с GS-NO эффективность антиоксидантного действия гутатионовых ДНКЖ. В то же время метаболиты NO могут ингибировать -каротина, окислительную деструкцию благодаря восстановлению оксоферрильной формы миоглобина (Mb-Fe+4=O), которая возникает в реакции (11) аналогично оксоферрильной форме гемоглобина. Известно, что оксоферрильные формы гемопротеидов способны окислять -каротин [Giulivi, Cadenas, 1994]. Было показано, что оксид азота восстанавливает феррилгемоглобин и феррилмиоглобин [Gorbunov et al., 1995].
В наших экспериментах образование оксоферрилмиоглобина наблюдалось в системе, содержащей гидропероксид трет-бутила и метмиоглобин, что следует из характерных изменений в спектрах оптического поглощения (увеличение поглощения при 548 и 582 нм).
Кинетика процесса приведена на рис. 12A. Добавление глутатионовых динитрозильных комплексов железа инициировало обратную реакцию – восстановление оксоферрильной формы миоглобина до метмиоглобина в соответствии с кинетикой, приведенной на рис. 12Б.
А 1,0 1, Б A 0,8 0, 0,6 0, 2- 0,4 0, 3- 0,2 0, 0,0 0, 450 500 550 600 650 450 500 550 600 650 Длина волны, нм Длина волны, нм Рис. 12. A Образование оксоферрилмиоглобина (MbFe+4=O) при инкубации tBOOH с метмиоглобином (метMb): (1) - спектр 0,1 мМ метMb в 0,1 М Na,Kфосфатном буфере рН 7,4;
(2, 3, 4, 5) – то же, что и (1), через 1, 2, 4 и 6 мин, соответственно, после добавления 0,4 мМ tBOOH (здесь и на панели Б стрелками отмечено увеличение и уменьшение характерных максимумов метMb и MbFe+4=O). Б – Восстановление MbFe+4=O под действием глутатионовых ДНКЖ;
(1) – спектр MbFe+4=O, образующегося после 6 мин инкубации метMb с tBOOH (то же, что спектр 5 на панели А);
(2, 3, 4) - то же, что и (1), через 1, 3, 5 мин, соответственно, после добавления 0,1 мМ ДНКЖ.
Восстановление оксоферрильной формы миоглобина сопровождалось быстрым снижением концентрации глутатионовых ДНКЖ, которую контролировали по характерному для мономерной формы этих комплексов сигналу ЭПР (рис. 13). В модельной системе, содержащей tBOOH и метмиоглобин, сложно установить вклад в деструкцию глутатионовых ДНКЖ свободных радикалов с одной стороны и оксоферрильной формы миоглобина с другой. Для определения этого вклада мы исследовали влияние на ДНКЖ только оксоферрилмиоглобина.
Рис. 13. Кинетика деструкции 0, g = 2, сигнал ЭПР ДНКЖ, отн. ед.
мМ ДНКЖ (по изменению сигнала ЭПР) в процессе инкубации с 0, мМ метMb в присутствии 0,4 мМ 600 t-BOOH. Перед регистрацией спектров ЭПР к образцам 324 326 добавляли 4 мМ цистеин. На Магнитное поле, мТл вставке представлен спектр 0, мМ динитрозильных комплексов железа в присутствии 0,1 мМ метMb.
0 5 10 15 Время, мин Последний получали в реакции метмиоглобина с пероксидом водорода, избыток которого удаляли каталазой. В ходе восстановления оксоферрильной формы миоглобина не происходило существенного снижения концентрации ДНКЖ, сопоставимого со снижением в системе, содержащей дополнительно t BOOH, т.е. в условиях генерирования алкоксильных и алкилпероксильных радикалов. Так, 50%-ное снижение концентрации динитрозильных комплексов железа имело место при молярном соотношении [MbFe+4=O]/[ДНКЖ] =8. В то же время, практически полное восстановление оксоферрилмиоглобина в этих экспериментах происходило при [MbFe+4=O]/[ДНКЖ] = 3 и ниже. Этот факт согласуется с выдвинутым нами предположением о способности глутатионовых ДНКЖ взаимодействовать с органическими свободными радикалами. В восстановлении оксоферрильной формы миоглобина и перехвате органических свободных радикалов могут участвовать все составляющие ДНКЖ компоненты, находящиеся в состоянии химического равновесия с этими комплексами [Ванин, 1998] (рис 1 А). Особую роль в этом процессе могут играть молекулы NO и тиолов. По имеющимся в литературе данным, восстановление оксоферрилформы миоглобина различными тиолами сопровождается образованием тиильных радикалов [Romero et al., 1992]. Действительно, в реакционной среде, содержащей метмиоглобин, t-BOOH и восстановленный глутатион (GSH), мы наблюдали образование характерного аддукта тиильного радикала (RS•) со спиновой ловушкой ДЕПМПО (рис. 14, спектр 1). Тем не менее, тиильные радикалы не возникали при добавлении в реакционную среду глутатионовых ДНКЖ вместо GSH (рис. 14, спектр 2). Более того, глутатионовые ДНКЖ в этих условиях действовали как типичные антиоксиданты, значительно снижая уровень тиильного радикала свободного глутатиона (рис. 14, спектр 3) и свободных радикалов производных t-BOOH (рис. 14, спектры 2 и 4).
Рис. 14. Спектры ЭПР спин аддуктов тиильного радикала с ДЕПМПО. Среда содержала 0, М Na,K-фосфатный буфер рН 7,4, 20 мМ ДЕПМПО, 0,1 мМ метMb, 1,6 мМ t-BOOH и 1 мМ ДТПА: (1) – после добавления 1,6 мМ GSH;
(2) - после добавления 0,8 мМ ДНКЖ;
(3) – после добавления 0,8 мМ ДНКЖ 3 и 1,6 мМ GSH;
(4) – без добавок (суперпозиция спектров спин 4 аддуктов ДЕПМПО и свободно радикальных производных трет 315 320 325 330 335 бутила).
Магнитное поле, мТл Согласно имеющимся в литературе данным, в ходе реакции NO с оксоферрильными формами гемоглобина и миоглобина образуется комплекс гемFe+3ONO, который далее распадается до нитрита и ферриформ гемопротеидов [Herold, Rehmann, 2001;
Herold, Rehmann, 2002]. Можно предположить, что анион глутатиона, образующийся при диссоциации глутатионовых ДНКЖ, взаимодействует с комплексом Mb-Fe3+-ONO:
Mb-Fe+3-ONO + GS Mb-Fe+3 + GS-NO (17).
