Разработка и стандартизация средств растительного происхождения, обладающих адаптогенной активностью
На правах рукописи
Николаева Ирина Геннадьевна РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ СРЕДСТВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ОБЛАДАЮЩИХ АДАПТОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук
Улан-Удэ - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук Научный консультант доктор фармацевтических наук, профессор Асеева Тамара Анатольевна Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией химии природных систем ФГУН Байкальский институт природопользования СО РАН Раднаева Лариса Доржиевна доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой фармацевтической химии с курсом органической и токсикологической химии ГБОУ ВПО Алтайский медицинский университет Минздравсоцразвития России Федосеева Людмила Михайловна доктор фармацевтических наук, профессор кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии ГБОУ ВПО Башкирский медицинский университет Минздравсоцразвития России Пупыкина Кира Александровна Ведущая организация ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения и социального развития РФ
Защита состоится «23» мая 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул.
Сахьяновой,
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН
Автореферат разослан « » _2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук В.Б. Хобракова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Одной из важнейших задач фармацевтической науки на современном этапе является разработка и внедрение новых эффективных лекарственных препаратов растительного происхождения, обладающих адаптогенным свойством, повышающих устойчивость организма к действию патогенных факторов (Антонов А.К., Бочарова О.А., Белоусов А.В. и др, 2011;
Самылина И.А. и др, 2011;
Engels H.J., Said J.M. et al., 1996). По сравнению с предыдущими десятилетиями, заметно ухудшилось состояние здоровья населения России. Факторами патогенеза многих заболеваний являются стрессы различного генеза, большая информационная нагрузка, недостаток физической активности, поступление в организм техногенных токсических веществ. Изменился характер питания человека и как следствие этого отмечается недостаточное употребление натуральных продуктов, витаминов, минеральных веществ, пищевых волокон. Решение указанных проблем возможно путем развития профилактической медицины, направленной на повышение адаптации организма, сохранение и укрепление здоровья населения (Киселева Т.Л., Чаузова А.В., Карпеев А.А., 2000;
Тутельян В.А. и др, 2004). В связи с этим необходимы комплексные лечебно профилактические средства, помогающие восстановить защитные функции организма. Одним из подходов к решению этой проблемы является разработка лекарственных и профилактических средств на основе растений, восполняющих дефицит необходимых организму нутриентов, содержащих антиоксиданты, витамины, иммуномодуляторы, макро- и микроэлементы и др (Шантанова Л.Н., Дашиев Д.Б., Раднаева Д.Б. и др, 2011). Преимущества разработки и применения фитосредств очевидны и обусловлены многими достоинствами, в числе которых широкий спектр фармакологического действия, в отличие от химических лекарственных средств они оказывают мягкое действие без риска развития побочных реакций (Кукес В.Г., Булаев В.М., Колхир В.К.и др., 2000;
Сур С.В., Гриценко Э.Н., 2001). Фитосредства влияют на организм человека как корригирующая система, благодаря наличию комплекса природных веществ (Николаев С.М, 2011;
Yoon J., Ha B. et al., 2002).
Вместе с тем при внедрении новых средств необходимо решать вопросы по разработке методов стандартизации, включающих качественную и количественную оценку биологически активных веществ, а также разработку оптимальной лекарственной формы указанных средств.
Целью настоящих исследований явилось экспериментальное обоснование разработки и стандартизации фитоэкстракционных средств, обладающих адаптогенным свойством.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
- разработать научно-методические подходы к поиску и изучению растительных средств, обладающих адаптогенным действием.
- экспериментально обосновать составы многокомпонентных растительных композиций для получения фитоэкстракционных средств, обладающих адаптогенным действием;
- провести фармакогностическое исследование сырья - побегов Pentaphylloides fruticosa (L.) O. Schwarz и трех растительных композиций «Тантон», «Арура Тан №7», «Иммунофит», подтвердить наличие в них биологически активных веществ, содержащихся в исходном сырье;
установить основные анатомо-диагностические признаки сырья;
определить урожайность и сырьевую обеспеченность побегов P. fruticosa;
- разработать показатели качественной и количественной стандартизации сырья, сухого экстракта, гранул на основе P. fruticosa;
чаев и экстрактов «Тантон» и «Арура Тан №7», «Иммунофит» по доминирующим биологически активным веществам;
- выявить особенности экстрагирования действующих веществ из многокомпонентных растительных композиций «Тантон», «Арура Тан №7», «Иммунофит» и провести исследования по выбору оптимальных параметров экстракции;
- разработать рациональную технологию получения экстрактов: на основе P. fruticosa, «Тантон», «Арура Тан №7», «Иммунофит»;
провести исследования по разработке технологии получения гранул с сухим экстрактом Pentaphylloidi fruticosae;
- разработать и представить нормативную документацию на биологически активные добавки к пище, обладающие адаптогенной активностью – «Арура Тан №7», «Арура-Тан№8», для внедрения их в производство: технические условия (ТУ), технологические инструкции (ТИ), рецептуры.
Научная новизна работы Cформулированы научно-методические подходы к поиску и изучению растительных адаптогенных средств, в основе которых лежит проведение исследований по поиску растений с адаптогенным, иммуномодулирующим действием, имеющих достаточный ресурсный потенциал, с дальнейшим комплексным фармакогностическим изучением и разработкой моно- и многокомпонентных растительных средств.
С учетом значимости отдельных групп биологически активных веществ в обеспечении эффектов их действия разработаны методики количественной оценки биологически активных веществ в средствах, обладающих адаптогенной активностью, предложены показатели качества, необходимые для их стандартизации. В растительном сырье побегах P. fruticosa, сухом экстракте и гранулах на его основе, а также в чаях и экстрактах «Тантон», «Арура Тан №7», «Иммунофит» разработаны методики стандартизации – по сумме флавоноидов;
в чае и экстракте жидком «Тантон» - по полисахаридам. Для растительного сырья - побегов P. fruticosa выявлены основные диагностические признаки, заключающиеся в особенностях строения верхнего и нижнего эпидермиса листа P. fruticosa, в наличии устьиц анамоцитного вида, располагающихся только на нижнем эпидермисе, двух типов волосков – одноклеточных головчатых и простых. Впервые определены урожайность побегов P.
fruticosa в пяти ценопопуляциях в Баргузинском, Селенгинском, Тарбагатайском районах Республики Бурятия. В растительном сырье побегах P.fruticosa, растительных чаях установлено содержание основных групп биологически активных веществ: флавоноидов, дубильных веществ, органических кислот, полисахаридов, аминокислот, компонентов эфирных масел, макро- и микроэлементов. Впервые в побегах P. fruticosa идентифицировано 11 высокомолекулярных жирных кислот, из них незаменимые: линоленовая, арахидоновая, докозагексановая.
