Клинико-генетический и биохимический анализ болезни паркинсона: механизмы предрасположенности, экспериментальные модели, подходы к терапии
На правах рукописи
БАГЫЕВА ГУЛЬБАХАР ХОДЖАЕВНА Клинико-генетический и биохимический анализ болезни паркинсона:
Механизмы предрасположенности, экспериментальные модели, подходы к терапии 14.00.13 – нервные болезни 03.00.04 – биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Москва 2009
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре неврологии РАМН Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор И. А. Иванова-Смоленская доктор биологических наук Т. Н. Федорова
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Г. Н. Авакян доктор медицинских наук, профессор А. С. Кадыков доктор медицинских наук, профессор С.В. Пирожков
Ведущая организация:
Московский Областной Научно-исследовательский Клинический Институт им. М.В. Владимирского (МОНИКИ).
Защита диссертации состоится «29» сентября 2009 г. в 12 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 001.006.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре неврологии РАМН по адресу: 125367 Москва, Волоколамское шоссе, 80.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НЦН РАМН.
Автореферат разослан «29» июня 2009 г.
Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 001.006.01, кандидат медицинских наук М. А. Домашенко
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования Болезнь Паркинсона (БП) – одно из наиболее тяжелых и распространенных нейродегенеративных заболеваний человека, характеризующееся хроническим прогрессирующим течением, нарушением функции базальных ганглиев и тяжелой инвалидизацией больных. Лечение больных БП до настоящего времени носит симптоматический характер и не влияет на текущий процесс нейродегенерации [Голубев и др., 1999;
Koller, Tse, 2004;
Jenner, 2008].
Существует несколько гипотез, касающихся причин гибели дофамин продуцирующих нейронов при БП, в их числе: генетическая предрасположенность;
окислительный стресс;
митохондриальная дисфункция;
действие экзогенных нейротоксинов [Иллариошкин, 2008]. По современным представлениям, в патогенезе нейродегенерации при БП могут участвовать все вышеуказанные механизмы, что дает возможность рассматривать БП как мультифакториальное страдание, которое проявляется в результате взаимодействия генетических и средовых факторов [Lee, Liu, 2008;
Veidman et al., 1998].
Семейные формы БП составляют 510% всех случаев заболевания, остальные случаи являются спорадическими [Lee, Liu, 2008;
Mizuno et al., 2008].
На молекулярном уровне моногенные формы БП представляют собой генетическую патологию ряда митохондриальных белков, компонентов убиквитин протеасомного комплекса, либо белков, изменение конформации которых приводит к формированию в нейронах нерастворимых включений, что инициирует реакции окислительного стресса и апоптоза [Иллариошкин, 2003, 2008;
Schiesling et al., 2008]. Роль генетики в этом процессе заключается либо в наследственных дефектах белкового гомеостаза, либо в формировании неблагоприятного метаболического фона, определяющего высокий риск нейродегенерации в определенных средовых условиях. Таким образом, мутационный анализ генов наследственных форм паркинсонизма, а также установление основных генов предрасположенности при спорадических формах заболевания представляют собой двуединую задачу, позволяющую оценить удельный вес геномных факторов в развитии БП [De Michele et al. 1995;
Schiesling et al., 2008].
Из средовых факторов риска БП важнейшим является окислительный стресс с нарушением внутриклеточного баланса между образованием активных форм кислорода (АФК) и состоянием тканевой антиоксидантной защиты.
Повышенный уровень АФК рассматривается в качестве универсального механизма развития многих нейродегенеративных заболеваний, а также процесса старения [Завалишин и др., 2001;
Иллариошкин, 2003]. Существенным источником АФК в клетках является нарушение функций митохондрий [Halliwell, 1999;
Chinnery et al., 1999]. Установлено, что в митохондриях нейронов черной субстанции, скелетных мышц и клеток крови больных БП наблюдается стойкий дефицит комплекса I дыхательной цепи [Swerdlow et al. 1998;
Wooten et al. 1997]. Поэтому актуальной задачей является изучение роли окислительного стресса в механизмах повреждения митохондрий при БП. Особый интерес представляет анализ возможности обеспечения сохранности структуры и функции митохондрий с помощью природных и синтетических антиоксидантов.
Новые данные о патогенезе нейродегенерации могут быть получены при исследовании уникальной экспериментальной модели паркинсонизма у быстростареющих мышей линии SAMP1 (Senescence Accelerated Mice, Prone). Эта модель отличается ускоренной динамикой развития возрастных изменений и четко выраженной симптоматикой в ответ на введение токсина МРТР (N-метил-4-фенил 1,2,3,6-тетрагидропиридина) [Болдырев и др., 2001, Stvolinsky et al., 2001]. Мыши SAMP представляют собой генетически устойчивую линию животных, ускоренное старение которых объясняется выраженным дисбалансом между образованием и нейтрализацией свободных радикалов и, как следствие множественными окислительными повреждениями биологических макромолекул в их тканях.
Можно предположить, что комбинация возрастных факторов и дефектов системы антиоксидантной защиты с нарушениями обмена веществ в мозге, вызываемыми МРТР, может привести к более выраженным нейродегенеративным изменениям, что позволит использовать эту модель для более тонкого исследования патогенетических механизмов паркинсонизма [Болдырев и др., 2001].
Таким образом, на сегодняшний день не вызывает сомнений существование ряда конститутивных генетических и биохимических факторов, определяющих предрасположенность к развитию БП. Однако вопросы соотношения этих факторов, их популяционной специфичности, а также целенаправленной профилактики на основе нейропротекции разработаны в недостаточной степени.
Цель работы: клинико-экспериментальный анализ ряда молекулярно генетических и биохимических факторов развития БП, а также разработка на этой основе новых подходов к терапии данного заболевания.
В соответствии с настоящей целью были поставлены следующие задачи:
1. Мутационный скрининг и изучение роли ряда основных генов, связанных с развитием наследственно-семейных форм паркинсонизма, в формировании генетической предрасположенности к спорадической БП:
• ген PRKN (паркин), локус PARK2 на хромосоме 6q25.2-27;
• ген LRRK2 (дардарин), локус PARK8 на хромосоме 12p11.2;
• ген SNCA (-синуклеин), локус PARK1 на хромосоме 4q21;
• ген GBA (глюкоцереброзидаза) в локусе 1q21.
2. Анализ клинико-генетических корреляций в случаях с идентифицированными мутациями в кандидатных генах паркинсонизма.
3. Изучение ассоциаций спорадической БП с полиморфными вариантами генов нейротрансмиттеров центральной нервной системы (ЦНС).
4. Моделирование паркинсонизма в эксперименте с помощью нейротоксина МРТР на линии быстро стареющих мышей SAMP, изучение у них вызванных биохимических нарушений, затрагивающих важнейшие ферментные системы митохондрий мозга.
5. Проведение сравнительного анализа параметров перекисного окисления липидов и антиоксидантных систем в клетках крови (моноаминооксидаза B, супероксиддисмута, карбонильные группы белков, окисленность липидного материала митохондриальных мембран) у больных БП в сопоставлении с аналогичными характеристиками у животных с экспериментальным паркинсонизмом – быстростареющих мышей линии SAMP.
6. Изучение роли окислительного стресса в механизмах повреждения митохондрий при паркинсонизме и обеспечение их сохранности с помощью природных (карнозин) и синтетических (мексидант) антиоксидантов на модели МРТР-индуцированного паркинсонизма у быстростареющих мышей линии SAMP, а также в сочетании с антипаркинсоническими препаратами у пациентов с БП.
Научная новизна. Впервые изучена роль генов наследственно-семейных форм первичного паркинсонизма (PRKN, LRRK2, SNCA, GBA) в развитии спорадической БП у российских больных – представителей преимущественно славянских этнических групп. Установлено, что наследуемые мутации в генах паркинсонизма выявляются более чем в 10% всех случаев спорадической БП, в том числе гетерозиготные экзонные перестройки гена PRKN – у 6,5% больных, а мажорные мутации в генах LRRK2 и GBA – суммарно у 5% больных. Показан более ранний возраст манифестации БП у носителей мутаций в гене PRKN, а также аддитивное действие комбинации различных мутаций в отношении тяжести заболевания. Впервые выявлена ассоциация спорадической БП с полиморфными аллелями генов ряда нейротрансмиттерных систем ЦНС – HTR2A (cеротониновый рецептор 2A), РОМС (проопиомеланокортин) и WFS1 (везикулярный пептид вольфрамин). В работе проведено комплексное клинико-биохимическое и экспериментальное исследование состояния окислительного статуса и антиоксидантной защиты при БП и МРТР-индуцированном паркинсонизме, показана однонаправленность основных патобиохимических звеньев нейродегенеративного процесса в клинике и эксперименте на модели быстростареющих мышей линии SAMP (угнетение активности СОД, повышение уровня липидных гидроперекисей, значительное снижение суммарной активности эндогенной антиоксидантной защиты).
Практическая значимость. Выявление с высокой частотой мутаций в генах PRKN, LRRK2 и GBA у пациентов со спорадической БП принципиально меняет подходы к медико-генетическому консультированию и оценке риска болезни у членов отягощенных семей. В работе предложены и апробированы на практике методы экономного мутационного скрининга генов паркинсонизма (APEX-технология, анализ дозы гена методом ПЦР в реальном времени при гетерозиготных экзонных перестройках). По результатам проведенных исследований в клинике и эксперименте уточнены характеристики окислительного стресса при паркинсонизме и обоснована целесообразность применения ряда новых антиоксидантов в патогенетической терапии БП. Проведено сравнительное изучение эффективности антиоксидантной терапии карнозином при МРТР индуцированном паркинсонизме, а также карнозином и мексидантом (в сочетании с антипаркинсоническими препаратами) у больных БП.
Положения, выносимые на защиту:
Важным фактором развития спорадической БП являются наследуемые 1.
мутации в генах, связанных с менделирующими формами первичного паркинсонизма: в российской (преимущественно славянской) выборке пациентов со спорадической формой БП гетерозиготные мутации генов PRKN, LRRK2 и GBA выявляются более чем в 10% случаев болезни.
При анализе клинико-генетических корреляций установлено, что 2.