С другой стороны, при восстановлении оксоферрильной формы миоглобина GSH должен возникать тиильный радикал, в реакции которого с оксидом азота также образуется S-нитрозоглутатион:
GS• + NO• GS-NO (18).
Известно, что S-нитрозотиолы при взаимодействии с ионами железа превращаются в динитрозильные комплексы железа [Ванин, 2004].
Возможно, что сами динитрозильные комплексы железа восстанавливают оксоферильную форму гема, причем образующиеся интермедиаты в присутствии тиолов могут вновь превращаться в ДНКЖ:
Mb-Fe+4=O + (RS-)2-Fe-(NO+)2 Mb-Fe+3 + (RS-)2-Fe+2-(NO+)ONO (19), (RS-)2-Fe+2-(NO+)ONO + RSH RSOH + (RS-)2-Fe+-(NO+)2 (20).
Аналогом реакций (19) и (20) можно считать окисление молекулярным кислородом оксида азота, входящего в состав нитрозильных комплексов железа с органическими лигандами на основе ферроцена [Munyejabo et al., 1995]. В этих условиях нитрозильный лиганд окисляется до нитрата и нитрита, причём образование Fe-NO2 группы предполагает перенос атома кислорода от Fe-NO3 на органический лиганд комплекса. Регенерация ДНКЖ в реакциях (1720) может объяснить низкий уровень разрушения этих комплексов под действием оксоферрильной формы миоглобина, а также отсутствие тиильных радикалов в реакционной системе, содержавшей метмиоглобин и t-BOOH (рис. 14). В этой системе глутатионовые ДНКЖ ингибируют накопление оксоферрильной формы миоглобина намного более эффективно, чем GSH и S-нитрозоглутатион, что согласуется с возможностью прямого взаимодействия динитрозильных комплексов железа с Mb-Fe+4=O.
Описанные выше процессы могут играть важную роль при поражении ткани в условиях ишемии и последующей реперфузии. Действительно, высокоокисленные состояния миоглобина обнаружены в ишемизированной сердечной мышце крыс [Arduini et al., 1990]. В связи с этим для изучения влияния оксида азота и его метаболитов на свободнорадикальное повреждение ткани сердечной мышцы была разработана экспериментальная система, в которой перекисное окисление липидов в гомогенате миокарда инициировалось сочетанием t-BOOH и метмиоглобина (см. «Матералы и методы»). Уровень свободнорадикального окисления биологических мембран в гомогенате оценивался по накоплению вторичных (ТБК-реактивных) продуктов ПОЛ. В этой системе мы исследовали влияние на перекисное окисление липидов гомогената миокарда как самого NO, так и нитроксильного аниона, нитрита, цистеиновых ДНКЖ, GS-NO и S-нитрозоцистеина. В качестве источников NO (NO) и нитроксильного аниона использовали синтетические доноры PAPA/NONO и соль Ангели (Na2N2O3) соответственно. ДНКЖ с цистеиновыми лигандами использовали в двух формах – в виде свободного комплекса или препарата, связанного с декстраном. Все использованные доноры и физиологические производные NO проявили способность ингибировать индуцированное t-BOOH и метмиоглобином перекисное окисление гомогената миокарда крыс. Наиболее эффективными антиоксидантами были синтетический донор оксида азота PAPA/NONO и связанные с декстраном цистеиновые ДНКЖ, которые в концентрации 100- мкМ существенно снижали образование ТБК-реактивных продуктов (рис. 15).
2,0 Рис. 15. Кинетические кривые ТБК-реактивные продукты, мкМ 2 образования ТБК-реактивных продуктов при перекисном 1,5 окислении липидов гомогената миокарда крысы индуцированном метмиоглобином и t-BOOH без добавок (1) или в присутствии 1, мкМ PAPA/NONO (2);
100 или мкМ цистеиновых ДНКЖ, связанных с декстраном (3 и 4, 0, соответственно).
0 20 40 60 80 100 Время инкубации, мин В тоже время свободные цистеиновые ДНКЖ вызывают усиление ПОЛ в гомогенате миокарда (рис. 16, кривая 2). Обнаруженное противоречие в действии разных вариантов цистеиновых ДНКЖ, по-видимому, обусловлено высвобождением в ходе их деструкции ионов железа и цистеина, катализирующих перекисное окисление и реакциях типа Фентона (реакция 1) и Хабера-Вайса:
Fe2+ + O2 Fe3+ + O2•– (21), 2RSH + 2Fe3+ 2Fe2+ + RSSR + H+ (22).
Действительно, свободный цистеин стимулировал инициированное метмиоглобином и t-BOOH свободнорадикальное окисление гомогената миокарда (рис. 16, кривая 3), причем добавление избытка цистеина вместе с ДНКЖ усиливало их прооксидантное действие (рис. 16, кривая 4).
2 Рис. 16. Усиление образования ТБК-реактивные продукты, мкМ ТБК-реактивных продуктов в ходе ПОЛ в гомогенате миокарда под действием 250 мкМ цистеиновых ДНКЖ (2), 2,5 мМ свободного цистеина (3) или сочетания мкМ цистеиновых ДНКЖ и 2,5 мМ цистеина (4). Кинетика накопления ТБК-реактивных продуктов ПОЛ в отсутствии добавок (1).
0 20 40 60 80 Время инкубации, мин Установлено, что в гомогенате миокарда цистеиновые лиганды ДНКЖ, ассоциированных с декстраном, замещаются на белковые. Можно предположить, что более медленная деструкция белковых ДНКЖ и постепенное поступление из них NO обеспечивает постоянную концентрацию оксида азота в ходе перекисного окисления и, тем самым, преобладание антиоксидантного действия динитрозильных комплексов над прооксидантным.
Нитрит и GS-NO в диапазоне концентраций от 200 до 800 мкМ демонстрировали близкую эффективность антиоксидантного действия. После 90 мин инкубации гомогената эти соединения в концентрации, равной 800 мкМ, снижали уровень ТБК-реактивных продуктов на 45-50%, тогда как соль Ангели в этой концентрации ингибировала ПОЛ на 80%. Таким образом, соль Ангели (донор NO) в используемой модельной системе являлась более эффективным антиоксидантом, чем нитрит и GS-NO. При инициации перекисного окисления в гомогенате сердца крыс только гидропероксидом трет-бутила такие метаболиты NO как, нитроксильный анион, нитрит, GS-NO и БСАДНКЖ ингибировали окислительную деструкцию коэнзимов Q9 и Q10 (рис. 17).