В результате проведенных исследований предложена схема разработки и стандартизации готовых форм на основе моносырья и из растительных композиций, установлена зависимость выхода биологически активных веществ от режимов экстрагирования, изучен их химический состав и предложены критерии для оценки качества полученных продуктов. Разработана рациональная технология получения экстрактов сухих P. fruticosa, «Арура Тан №7», экстрактов жидких «Тантон» и «Иммунофит», обеспечивающая максимальный выход биологически активных веществ. Обоснованы состав, технология и целесообразность применения вспомогательных веществ для получения гранул на основе сухого экстракта Pentaphylloidi fruticosae, обеспечивающих их технологические свойства.
Рациональность составов и эффективность применения предложенных растительных средств подтверждены фармакологическими исследованиями.
Практическая значимость По результатам исследований разработаны и внедрены:
- биологически активные добавки к пище «Тан-Арура №7» (№ РУ 77.99.11.3.У.2757.4.10 от 28.04.2010), «Тан-Арура№8» (№РУ 77.99.11.3.У.3233.4.10 от 14.04.2010);
- разработаны и предложены:
«Способ получения средства, обладающего антиаллергической активностью» Патент на изобретение № 2109517 от 27.04.1998 г;
«Антидиабетическое средство» Патент на изобретение № 2150952 от 20.06.00 г;
«Лекарственное средство, обладающее адаптогенной активностью» Патент на изобретение №2259840 от 10.09.2005г;
- результаты, полученные при проведении исследований, используются в учебном процессе на кафедре фармации Бурятского государственного университета (Акт внедрения от 20.09.2011 г.).
Основные положения, выносимые на защиту - научно-обоснованный алгоритм разработки растительных адаптогенных средств, включающий методические подходы к их поиску и изучению;
- схема создания готовых форм на основе побегов P. Fruticosa и многокомпонентных композиций;
результаты экспериментальных исследований по разработке рациональной технологии экстрактов (жидких, сухих) и гранул;
- результаты фармакогностических исследований побегов P. fruticosa, включающие данные по анатомо-диагностическим признакам побегов, запасам сырья в районах Республики Бурятия;
- результаты фармакогностических исследований по определению критериев подлинности и содержания биологически активных веществ в многокомпонентных растительных композициях «Тантон», «Арура Тан№7», «Иммунофит» и готовых формах на их основе;
- результаты исследований по стандартизации моно- и многокомпонентных растительных средств по действующим веществам.
Апробация работы Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на:
- Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1995, 1997, 1998);
- международном совещании, посвященном памяти В.Г.Минаевой «Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений» (Новосибирск, 1998);
- III Дальневосточной региональной конференции с всероссийским участием «Новые научные технологии в Дальневосточном регионе» (Благовещенск, 1999);
- III международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Пушкин, 1999);
- II всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых “Агроэкология и устойчивое развитие регионов”(Красноярск, 2000);
- научно-практической конференции «Тибетская медицина: теория и практика» (Улан-Удэ, 2001);
- международной научной конференции “Традиционная медицина и гомеопатия накануне III тысячелетия”(Элиста, 2000);
- III конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2002);
- научно-практической конференции, посвященной 70-летию службы контроля качества лекарственных средств в Бурятии (Улан-Удэ, 2003);
- научно-практической конференции «Биологически активные добавки в профилактической и клинической медицине»(Улан-Удэ, 2003);
-III региональной научно-практической конференции с международным участием «Комплексное использование растительных ресурсов лесных экосистем»(Красноярск, 2004);
- всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006);
- заседаниях Общества фармацевтов Республики Бурятии (Улан-Удэ, 2007, 2010, 2011).
Связь задач исследований с проблемным планом Настоящая работа выполнена в соответствии с программой и планом научно-исследовательских работ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по теме № 146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация», утвержденной президиумом СО РАН.
Публикации Основное содержание работы
отражено в 45 научных работах, из них 13 статей - в изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ, монография, получены 3 патента РФ на изобретения;
2 регистрационных удостоверения.
Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на 305 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, 4 глав собственных исследований, выводов и списка используемой литературы, включающего 289 источников, из которых - на иностранных языках. Работа иллюстрирована 45 рисунками и таблицами.
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, приведены научная новизна и практическая значимость работы.
В первой главе изложены данные литературы о нарушении адаптационных процессов, а также приведены сведения о роли растительных средств как регуляторов адаптивных реакций организма;
проанализированы и обобщены материалы о растительных адаптогенах.
Во второй главе приведены сведения об объектах исследования, характеристике используемых приборов и методов.
Третья глава посвящена фармакогностическому изучению побегов P.
fruticosa. Приведены данные по определению характерных анатомо диагностических признаков побегов P. fruticosa, химическому исследованию биологически активных веществ, разработке методов стандартизации сырья. Представлена морфологическая группа растительного сырья, его сырьевая обеспеченность в некоторых районах Республики Бурятия, а также указаны условия сбора растительного сырья – побегов P. fruticosa. Приведены результаты экспериментальных исследований по обоснованию рациональной технологии получения сухого экстракта и гранул из побегов P. fruticosa. Предложены критерии подлинности и обоснования нормы содержания биологически активных веществ, включенные в нормативную документацию на сырье, сухой экстракт, гранулы.
Четвертая глава включает данные по экспериментальному обоснованию разработки нового средства с адаптогенным действием «Тантон». Приведены результаты исследований по фармакогностической характеристике растительной композиции, определению подлинности и показателей качества чая, идентификации биологически активных веществ, разработке методик количественного определения основных групп действующих веществ. Представлены данные по обоснованию технологии получения жидкого экстракта «Тантон», предложены критерии подлинности и нормы содержания биологически активных веществ в экстракте жидком.
В пятой главе приведены материалы по разработке чая и сухого экстракта из лекарственных растений в виде БАД к пище, обладающей адаптогенной активностью («Арура Тан№7»). Приводятся результаты разработки технологии получения и стандартизации чая и сухого экстракта. Обоснована и экспериментально подтверждена рациональность многокомпонентного состава и соотношения компонентов в исходной композиции. Дана фармакогностическая характеристика растительной композиции, идентифицированы биологически активные вещества и установлено количественное содержание доминирующих веществ с использованием комплекса физико-химических методов исследований.