носительство мутаций в генах PRKN (паркин) и GBA (глюкоцереброзидаза) ассоциировано с более ранним дебютом клинической симптоматики, а сочетание мутаций (двойная гетерозиготность) в различных генах паркинсонизма характеризуется аддитивным эффектом в отношении тяжести течения заболевания.
Мажорная мутация G2019S в гене LRRK2 обусловливает широкий полиморфизм возраста дебюта и фенотипических проявлений паркинсонизма. Высокая частота носительства данной мажорной мутации у пациентов с БП обусловлена как «эффектом основателя», так и повторными мутационными событиями de novo.
В исследованной популяции установлена ассоциация спорадической 3.
БП с полиморфизмами в генах HTR2A (cеротониновый рецептор 2A), РОМС (проопиомеланокортин) и WFS1 (везикулярный пептид вольфрамин), что подтверждает патогенетическую взаимосвязь данного заболевания с активностью нейропептидной и серотонинергической трансмиттерных систем головного мозга.
С биохимической точки зрения БП (идиопатический паркинсонизм) и 4.
экспериментальный МРТР-индуцированный паркинсонизм у быстростареющих мышей линии SAMP1 характеризуются однонаправленными изменениями, свидетельствующими об истощении системы антиоксидантной защиты и усилении свободнорадикальных процессов перекисного окисления липидов. С учетом возникающих при этом у мышей линии SAMP1 двигательных и поведенческих нарушений можно заключить, что животные с генетически ускоренным старением мозга являются наиболее адекватной моделью для изучения механизмов нейродегенеративного повреждения вещества мозга в эксперименте.
Окислительный стресс и его патофизиологические проявления на 5.
уровне ткани мозга быстростареющих животных с экспериментальным паркинсонизмом предотвращаются курсовым введением природного антиоксиданта карнозина (протекция в отношении угнетения двигательной активности и МРТР-индуцированной мышечной ригидности, предотвращение подавления активности МАО-В и активации СОД, защита белков от окислительной модификации). У больных БП назначение карнозина сопровождается существенным усилением позитивной динамики клинических симптомов (по сравнению с группой базисной терапии), уменьшением окислительного повреждения липопротеинов крови на фоне повышения уровня эндогенной антиоксидантной защиты и сохранения активности Cu/Zn-СОД.
Включение в терапевтическую схему у пациентов с БП 6.
синтетического антиоксиданта мексиданта способствует нейтрализации роста липидных гидроперекисей в липопротеинах крови и повышению уровня эндогенной антиоксидантной защиты;
особенно отчетлив эффект мексиданта в отношении снижения частоты выявляемых побочных эффектов леводопа-терапии.
Результаты проведенных исследований являются основанием для использования природных и синтетических антиоксидантов различных классов (карнозин, мексидант) в комплексном лечении паркинсонизма.
Апробация работы. Работа апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании сотрудников I, II, III, V неврологических, нейрохирургического и научно-консультативного отделений, отделения реанимации и интенсивной терапии, отдела исследований мозга, научно координационного отдела, отделения лучевой диагностики, лабораторий экспериментальной и клинической нейрохимии, кардионеврологии, ультразвуковой диагностики, эпидемиологии и профилактики заболеваний нервной системы, патологической анатомии с прозектурой, клинической нейрофизиологии НЦН РАМН 13 мая 2009 г.
Результаты работы доложены на: научной конференции НИИ неврологии РАМН (2006 г);
Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (2004, 2005);
II Украинском симпозиуме с международным участием «Экстрапирамидные болезни и возраст» (Киев, 2004);
Научно-практической конференции неврологов Московской области (Ступино, 2005);
V съезде Российского общества медицинских генетиков (Москва, 2005);
IX Всероссийском съезде неврологов (Ярославль, 2006);
Международных конгрессах по болезни Паркинсона и нарушениям движений (Рим, 2004;
Новый Орлеан, 2006;
Киото, 2007), XVII Всемирном конгрессе по болезни Паркинсона (Амстердам, 2007);
Конференции Европейской Федерации Неврологических Обществ (Брюссель, 2007);
I Национальном конгрессе по болезни Паркинсона и расстройствам движений (Москва, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 32 научных работы в отечественных и зарубежных изданиях.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы по теме диссертации, описания материалов и методов исследования, 3 глав с изложением полученных результатов, обсуждения, выводов и практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Диссертация изложена на 214 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и рисунков. Библиографический указатель включает 314 источников, в том числе работу отечественных и 263 зарубежных авторов.
Автор выражает искреннюю благодарность за помощь и поддержку при выполнении различных фрагментов диссертационного исследования:
коллективу сотрудников нейрогенетического отделения Научного центра неврологии РАМН (зав. – проф. И.А. Иванова-Смоленская), в особенности научным сотрудникам ДНК-лаборатории отделения – кандидатам мед. наук Н.И.Миклиной и Н.Ю. Абрамычевой;
сотрудникам лаборатории клинической и экспериментальной нейрохимии (зав. – проф. А.А. Болдырев) Научного центра неврологии РАМН;
сотрудникам лаборатории молекулярной генетики наследственных заболеваний (зав. – д.б.н., проф. П.А.Сломинский) Отдела молекулярных основ генетики человека (зав. – проф., лауреат Государственной премии РФ С.А.Лимборская) Института молекулярной генетики РАН;
сотрудникам Института молекулярной и клеточной биологии Тартуского университета (Эстония).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общая характеристика обследованных больных и семей Обследованы 369 больных с различными вариантами первичного паркинсонизма, а также 65 их клинически здоровых родственников. У 351 больного имела место спорадическая БП, а у 18 (4,9%) имелись указания на достоверное аутосомно-доминантное наследование болезни. Аутосомно-доминантный паркинсонизм рассматривался нами в качестве своеобразной группы сравнения по отношению к основной обследованной группе – спорадической форме БП.
Большинство больных БП имели славянские этнические корни по одной либо обеим родительским линиям и происходили из семей, проживавших на протяжении 2–3 поколений на территории европейской части России. В исследование не включались лица с ювенильным паркинсонизмом, заболевшие на первом-втором десятилетии жизни и имевшие a priori генетическую составляющую в качестве ведущего фактора развития болезни [Загоровская и др., 2004;
Mata et al., 2004].
Исключением были 9 пациентов с доказанным аутосомно-рецессивным ювенильным паркинсонизмом и выявленными ранее делециями отдельных экзонов гена PRKN (паркин, локус PARK2), образцы ДНК которых использовались в качестве позитивного контроля при разработке метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для анализа дозы гена PRKN (см. далее).
Таким образом, нами обследована невыборочная серия преимущественно спорадических случаев БП (возраст дебюта – 20–75 лет), наблюдавшихся в нейрогенетическом отделении Научного центра неврологии РАМН в 20032007 гг.
и соответствующих общепринятыми критериям БП [Hughes et al., 1992].
Оценка тяжести состояния больных БП опиралась на стандартные количественные шкалы: 1) функциональная шкала ХенЯра в модификации Линдвала;
2) унифицированная рейтинговая шкала оценки БП (UPDRS).
В качестве контроля при проведении генетических исследований обследованы 350 неврологически здоровых лиц (700 контрольных хромосом), соответствующих основной группе по возрастному и половому составу.
Методы исследования Молекулярно-генетические методы исследования Молекулярно-генетическая часть работы выполнялась на базе ДНК лаборатории нейрогенетического отделения ННЦ РАМН и отдела молекулярных основ генетики человека Института молекулярной генетики РАН (зав.
лабораторией проф. П.А. Сломинский, зав. отделом – лауреат Государственной премии РФ, проф. С.А. Лимборская). Часть исследований (оценка аллельных частот на основе APEX-технологии) проводилась совместно с Институтом молекулярной и клеточной биологии Тартуского университета (Эстония). Всего исследовано свыше 800 образцов ДНК, в том числе 434 образца ДНК больных с паркинсонизмом и более 400 образцов ДНК здоровых лиц из групп контроля.
Анализ наиболее частой мажорной мутации в гене LRRK2 (локус PARK8) – нуклеотидной замены 6055GA в 41-м экзоне LRRK2, ведущей к замещению глицина (G) на серин (S) в белковой позиции 2019, осуществлялся методом ПЦР в реальном времени [Kachergus et al., 2005]. В части случаев БП анализ мутации LRRK2-G2019S осуществлялся с помощью стандартного сайт-специфичного SfcI рестрикционного теста («Ферментас», Литва) в соответствии с описанным для мутации G2019S протоколом [Hernandez et al., 2005]. Для анализа гаплотипов у носителей мутации G2019S были типированы 2 микросателлитных (D12S2516, D12S2518) и 4 однонуклеотидных SNP-полиморфизма (rs7966550, rs1427263, rs11176013, rs11564148), сцепленных с локусом PARK8 на хромосоме 12q 24-полиморфизму [Kachergus et al., 2005]. Генотипирование по гена аполипопротеина Е (AроE) у носителей мутации LRRK2-G2019S проводилось в соответствии со стандартным протоколом [Wenham et al., 1991].
Анализ структурных перестроек в гене PRKN (паркин, локус PARK2) проводился с помощью количественного анализа дозы гена методом ПЦР в реальном времени в технологии TaqMan на приборе ANA-32 (“Syntol”, Москва). В качестве внутреннего стандарта с каждым экзоном PRKN коамплифицировался ген -глобина. Для максимальной верификации интенсивности флюоресценции ПЦР продуктов все образцы тестировались трижды. Отношение концентраций паркин/ глобин подсчитывалось для всех ДНК образцов. Нормальным расценивалось соотношение от 0,7 до 1,3. Показатели ниже 0,6 или выше 1,4 расценивались как гетерозиготная делеция или дупликация определенного экзона, соответственно.
Этим же методом ПЦР в реальном времени в технологии TaqMan (амплификация с использованием немеченых праймеров в присутствии флуоресцентно меченного экзон-специфичного зонда) оценивалась копийность экзонов 46 гена SNCA (-синуклеин).
Анализ 5 мажорных мутаций в гене GBA (глюкоцереброзидаза), которые в ряде популяций мира ассоциированны с БП [Sato et al., 2005], проводился с помощью специфичных для каждой нуклеотидной замены рестрикционных тестов.
Исследованы мутации 84insGG (2-й экзон гена), K198T (6-й экзон), R329C (8-й экзон), N370S (9-й экзон) и L444P (10-й экзон).