исходный гомогенат окисленный гомогенат Рис. 17. Изменение уровня без добавок коэнзимов Q9 (А) и Q10 (Б) в + NaNO А гомогенате миокарда крысы + соль Ангели после добавления 1 мМ t-BOOH.
+ БСА-ДНКЖ Инкубация проводилась в + GS-NO течение 90 мин при комнатной 0 20 40 60 80 температуре без добавок (2) или в Концентрация Q 9, нг/г ткани миокарда присутствии 600 мкМ нитрита исходный 1 гомогенат натрия (3), 600 мкМ донора окисленный гомогенат нитроксильного аниона - соли без добавок Ангели (4), 140 мкм БСА-ДНКЖ 3 + NaNO Б (5), 600 мкМ GS-NO (6).
4 + соль Ангели 5 + БСА-ДНКЖ- + БСА-ДНКЖ 6 + GS-NO 0 1 2 3 4 5 6 7 Концентрация Q10, нг/г ткани миокарда Примечательно, что в наших экспериментах антиоксидантными свойствами обладали нитроксильный анион и нитрит, т. е. продукты восстановления и окисления NO, соответственно. Этот факт указывает на существование в клетке редокс-системы, поддерживающей равновесие между различными формами NO. Существование такой системы объясняет неоднозначное действие метаболитов NO на патологические процессы, возникающие при окислительном стрессе.
3. Взаимное влияние S-нитрозотиолов, динитрозильных комплексов железа и активных форм кислорода в биологических объектах.
В настоящее время известно, что в митохондриях происходит генерация как активных форм кислорода, так и NO. Образование широкого спектра активных метаболитов в одном компартменте клетки вряд ли может быть случайным. Действительно, оксид азота, пероксинитрит и свободные радикалы кислорода влияют на функционирование дыхательной цепи митохондрий и других ферментов этих органелл. В физиологических условиях ДНКЖ являются донорами NO и ионов нитрозония (NO+), однако взаимодействие этих комплексов с митохондриями практически не изучено. В наших экспериментах для создания условий интенсивной генерации О2• митохондрии из сердечной мышцы крыс инкубировали в присутствии антимицина А и субстрата дыхательной цепи – сукцината. Образование супероксида зафиксировано методом ЭПР с помощью спиновой ловушки TIRON. В этих же условиях наблюдалась деструкция ДНКЖ, содержащих низкомолекулярные тиолы.
Важная роль О2• в разрушении исследуемых ДНКЖ подтверждается ингибированием этого процесса СОД. Эти данные согласуются с результатами, полученными при деструкции динитрозильных комплексов железа под действием О2• продуцируемого в системе ксантин ксантиноксидаза.
Ферритин, в частности его митохондриальная форма, является источником для многочисленных железосодержащих белков этих органелл [Arosio, Levi, 2002;
Campanella et al., 2009]. В наших экспериментах показано, что в присутствии GS-NO и глутатиона ферритин может быть источником ионов железа для образования ДНКЖ, причём этот процесс стимулируется супероксидом, генерируемым митохондриями (рис. 18).
- - Рис. 18. Кинетика образования - тиольных ДНКЖ в реакционной Сигнал ЭПР, отн.ед.
среде содержавшей: (1) – 100 мМ K,Na-фосфатный буфер (рН 7,4), 0,2 мМ GSH, 3 мМ GS-NO и ферритин (0,2 мкг/мл);
(2) – то же, что и (1) + митохондрии ( мг белка/мл) + 2 мМ сукцината;
(3) – то же, что и (2) + 4 мкМ антимицина А.
0 2 4 6 8 Время, мин Известно, что О2• стимулирует высвобождение ионов двухвалентного железа из ферритина. Однако в этих условиях накопление тиол-содержащих ДНКЖ должно уменьшаться в результате их взаимодействия с супероксидом. С другой стороны, при высокой концентрации GS-NO (3 мМ) последний должен перехватывать супероксид. Продуктами этого взаимодействия может быть оксид азота и пероксинитрит [Trujillo еt al., 1998]:
GS-NO + O2• GSH + NO + O2 (23), GS-NO + O2• GS• + ONOO (24).
Нельзя исключить, что в реакции GS-NO с супероксидом, а также при одноэлектронном восстановлении NO компонентами дыхательной цепи может продуцироваться нитроксильный анион. Возможно, что NO, как и супероксид, вызывает мобилизацию железа из ферритина, при этом нитроксильный анион, вероятно, окисляется до оксида азота. В то же время ONOO, образующийся в реакции 25, по-видимому, нейтрализуется с участием митохондриальных ферментативных систем.
Важным фактом является то, что сами митохондрии могут быть источником железа для формирования ДНКЖ. Из спектров ЭПР, приведенных на рисунке 19, видно, что при смешивании S-нитрозоцистеина и цистеина с митохондриями из сердца крысы образуются динитрозильные комплексы железа (рис. 19 А и Б, спектры а, вг). Спектры ЭПР этих комплексов по своим параметрам аналогичны спектрам низкомолекулярных ДНКЖ, возникающих в модельной системе, содержащей S-нитрозотиол, цистеин и ионы железа (рис.
19 А, спектр б). Митохондрии находились в газопроницаемом капилляре при 25°C и парциальное давление кислорода в среде инкубации оставалось во время записи спектров практически постоянным.
А Б g=2, 2,03 2, g=2, в Сигнал ЭПР, отн.ед.
а г g=2, б д 312 316 320 324 312 316 320 324 Магнитное поле, мТл Магнитное поле, мТл Рис. 19. Спектры ЭПР динитрозильных комплексов железа. Во всех экспериментах инкубационная среда содержала: 7,2 мМ сукцината, 120 мкМ АДФ, 20 мМ цистеина и 12 мМ S-нитрозоцистеина. Панель А: (а) – вместе с цистеином и S-нитрозоцистеином в среду добавлены митохондрии (22 мг/мл белка), спектр зарегистрирован после 8 мин инкубации в условиях гипоксии;
(б) – то же что и (а), но вместо митохондрий добавлен FeSO4 (4 мкМ). Панель Б: (в) – разностный спектр (а – б) 2;
(г) – то же, что и (а), но после 8 мин гипоксии, препарат инкубировался 4 мин при аэрации;
(д) – то же, что и (а), но в среду добавлен батофенантролин (1,5 мМ).
Кроме сигналов низкомолекулярных ДНКЖ в инкубационной среде, содержавшей митохондрии, цистеин и S-нитрозоцистеин, нами зарегистрирован более широкий ассиметричный сигнал ЭПР (рис. 19 Б, спектр в), характерный для динитрозильных комплексов железа, связанных с белками.