Методом ВЭЖХ определено содержание суммы элеутерозидов в пересчете на сирингин, розавина, глицирризиновой кислоты в растительной композиции, а также идентифицированы отдельные флавоноиды, органические кислоты, сирингин, poзавин, глицирризиновая кислота, сахара. Исследовано влияние основных факторов, влияющих на процессы экстракции БАВ из растительной композиции. Разработаны методики оценки критериев подлинности и количественного содержания действующих веществ в сухом экстракте.
Шестая глава содержит экспериментальный материал по обоснованию состава, разработке и стандартизации чая и экстракта жидкого «Иммунофит». Подтверждено наличие БАВ, исследованы и предложены методы контроля качества и стандартизации указанного средства.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования В качестве объектов исследования служило растительное сырье:
Побеги пятилистника кустарникового (Cormus Pentaphylloidi fruticosae) -ТУ 9370-008-03533369-09, ТУ 9375-136-00482192-97;
Корневища и корни девясила (Rhizomata et radices Inulae) – ГФ ХI изд., вып. 2, ст. 73;
Корень солодки (Radices Glycyrrhizae) – ГФ Х изд., ст. 573;
Цветки ноготков (Flores Calendulae) – ГФ ХI изд., вып. 2, ст. 5;
Плоды облепихи сухие (Fructus Hippopheae) – ТУ 64-472-88;
Корневища и корни родиолы розовой (Rhizomata et radices Rhodiolaе roseaе) - ГФ ХI изд., вып. 2, ст. 75;
Плоды боярышника (Fructus Crataegi) - ГФ ХI изд., вып. 2, ст. 32;
Корневища бадана (Rhizomata Bergeniaе) - ГФ ХI изд., вып. 2, ст. 32;
Плоды шиповника (Fructus Rosae) - ГФ ХI изд., вып. 2, ст. 38;
Листья крапивы (Folia Urticae dioicae) - ГФ ХI изд., вып. 2, ст. 25;
Корневища аира (Rhizomata Acori calami) - ГФ ХI изд., вып. 2, ст. 72;
Корневища с корнями левзеи сафлоровидной (Rhizomata cum radicibus Carthamoides) - ФС 42-2707-90;
Корневища имбиря аптечного (Rhizomata Zingiberi officinalae) - ТУ 29046-91 «Пряности. Имбирь»;
Плоды кардамона настоящего (Fructus Elettariae cardamomi) - ТУ 29052-91 «Пряности. Кардамон»;
Плоды мускатного ореха (Fructus Myristici fragransis) - ТУ 29048- «Пряности. Мускатный орех»;
Плоды перца черного (Fructus Piperi nigri) - ТУ 29050-91 «Пряности.
Перец черный и белый»;
Корни петрушки (Radices Petroselini) - ТУ 16731-71 «Белые коренья петрушки, сельдерея и пастернака сушеные»;
Корневища и корни элеутерококка колючего(Rhizomata et radices Eleutherococci senticosi) - ФС 42-2725-90;
Побеги черники обыкновенной (Cormus Myrtilli) - ФС 42-2948-93;
Трава чабреца (Herba Serpylli) - ГФ ХI вып. 2, ст. 60;
Листья подорожника большого (Folia Plantaginis majoris) - ГФ ХI вып.
2, ст. 20;
Трава горца птичьего (спорыша) (Herba Polygoni avicularis) - ГФ ХI вып. 2, ст. 56;
Цветки гвоздики (Flores Eugeniae caryophyllatae)- Гвоздика целая ГОСТ 29047-91;
На основе вышеперечисленного состава разработаны композиции:
чаев адаптогенных «Тантон», «Арура-Тан№7»;
«Иммунофит»;
экстракты сухие: из побегов P. fruticosa, «Арура-Тан№7»;
экстракты жидкие:
«Тантон», «Иммунофит».
Для экспериментальных исследований и разработки готовых форм использовалось сырье, собранное в различных районах Бурятии, а также приобретенное через аптечную сеть г. Улан-Удэ и в ООО«Травы Башкирии».
Отбор средней и аналитических проб проводили согласно ГФ ХI изд., вып. 1, стр. 273.
Измельчение воздушно-сухого сырья проводили на мельнице, фракционирование порошков измельченного сырья осуществляли просеиванием через набор сит с размером отверстий: 1,0;
2,0;
3,0;
5,0;
7, и 10,0 мм.
Микроскопические исследования лекарственного растительного сырья проводили согласно Фармакопейной статьи ГФ ХI изд., вып. 1, стр.
277.
Запасы сырья – побегов P. fruticosa - определяли в Селенгинском, Баргузинском и Тарбагатайском р-нах в фазу цветения растений;
урожайность определяли на конкретных зарослях с использованием метода модельных экземпляров (Методика…, 1986).
В работе использованы реактивы, растворители и стандарты, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации.
Сгущение полученных извлечений на стадии экспериментальных исследований проводили на вакуум-выпарном ротационном испарителе марки ИРМ-1.
Определение экстрактивных веществ в сырье (экстрагенты-вода очищенная, спирт этиловый разной концентрации) проводили по ГФ XI, вып. 1, с. 295;
содержание эфирного масла - по ГФ XI, вып. 1, с. 290, метод 1;
определение золы - по ГФ XI, вып. 2, с. 24;
определение влажности растительного материала - по ГФ XI, вып. 1, с. 285;
определение сухого остатка в экстракте - по ГФ XI, вып. 1, определение содержания спирта этилового в экстракте - по ГФ XI, вып. 1, с. 26;
определение плотности отгона - по ГФ XI, вып. 1, с. 24;
определение тяжелых металлов - по ГФ XI, вып. 1, с. 165;
определение pH проводили на универсальном иономере ЭВ-74;
УФ-спектры регистрировали на саморегистрирующем спектрофотометре Agilent 8453 E UV-VI SIBLE в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм, в диапазоне длин волн от 200 до 900 нм.
Анализ на микроэлементный состав проводили на спектрографе ДФС 8 с плоскостной дифракционной решеткой для качественного и количественного спектрального анализа в области 200-1000 нм;
определение аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе ААА339(ЧССР). Измерение оптической плотности растворов проводили на спектрофотометрах СФ-46 и Cecil 2011 в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.