Анализ однонуклеотидных полиморфизмов в кандидатных генах проводился с использованием APEX-технологии (от англ.: Arrayed Primer EXtension), сочетающей в себе эффективность метода микрочипов и точность ди дезоксисеквенирования по Сэнгеру [Kurg et al., 2000]. Проанализированы однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в 19 генах, которые могут быть вовлечены в нейродегенеративный процесс при БП. Гены-кандидаты и конкретные SNP были отобраны на основании их участия в нейротрансмиссии и показанного ранее для некоторых из них возможного вовлечения в патогенез БП (таблица 1).
Таблица 1. Исследованные с помощью APEX-технологии гены и однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs).
Ген (аббревиатура) Число SNPs Локализация гена Холецистокинин (CCK) 2 3p22-p21. Холецистокинин, A-рецептор (CCKAR) 3 4p15.1-p15. Холецистокинин, В-рецептор (CCK2B) 4 11p15. D1-дофаминовый рецептор (DRD1) 5 5q35. D2-дофаминовый рецептор (DRD2) 6 11q D3-дофаминовый рецептор (DRD3) 2 3q13. D5-дофаминовый рецептор (DRD5) 1 4p16. Тирозин-гидроксилаза (TH) 1 11p15. Серотониновый рецептор 1A (HTR1A) 1 5q11.2-q Серотониновый рецептор 1B (HTR1B) 3 6q Серотониновый рецептор 2A (HTR2A) 3 13q14-q Серотониновый рецептор 2С (HTR2C) 1 Xq Транспортер серотонина (SLC6A4) 1 17q11.1-q Триптофан-гидроксилаза 1 (TPH1) 2 11p15.3-p Опиоидный рецептор М1 (OPRM1) 3 6q24-q Опиоидный рецептор D1 (OPRD1) 2 1p36-p34. Проопиомеланокортин (POMC) 3 2p23. Проэнкефалин (PENK) 1 8q23-q Вольфрам-синдром 1(WFS1) 6 4p16. Генерация олигонуклеотидных микрочипов и ориентированных праймер продлевающих реакций выполнялась в соответствии с описанием [Maron et al., 2005]. Считывание полиморфизмов выполнялось в программе GenoramaTM 4.1 с использованием сигнальных паттернов контрольной ДНК в качестве референсного сиквенса. Использовались также программы SNP Assistant и Statistica 6.0 (различия в распределении генотипов между больными и контролем, Р-уровень).
Моделирование экспериментального паркинсонизма на быстростареющих мышах линии SAM Экспериментальные исследования были выполнены на 106 мышах линии SAMP1 (с ускоренным старением) и контрольной линии SAMR1, выведенных сотрудниками Университета г. Киото, Япония (проф. T.Takeda, проф. M.Hosokawa).
Для индукции паркинсонизма животным (n=18) ежедневно вводили раствор МРТР ("Sigma") внутрибрюшинно в течение 8 дней в дозе 30 мг/ кг массы тела. Второй группе животных (n=16) за 30 минут до введения МРТР вводили карнозин в течение 8 дней (внутрибрюшинно, в концентрации 100 мг/кг массы тела). В контрольную группу вошли животные (n=19), которым вместо МРТР вводили физиологический раствор. Животных декапитировали на 10-й день эксперимента. После забоя животных мозг быстро извлекали и замораживали в жидком азоте до проведения биохимических исследований.
Физиологическое состояние животных оценивали по параметрам, определяемым в стандартном тесте «Норковая камера». Тестирование проводили дважды: до начала эксперимента (для разделения животных на равноценные группы) и по окончании на 8-й день (после последнего введения МРТР), используя три параметра: вертикальная и горизонтальная двигательная активность, исследовательская активность и груминг [Sedelis et al., 2001]. Измеряли также ригидность мышц туловища, используя симптом «горбатости» (укорочение расстояния от шеи до основания хвоста, L).
Биохимические параметры измеряли в митохондриальной фракции, выделенной из коры больших полушарий животных. В соответствии с описанными протоколами [Федорова, 1999, 2003;
Buss et al., 1997], в работе исследовались:
• Активность МАО-В (с использованием бензиламина как субстрата).
• Активность СОД (по подавлению скорости восстановления нитросинего тетразолия при генерации супероксидного анион-радикала).
• Количественная оценка окислительного стресса на основании хемилюминесценции (ХЛ) биологических образцов (суммарной фракции липопротеинов низкой и очень низкой плотности или тканевых гомогенатов мозга экспериментальных животных), в т.ч.: а) показатели Fe2+-индуцированной ХЛ ткани мозга;
б) окисленность белков в цельном гомогенате коры мозга и в митохондриальной фракции. По амплитуде (h) быстрой вспышки ХЛ судили об исходном уровне липидных гидроперекисей в мембранной фракции мозга, по Fe2+ латентному периоду () – об устойчивости липопротеинов к индуцированному окислению (эффективность антиоксидантной защиты мембранных структур). По окончании латентного периода начинается фаза медленного нарастания интенсивности ХЛ (Н), пропорциональной количеству окисляемого материала в образце. Величина V (измеряемая как угол наклона кривой возгорания ХЛ) соответствует скорости окисления липидного материала.
Клинико-биохимические исследования Активность МАО-В измеряли в тромбоцитах крови с использованием бензиламина в качестве субстрата [Дроздов, Анохина, 1990;
Gallant et al., 2000].
Активность супероксиддисмутазы Cu/Zn-СОД в эритроцитах измеряли в супернатанте спектрофотометрически по скорости восстановления нитросинего тетразолиевого в присутствии смеси ксантин/ксантинооксидаза при длине волны 560 нм и температуре 25оС [Misra, Fridovich, 1972;
Шалабодов, Гусева, 2001].
Количество белка в полученных образцах определяли по методу Лоури, использующему биуретовую реакцию на пептидные связи и реакцию Фолина (на тирозин и триптофан) [Практикум по биохимии МГУ, 1989].
Fe2+-индуцированная ХЛ суммарной фракции липопротеинов низкой и очень низкой плотности сыворотки крови пациентов и здоровых доноров, оценивалась стандартными методами с определением тех же кинетических параметров, указанных выше для экспериментальной части работы.
Статистические методы исследования При проведении мутационного (полиморфного) ДНК-анализа рассчитывался показатель равновесия Харди–Вайнберга для оценки ожидаемости распределения аллелей у пациентов и в группе контроля. Для оценки ассоциаций между генотипами и клиническими характеристиками использовались методы непараметрической ранговой корреляции Спирмена.
Общий статистический анализ данных проводился с использованием пакета прикладных программ «Statistica 5.0». В случае нормального распределения и выполнения условия равенства дисперсий для сравнения средних значений непрерывных признаков в группах использовался парный критерий Стъюдента. В случае распределений, отличных от нормальных, для сопоставления групп по количественным признакам U-критерий МаннаУитни. Для изучения динамических изменений использовался метод Вилкоксона для связанных выборок, в оценке достоверности некоторых получаемых различий по непараметрическим критериям применялись также методы Крускала–Уоллиса и Данна. Достоверными считали различия при р 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Клинико-генетический анализ болезни Паркинсона Одной из задач настоящей работы была оценка молекулярно-генетических факторов риска развития БП у больных с «классической» спорадической формой данного заболевания на территории европейской части России. При этом была поставлена двуединая задача: 1) определение частот мутаций в генах наследуемых форма первичного паркинсонизма (локусы PARK2, PARK8 и др.);
2) оценка роли полиморфных вариантов большого числа генов предрасположенности к БП.
Анализ наследуемых мутаций в генах первичного паркинсонизма Мутационный скрининг гена PRKN (локус PARK2 на хромосоме 6q25.2-27, белок паркин). Гомозиготные мутации в гене PRKN (паркин) лежат в основе развития аутосомно-рецессивного ювенильного (юношеского) паркинсонизма [Lucking et al., 2000]. В последние годы, однако, показан повышенный риск развития спорадической БП у носителей мутаций гена PRKN в гетерозиготном состоянии [Mata et al., 2004], поэтому выявление даже одной мутантной по паркину хромосомы имеет большое клиническое значение. С учетом высокой частоты структурных перестроек в гене PRKN (экзонные делеции и мультипликации) [West 2002;
Illarioshkin et al., 2003], при БП необходимо в первую очередь осуществлять скрининг пациентов на наличие гетерозиготных нарушений дозы гена.
Исследование дозы гена PRKN проведено у 337 пациентов с БП (мужчин – 153, женщин – 184). Средний возраст манифестации первых симптомов БП составил 46,4 ± 13,6 лет (от 20 до 75), средний возраст в момент обследования – 54,3 ± 14,5 лет (от 21 до 81). Все обследованные случаи БП были подразделены на две большие группы – ранние и поздние (согласно общепринятым критериям, условная граница возраста дебюта для «ранней» БП составляет 45 лет):
1) БП с ранним началом – возраст манифестации первых симптомов в данной подгруппе был от 20 до 43 лет (средний возраст начала болезни 35,5 ± 7, лет), всего 57 мужчин и 82 женщины.
2) «Классическая» БП с более поздним дебютом симптомов – от 46 до лет (54,6 ± 11,8), всего 96 мужчин и 102 женщины.
При количественном анализе гена PRKN, проведенном у 139 пациентов с ранним началом БП, нами в 15 случаях (4 мужчин и 11 женщин, 10,8% от общего числа больных с ранним началом) были выявлены различные структурные перестройки в гене паркина. В 13 случаях перестройки были гетерозиготными, а в двух – гомозиготными (таблица 2). В их числе: делеции отдельных экзонов – случая;
делеции двух либо трех примыкающих экзонов, которые могут быть в положении cis либо trans – 6 случаев;
сочетание удаленных разноэкзонных делеций – 1 случай;
дупликации отдельных экзонов – 3 случая;
сложная структурная перестройка в виде сочетания дупликации экзона с делециями двух удаленных экзонов – 1 случай. Общая частота экзонных перестроек в гене PRKN при БП молодого возраста составила 0,063 (19 хромосом из 302).