Сигнал ЭПР белковых ДНКЖ регистрировали как при продувке азотом, так и в условиях аэрации (рис. 19 А, Б). В то же время при смене гипоксии в на аэрацию сигнал низкомолекулярных ДНКЖ снижался (рис. 19 Б, спектр г).
Следует отметить, что добавление в исследуемую модельную систему батофенантролина (хелатора железа, разрушающего ДНКЖ) в меньшей степени влияет на интенсивность сигнала ЭПР белковых ДНКЖ, чем на сигнал низкомолекулярных динитрозильных комплексов (рис. 19 Б, спектр д). Следует отметить, что ДНКЖ образуются также в результате действия на митохондрии сочетания цистеина с S-нитрозоглутатионом или DETA/NO (донор NO).
Таким образом, в наших экспериментах источником оксида азота для формирования ДНКЖ могут быть S-нитрозотиолы и синтетические доноры NO, тогда как ионы железа поступают из митохондрий. В состав ДНКЖ могут включаться ионы железа, высвобождающиеся из митохондриальных железосерных белков и ферритина, а также ионы железа, связанные с низкомолекулярными лигандами. Действительно, в работе [Tangeras et al., 1980] показано, что до 70% негемового железа в митохондриях находится в форме низкомолекулярных комплексов. Известно также, что оксид азота вызывает деградацию железосерного кластера митохондриальной и цитозольной аконитазы [Kennedy et al., 1997].
Образование ДНКЖ было также зафиксировано в клетках Escherichia coli при инкубации бактерий в среде, содержащей GS-NO (рис. 20). Спектры ЭПР динитрозильных комплексов железа регистрировались в суспензии бактерий замороженных при температуре жидкого азота. Для изучения роли гемопротеидов при окислительном и нитрозативном стрессе использовались клетки E. coli, экспрессирующие легоглобин (Lb).
Б A g=2, g=2, 3000 3000 g=2, g=1, сигнал ЭПР, отн. ед. 2000 3 g=2, 1000 0 280 300 320 340 360 280 300 320 340 360 Магнитное поле, мТл Магнитное поле, мТл Рис. 20., Спектры ЭПР клеток E. coli не синтезирующих (А) и синтезирующих легоглобин (Б). 1 необработанные бактерии;
2 бактерии после инкубации с t-BOOH;
3 после инкубации с GS-NO;
4 после инкубации с GS-NO и t-BOOH. Инкубация суспензии бактерий проводилась в течение 20 мин. Спектры регистрировались при 77 K.
В наших исследованиях окислительный и нитрозативный стресс инициировали, воздействуя на клетки E. coli гидроперексидом трет-бутила и GS-NO, соответственно. Сигнал ЭПР ДНКЖ наблюдался в клетках бактерий, как синтезирующих, так и не синтезирующих легоглобин, а также при добавлении в среду инкубации вместе с GS-NO гидропероксида трет-бутила.
Как видно из рис. 20, в присутствии tBOOH уровень образующихся клетках E.
coli динитрозильных комплексов железа снижается. Интенсивность сигнала ДНКЖ при инкубации бактерий с tBOOH уменьшалась на 35-45%. В аналогичных условиях в культуре, синтезирующей легоглобин, сигнал ЭПР динитрозильных комплексов снижался лишь на 8-12% (рис. 20). К середине логарифмической фазы (9 ч роста) t-BOOH в концентрации 40 мкМ подавлял рост культур E. coli на 4446%, приблизительно в равной степени (рис. 21). S нитрозоглутатион в концентрациях до 200 мкМ существенно не ингибировал рост исследуемых бактериальных культур. Более того, рост всех типов клеток E. coli в условиях вызванного t-BOOH окислительного стресса стимулировался GS-NO (рис. 21). Защитный эффект GS-NO являлся дозозависимым. Важно, что восстановление роста культур E. coli наблюдалось даже при добавлении GS-NO вместе с t-BOOH, при концентрациях последнего, вызывающих практически полное подавление роста исследуемых штаммов.
А660 А Б А 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, клетки синтезирующие Lb контроль + t-BOOH + t-BOOH + GS-NO + t-BOOH + GS-NO + t-BOOH 0, 0, 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 Время, ч Время, ч Рис. 21. Влияние гидропероксида трет-бутила (40 мкМ) или его сочетания c S-нитрозоглутатионом (200 мкМ) на рост клеток E. coli с высоким уровнем экспрессии легоглобина (А), а также на рост бактерий, не содержащих ген легоглобина (Б). Стрелками отмечено время введения в бактериальную культуру t-BOOH и GS-NO.
Нельзя исключить, что при окислительном стрессе в клетках E. coli, экспрессирующих легоглобин, происходит взаимодействие Lb с метаболитами NO [Космачевская, Топунов, 2009]. Так, образующаяся при взаимодействии легоглобина с tBOOH оксоферрильная форма Lb может восстанавливаться тиольными ДНКЖ, которые, в свою очередь, регенерируются с участием S-нитрозотилов и эндогенных SHсодержащих молекул. На спектре ЭПР, зарегистрированном после инкубации содержащих Lb бактерий с GS-NO и tBOOH, кроме сигнала ДНКЖ присутствует широкий сигнал ЭПР, характерный для нитрозилированого гема (рис. 21Б, спектр 4).
Поскольку этот сигнал не регистрировался в клетках контрольного штамма (рис.
21А, спектр 4), нитрозилированным гемопротеидом являлся легоглобин.
Весьма вероятно, что легоглобин нитрозилируется оксидом азота, образующимся при разрушении ДНКЖ интермедиатами окислительного стресса. Действительно, нитрозилированный Lb возникает только в клетках, инкубированных в среде с tBOOH и GS-NO. В ответе бактериальной клетки на окислительный и нитрозативный стресс участвуют транскрипционные факторы SoxR, FNR и Fur, активность которых регулируется NO через образование связанных с ними нитрозильных комплексов железа [Cruz-Ramos et al., 2002;
Ding, Demple, 2000;
Lewis et al., 2008]. Из этого следует, что обнаруженные нами в клетках E. coli динитрозильные комплексы железа могут быть связаны с белковыми факторами транскрипции. Таким образом, разные формы ДНКЖ могут регулировать ответ бактерий на окислительной стресс на двух уровнях, непосредственно перехватывая свободные радикалы и другие токсические формы кислорода, а также выполняя функцию триггеров, активирующих синтез антиоксидантных ферментов.