Исследование качественного состава изучаемых объектов проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), бумажной хроматографии (БХ);
использовали пластины «Сорбфил» (Россия), хроматографическую бумагу FN-12 (Германия) и системы растворителей:
1. хлороформ-метанол-вода (26:14:3) и 1а-(61:32:7);
2. гексан-этилацетат 85:15;
3. этилацетат-уксуная кислота-вода 25:5:5;
4. этилацетат-метилэтилкетон-муравьиная кислота – вода 50:30:10:10;
5. н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2);
6. 15% раствор кислоты уксусной;
7. вода очищенная;
8. бензол-этанол (9:1);
9. гексан-эфир- кислота уксусная (90:10:1);
10. н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3);
Для проявления хроматограмм использовали следующие реактивы:
1. 5% спиртовый раствор алюминия хлорида;
2. 5% спиртовый раствор кислоты фосфорномолибденовой;
3. 1% раствор ванилина в кислоте серной концентрированной;
4. 1% раствор калия перманганата в 1% растворе кислоты серной;
5. 5% спиртовый раствор йода;
6. анилинфталатный реактив;
7. 20% раствор кислоты серной.
При разработке методик качественного и количественного определения биологически активных веществ были использованы хроматографически чистые вещества и стандарты: галловая кислота – Fluka, кат. № 48630, кофейная кислота – Sigma, кат. № 0625, хлорогеновая кислота –Sigma, кат. № 3378, феруловая кислота СО – ТУ 9369-143 0486244-01, апигенин- Fluka, кат. № 10748, гесперидин- Sigma, кат. № 04125, глицирризиновая кислота – Fluka, кат. № 50531, ВИЛАР ТУ 9369 148-04868244-02, лютеолин ГСО – ФС 42-3130-95, лютеолин-7-гликозид ГСО – ФС 42-3130-95, кверцетин ГСО – ФС 42-290-79, ВИЛАР ТУ 9369 128-04868244-03, рутин ГСО – ФС 42–2508-87, ВИЛАР ТУ 9369-141– 048668244-02, гиперозид ГСО – ФС 42-0106-03, кемпферол - Fluka, кат. № 60010, арбутин – Fluka, кат. № 10960, СО ВИЛАР (ТУ 9363-133-048668 44-01), розавин - ФС 42-71-01, сирингин – ФС 42-89-02, ликвиритогенин, ликуразид - ТУ разработаны ВИЛАР (г. Москва), СОВС мирицетина, цикориевой кислоты, глицирризиновой кислоты, нарингенина, нарингенин-5-гликозида, предоставленные ВИЛАР (г. Москва).
Исследование объектов проводили на жидкостном хроматографе «Милихром А-02» (Россия) на колонке (l = 75 мм, 2 мм), упакованной сорбентом «Nucleosil, 100-5, C18», с эффективностью равной 5000 т.т. по пику хризена (k’=10) с последующей компьютерной обработкой хроматографических данных. Пики на хроматограммах идентифицировали по двум параметрам: время удерживания (tR) и интегральное спектральное отношение (R). Значения R рассчитывали как отношения площадей пиков, зарегистрированных на использованных длинах волн детектирования. Доверительные интервалы для tR пиков при градиентном и изократическом разделениях не превышали 2 % (n = 1, P = 0,95), для R 5,6 % (n = 1, P = 0,95). Также исследования проводили на жидкостном хроматографе фирмы «GILSTON» (Франция), с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «Мультихром» для Windows. В качестве неподвижной фазы использовали металлическую колонку PLATINUM EPS C-18 100A размером 4,4х250 мм.
Условия газохроматографических (ГХ-МС) исследований: прибор Agilent 5973N + GC 6890, колонка Ultra-2 (5% фенилметилсилоксан) 50 м, внутренний диаметр 320 мкм, поток гелия 1 мл/мин;
температура минуты – 70 С, далее 5 гр/мин до 310С и еще 20 мин при этой температуре;
температура инжектора 260 С;
температура ионного источника 230 С;
температура квадруполя 150 С. Идентификация веществ проводилась по базам данных PBM и NIST: The NIST Mass Spectral Search Program for the NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library. Ver.
1,7, build 07/18/2000. Distributed by Standard Reference Data Program of the National Institute of Standards and Technology.
Идентификацию метиловых эфиров жирных кислот проводили методом газо-хромато-масс-спектрометрии на газовом хроматографе Hewlett-Packard 6890 с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором HP 5973. Использовалась 30 метровая кварцевая колонка CP Wax (неполярная фаза – полиэтиленгликоль) с внутренним диаметром 0,20 мм. Толщина пленки неподвижной фазы составляет 0,25 мкм. В качестве подвижной фазы использовали гелий марки «А». Качественный анализ основан на сравнении времен удерживания полных масс-спектров соответствующих чистых компонентов, представленных в машинном каталоге, стандартных смесей GLC-68D (Nu-Chek-Prep;
Elysian, Minnesota, USA).
Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с требованиями ГФ XI, вып. 1, стр. 199 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний» с использованием парного критерия «t» при нормальном распределении данных или близком к нормальному распределению.
Методологические основы разработки средств на основе лекарственных растений Несмотря на большой арсенал имеющихся средств, проблема изыскания новых высокоэффективных и безопасных средств остается актуальной. Это обусловлено недостаточной эффективностью используемых средств для лечения и профилактики некоторых заболеваний, наличием нежелательного побочного действия лекарственных препаратов, ограниченными сроками годности средств.
Одним из путей решения этой проблемы является разработка новых эффективных и безопасных средств на основе растительного сырья.
По современным представлениям, лекарственное растение – это цельный, биогенетически сложившийся комплекс, включающий в себя активно действующие вещества. Этот активный комплекс, сформировавшийся в живой клетке, имеет большее сродство с организмом человека, чем химически чистое вещество.
Поиск и разработка новых средств на основе растений связан с огромной наукоемкостью работ, длительностью разработки технологии производства, сложностью медико-биологических испытаний и требует больших затрат. Методика разработки фитосредств на основе лекарственного растительного сырья состоит из трех основных этапов: I – поиск перспективного объекта исследования;
II – фармакогностическое и фармакологическое изучение объекта;
III – разработка, стандартизация и внедрение оптимальной готовой формы (Рис.1).