Средний возраст начала болезни у носителей мутаций PRKN в данной подгруппе составил 28,9 ± 7,5 лет, что статистически значимо ниже, чем в целом по данной группе паркинсонизма молодого возраста (35,5 ± 7,8 лет, р0,05). При сопоставлении паркин-позитивной и паркин-негативной подгрупп каких-либо других различий клиники выявлено не было. Дебют симптомов у 2 носителей гомозиготной делеции (30 и 26 лет) в целом находился в рамках средних значений возраста дебюта у носителей мутаций в гене PRKN. Также не выявлено отличий клинического фенотипа у пациентов – носителей дупликаций экзонов в гене PRKN.
В подгруппе БП с поздним началом, включавшей 198 пациентов, структурные перестройки гена PRKN были выявлены нами у 7 больных – т.е. в 3,5% случаев болезни с дебютом симптомов после 45 лет (таблица 3). Все мутации были гетерозиготными экзонными делециями. В их числе: делеции отдельных экзонов – 3 случая и делеции двух-трех примыкающих экзонов – 4 случая.
Таблица 2. Выявленные структурные перестройки в гене PRKN у пациентов с ранней болезнью Паркинсона.
Возраст Экзоны гена PRKN дебюта симптомов 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 (годы) Таблица 3. Выявленные структурные перестройки в гене PRKN у пациентов с поздней болезнью Паркинсона.
Возраст Экзоны гена PRKN дебюта симптомов 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 (годы) Примечание гетерозиготная делеция (для таблиц 2 и 3):
гомозиготная делеция гетерозиготная дупликация Средний возраст манифестации болезни у носителей мутаций PRKN из группы с поздним началом БП составил 58,6 ± 6,0 лет, что достоверно не отличалось от показателей в общей группе поздней БП (54,6 ± 11,8). Как и для ранней БП, в группе поздней БП не выявлено каких-либо особенностей фенотипа болезни у паркин-позитивных пациентов по сравнению с паркин-негативными.
Таким образом, суммарная частота выявления мутаций гена PRKN у пациентов со спорадической БП составила 6,5% (22 случая из 337). В контроле ни у кого из обследованных лиц экзонных перестроек в гене PRKN не выявлено.
Нами было проведено сопоставление клинических особенностей заболевания в паркин-позитивных и паркин-негативных случаях для общей группы БП. Единственным существенным различием между группами стал возраст манифестации заболевания – более ранний при носительстве мутаций: так, у больных с выявленными мутациями в гене PRKN возраст начала заболевания варьировал от 20 до 68 лет (средний возраст 38,4 ± 15,1 лет), а в группе больных без структурных перестроек в PRKN – от 24 до 84 лет (49,4 ± 14,2 лет) (р0,05).
Других различий между сопоставляемыми подгруппами не отмечено. Клиническая картина заболевания в обеих группах больных соответствовала изолированному леводопа-чувствительному паркинсоновскому синдрому (брадикинезия, мышечная ригидность, тремор покоя, постуральная неустойчивость), в ряде случаев сочетающемуся с дистонией и леводопа-индуцированными дискинезиями.
Интересно, что у 2 больных нами выявлена гомозиготность по мутациям в гене PRKN (см. таблицу 2), что, согласно традиционным представлениям, соответствует диагнозу аутосомно-рецессивного ювенильного паркинсонизма.
Однако у этих пациентов заболевание манифестировало не в «юношеском» возрасте, а в 30 и 26 лет. Указанное наблюдение подчеркивает ограниченность понятия «ювенильный паркинсонизм» у носителей гомозиготных мутаций PRKN и позволяет согласиться с мнением ряда авторов, предлагающих для данной формы болезни более общий термин «паркин-ассоциированный паркинсонизм».
Результаты проведенной работы, показывающие высокую частоту гетерозиготных экзонных перестроек в гене PRKN, подтверждают обсуждаемую в литературе точку зрения о патогенетической значимости паркин гаплонедостаточности для поражения базальных ганглиев больших полушарий мозга [Hilker et al., 2002;
West-2002].
Анализ мажорной мутации в гене LRRK2 (локус PARK8 на хромосоме 12p11.2, белок дардарин). Ген LRRK2 имеет большое значение в развитии БП в общей популяции [Berg et al., 2005;
Okubadejo et al., 2008]. С учетом сложной молекулярной организации гена, в большинстве работ мутационный скрининг ограничивался поиском наиболее частых (мажорных) мутаций, которые обусловливают основную часть известных мутационных повреждений LRRK2.
Мажорная мутация G2019S встречается в среднем с частотой 0,410% в зависимости от наличия или отсутствия семейного анамнеза [Foroud, 2005]. Нами был предпринят поиск мутации G2019S в гене LRRK2 у 359 больных БП (169 мужчин и 190 женщин), включая 345 спорадических и 14 семейных (доминантных) случаев.
М 1 2 300 п.о.
250 п.о.
200 п.о.
Рисунок 1. Результат исследования мутации G2019S в гене LRRK2.
Длинной стрелкой указан нормальный SfcI-рестрикционный фрагмент размером 228 пар оснований (п.о.), короткой стрелкой — мутантный фрагмент 207 п.о. (мутация G2019S). M — маркер молекулярного размера;
дорожка 1 — носитель мутации G2019S в гене LRRK2 (больная Тим.С.);
дорожки 2 и 3 — норма.
При обследовании пациентов с БП в указанной выше выборке были выявлены 4 случая гетерозиготного носительства мутации G2019S в гене LRRK (рисунок 1). Три носителя G2019S не имели семейного анамнеза, а один был членом семьи Нес. с четким аутосомно-доминантным наследованием БП. Таким образом, суммарная частота данной мутации составила 1,1% в общей группе обследованных пациентов с БП, 0,9% среди больных со спорадической формой БП и 7,1% среди аутосомно-доминантных случаев заболевания. Ни у кого из лиц контрольной группы (350 клинически здоровых лиц из общей популяции) мутация G2019S в гене LRRK2 выявлена не была.
Tаблица 4. Клиническая характеристика больных с идентифицированной мутацией G2019S в гене LRRK Боль- Пол Возр. Возр. в Началь- ТП ПТ Р Б ПН Д АС КН ОПЛ ЛИД ной начала момент ный (годы) обсле- симп дова- том ния (годы) Куч. м 52 55 Д + + + + + + В.
Тим. ж 39 43 Б и ТП + + + + + + + + С.
Нес- ж 71 72 Б и ТП + + + + + + I- Нес- м 55 57 ТП и ПТ + + + + + II- Нес- ж 57 59 БиР + + + + + II- Дом. ж 28 35 ТП и Р + + + + + + + Н.
Примечание: TП – тремор покоя, ПT – постуральный тремор, Р – ригидность, Б – брадикинезия, ПН – постуральная неустойчивость, Д – дистония, АС – асимметрия симптомов в дебюте болезни, КН – когнитивные нарушения, ОПЛ – ответ на прием леводопы, ЛИД – леводопа-индуцированные дискинезии.
Клинические характеристики болезни у G2019S-позитивных пациентов представлены в таблице 4. В этот анализ нами были включены данные двоих пациентов из семьи Нес. с доминантным наследованием, ДНК которых была недоступна для анализа. Как видно из таблицы 4, у всех больных с мутацией LRRK2-G2019S развивался типичный леводопа-чувствительный паркинсонизм с асимметричным началом симптомов и вариабельной комбинацией брадикинезии, ригидности и тремора покоя. Более редкими проявлениями были постуральная неустойчивость, дистония, и леводопа-индуцированные дискинезии. Когнитивные и вегетативные расстройства у этих больных отсутствовали. У всех членов семьи Нес. выраженным и ранним симптомом болезни был постуральный тремор.
Обращают на себя внимание различия между поколениями значений возраста начала болезни у членов этой семьи – носителей мутации LRRK2-G2019S: если у матери (I-2) болезнь началась в 71 год, то у ее детей (II-2 и II-3) возраст начала болезни был существенно моложе – соответственно, 55 и 57 лет.
Среди обследованных пациентов нами впервые был выявлен уникальный случай сочетания 2 мутаций в самостоятельных генах паркинсонизма (PRKN + LRRK2) у больной со спорадической формой БП: 1) дупликация 5-го экзона PRRN;
2) мутация G2019S в гене LRRK2. Яркой фенотипической особенностью данного случая двойной гетерозиготности явились раннее начало болезни (39 лет) и чрезвычайно резко выраженные хореобаллические леводопа-индуцированные дискинезии пика дозы. Можно предположить, что наличие 2 мутаций в разных генах явилось фактором, утяжеляющим течение болезни. Аддитивный эффект нескольких локусов с точки зрения их влияния на тяжесть клинических проявлений БП ранее был показан и для некоторых генов предрасположенности – CYP2D (цитохромоксидаза), PON1 (параоксоназа-1) и др. [Djuric et al., 2004].
Как видно в таблице 4, для носителей мутации LRRK2-G2019S характерна выраженная вариабельность возраста начала болезни (от 39 to 71 года). Для объяснения такой вариабельности нами был протестирован ген АроЕ – модификатор течения нейродегенеративных заболеваний [Rubinsztein et al., 1994].
В обследуемой семье все больные, независимо от возраста дебюта, явились носителями одного и того же наиболее частого в популяции генотипа АроЕ – 3/3.
Таблица 5. Анализ гаплотипов в локусе PARK8 у носителей мутации G2019S в гене LRRK2.
Маркер Частый европейский Больной Куч. Больной Тим. Больной Нес-II гаплотип В. С. (Kachergus et al., 2005) rs7966550 T T T T D12S2516 254 254 254 rs1427263 A A A C rs11176013 G G G G/A rs11564148 A A T/A T/A D12S2518 154 154 154 Для оценки происхождения мутации LRRK2-G2019S у российских пациентов с БП нами в 3 случаях проведена реконструкция гаплотипов, охватывающих 6 ДНК-маркеров в локусе PARK8 Результаты реконструкции гаплотипов представлены в таблице 5. В результате было установлено, что пациента являются носителями одного и того же описанного в Европе G2019S сцепленного гаплотипа [Kachergus et al., 2005], тогда как третий больной Нес-II- имеет другой гаплотип, четко различающийся по маркеру rs1427263. Наши результаты свидетельствуют о возможности повторных мутационных событий и существовании «горячей точки» мутаций в кодоне 2019 гена LRRK2. Следует отметить, что совсем недавно к похожему выводу пришли и A.Orr-Urtreger с соавт.