Известно, что в организме млекопитающих ДНКЖ проявляют свойства эндотeлий-релаксирующего фактора [Vanin, Manukhina, 2007]. Поскольку супероксид и другие АФК, разрушая ДНКЖ, могут влиять на физиологические функции этих комплексов NO, мы исследовали сосудорасширяющее действие цистеиновых ДНКЖ в присутствии антиоксидантных ферментов. В экспериментах на кольцевых фрагментах аорты крыс после их сокращения под действием норадреналина цистеиновые ДНКЖ вызывали дозозависимое расслабление, имевшее двухфазный характер. СОД существенно (в 2,5 раза) снижала скорость восстановления тонуса сосуда, что приводило к увеличению продолжительность его релаксации (рис. 22А). При этом практически исчезают различия между быстрой и последующей медленной фазами релаксации изолированного сосуда. Интересно, что максимальный уровень релаксации уменьшается в присутствии СОД. Вероятно, супероксиддисмутаза предотвращает снижение уровня эндогенного пула депонированных форм оксида азота. Свой вклад в наблюдаемые эффекты может вносить пероксид водорода, образующийся в реакции дисмутации О2•.
600 цистеиновые ДНКЖ, М контроль 550 10-7 10- A Рис. 22. Влияние СОД и пероксида водорода на 400 350 расслабление сосудов под действием цистеиновых 10 1 ДНКЖ.
200 СOД мН 150 А расслабление фрагмента сосуда после добавления 50 5 мин 0 ДНКЖ в присутствии (1) и в 0 норадреналин -50 1000 2000 3000 отсутствие (2) СОД (25 ед/мл).
Б расслабление фрагмента цистеиновые ДНКЖ, М - контроль Б сосуда после добавления -6 -5 - ДНК-Цис1: Д Ж-Ц т НКЖ ист :2 -6 - К нт л о ро ь К нт л о ро ь 100% 0% ДНКЖ в присутствии 0.. мкМ Н2О2 (1);
без Н2О2 (2).
H2O - H 2 - 2O2 Предварительное сокращение 0.. изолированного кольцевого Н2О фрагмента крысиной аорты 0.. 0 достигалось добавлением норадреналина (10-7 М).
0.. NA A N норадреналин 0 5 10 5 0 5 10 1 mnn ii m Действительно, сочетание СОД и каталазы ещё более удлиняло время расслабления сосуда под действием ДНКЖ. Добавление 100 мкМ Н2О повышало исходный тонус сосуда, причём эффект ДНКЖ на этом фоне был ослаблен и значительно укорочен (рис. 22Б). Полученые нами результаты хорошо согласуются с изложенными ранее данными о защите содержащих тиолы ДНКЖ супероксиддисмутазой и каталазой. Предотвращая деградацию ДНКЖ, эти ферменты пролонгируют их релаксирующее (вазодилятаторное) действие на гладкие мышцы сосудов. Можно также предположить, что первая быстрая фаза релаксации вызванной цистеиновыми ДНКЖ зависит от АФК и определяется NO, высвобождающимся при распаде этих комплексов.
4. Взаимодействие активных форм кислорода, метаболитов оксида азота и активных карбонильных соединений в условиях, моделирующих карбонильный стресс.
Как и активные формы кислорода, карбонильные соединения способны вызывать модификацию биологических макромолекул [Kamiya, Kamiya, 2001;
Bourajjaj et al., 2003;
Stadtman & Levine, 2003;
Thorpe S.R., Baynes, 2003;
Schalkwijk, 2007]. При диабетической гипергликемии возможно развитие так называемого «карбонильного стресса», возникающего вследствие накопления активных карбонильных соединений, являющихся продуктами автоокисления глюкозы и метаболизма триозофосфатов, в том числе глиоксаля, метилглиоксаля и 3-дезоксиглюкозона [Lee et al., 1998;
Thorpe S.R., Baynes, 2003]. В нашей работе в качестве модели карбонильного стресса, была использована система взаимодействия L-лизина и метилглиоксаля. Использование L-лизина было обусловлено тем, что эта аминокислота является одной из основных мишеней действия активных карбонильных соединений в белковых молекулах [Bourajjaj et al., 2003]. На рис. 23 приведены результаты ЭПР-спектроскопии продуктов реакций Lлизина с метилглиоксалем. Из приведенных на этом рисунке данных видно, что в анаэробных условиях в реакции L-лизина с метилглиоксалем удается зарегистрировать свободнорадикальные интермедиаты (рис. 23, спектр 1). Спектры ЭПР этих свободнорадикальных интермедиатов характеризуются многокомпонентной сверхтонкой структурой и могут являться суперпозицией спектров катион-радикала диалкилимина и анион радикала метилглиоксаля (семидиона) [Lee et al., 1998]. В условиях аэрации реакционной смеси были зарегистрированы лишь следовые количества свободнорадикальных интермедиатов. Замена газовой среды на азот после инкубации смеси метилглиоксаля с L-лизином в аэробных условиях приводит к значительному (почти на порядок) росту уровня регистрируемых методом ЭПР свободных радикалов, причём содержание этих радикалов возрастало при добавлении СОД к реакционной смеси. Вызываемый СОД эффект может быть связан с удалением супероксида, продуцируемого в исследуемой модельной системе.
Полученные экспериментальные результаты и анализ литературных данных [Phillips, Thornalley, 1993;
Lee et al., 1998;
Suji, Sivakami, 2007] позволяют предложить последовательность реакций, приводящих к образованию свободных радикалов при взаимодействии аминокислот с карбонильными соединениями (рис. 23). Из представленной схемы видно, что диалкилимин представляет собой основание Шиффа, возникающее в процессе взаимодействия карбонильных групп метилглиоксаля с двумя молекулами Lлизина. В реакции диалкилимина с ещё одной молекулой -кетоальдегида образуются, соответственно, катион-радикал основания Шиффа и семидион метилглиоксаля. При одноэлектронном окислении последнего кислородом образуется супероксид (рис. 23).
.- супероксидный O2 анион-радикал метилглиоксаль O L-лизин H3C H + 2 H2NCH2(R)COO продукты конечного O O гликирования анион-радикал H3C H -.
(семидион) метилглиоксаля O O H3C H H3C H.
+ -OOC(R)H2C N NCH2(R)COO -OOC(R)H2C N NCH2(R)COO катион-радикал диалкилимина диалкилимин L-лизина и метилглиоксаля Рис. 23. Схема образования свободнорадикальных интермедиатов в реакции метилглиоксаля с L-лизином (модель реакции Майара).