I. При создании новых средств на основе лекарственных растений учитывается опыт народной и традиционной медицины. На этом этапе выявляются новые потенциально перспективные виды растений, эффективные при различных заболеваниях, и одновременно имеющие достаточные сырьевые запасы. В плане поиска перспективных лекарственных растений представляет интерес ассортимент лечебных средств, сложившийся в течение долгого времени в различных медицинских системах. Большой вклад в проблему изыскания перспективных лекарственных растений Дальнего Востока внес А.И.Шретер (1979), разработавший системный подход, который включает целый ряд ботанических аспектов поиска – анализ флоры, информацию о биологической активности, химическом составе, использовании в различных эмпирических системах, родственных отношений растений изучаемой территории и др. – с использованием электронно вычислительной техники. Метод позволяет оптимизировать процессы поиска, прогнозировать перспективность отдельных таксонов, флористических районов. М.А. Гриневич (1990) предложено использовать информационный скрининг сложных многокомпонентных рецептов Китая, Кореи и Японии, включающий перевод, расшифровку и определение встречаемости растений в рецептах, инвентаризацию и идентификацию компонентов, их классификацию и отбор по заданным параметрам (признакам) перспективных лекарственных растений с помощью электронно-вычислительной техники. Данный метод позволил выявить группы (перечни) перспективных растений, используемых для лечения атеросклероза, гипертонической болезни, заболеваний нервной системы и др. Т.А. Асеевой (1985) предложен метод выявления перспективных композиций с предполагаемым видом фармакологической активности. В тибетских многокомпонентных лекарственных смесях лечебное действие сочетаний направлено на нормализацию основных физиологических процессов в организме и повышению функциональной активности отдельных органов;
усложнение состава препарата происходило за счет дублирования лечебного действия отдельных компонентов и путем введения ингредиентов направленного действия (Базарон Э.Г., Асеева Т.А., 1984).
С позиции современной фармации очень важно, чтобы перспективный объект имел достаточную сырьевую обеспеченность. В случае отсутствия сырьевых запасов эффективное перспективное средство станет научным эталоном для выявления закономерностей механизма действия средств;
если объект имеет достаточные запасы, или вид введен в культуру, то разработанное средство может найти широкое применение в практическом здравоохранении. Учитываются данные о химическом составе растений, их применении в народной и традиционной медицине, а также официнальность растительного сырья.
II – второй этап включает эксперименты по фармакогностическому и фармакологическому изучению объекта исследования. Определяются основные группы биологически активных веществ (БАВ), идентифицируются отдельные вещества с использованием химических и физико-химических методов. Количественно определяется содержание БАВ различными видами хроматографии, спектрофотометрией, Рисунок Схема разработки средств на основе лекарственного растительного сырья Данные народной Официнальность и традиционной медицины Распространение I – поиск Метод выявления Запасы сырья перспективного отдельных объекта таксонов, исследования Данные о флористических химическом районов составе Метод Данные о информационного фармакологичес- скрининга ких свойствах Другие методы Определение основных групп Общая БАВ фармакологическ II – ая активность фармакогности Определение ческое и индивидуальных фармакологи Специфическая компонентов ческое фармакологическ изучения ая активность Количественное объекта определение исследования Определение основных БАВ безопасности Разработка методов Определение токсичности Стандартизация III – Разработка разработка, Клинические нормативной стандартиза- испытания документации ция и внедрение Регистрация рациональной Разработка нормативной готовой формы технологии документации готовых форм Реализация объемными химическими методами. Параллельно проводятся фармакологические испытания, включающие эксперименты по установлению общих фармакологических свойств, специфической фармакологической активности, а также определении их безопасности.
III – разработка, стандартизация и получение рациональной готовой формы. Разрабатываются показатели качества готового продукта, характеризующие подлинность, доброкачественность и количественное содержание основных БАВ. Для этого предлагается применение комплекса химических, физических и физико-химических показателей.
Обосновываются и предлагаются методики количественного определения БАВ, технология получения готовых форм, постадийный контроль производства. Проводятся клинические испытания. Третий этап включает также организационные вопросы по разработке и регистрации нормативной документации.
Разработка и стандартизация средств, полученных на основе растительного сырья – побегов Pentaphylloides fruticosa (L.)O.Schwarz:
сухого экстракта и гранул.
К растениям, имеющим широкий ареал и значительный запас сырья, относится пятилистник кустарниковый (P. fruticosa). Препараты из данного растения популярны в народе как кровоостанавливающее, противовоспалительное, успокаивающее, обезболивающее средства, принимаемые внутрь при желудочно-кишечных и женских заболеваниях и наружно при лечении нарывов, ран, фурункулов, а также в виде полосканий при ангине, стоматите (Николаева И.Г., Хобракова В.Б., Арьяева М.М., 2001). В практике тибетской традиционной медицины это растение известно под названиями спэн, спэн-ма, спэн-наг, спэн-дкар. В главе "лечебные свойства и показания к применению лекарственных растений" трактата "Дзейцхар Мигчжан"(1985) указывается, что ветви курильского чая (спэн-ма) "излечивают" болезни молочной железы "с жаром" и укрепляют зубы (л. 53 б). В другом трактате тибетской медицины "Вайдурья - онбо" (Базарон Э.Г., Асеева Т.А., 1984), спэн-ма используется как мочегонное средство, а зола полезна при лихорадке (л.244а). Растение в составе с другими видами сырья используется при желудочно-кишечных заболеваниях, туберкулезе легких, а ветви - при крупозной пневмонии и как отхаркивающее (Гаммерман А.Ф., Семичев Б.В., 1963;
"Дзейцхар мигчжан" - памятник тибетской медицины, 1985;
Дудин С.А., 1993, Кунпан-дудзи,2008). Средства из P. fruticosa оказывают терапевтическое влияние на течение экспериментального диабета у животных (Арьяева М.М.и др, 1999). Установлено, что экстракт оказывает выраженное противовоспалительное действие, а при дозе облучения 7 Гр на 32,4 % увеличивает среднюю продолжительность жизни (СПЖ) животных и повышает их выживаемость в 2,7 раза (Матвеев А.Ю. и др, 1991). Установлено антимикробное действие препаратов пятилистника кустарникового (Федосеева Г.М. и др, 1991;
Николаев С.М.и др, 2001) Отмечена высокая тромбопластическая активность средств P. fruticosa (Триль В.М., Шишкина Е.С., 1981). Выявлены высокая активность экстракта сухого при экспериментальном дисбактериозе, а также установлено его иммуномодулирующее действие при иммунодефицитных состояниях (Хобракова В.Б. и др, 2000;
Николаев С.М. и др, 2002).