(2007), которые обнаружили, что общий «европейский» гаплотип отсутствует у 3% больных – носителей мутации LRRK2-G2019S в Израиле.
Анализ мультипликаций гена SNCA (локус PARK1 на хромосоме 4q21, белок -синуклеин). С учетом значительной редкости точковых мутаций в гене SNCA [Kruger et al., 1998;
Zarranz et al., 2004] и имеющихся данных об их отсутствии в российской популяции [Illarioshkin et al., 2000], в настоящей работе основной целью был анализ дозы гена SNCA, мультипликации которого были ранее выявлены в части семейных случаев БП и болезни диффузных телец Леви [Singleton et al., 2003;
Farrer M. et al., 2004]. Количественный анализ гена SNCA был проведен у 53 больных БП (мужчин – 20, женщин – 33) из 40 семей с достоверным или предположительным аутосомно-доминантным типом наследования. Средний возраст обследованных на ген SNCA больных БП составил 56,2 ± 16,7 лет (от 21 до 84 лет), средний возраст начала болезни – 47,6 ± 15,0 лет (от 20 до 73 лет).
Для всех трех анализируемых экзонов гена SNCA были получены значения коэффициента -синуклеин/-глобин, лежащие в диапазоне от 0,7 до 1,3, что говорит об отсутствии делеций и дупликаций гена SNCA в исследуемой выборке.
Эти результаты согласуются с данными других авторов [Hope et al., 2004;
Johnson et al., 2004;
Wang et al., 2008] и свидетельствуют о том, что для России, как и для большинства других популяций мира, первичные синуклеинопатии не типичны.
Анализ мажорных мутаций в гене GBA (локус на хромосоме 1q21, белок глюкоцереброзидаза). Аутосомно-рецессивные мутации гена GBA сопровождаются развитием известной лизосомной болезни накопления – болезни Гоше, а гетерозиготные мутации в ряде изученных ранее популяций могут рассматриваться в качестве фактора риска БП [Sidranskу, 2004;
Маta-2008]. Мутационный скрининг на носительство 5 мажорных мутаций в гене GBA был проведен нами у больных БП (мужчин и женщин – по 51) в возрасте от 21 до 70 лет (43,6 ± 12,2 лет), возраст начала болезни от 20 до 65 лет (34,8 ± 12,2 лет).
В результате мутационного скрининга были выявлены 4 больных, являющихся гетерозиготными носителями мутаций в гене GBA: у двоих не связанных родством пациентов выявлена мутация L444P в 10-м экзоне гена GBA, а еще у двоих неродственных больных – мутация N370F в 9-м экзоне гена. Все случаи болезни – спорадические. В контрольной выборке клинически здоровых лиц мутации в гене GBA выявлены не были. Проведенный анализ не выявил каких либо особенностей фенотипа БП у носителей мутаций в гене GBA: во всех случаях имел место леводопа-чувствительный синдром паркинсонизма, дебютировавший в 23, 32, 38 и 44 лет. Общая частота выявления мутаций в гене GBA в спорадических случаях БП в обследованной нами популяции составила 3,9%.
Один пациент с БП оказался гетерозиготным носителем мутаций в двух самостоятельных исследованных генах паркинсонизма – PRKN (делеция 4-го экзона) и GBA (L444P). В данном случае двойной гетерозиготности особенностью фенотипа было раннее начало болезни (32 года) и сочетание леводопа чувствительного паркинсонизма с дистонией.
Таким образом, как и в популяциях США, Канады, ряда европейских стран, у больных БП славянского этнического происхождения из европейской части России мутации гена GBA являются значимым фактором риска спорадической БП.
Идентификация мутаций в генах LRRK2, PRKN и других генах первичного паркинсонизма у лиц, не имеющих семейного анамнеза, принципиально меняет подходы к медико-генетическому консультированию и профилактике повторных случаев заболевания среди родственников из группы риска. В таких семьях, в частности, становится возможной пренатальная и пресимптоматическая диагностика носительства мутации, что в будущем, при внедрении в практику эффективных методов нейропротекции, может позволить своевременно реализовать стратегию превентивной терапии с целью предотвращения заболевания или отсрочивания времени его наступления.
Оценка роли полиморфизмов генов нейротрансмиссии в формировании генетической предрасположенности к болезни Паркинсона Анализ предрасположенности к БП проводился с помощью исследования ассоциаций заболевания с 50 однонуклеотидными полиморфизмами (SNP) в генах нейротрансмиттеров, которые могут быть вовлечены в патологический процесс при БП (см. выше, таб. 1). Всего исследовано 97 пациентов со спорадической формой БП (мужчин 36, женщин 61, средний возраст 60,1 ± 12, лет). В отобранную группу больных не включались пациенты с мутациями в генах PRKN и LRRK2. С целью более детального анализа все больные были подразделены на 2 подгруппы: 1) с преобладанием тремора (n=61);
2) с преобладанием мышечной ригидности (n=36). Контрольную группу составили 100 здоровых не родственных лиц, соответствующих по полу, возрасту и этнической принадлежности обследованной группе больных БП. В контроле распределение генотипов для всех полиморфизмов соответствовало равновесию Харди–Вайнберга.
Таблица 6. Распределение частот аллелей и генотипов у пациентов с БП и в группе контроля для ассоциированных генов.
Референсный Аллели и Контроль Больные БП Р номер SNP генотипы N (%) N (%) Ген HTR2A G 135 (67,5) 113 (58) A rs6311 65 (32,5) 81 (42) GG 46 (46) 31 (32) 0, GA 43 (43) 51 (53) AA 11 (11) 15 (15) Ген WFS 173 (86,5) C 147 (76) 27 (13,5) rs1801211 T 47 (24) 73 (73) CC 52 (54) 0, 27 (23) CT 43 (44) 0 (0) TT 2 (2) Ген POMC 197 (98,5) C 180 (93) 3 (1,5) T 14 (7) 98 (98) CC 88 (91) 0, rs 1 (1) CT 4 (4) 1 (1) TT 5 (5) 194 (99) C 176 (92) 2 (1) T 16 (8) 96 (98) rs2071345 CC 88 (91) 0, 2 (2) CT 2 (2) 0 (0) TT 7 (7) В работе установлено, что для 4 SNP-сайтов из 3 генов имеют место выраженные различия частот аллелей и генотипов между БП и контролем (таблица 6). Ассоциация выявлена между БП и одним из 3 полиморфизмов гена HTR2A (cеротониновый рецептор 2A): –1438A аллель полиморфного маркера rs встречается при БП статистически значимо чаще, чем в контроле (P=0,04). Еще одна ассоциация была выявлена для одного из 6 исследованных полиморфизмов гена WFS1 – маркера rs1801211 из 8-го экзона: установлено, что аллель 1645T значимо чаще имеет место у пациентов с БП по сравнению с контролем (P=0,007).
Среди трех исследованных полиморфизмов гена РОМС (проопиомеланокортин) два полиморфизма из 3-го экзона – C282T (rs28930368) и C585T (rs2071345) – показали значимую ассоциацию с БП по распределению аллелей и генотипов (P=0,03, см. таб. 6). Значительно повышенная частота редкого аллеля Т и гомозиготного генотипа ТТ наблюдалась в группе больных БП для обоих полиморфизмов. Указанные SNP находятся почти в полном неравновесном сцеплении друг с другом (парный D=0,94, r2=0,83). При проведенном анализе гаплотипов по данным двум тесно сцепленным маркерам нами суммарно были выявлены 4 гаплотипа, при этом «ядерный» гаплотип СС был статистически значимо превалирующим в контрольной группе (P=0,002), тогда как гаплотип ТТ был значимо более частым в группе пациентов с БП (P=0,002). Анализ третьего полиморфизма в гене РОМС – C866T (rs1042571) – показал превалирование гомозиготности по С-аллелю в группе больных (64% vs. 57% в контроле), однако это различие не достигало уровня статистической значимости (P=0,31). Данный полиморфизм не находится в неравновесном сцеплении с двумя предыдущими.
Таблица 7. Распределение комбинированных POMC-генотипов rs и rs2071345 у пациентов с различными формами БП.
Клинические формы БП Преобладание Преобладание Полиморфизм Генотип мышечной тремора ригидности N (%) N (%) 60 (68) 28 (32) CC rs (C282T) 2 (22) 7 (78) CT+TT 60 (68) 28 (32) rs2071345 CC (C585T) 2 (22) 7 (78) CT+TT Нами также оценено возможное комбинированное влияние двух «неблагоприятных» Т-аллелей указанных выше полиморфизмов C282T (rs28930368) и C585T (rs2071345) гена РОМС на развитие БП. С этой целью мы сгруппировали всех гетерозигот и гомозигот по Т-аллелям обоих SNP в единый генотип и изучили корреляции между группами комбинированных генотипов, возрастом начала болезни и клинической формой БП. Для обоих полиморфизмов были обнаружены идентичные корреляции между формой болезни и комбинированным генотипом (гамма-корреляция: Гамма=0,5787, Z=2,8532, P=0,0043 для C282T и Гамма=0,5893, Z=2,8967, P=0,0038 для C585Т). У больных с преобладанием мышечной ригидности имело место значимое повышение частоты комбинированного генотипа CT+TT (для обоих полиморфизмов), тогда как у пациентов с преобладанием тремора – гомозиготного СС-генотипа (таблица 7).
Функциональное значение выявленных ассоциаций требует отдельного анализа. Ген HTR2A имеет отношение к обмену серотонина, состояние которого играет большую роль в функционировании экстрапирамидной системы за счет модуляции высвобождения дофамина в нигростриарных терминалях [Galloway et al., 1993;
Ng et al., 1999]. В нейрохимических исследованиях установлено снижение концентрации серотонина в стриатуме, коре и цереброспинальной жидкости у больных БП [D’Amato et al., 1987]. Установленная нами в российской выборке пациентов ассоциация БП с полиморфизмом –1438A гена HTR2A подтверждает патогенетическую связь данного заболевания и серотониновой системы. Белковый продукт гена WFS1, вольфрамин, является мембранным гликопротеином эндоплазматического ретикулума и предположительно участвует в формировании синаптических везикул [Takeda et al., 2001]. Как показывают данные литературы и результаты настоящего исследования, дефекты гена WFS1 могут быть вовлечены в селективную дегенерацию различных нейронов, включая дофаминергические.