О2• В исследуемой системе неферментативное образование обнаружено при взаимодействии Lлизина и метилглиоксаля с помощью нитросинего тетразолия, а также хемилюминесцентным методом (рис. 24 А, Б). В этих условиях СОД эффективно элиминирует супероксид, а также снижает скорость падения интенсивности сигнала ЭПР при смене продувки реакционной среды азотом на аэрацию (рис. 25 А, кривые 1 и 2).
А а б 0, Хемилюминесценция, отн. ед.
0, 0, 0, 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 0 1 2 3 4 5 Время, мин Время, мин Рис. 24. Образование О2• в реакции Lлизина с метилглиоксалем. Кинетика накопления формазана при восстановлении супероксидом нитросинего тетразолия в карбонатном буфере (рН 9,5) (а, кривая 1). Индуцированная О2• хемилюминесценция люцигенина в фосфатном буфере (фосфатный буфер, рH 7,8) (б, кривая 1). Влияние СОД (кривые 2 на панелях а и б).
При аэрации реакционной среды в присутствии СОД зарегистрирован спектр ЭПР, имеющий 5 компонент сверхтонкой структуры и g фактор, равный 2,0042 (рис. 25Б, спектр 2). Характеристики приведенного на рис. (панель Б) спектра ЭПР соответствуют сигналу цис-формы анион-радикала метилглиоксаля (рис. 25Б, спектры 2 и 3). Быстрое снижение содержания катион-радикала диалкилимина и семидиона метилглиоксаля при смене анаэробных условий на аэробные (рис. 25 А, кривая 1) указывает на то, что молекулярный кислород непосредственно взаимодействуют с этими свободными радикалами. Причём защитное действие СОД в отношении анион-радикала метилглиоксаля позволяет утверждать, что семидион элиминируется в реакции с супероксидом. Быстрое снижение содержания катион-радикала диалкилимина и семидиона метилглиоксаля при смене анаэробных условий на аэробные (рис. 25А, кривая 1) указывает на то, что молекулярный кислород непосредственно взаимодействуют с этими свободными радикалами. Причём защитное действие СОД в отношении анион-радикала метилглиоксаля позволяет утверждать, что семидион элиминируется в реакции с супероксидом (рис. 25А,Б).
А Б аэрация Сигнал ЭПР, отн. ед.
g= 2, 2 1 0 4 8 12 16 324 Магнитное поле, мТл Время, мин Рис. 25. Влияние кислорода и СОД на уровень свободнорадикальных производных метилглиоксаля и диалкилимина. А: снижение уровня семидиона метиглиоксаля и катион-радикала диалкилимина в условиях аэрации;
(1) – 160 мМ L-лизина и 160 мМ метилглиоксаля в 0,2 М фосфатном буфере;
(2) – то же что и (1) + 400 ед. СОД. Б: (1) – спектр ЭПР реакционной среды, содержавшей СОД (400 ед./мл), через 8 мин после смешивания лизина и метилглиоксаля, регистрацию спектров ЭПР проводили при продувке азотом;
(2) – тот же образец через 2 мин после начала аэрации;
(3) – симуляция спектра анион-радикала метилглиоксаля.
Исходя из полученных результатов, можно предположить, что редоксактивные продукты реакции Майара могут взаимодействовать с метаболитами оксида азота. Действительно, S-нитрозотиолы и, в меньшей степени, другие доноры NO увеличивают выход семидионов и свободных радикалов диалкилимина, которые образуются в реакции метилглиоксаля с L-лизином или Nацетиллизином (рис. 26А,Б). Последний использовался как аналог остатка лизина в белковой молекуле. Следует отметить, что продукция свободнорадикальных интермедиатов может стимулироваться как самими S-нитрозотиолами, так и возникающим при их декомпозиции NO.
1200 Сигнал ЭПР отн.ед.
A Б 0 4 8 12 16 0 2 4 6 8 10 12 Время, мин Время, мин Рис. 26. Влияние метаболитов и доноров оксида азота на кинетику образования свободнорадикальных производных метилглиоксаля и диалкилимина в реакции Майара. (А): (1) - 100 мМ L-лизина, 100 мМ метилглиоксаля;
(2) - (1) + 4 мМ GS-NO;
(3) - (1) + 4 мМ соли Ангели. (Б): (1) - 160 мМ N-лизина, 160 мМ метилглиоксаля и 1 мМ ДТПА;
(2) - (1) + 4 мМ GS-NO;
(3) - (1) + 4 мМ Sнитрозоцистеина;
(4) – (1) + 4,8 мМ PAPA/NONO (5) - (1) + 4 мМ соли Ангели.
Во всех случаях среда содержала 0,2 М К,Na-фосфатный буфер, pH среды 8,5.
Нельзя исключить, что при взаимодействии NO c шиффовыми основаниями и другими обладающими восстановительными свойствами продуктами реакции Майара продуцируется нитроксильный анион. Однако, нитроксильный анион ингибирует образование регистрируемых ЭПР свободных радикалов в реакции L-лизина или Nацетиллизина с метилглиоксалем (рис. 26 А, Б). Таким образом, медиатором одноэлектронного окисления диалкилимина метилглиоксалем (рис. 23) являются другие редоксактивные производные оксида азота, например анионрадикалы Sнитрозотиолов и продукты нитрозилирования оснований Шиффа.
Рис. 27. Образование нового типа ДНКЖ в реакционной среде, 1 содержавшей 150 мМ метилглиоксаля и 150 мМ Lлизина (рН среды 8,5). В среду вводили 1 мМ ДНКЖ с фосфатными лигандами (спектр 1) g=2, или 0,4 мМ FeSO4 и 8 мМ 2 PAPA/NONO (спектр 2). Спектр зафиксирован в среде, содержавшей L лизин + 0,4 мМ FeSO4 + 8 мМ 3 PAPA/NONO.