Фармакогностическое изучение побегов Pentaphylloides fruticosa (L.)O.Schwarz.
Установлены основные группы биологически активных веществ (БАВ) с использованием общих химических реакций, бумажной хроматографии:
дубильные вещества двух типов, полисахариды, аминокислоты, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, тритерпеноидные сапонины, жирные кислоты. Методом ВЭЖХ обнаружены кислоты-коричная, хлорогеновая, кофейная, цикориевая, феруловая;
флавоноиды - лютеолин 7-гликозид, апигенин, робинин, гиперозид, рутин, дигидрокверцетин, кверцетин (Табл.1).
Таблица Результаты качественного и количественного содержания веществ методом ВЭЖХ в побегах Pentaphylloides fruticosa (L.)O.Schwarz Вещества Время удерживания, Количественное мин содержание мкг/г коричная кислота 5,45 59, хлорогеновая кислота 6,39 36, кофейная кислота 7,48 39, цикориевая кислота 10,13 28, феруловая кислота 12,48 18, лютеолин-7-гликозид 15,15 10, апигенин 17,12 8, гиперозид 19,55 2, рутин 23,95 2, робинин 26,58 3, дигидрокверцетин 44,63 1, кверцетин 50,18 0, Установлен качественный и количественный аминокислотный состав побегов P. fruticosa (Табл.2). Обнаружены аспарагиновая кислота, треонин, серин, аспарагин, глутаминовая кислота, глутамин, пролин, глицин, аланин, цистин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, -аминомаслянная кислота, -аминомаслянная кислота, лизин, гистидин, а после кислотного гидролиза - аспарагиновая кислота, треонин, серин, глутаминовая кислота, пролин, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, тирозин, аргинин, гистидин, лизин.
Таблица Содержание свободных и связанных аминокислот в побегах Pentaphylloides fruticosa (L.)O.Schwarz Вещества Содержание аминокислот в побегах, мкг/г свободные связанные аминокислоты аминокислоты Аспарагиновая кислота 279,51 6020, 203,07 332, Треонин Серин 236,48 361, Аспарагин 6127,79 Глутаминовая кислота 179,46 692, Глутамин 50,44 Пролин 1019,50 463, Глицин 82,42 201, Аланин 149,91 185, - 359, Валин Цистин 391, 126,82 189, Метионин 144,65 165, Изолейцин 48,54 101, Лейцин Тирозин 16,31 154, 187,50 227, Фенилаланин 334,56 -аминомаслянная кислота 136,87 -аминомаслянная кислота 48,61 1491, Лизин Гистидин 58,20 1002, Аргинин 203, Примечание: *- незаменимые аминокислоты, «-» - не обнаружено Впервые в побегах P. fruticosa методом ГХ-МС идентифицировано высокомолекулярных жирных кислот (Рис.2, табл.3).
Рисунок Хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот побегов Pentaphylloides fruticosa (L.)O.Schwarz 13. 29. 20. 40000010.11 30. 21. 17. 16. 18. 19. 18. 11.18 13. 14. 15. 10. 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30. Таблица Жирно-кислотный состав побегов Pentaphylloides fruticosa (L.)O.Schwarz Наименование Число Время Количество,% кислоты атомов удерживания, мин Миристиновая С14:0 10,12 2, Изо-тетрадеценовая С14:1n5 10,37 0, Пальмитиновая С16:0 13,00 26, Изо-гептодекановая С17:0 13,87 0, -олеиновая С18:1n11 16,82 6, -олеиновая С18:1n9 17,18 6, Октодикатриеновая С18:3n4 18,26 2, Леноленовая С18:3n3 19,51 3, Арахидоновая С18:4n6 29,31 8, Докозагексаеновая С22:6n3 30,51 4, Высокое содержание моно- и полиненасыщенных жирных кислот подтверждает биологическую ценность данного продукта. Обнаружены незаменимые жирные кислоты, такие как: линоленовая, арахидоновая, докозагексановая кислоты. Установлено количественное содержание флавоноидов, полисахаридов, дубильных веществ, аскорбиновой кислоты.
Определены анатомо-диагностические признаки побегов P. fruticosa (Рис.3). Для стеблей характерно наличие механической склеренхимы, одноклеточных простых волосков, кутикулы, друз. Лист данного вида имеет наиболее выраженные особенности: эпидермис нижней стороны более извилист, чем эпидермис верхней стороны, устьица аномоцитного типа располагаются только на нижней стороне. Отмечено большое количество друз оксалата кальция, которые образуют скопления (особенно вдоль жилок), а также могут располагаться по одиночке.
Рисунок Диагностические особенности листа Pentaphylloides fruticosa (L.)O.Schwarz 1-головчатый волосок, 2 – простой одноклеточный, 3 – нижний эпидермис, 4 – верхний эпидермис, 5 – друзы, 6- устьица Характерно наличие двух типов волосков: простых одноклеточных 0,8-1,0 мм длиной с конусовидным основанием, встречающихся как на нижнем, так и на верхнем эпидермисе листа, и головчатые, располагающиеся только на нижней стороне. Черешок листа имеет подковообразный вид.
Выявлены ценопопуляции P. fruticosa в отдельных районах Бурятии и определены урожайность и эксплуатационный запас сырья этого вида.
Подсчет численности экземпляров проводили на 18-31 учетных площадках площадью от 10 до 20 м2, заложенных равномерно в пределах заросли. В различных зарослях число товарных экземпляров колебалось в зависимости от их численности. Для определения сырьевой фитомассы отбирали каждый третий или пятый товарный экземпляр без субъективного выбора, а резку облиственных побегов проводили со всего товарного экземпляра. Выход воздушно-сухого сырья из свежесобранного составил 55%. В Баргузинском р-не изучены две конкретные заросли (березняк душекиево-разнотравный и багульниково-моховый). Число учетных площадок на них - 61. Площадь учетной площадки - 15 м2. Число товарных экземпляров - 82. В Селенгинском р-не исследованы две конкретные заросли (ивняк пырейниковый, ильмовник пятилистниково разнотравный). Число заложенных на них учетных площадок - 43.