Полученные нами данные свидетельствуют, что ген РОМС играет роль в патогенезе спорадической БП и предположительно является модификатором, в определенной степени ответственным за фенотипическую вариабельность БП в изученной популяции. Белок РОМС (проопиомеланокортин) – прекурсор -меланотропин.
регуляторных пептидов, включая АКТГ и Предыдущие исследования показали, что синтетический аналог АКТГ(410) может повышать экспрессию мРНК мозгового нейротрофического фактора (BDGF) в первичных глиальных клетках мозга новорожденных крыс, а -меланотропин может повышать экспрессию мРНК BDGF в нейронах среднего мозга крыс [Shadrina et al., 2001;
Dolotov et al., 2003]. Известно также, что РОМС как нейропептид ответствен за пролиферацию, дифференцировку и выживание нейронов. Эти данные объясняют выявленную ассоциацию между полиморфизмами гена РОМС и БП.
Результаты проведенного исследования хорошо иллюстрируют растущую роль молекулярно-генетического подхода в понимании закономерностей развития БП, причем не только ее семейных форм, но и наиболее распространенных в популяции спорадических случаев заболевания.
2. Новые подходы к моделированию паркинсонизма в эксперименте и возможности антиоксидантной терапии Объектом настоящего исследования при разработке новой экспериментальной модели паркинсонизма стали мыши линии SAMP1 (Senescence Accelerated Mice, Prone), характеризующиеся ускоренными темпами накопления старческих признаков и значительно меньшей продолжительностью жизни (1,5– года по сравнению с 3–3,5 годами у животных исходной линии) [Takeda et al., 1994]. Эта модель, по нашему мнению, значительно точнее других моделей воспроизводит «контекст» возрастных изменений мозга, имеющих место при БП.
Морфофизиологические и биохимические особенности мышей SAMP Морфологическая и физиологическая характеристика. До 4-месячного возраста мыши линии SAMP1 по поведению и морфологическим характеристикам практически не отличаются от животных контрольной линии SAMR1 (Senescence Accelerated Mice, Resistant). При оценке в 8 мес. практически по всем показателям мыши линии SAMP1 значительно опережали свой биологический возраст. У них проявляются нарушения поведенческих реакций (аномальная подвижность, пассивное избегание) и когнитивных функций (уменьшении способности к ориентации и запоминанию), отмечается снижение веса тела. Характерно появление «старческих» морфологических изменений – потеря волос, отсутствие их блеска, шероховатость и язвы на коже, воспаление слизистой оболочки глаз и носа, изъязвление роговицы, искривление позвоночника.
Особенности биохимических процессов у мышей линии SAMP1. Как представлено на рисунке 2, активность МАО-В у мышей линии SAMP1 в возрасте 8 мес. оказалась почти в 2 раза выше, а активность СОД существенно ниже, чем у мышей контрольной линии SAMR1.
145 * 160 140 нмоль/мг белка в час нмоль/мг белка в час 80 30 * 0 SAMR1 SAMP1 SAMR1 SAMP А Б Рисунок 2. Активность МАО-В (а) и СОД (б) в митохондриальной фракции мозга 8-месячных мышей исследуемых линий.
Характеристика окислительного стресса, оцениваемая по ХЛ-тесту, в тканях мозга животных линии SAMP1 и контрольной линии SAMR1 представлена в таблице 8. В мозге быстростареющих мышей наблюдается повышенный уровень липидных гидроперекисей по сравнению с контрольными животными, а суммарная активность эндогенной антиоксидантной защиты у мышей SAMP1 значительно снижена относительно контроля. Эти данные свидетельствуют о развитии в мозге мышей с ускоренным старением окислительного стресса, обусловленного повышенной продукцией АФК.
Таблица 8. Характеристика окислительного стресса в мозге мышей линий SAM, регистрируемого по параметрам Fe2+-индуцированной ХЛ.
Параметры Fe2+-индуцированной хемилюминесценции Животные Гидроперекиси Скорость Резистентность к в возрасте липидов окисления окислению 8 месяцев (h, мВ) (V, отн. ед.) (, с) 84,0 ± 9,1 177,0 ± 5,7 1,1 ± 0, SAMR 1,24 ± 0, SAMP1 115,0 ± 6,0* 130,0 ± 9,0* Примечание: * р0,05.
Нейродегенеративные изменения, индуцированные введением нейротоксина МРТР быстростареющим мышам Биохимические изменения в мозге, индуцированные МРТР. Введение МРТР приводило к дальнейшему снижению уровня дофамина в стриатуме у животных линии SAMR1 (таблица 9). Уровень норадреналина в мозге исследуемых животных (быстростареющих и контрольных) также снижается при введении МРТР. Соотношение норадреналина к дофамину в стриарной области мозга после воздействия МРТР снижается как у быстростареющих, так и у контрольных мышей, причем у первых более значительно.
Таблица 9. Изменение уровня катехоламинов в стриатуме 8-месячных мышей линий SAMR1 и SAMP1 под действием МРТР.
Группы Дофамин, Норадреналин, Норадреналин/ животных Дофамин нмоль/г ткани нмоль/г ткани SAMR1 0,27±0,20 2,5±0,44 9, SAMR1+MPTP 0,052±0,07* 0,31 ±0,1* 5, SAMP1 0,021 ±0,01# 1,8±0,50# 85,71# SAMP1+MPTP 0,07±0,03 0,33±0,1* 4,71* Примечание: р0,05 характеризует достоверные различия по отношению к животным этой же линии, получавшим физиологический раствор (*), или к животным линии SAMR1 (#).
Активность МАО-В после введения МРТР возрастала у животных SAMP с 129,0±3,0 до 150,0±4,1 нмоль/мг белка, в то время как у устойчивых мышей линии SAMR1 не было отмечено повышения активности этого фермента (85,1±2, и 80,5±2,6 нмоль/мг белка для контроля и опыта, соответственно). Активность СОД после введения МРТР преимущественно снижалась в мозге животных контрольной линии (с 99,0±1,0 ед/мг белка в час до 45,0±2,0 ед/мг белка в час) и оставалась в мозге SAMP1 практически такой же низкой, как и без введения МРТР (35,7±0,7 и 40,5±1,5 ед/мг белка в час, соответственно).
Результаты количественной оценки окислительного стресса в мозге животных на фоне введения МРТР представлены в таблице 10. У мышей контрольной линии SAMR1 МРТР не изменяет уровень предобразованных гидроперекисей и скорость окисления, что, по-видимому, связано с наличием у этих животных мощной антиоксидантной системы, предотвращающей образование окисленных продуктов. В то же время, после введения МРТР животным SAMP выраженный окислительный стресс у них проявлялся существенным повышением уровня преобразованных липидных гидроперекисей в мозге, укорочением латентного периода индуцированного окисления (свидетельствующего об устойчивости мембран мозга к окислению) и возрастанием в 2 раза скорости окисления мембранных липидов.
Таблица 10. Окисляемость мембран мозга 8-месячных животных линий SAMR1 и SAMP1 в норме и после введения МРТР.
Группы Гидроперекиси Резистентность к Скорость Суммарная животных липидов окислению окисления окисляемость (h, мВ) (, с) (V, отн. ед.) (Н, мВ) SAMR1 99,5±19,1 177,0±5,7 1,24±0,13 2612± SAMR1 88,7±4,2 140,0±8,0# 1,30±0,11 1849± +МРТР SAMP1 115,0±10,6 130,0±9,7* 1,10±0,14 2076±25* SAMP1 127,0±15,3# 115,0±2,5 # 2,03±0,30# 2162±10* +МРТР Примечание: * достоверное различие (р0,05) между группами SAMP1 и SAMR1, # достоверное различие (р0,05) между группами, получавшими МРТР и соответствующим контролем.
Для оценки влияния МРТР на состояние белков клетки мы исследовали уровень карбонильных групп в белках, которые возникают при окислительной модификации аминогрупп белковых молекул. Уровень окисленных белков, измеренный в митохондриальной фракции и в гомогенате мозга мышей, до введения мышам был одинаков у животных SAMP1 (соответственно, 1,5±0,01 и 0,58±0,04 нмоль/мг белка) и SAMR1 (1,5±0,02 и 0,62±0,02 нмоль/мг белка).
Введение МРТР индуцировало накопление белковых карбонилов в обоих случаях, но этот параметр возрастал гораздо существеннее у мышей SAMP1 (3,1±0, нмоль/мг в митохондриальной фракции и 1,04 ±0,05 нмоль/мг в гомогенате мозга) по сравнению с контрольными животными SAMR1 (1,6±0,01 и 0,77±0,05 нмоль/мг белка;
р0,05 при сравнении показателей групп SAMP1 и SAMR1).
Физиологические изменения и соответствие их симптоматике паркинсонизма у мышей линии SAMP1 на фоне введения МРТР. После курсового введения МРТР как горизонтальная, так и вертикальная двигательная активность у мышей линии SAMP1 оказалась существенно снижена по сравнению с исходными значениями (рис. 3). Исследовательская активность у мышей линии SAMP1 (рис. а) была ниже, чем у мышей линии SAMR1. В то же время, у животных с ускоренным темпом старения после введения МРТР изменений исследовательской активности обнаружено не было.
60 Горизонтальная активность, сектора 53,2 10, 50 7, Количество стоек 40 34,5 * 5* 30 3,4 * 20 16 * 10 Контроль МPТP 0 SAMR1 SAMP1 SAMR1 SAMP А Б Рисунок 3. Нарушения горизонтальной (а) и вертикальной (б) двигательной активности, вызванные введением мышам исследуемых линий нейротоксина МРТР.
Примечание: * р0,05 по отношению к исходному измерению.
Одновременно с этим на фоне введения МРТР наблюдалось существенное увеличение мышечной ригидности у животных линии SAMP1 (рис. 4 б). У мышей линии SAMR1 в ответ на введение МРТР ригидность не развивалась.
Таким образом, животные линии SAMP1 характеризовались значительно большей чувствительностью к нейротоксину МРТР по сравнению с контролем, что проявлялось усилением проявлений окислительного стресса, нарастанием дисбаланса катехоламинов, нарастанием уровня окисленных белков и нарушениями выполнения двигательных и физиологических тестов, свидетельствующими об МРТР-индуцированном повреждении в области черной субстанции и дофаминергической системы мозга.