320 324 328 Магнитное поле, мТл Введение ДНКЖ с фосфатными лигандами в реакционную среду, содержащую Lлизин и метилглиоксаль, приводит к появлению нового сигнала ЭПР с g фактором равным 2,018 (рис. 27, спектр 1). Важно, что аналогичный сигнал возникает при добавлении в эту среду ионов Fe2+ и доноров оксида азота DETA/NO и PAPA/NONO (рис. 27, спектр 2). В присутствии фенантролина, являющегося эффективным хелатором двухвалентного железа, сигнал с g фактором 2,018 не образуется. В среде, содержавшей только метилглиоксаль или Lлизин, этот сигнал также не зафиксирован (рис. 27, спектр 3). Исходя из этого, можно предположить, что в реакционной среде образуются новый тип динитрозильных комплексов железа (лизин/МГДНКЖ), лигандами которых являются продукты взаимодействия метилглиоксаля и L-лизина. Так как сигнал ЭПР нового типа ДНКЖ не регистрируются при замене лизина на Nацетиллизин, можно заключить, что аминогруппа лизина необходима для образования входящего в состав лизин/МГДНКЖ лиганда. Скорее всего, в координации ионов железа в этих комплексах участвует азот основания Шиффа, образующегося при взаимодействии метилглиоксаля с аминогруппой и карбоксильная группа аминокислоты. Важно, что в условиях аэрации реакционной среды лизин/МГДНКЖ быстро разрушаются, при этом скорость деструкции этих комплексов уменьшается в присутствии СОД. Этот факт согласуется с полученными данными об интенсивной генерации супероксида в ходе взаимодействия лизина с метилглиоксалем.
g=2, g=2, б a в г 326 318 320 322 324 318 32 0 322 М агнитное поле, мТл Магнитное поле, мТл Рис. 28. Спектры ЭПР цистеиновых ДНКЖ и комплексов с цистеином, модифицированным метилглиоксалем: (a) 3,6 мМ цистеиновых ДНКЖ;
(б) 100 мМ метилглиоксаля + 3,6 мМ цистеиновых ДНКЖ;
(в) – 50 мМ цистеина + 150 мМ метилглиоксаля и после 5 мин инкубации добавлены 1,2 мМ ДНКЖ с фосфатными лигандами;
(г) – то же что и (б) + 5 мМ батофенантролина.
Спектры регистрировали при продувке азотом.
Другой вариант динитрозильных комплексов образуется в присутствии избытка метилглиоксаля в реакционной среде, содержащей фосфатный буфер и цистеиновые ДНКЖ, при этом исчезает характерный для этих комплексов спектр ЭПР с g фактором равным 2,03 (рис. 28, спектр а), но появляется сигнал ДНКЖ с фосфатными лигандами и сигнал ЭПР с g фактором, равным 2,018 (рис. 28, спектр б). Аналогичный сигнал образуется при добавлении ДНКЖ, связанных с анионами фосфата, в смесь цистеина и метилглиоксаля (рис. 29, спектр в). Появление этого сигнала, как и в случае с лизин/МГДНКЖ, подавляется батофенантролином (рис. 28, спектр г).
ДНКЖ, возникающие при модификации цистеина метилглиоксалем (цистеин/МГДНКЖ) имеют хорошо разрешенную сверхтонкую структуру из семи компонент. Существенно, что сигнал ЭПР с g фактором 2,018 не регистрируется при добавлении ДНКЖ с фосфатными лигандами к реакционной среде, содержащей вместо цистеина N-ацетилцистеин.
Следовательно, аналогично лизину в формировании новых типов ДНКЖ участвует атом азота аминогруппы цистеина. Введение модифицирующего SH-группы агента N-этилмалеимида (NEM) в реакционную смесь одновременно с цистеиновыми ДНКЖ и метилглиоксалем предотвращает образование цистеин/МГДНКЖ. При этом под действием NEM цистеиновые ДНКЖ превращаются в динитрозильные комплексы с фосфатными лигандами.
Тем не менее, добавление NEM после завершения реакции цистеиновых ДНКЖ с метилглиоксалем не влияет на содержание цистеин/МГДНКЖ. Эти факты указывают на то, что образование гемитиоацеталя в ходе реакции метилглиоксаля с SH-группой цистеина необходимо для формирования цистеин/МГДНКЖ. На потенциально важное физиологическое действие цистеин/МГДНКЖ указывает то, что эти комплексы в крови экспериментальных животных ведут себя аналогично немодифицированных цистеиновым ДНКЖ. В цельной крови и плазме крыс оба варианта динитрозильных комплексов переходят на белковые компоненты. Таким образом, даже модифицированные активными карбонильными соединениями ДНКЖ могут выполнять функцию переносчика NO.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Анализ современных научных данных позволяет сделать вывод о тесной взаимосвязи молекулярных процессов, проходящих в живых системах при окислительном, нитрозативном и карбонильном стрессах. Метаболизм оксида азота в условиях этих стрессовых воздействий определяется его взаимодействием с супероксидом и другими редокс-активными соединениями, в первую очередь тиолами и ионами металлов переменной валентности.
На основании полученных в нашей работе экспериментальных результатов можно заключить, что S-нитрозотиолы и различные типы ДНКЖ в большинстве исследованных модельных системах проявляют антиоксидантные свойства. Быстрый распад как низкомолекулярных, так и белковых динитрозильных комплексов под действием супероксида, органических свободных радикалов и пероксинитрита согласуется с тем, что эти метаболиты NO способны защищать другие биологические молекулы от деструкции в ходе окислительного стресса. В то же время скорость реакции альбуминовых ДНКЖ O2 NO NO2 N2O NO Источники RSH оксида азота ONOO Источники супероксида RS-NO O.- 2+ O ONOO- Fe ферритин гем-Fe+4=O RS- + NO оксоферильная ДНКЖ форма гема (RS-) 2-Fe -(NO ) + + NOx Fe-S белки RS-NO Рис. 29. Схема динамического равновесия между метаболитами оксида азота и ионами железа и тиолами, определяющая баланс прооксидантных и антиоксидантных процессов в клетке. Серыми линиями отмечены реакции, важные для образования ДНКЖ и антиоксидантного действия этих комплексов.
Жирной стрелкой отмечена обнаруженная нами реакция формирования ДНКЖ в условиях окислительного стресса. NOx физиологически активные метаболиты оксида азота.
с супероксидом (k 107 M-1с-1) почти на три порядка меньше скорости взаимодействия последнего с оксидом азота (k 6,7 109 M-1с-1).
Следовательно, ДНКЖ действительно могут быть формой стабилизации оксида азота, как в нормальных, так и патологических состояниях организма. Можно предположить, что взаимодействие ДНКЖ с активными формами кислорода и азота делает возможным регуляцию различных физиологических функций NO через изменение его концентрации в результате деструкции динитрозильных комплексов железа. Это предположение было подтверждено при исследовании сосудорасширяющего действия ДНКЖ. Обнаруженное усиление образования ДНКЖ при генерации митохондриями супероксида в системе, содержащей Sнитрозоглутатион и ферритин, может лежать в основе адаптивного ответа клетки на окислительный и нитрозативный стресс (рис. 29). В этих условиях синтез ДНКЖ, связывающих NO и ионы, железа является альтернативой прооксидантному действию активных форм кислорода и азота.