Площадь учетной площадки - 10 и 20 м2. Общее число товарных экземпляров - 48. В Тарбагатайском р-не обследована одна конкретная заросль (ивняк редкотравный). Число заложенных учетных площадок - 28.
Площадь площадки - 15 м2. Число товарных экземпляров - 31. Площадь заросли в каждом районе определяли, приравнивая ее очертания к прямоугольнику. Измерения длины и ширины производили шагами, из расчета 1 шаг равен 0,6 м, или по спидометру автомашины.
Урожайность воздушно-сухого сырья пятилистника кустарникового в трех ценопопуляциях в Баргузинском и Тарбагатайском р-нах была низкой (5.7 – 14.3 г/м2), а в двух ценопопуляциях в Селенгинском р-не – достаточно высокой (200.2-204.9 г/м2). Эксплуатационный запас воздушно-сухого сырья в ценопопуляциях в двух первых районах составил от 55,8 до 475,3 кг и значительно выше в ценопопуляциях в Селенгинском р-не - 2782,8 и 4533,0 кг.
Разработка способа получения сухого экстракта и гранул на основе побегов P. fruticosa Оптимизирована технология получения сухого экстракта, разработаны показатели качества. В сухом экстракте Pentaphylloidi fruticosae методом ВЭЖХ с использованием стандартных образцов определено количественное содержание некоторых флавоноидов: рутина 40,40±2,22 мкг/г, кверцетина -78,30±3,73 мкг/г, лютеолина -14,90± 0,04мг/г.
С целью разработки твердой лекарственной формы - гранул определены технологические показатели сухого экстракта Pentaphylloidi fruticosae. Сухой экстракт представляет собой темно-коричневый аморфный порошок с приятным запахом и вяжущим вкусом. Потеря в массе при высушивании не должна превышать 4%. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин не менее 6%. Порошок гигроскопичен, пачкающийся, липкий на ощупь, на воздухе быстро отсыревает и превращается в комкообразную массу. Сухой экстракт Pentaphylloidi fruticosae сыпучестью не обладает, сыпучесть экстракта с вибровстряхиванием составила 4,28±0,08 г/с;
насыпная масса свободнонасыпанного порошка (В) составляет 0,489±0,031г/см3;
а после г/см3, уплотнения составляет Вупл=0,642±0,029 коэффициент вибрационного уплотнения КВ составляет 0,238±0,018, что соответствует сыпучести материалов и характеризуется как порошок с неудовлетворительной насыпной массой, прессуемость модельных таблеток сухого экстракта 1,100,19 кг/мм2, прочность модельных таблеток на излом 3,620,38 кг, истинная (удельная) плотность 1,41±0, г/см3, пористость составляет 36,32 %, угол естественного откоса 45°±5°, фракционный состав неоднороден. В связи с этим создаются затруднения при фасовке и дозировании порошка. Для устранения этих недостатков возникает необходимость создания удобной формы – гранул, обеспечивающих более точное объемное дозирование с улучшением сыпучести, что важно при промышленном производстве. Подобраны вспомогательные вещества, с целью уменьшения гигроскопичности в состав массы вводили основной магния карбонат, для улучшения сыпучести массы вводили лактозу, в качестве увлажняющих агентов использовали воду, 96 и 70% растворы этанола, 64% раствор сахара, 5% раствор крахмала, 20% водный и этанольный растворы поливинилпирролидона (ПВП), 2% раствор метилцеллюлозы (МЦ).
Выбор вспомогательных веществ проводили с учетом следующих показателей: сыпучести без вибровстряхивания и с вибровстряхиванием;
насыпной массы свободнонасыпанного порошка и с уплотнением, фракционный состав (% пылевой фракции), прочности на истираемость.
Обнаружено, что наилучшей сыпучестью обладают гранулы, полученные при увлажнении 2% р-ром МЦ и 5% р-ром крахмала (составы №№ 1, 4).
Использование в качестве наполнителя смеси - лактоза:магний карбонат основной (1:1) нежелательно, т.к. это приводило к увеличению пылевидной фракции, а также уменьшению сыпучести и ухудшению внешнего вида гранул и их органолептических свойств (липкие на ощупь) (состав №2). Уменьшение количества наполнителя (лактозы) приводило к увеличению пылевидной фракции (составы №№ 12, 14, 16). Увеличение количества наполнителя (лактозы) приводило также к уменьшению сыпучести (составы №№ 13, 15). Использование в качестве увлажнителя 20% этанольного раствора ПВП привело к потере сыпучести гранул (состав № 17). Всего исследовано 17 составов гранул. Установлено, что гранулы всех составов распадались не более, чем за 2 минуты, уменьшение количества наполнителя (лактозы) приводило к уменьшению прочности на истираемость (составы №№ 12, 14, 16). Для дальнейших исследований выбраны составы №№ 1, 4, 6, 13, обладающие удовлетворительными технологическими свойствами (Табл.4).
Таблица Технологические свойства гранул сухого экстракта Pentaphylloidi fruticosae, обладающие удовлетворительными технологическими свойствами п/ Сыпучесть Насыпная Коэф Пылевая н г/с масса ф. фракция, Особенности гранулирования со вибро % без с своб с ст упл.
виб виб одн упл ав ро ро онас отне а ыпн ние м 1 11,6 6,90 0,62 0,65 0,067 7,08 В процессе влажной 0 грануляции на грануляторе образуются труднопротираемые комки 4 8,80 6,76 0,65 0,7 0,79 10,67 При влажном гранулировании происходит образование труднопротираемых комков 6 Процесс влажной грануляции 6,69 5,29 0,59 0,64 0,079 2,56 происходит легко, полученные гранулы свободно проходят через гранулятор и быстро высыхают.
13 7,25 6,27 0,57 0,62 0,078 5,69 Процесс влажной грануляции проходит удовлетворительно Установлено, что гранулы состава №6 имеют наименьший прирост влаги по сравнению с другими составами, однако через 20 ч. происходит изменение свойств гранул (расплавление). Нужно отметить, что через ч. происходит расплавление всех гранул. Разработана технологическая схема получения гранул состава №1 и постадийный контроль производства гранул сухого экстракта Pentaphylloidi fruticosae. Для характеристики гранул предложены следующие показатели качества:
описание внешнего вида, определение подлинности, потеря в массе при высушивании и количественное содержание суммы флавоноидов.