12 10,8 6, 6,2 9, Количество “норок” 4,9 * Длина, см 4,4 4, 2 Контроль МPТP 0 SAMR1 SAMP1 SAMR1 SAMP А Б Рисунок 4. А. Исследовательская активность мышей линии SAMP1 и SAMR1 до и после введения МРТР. Б. Развитие ригидности, вызванной введением МРТР мышам исследуемых линий.
Примечание: * р0,05 по отношению к исходному измерению.
Влияние карнозина на физиологические и биохимические проявления паркинсонизма, вызванного введением МРТР мышам линии SAM В настоящей работе возможности снижения токсического действия МРТР и коррекции дефицита антиоксидантной защиты у животных линии SAM с экспериментальным паркинсонизмом были исследованы применительно к природному нейропептиду карнозину, характеризующемуся широким спектром нейропротективных эффектов [Болдырев, 1998;
Boldyrev, 2001;
2007]. Карнозин вводили животным одновременно с МРТР.
Влияние карнозина на физиологические характеристики животных. Как видно на рисунке 5, карнозин практически полностью препятствовал угнетению горизонтальной и вертикальной двигательной активности у быстростареющих мышей линии SAMP1 на фоне введения нейротоксина МРТР. Исследовательская активность, исходно низкая у мышей линии SAMP1, после введения МРТР и карнозина не претерпела существенной динамики.
60 20 18,8 Контроль 53, Горизонтальная активность, сектора 48 МPТP 43,4 34,5* Количество стоек 10, 30 * 7, 7, 20 16 * 3,4* 0 SAMR SAMP SAMP+карнозин SAMR SAMP SAMP+карнозин А Б Рисунок 5. Влияние карнозина на развитие нарушений горизонтальной (а) и вертикальной (б) двигательной активности, вызванных введением мышам исследуемых линий нейротоксина МРТР.
Примечание: * р0,05 по отношению к исходному измерению.
Как видно на рисунке 6, карнозин существенно (до уровня контрольных значений) препятствовал развитию ригидности у мышей линии SAMP1 на фоне введения нейротоксина МРТР.
6,5 6,4 Контроль 6, 6,2 МPТP 4,9 * Длина, см SAMR SAMP SAMP+карнозин Рисунок 6. Влияние карнозина на ригидность, вызванную введением МРТР мышам исследуемых линий.
Примечание: * р0,05 по отношению к исходному измерению.
Влияние карнозина на биохимические характеристики животных. Как видно в таблице 11, при сочетанном введении МРТР и карнозина предотвращается МРТР-индуцированное подавление активности СОД (активность фермента сохраняется на уровне контрольных значений). Повышение активности МАО-В, индуцируемое введением животным МРТР, также существенно нивелируется сочетанным применением карнозина.
Таблица 11. Влияние карнозина на изменение активности МАО-В и СОД в митохондриях серого вещества мозга мышей линии SAMP МАО-В, СОД, Группа животных нмоль/мг белка в час ед/мг белка Контроль (физ. раствор) 130 ± 6 66,6 ± 156 ± 9* 50 ± 5* Введение МРТР Введение карнозина 79 ± 5** 58,1 ± и МРТР Примечание: * р0,05 при сопоставлении исследуемой группы с контролем;
** достоверность различий между группой животных, которым вводился только МРТР, и группой МРТР + карнозин.
Параметры Fe2+-индуцируемой ХЛ мембран мозга мышей Таблица 12.
линии SAMP1, содержащихся в различных условиях.
Группы Гидроперекиси Резистентность к липидов (мВ) окислению (с) животных 115 ± 2,5 * 127,0 ± 15,3 * SAMP + MPTP SAMP + MPTP + 123,0 ± 11,0** 75,0 ± 5,3** + карнозин 126 ± 5, 95,0 ± 7, SAMP + физ. раствор Примечание. Достоверность различий: * по сравнению с контролем (SAMP + физиологический раствор), ** по сравнению с животными, получавшими МРТР (SAMP + MPTP).
Карнозин оказывал положительное влияние и на количественные характеристики окислительного стресса в митохондриальной фракции мозга (таблица 12). Уровень липидных гидроперекисей под действием карнозина нормализовывался, одновременно карнозин способствовал повышению резистентности липидов к окислению, снижающейся под действием МРТР, до контрольных величин. Карнозин также предотвращал МРТР-индуцированное увеличение концентрации карбонильных групп белков в митохондриях мозга.
Таким образом, карнозин при сочетанном применении с МРТР эффективно восстанавливает двигательные параметры экспериментальных животных и препятствовует развитию в мозге мышей SAMP1 окислительного стресса, который является важным патогенетическим фактором развития паркинсонизма. Эффект карнозина может, по-видимому, опосредоваться несколькими механизмами, включая как взаимодействие с радикальными продуктами, так и активацию супероксид-перехватывающей активности и подавление МАО-B. Поскольку карнозин является природным компонентом нервной ткани, можно ожидать, что он не будет вызывать побочных эффектов даже при длительном применении. Все это экспериментально обосновывает возможность использования карнозина в качестве препарата, влияющего на динамику нейродегенеративных изменений в условиях окислительного повреждения мозга.
3. Оценка эффективности антиоксидантной терапии болезни Паркинсона Одним из ключевых молекулярных механизмов нейродегенерации при БП является поражение митохондрий, сопровождающееся нарушением клеточной энергетики и развитием окислительного стресса в нигростриарных нейронах [Иллариошкин, 2008;
Thomas, Beal, 2007]. В связи с этим особое значение имеет внедрение в практику методов нейропротекции при БП на основе применения современных антиоксидантов с различными механизмами действия. В настоящей работе нами на основании анализа совокупности клинических и лабораторно биохимических показателей, характеризующих эндогенный антиоксидантный статус пациентов с БП, была оценена эффективность двух новых препаратов с антиоксидантным действием – карнозина и мексиданта.
Результат применения карнозина при болезни Паркинсона В исследование были включены 36 больных с дрожательно-ригидной и дрожательной формами БП (женщин – 16, мужчин – 20) в возрасте от 46 до 68 лет (средний возраст 53,7±15,2 лет). Обязательным условием включения было информированное согласие больного;
разрешение на применение карнозина в целях настоящего исследования у пациентов с БП было дано локальным этическим комитетом НЦН РАМН. Пациенты находились на лечении леводопа-содержащими препаратами (мадопар, наком), агонистами дофаминовых рецепторов (проноран, мирапекс) и амантадинами, дозы которых подбирались индивидуально в зависимости от состояния пациентов и тяжести клинической симптоматики.
Все больные были разделены на 2 группы, сопоставимые по возрасту, длительности заболевания и выраженности симптомов. В группу 1 входили пациентов, получавших базисную терапию. При поступлении в стационар этим пациентам оказывался только стандартный объем специализированной помощи (коррекция дозировок и форм леводопы и агонистов дофаминовых рецепторов, проведение курсов баланс-тренинга на стабилометрической платформе, специализированной лечебной физкультуры и т.д.). В группу 2 входили пациентов, получавших базисную терапию в сочетании с карнозином.
Продолжительность лечения составила 30 дней. Обследование проводилось на 1-м визите и через 30 дней после начала терапии – либо только базисной, либо базисной в сочетании с карнозином. Суммарная суточная доза карнозина (в составе биологически активной добавки - севитина, производство «Медтехника, Россия) составляла 1,5 г в 3 приема. Группа контроля включала практически здоровых лиц сопоставимого возраста.
Таблица 13. Окислительный статус обследованных пациентов с БП.
Показатели Норма Больные БП Активность МАО-В (нмоль бензиламина/мг белка) 73,0 ± 7,0 49,8 ± 3,0** Активность Cu/Zn-СОД (ед/мг гемоглобина) 3,2 ± 0,4 2,98 ± 0, Гидроперекиси (h, мВ) 111 ± 6 107 ± Параметры Fe2+ индуцированной Лаг-период (, с) 78,0 ± 4,3 42,4 ± 15* хемилюминесценции Суммарная липопротеинов плазмы 923 ± 100 1076 ± окисляемость (Н, мВ) крови Скорость (V, отн. ед.) 2,18 ± 0,42 2,75 ± 0,42** Примечание: * р=0,05;
** р=0,02 (различия по сравнению с контролем).
Исходное состояние окислительного статуса у больных БП. Исходный биохимический статус пациентов с БП, оцененный до начала специфической антиоксидантной терапии (таблица 13), характеризовался статистически значимым (вдвое) снижением резистентности к индуцированному окислению липопротеинов, значимым повышением скорости окислительных повреждений липопротеинов плазмы крови, тенденцией к повышению суммарной окисляемости липопротеинов плазмы крови, статистически значимым снижением активности МАО-В и тенденцией к снижению активности СОД в эритроцитах. Полученные данные демонстрируют наличие значительных, комплексных нарушений антиоксидантного статуса организма и снижении его устойчивости к окислительному стрессу при БП, что в целом соответствует изменениям, выявляемым в мозге экспериментальных мышей линии SAMP1 с МРТР индуцированным паркинсонизмом (см. выше).
Динамика клинических показателей на фоне лечения. В общей выборке обследованных больных средняя выраженность неврологической симптоматики по шкале UPDRS исходно составила в среднем 39 баллов (40,8±14,6 в группе 1 и 37,3±15,0 в группе 2). Через 30 дней лечения в обеих группах пациентов произошло достоверное уменьшение степени выраженности неврологической симптоматики.
Так, в группе 1 (базисная терапия) зарегистрировано уменьшение выраженности клинической симптоматики на 20,3% – конечный суммарный балл по шкале UPDRS составил 32,5±12,0 (p=0,05). В группе 2 у больных, получавших карнозин в дополнение к базисной терапии, симптоматика к окончанию курса лечения уменьшилась на 33,2% конечный суммарный балл по шкале UPDRS составил 24,9±8,1 (p=0,01). Различие между группами больных было статистически значимо (р=0,02). Таким образом, введение карнозина в схему лечения способствовало усилению позитивной клинической динамики, достигнутой на фоне противопаркинсонической терапии.