В то же время не исключено, что S-нитрозотиолы и ДНКЖ, в состав которых входят модифицированные метилглиоксалем аминокислоты, играют особую регуляторную и протекторную роль в условиях карбонильного стресса.
В этих условиях большое значение могут иметь антиоксидантные свойства ДНКЖ, т.к. патологические явления, связанные с гипергликемией, часто сопровождаются усилением свободнорадикальных процессов в клетках и тканях.
Таким образом, динитрозильные комплексы железа с тиольными лигандами являются уникальной группой соединений, способными быть донорами NO и в то же время способными реагировать с широким спектром интермедиатов окислительного, нитрозативного и карбонильного стресса.
Сопоставление полученных нами и имеющихся в научной литературе данных позволяют утверждать, что от равновесия между различными формами ДНКЖ и другими метаболитами оксида азота зависит выживание клетки в условиях выше упомянутых стрессовых воздействий.
ВЫВОДЫ 1. Динитрозильные комплексы железа, связанные с низкомолекулярными тиолами (глутатионом и цистеином) или с белками (альбумином и метгемоглобином), разрушаются при взаимодействии с супероксидным радикалом и пероксинитритом. Вместе с тем, ДНКЖ, включающие в качестве лигандов глутатион или цистеиновые остатки альбумина, практически не реагируют с пероксидом водорода и органическими гидропероксидами.
2. Реакция разрушения динитрозильных комплексов железа, связанных с альбумином, под действием супероксида, характеризуется величиной константы скорости (~107 M-1 с-1), что почти на три порядка меньше аналогичной константы для реакции O2• со свободными молекулами NO. Таким образом, включение NO в белковые ДНКЖ может обеспечивать его защиту от действия супероксида в тканях и кровеносной системе.
3. Динитрозильные комплексы железа и другие метаболиты оксида азота проявляют антиоксидантные свойства в различных модельных системах. В то же время высвобождение ионов железа при разрушении ДНКЖ может приводить к прооксидантному эффекту.
4. Установлено, что антиоксидантное действие динитрозильных комплексов железа обусловлено способностью этих комплексов перехватывать свободные радикалы и эффективно восстанавливать оксоферрильную форму миоглобина. Предложен механизм взаимодействия глутатионовых ДНКЖ и оксоферрилмиоглобина.
5. Обнаружено, что разрушение гемоглобиновых динитрозильных комплексов железа под действием гидропероксидов опосредовано гемовой группой и свободными радикалами аминокислотных остатков белка. В этих условиях ДНКЖ предотвращают окислительную модификацию связанных с ними субъединиц гемоглобина.
6. В присутствии S-нитрозотиолов происходит образование динитрозильных комплексов железа в митохондриях и клетках Е. coli. При этом формирование динитрозильных комплексов железа коррелирует с устойчивостью бактериальных клеток к окислительному стрессу.
7. Установлено, что Sнитрозотиолы существенно увеличивают выход органических свободных радикалов, возникающих в реакции L-лизина с метилглиоксалем, что указывает на важную роль этих метаболитов оксида азота в регуляции процессов неферментативного гликирования.
8. Обнаружены динитрозильные комплексы железа нового типа, лигандами которых являются продукты взаимодействия L-цистеина и L-лизина с метилглиоксалем. Динитрозильные комплексы, содержащие цистеин, модифицированный метилглиоксалем, в плазме крови функционируют как доноры FeNO группы.
9. Совокупность полученных результатов позволила предложить новый механизм регуляции баланса антиоксидантных и прооксидантных процессов в биологических системах через образование и деструкцию динитрозильных комплексов железа.
ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Кухарчук В.В., Шумаев К.Б., Дмитровский А.А., Чернядьева И.Ф., Быховский В.Я. Ингибирование астаксантином окисления аполипопротеин В-содержащих липопротеидов плазмы крови человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1997. Т.123, № 3. C.285-288.
2. Шумаев К.Б., Рууге Э.К., Дмитровский А.А., Быховский В.Я., Кухарчук В.В. Влияние антиоксидантов и продуктов перекисного окисления липидов на образование радикала пробукола в липопротеинах низкой плотности // Биохимия. 1997. Т.62, № 6. С.769-773.
3. Гомбоева С.Б., Гесслер Н.Н., Шумаев К.Б., Хомич Т.И., Мойсеёнок А.Г., Быховский В.Я. Некоторые природные и синтетические антиоксиданты как стабилизаторы превращения -каротина в витамин А // Биохимия. 1998. Т.43, № 2. С.224-229.
4. Тихазе А.К., Ланкин В.З., Колычева С.В., Коновалова Г.Г., Шумаев К.Б., Козаченко А.И., Гуревич С.М., Жарова Е.А., Смирнов Л.Д. Является ли триметазидин антиоксидантом? // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1998. Т.126, № 11, P.551-554.
5. Тихазе А.К., Ланкин В.З., Коновалова Г.Г., Шумаев К.Б., Каминный А.И., Козаченко А.И., Гуревич С.М., Наглер Л.Г., Зайцева Т.М., Кухарчук В.В.
Антиоксидант пробукол является эффективной ловушкой липидных радикалов в липопротеинах низкой плотности in vitro и in vivo // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1999. Т.127, № 8. P.186-189.
6. Гесслер Н.Н., Гомбоева С.Б., Шумаев К.Б., Быховский В.Я., Ланкин В.З.
Механизм соокисления -каротина и полиеновых жирных кислот // Докл.
РАН. 2001. Т.63, №3. C.402-405.
7. Козаченко А. И., Наглер Л. Г., Гуревич С. М., Шумаев К. Б., Ланкин В.З., Беленков Ю. Н. Особенности ингибирования -каротином свободнорадикального окисления жирных кислот с разной степенью ненасышенности // Докл. РАН. 2001, T. 379, № 6. C.786-788.
8. Шумаев К.Б., Рууге Э.К., Ланкин В.З., Ванин А.Ф., Гомбоева С.Б.
Беленков Ю.Н. Механизм ингибирования свободнорадикального окисления -каротина S-нитрозоглутатионом и динитрозильными комплексами железа // Докл. РАН. 2001. T. 379, № 5. C.702-704.
9. Гесслер Н.Н., Гомбоева С.Б., Шумаев К.Б., Быховский В.Я., Ланкин В.З.
Свободнорадикальное окисление липидов подавляет ферментативную конверсию -каротина в витамин А // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2001. T. 131, № 5. C.532-535.