В результате проведенного лечения у больных обеих групп отмечалось улучшение двигательной активности, более выраженное на фоне карнозина (в группе 1 – на 24,4%, в группе 2 – на 32,0%). Достигнутое улучшение проявлялось также в уменьшении одного из наиболее значимых клинических проявлений паркинсонизма гипокинезии, выявляемой тестами «пронация-супинация», «движения в стопе», «движение кистей рук» (рисунок 7). У пациентов обеих групп отмечалось снижение других двигательных проявлений паркинсонизма – ригидности (выявляемой в верхних и нижних конечностях) и тремора, причем применение карнозина способствовало более выраженному улучшению моторики.
движения в p=0, стопе пронация- p=0, супинация движения p=0, кистей рук ригидность в p=0, нижних конечностях ригидность в верхних p=0, конечностях 0 0.5 1 1.5 2 2. баллы Рисунок 7. Динамика отдельных симптомов на фоне лечения карнозином.
Серые столбики – группа 2;
черные – группа 1;
указана значимость различий по отношению к группе больных, не получавших карнозина (значимые различия выделены жирным шрифтом).
Субъективная оценка эффективности лечения, определяемая по тесту «повседневная активность», также выявила преимущества карнозина: при базисной терапии происходило улучшение повседневной активности на 16%, а в группе с карнозином – на 30%, что сопровождалось улучшением самообслуживания.
Следует отметить, что для карнозина была выявлена хорошая переносимость и отсутствие побочных эффектов.
Оценка окислительного статуса пациентов. Как видно в таблице 14, базисная терапия приводит к некоторому (на 10%) повышению активности МАО В, и добавление карнозина не изменяет этого параметра. Активность Zn/Cu-СОД на фоне базисной терапии статистически незначимо понижалась, тогда как при дополнительном приеме карнозина отмечено статистически значимое (p=0,035) повышение активности СОД относительно исходных величин.
Таблица 14. Динамика активности МАО-В и СОД у пациентов с БП на фоне лечения карнозином.
МАО-В Cu/Zn-СОД Группы (нмоль бензиламина/мг белка) (ед/мг гемоглобина) пациентов До лечения 49,8 ± 3,0 3,0 ± 0, Базисная терапия 58,9 ± 4,2 2,7 ± 0, Базисная терапия + 57,1 ± 3,5 3,4 ± 0,1* карнозин Примечание: * р=0,05 (различия до и после лечения).
изменение клинической симптоматики, баллы 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0. изменение активности СОД, ед/мг гемоглобина Рисунок 8. Зависимость между динамикой неврологической симптоматикой и изменением активности Cu/Zn-СОД (r = 0,52;
p = 0,07).
При сопоставлении активации СОД с динамикой выраженности неврологической симптоматики между этими параметрами была выявлена отчетливая положительная корреляция (r = 0,52, р=0,07) (рисунок 8). Более того, во всей группе пациентов с БП была установлена прямая зависимость между активностью СОД до лечения и степенью изменения клинической симптоматики на фоне терапии (r = 0,26). Можно предположить, что чем меньше начальное значение СОД, ниже тяжесть заболевания и больше возможности активировать антиоксидантную защиту, тем более выражен эффект терапии заболевания в результате торможения окислительных процессов, сопровождающих БП.
Таблица 15. Динамика параметров Fe2+-индуцированной ХЛ липопротеинов плазмы крови на фоне лечения карнозином.
Параметры Fe2+-индуцированной хемилюминесценции Гидроперекиси, Лаг-период, Скорость, Суммарная Группы пациентов отн. ед. с окисляемость, отн. ед.
отн. ед.
Норма 111 ± 6 78,0 ± 4,3 923 ± 100 2,18 ± 0, До лечения 107 ± 25 42,4 ± 15 1076 ± 215 2,75 ± 0, Базисная терапия 114 ± 30 43,9 ± 11,0 1124 ± 186 2,72 ± 0, Базисная терапия + 94 ± 18 61,4 ± 16,0* 1025±134 2,29 ± 0,45** карнозин Примечание: * р=0,015;
** р=0,001 (различия до и после лечения).
Оценка Fe2+-индуцированной ХЛ показала (таблица 15), что уровень липоперекисей плазмы крови больных БП не изменяется при базисной терапии, но статистически незначимо понижается при использовании карнозина.
Дополнительное введение в протокол лечения карнозина статистически значимо увеличивает лаг-период окисления, почти возвращая к норме резистентность к Fe2+.
ионам Скорость окислительных повреждений липопротеинов крови пациентов на фоне карнозина также статистически значимо понижается.
Результат применения мексиданта при болезни Паркинсона В данной части исследования приняли участие 49 больных с дрожательно ригидной и дрожательной формами БП (женщин – 28, мужчин – 21) в возрасте от 58 до 65 лет (средний возраст 61,7±3,8 лет). Длительность заболевания составила 6,5±3,8 лет. Как и в исследовании, посвященном карнозину, больные находились на базисном лечении леводопа-содержащими препаратами, агонистами дофаминовых рецепторов и/или амантадинами.
Все пациенты были разделены на две группы методом случайной выборки, сопоставимые по полу, возрасту, длительности и тяжести заболевания. Группу составили 22 пациента, получавших базисное лечение (при поступлении – коррекция дозировок и форм леводопы и агонистов дофаминовых рецепторов, проведение курсов баланс-тренинга на стабилометрической платформе, специализированной лечебной физкультуры и т.д.). В группу 2 вошли пациентов, дополнительно получавших в течение 20 дней мексидант структурный аналог антиоксиданта мексидола (препарат изготовлен на Экспериментальном производстве медико-биологических препаратов РКНПК Минздравсоцразвития России). С 1-го по 10-й день мексидант вводили внутривенно капельно (200 мг в сутки);
в течение последующих 10 дней – внутримышечно 2 раза в сутки по 2 мл утром и вечером (200 мг в сутки).
Оцениваемые неврологические и биохимические исследования были теми же, как и при проведении терапии карнозином. Обследование проводилось до начала лечения (1-й визит) и через 20 дней (2-й визит) после начала терапии.
Динамика клинических показателей на фоне лечения. До начала лечения пациенты обеих групп были сопоставимы по степени тяжести неврологической симптоматики: в группе больных, получавших базисную терапию, исходная тяжесть симптомов по шкале UPDRS составлял 50,1±4,7 баллов, в группе больных, получавших дополнительно к базисной терапии мексидант 44,7±3,1 баллов.
Через 20 дней лечения в обеих группах пациентов произошло достоверное (р=0,0001) снижение неврологической симптоматики, несколько более выраженное на фоне мексиданта в дополнение к базисной терапии: процент улучшения суммарного балла по шкале UPDRS у пациентов на базисной терапии составил 21,8%, а у пациентов, получавших дополнительно мексидант 26,8%.
На фоне лечения улучшение, регистрируемое по шкале «Повседневная активность», отмечалось у больных обеих групп, причем более выраженное – у пациентов, получавших мексидант. Уменьшение выраженности неврологических симптомов заболевания по шкале «Двигательные нарушения», наблюдавшееся у пациентов обеих групп в одинаковой степени, касалось снижения тремора покоя ног и постурального тремора рук. В группе пациентов, получавших мексидант, более отчетливым было улучшение по тестам «ригидность в верхних и нижних конечностях», «движение кистей рук», «движения в стопе», «чувствительные нарушения». Наиболее значимым преимуществом мексиданта явилось достоверное (р0,03) уменьшение выраженности осложнений леводопа-терапии (дискинезии и др.) относительно пациентов, получавших базовую терапию (рисунок 9).
IV - осложнения постураль.устойч.
брадикинезия чув ств ит. нарушения p=0, дв ижения в стопе пронация-супинация дв иж.кистей рук проба постук. пальц.
риг. в ниж. кон.
ригид.в в ерх. кон.
постур. трем. рук базовая трем.пок. ног терапия мексидант * трем.пок.рук 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3, Рисунок 9. Динамика отдельных симптомов на фоне лечения мексидантом.
Оценка окислительного статуса пациентов. В процессе лечения в обеих группах больных достоверных изменений активности МАО-В не наблюдалось.
Исходно низкая активность СОД на фоне мексиданта несколько возрастала, но все же продолжала оставаться пониженной по итогам терапии. Как видно в таблице 16, после лечения в группе базисной терапии уровень липидных гидроперекисей не изменяется и остается высоким, не изменяется и сниженная по сравнению с нормой резистентность липопротеинов к окислению. Введение в протокол лечения мексиданта предотвращает повышение уровня липидных гидроперекисей (р0,05) и значительно (на 42%) увеличивает резистентность липопротеинов к окислению.
Таблица 16. Динамика параметров Fe2+-индуцированной ХЛ липопротеинов плазмы крови на фоне лечения мексидантом.
Параметры Fe2+-индуцированной хемилюминесценции Лаг-период, Скорость, Гидропере- Суммарная Группы пациентов киси, отн. ед. с окисляемость, отн. ед.
отн. ед.
Норма 84,7 ± 7,4 78,0 ± 4,3 923 ± 100 2,18 ± 0, Базисная до 110,8 ± 29 44,2 ± 11,3 1096± 158 2,75± 0, терапия после 114,4 ± 30 43,9 ± 11,0 1124 ± 186 2,72 ±0, Базисная до 103,7 ± 19 40,2 ± 12,5 1098 ± 283 3,36 ± 0, терапия + 59,6 ± 16,0 *, ** после 89,6 ± 18 1111 ± 334 2,41± 0,27* мексидант Примечание: * р0,05 (достоверность отличий до и после лечения);
** р0, (достоверность отличий после лечения мексидантом относительно базовой терапии).
Таким образом, результаты клинико-биохимической части работы свидетельствуют о клинической эффективности карнозина, применяемого в сочетании с базисной терапией у пациентов с БП. Улучшение клинической симптоматики выявляется на фоне значительного улучшения антиоксидантного статуса организма. По-видимому, карнозин может оказаться перспективным соединением и при лечении других нейродегенеративных заболеваний, течение которых сопровождается развитием окислительного стресса. Нами показано также, что при БП клинически оправданным может быть включение в терапевтическую схему мексиданта, хотя в целом его эффекты при БП оказались менее выраженными, чем у карнозина (так, в частности, мексидант значимо не влиял на активность СОД и оказывал менее отчетливое клиническое действие). Наиболее перспективным оказался эффект мексиданта в отношении снижения частоты выявляемых побочных эффектов леводопа-терапии, что может способствовать повышению эффективности проводимого лечения.