Разработка и стандартизация адаптогенного средства «Тантон» В соответствии с основными этапами разработки растительных средств процесс создания адаптогенного средства «Тантон» был подразделен на три этапа: I – разработка рецептуры (перспективного объекта исследования);
II – фармакогностическое и фармакологическое изучение;
III - разработка, стандартизация и получение рациональной готовой формы.
I. Как и при разработке моносредств необходимо было обратиться к опыту народной и традиционной медицины, а также современным подходам по разработке многокомпонентных растительных средств (Николаев С.М., 1988;
Гриневич М.А., 1990).
С учетом этого разработан комплексный растительный чай, состоящий из 17 видов сырья. Наряду с официнальными растениями:
календула лекарственная (цветки), крапива двудомная (листья), бадан толстолистный (корни), аир болотный (корни), родиола розовая (корни), левзея сафроловидная (корни), солодка уральская (голая) (корни), боярышник (плоды), девясил высокий (корни), шиповник (плоды), в чай включены пищевые растения: петрушка кудрявая (корни), мускатный орех (плоды), перец черный (плоды), кардамон настоящий (плоды), облепиха крушиновидная (плоды), курильский чай (побеги), имбирь аптечный (корни).
Многокомпонентная лекарственная композиция содержит оптимальный набор компонентов, подобранных по принципу сочетанного разностороннего действия на организм, среди которых условно можно выделить четыре основные группы: растения-адаптогены, иммуномодуляторы, витаминоносные растения, и растения, обладающие широким спектром действия. Основу растительного сбора составляют адаптогены-родиола розовая, левзея сафроловидная, солодка голая, специфические БАВ из них (глюкозиды, флавонолигнаны, монотерпены, экдистероиды, тритерпеновые сапонины и др.) оказывают регулирующее влияние на нейроэндокринные и иммунные процессы, эти растения имеют однонаправленное действие, что способствует усилению стимулирующего эффекта. Были включены растения, способные возместить недостаточность витаминов и микроэлементов: шиповник, облепиха, боярышник, крапива, петрушка. Также при составлении композиции учитывали необходимость присутствия растений, имеющих широкий спектр фармакологического действия, таких как девясил высокий, аир болотный, бадан толстолистный, календула лекарственная, боярышник, пятилистник кустарниковый;
БАВ этих растений (флавоноиды, каротиноиды, тритерпеноиды, катехины, фенольные и органические кислоты, дубильные вещества, полисахариды и др.) способствуют нормализации нарушенных функций и систем, выводят из организма токсины, усиливают и потенцируют действие сопутствующих ингредиентов. Особой группой, включенной в сбор, являются пищевые растения, часто используемые в практике тибетской медицины:
мускатный орех, перец черный, кардамон настоящий, имбирь аптечный (Асеева Т.А., Найдакова Ц.А., 1983;
Асеева Т.А., Дашиев Д.Б., 1989).
Содержащиеся в их составе гликозиды, эфирные масла, минеральные соли обладают широким фармакологическим действием: возбуждают деятельность пищеварительной системы, усиливают усвояемость питательных элементов, благоприятно влияют на деятельность нервной и сердечно-сосудистой систем, обладают тонизирующим, иммуномодулирующим, противовоспалительным, спазмолитическим, бактерицидным, противоопухолевым действием.
II. С помощью современных методов фитохимического анализа проведено исследование водного, водно-спиртового извлечения из растительного чая и экстракта жидкого на присутствие основных биологически активных веществ. Данные качественного анализа свидетельствуют о наличии биологически активных веществ, относящихся к таким классам природных соединений как флавоноиды, дубильные вещества, тритерпеноиды, полисахариды, арбутин и фенологликозиды, аминокислоты, алкалоиды. В исходной композиции не обнаружены сердечные гликозиды. Методом двумерной хроматографии на бумаге в системах растворителей 5, 6 проведено разделение водно спиртового извлечения из данной композиции. Хроматограммы просматривали в УФ-свете, проявляли 2% раствором алюминия хлорида и нагревали при t-ре 105C в течение 2 минут. На хроматограмме выявлены 11 зон фенольных соединений, которые в УФ-свете обладают собственной флуоресценцией желтого, коричневого и сиреневого цвета. После обработки зон 2% спиртовым раствором алюминия хлорида флуоресценция усиливалась и пятна приобретали желтый, желто-зеленый цвет. По характерной окраске предварительно можно выделить основные группы природных веществ: фенолы флавоноиды и танины. Методом нисходящей хроматографии на бумаге в системе 10 установлены моносахаридный состав водорастворимого полисахаридного комплекса в сравнении со стандартными образцами сахаров. Гидролиз проводили 10% кислотой серной при 100С в течение 6 часов. После обработки хроматограммы анилинфталатным реактивом обнаружены три пятна.
Значения Rf моносахаридов в исследуемом образце и пятен веществ свидетелей глюкозы (Rf=0,24), фруктозы (Rf=0,27) и маннозы (Rf=0,1) совпадали.
Компонентный состава эфирного масла «Тантон» В исходный состав «Тантон» входят растения, содержащие эфирные масла-мускатный орех, имбирь, кардамон, аир болотный, девясил и др.
Проведен газохроматографический анализ с масс-спектральным детектированием эфирного масла исходного состава. Результаты ГХ-МС анализа эфирного масла исходного сбора представлены на рисунке 4.
Использование метода ГХ-МС позволило определить в исходной композиции более 40 индивидуальных соединений, которые относятся к монотерпеноидам, сесквитерпеноидам, сложным эфирам высших спиртов и жирных кислот.
Рисунок Хроматограмма эфирного масла растительного сбора «Тантон» Идентификация фенольных веществ чая «Тантон» методом ВЭЖХ В результате исследований на хроматограммах определены флавоноиды: гиперозид, кверцетин и мирицетин и галловая кислота.
Результаты исследований представлены в таблице 5.
При исследовании «Тантон» установлено, что чай содержит значительное количество минеральных веществ. Из макроэлементов отмечается наибольшее содержание кальция, магния, натрия, фосфора, а также присутствие в значительных количествах марганца, бария, алюминия. Из микроэлементов присутствуют- алюминий, железо, медь, цинк, кобальт, никель, бром, фтор, бор, марганец и др. Роль минеральных веществ в регуляции физиологических процессов весьма значима.
Показано, что малые биотические дозы микроэлементов стимулируют многие функции организма, усиливают и иммунные механизмы защиты (Подколзин А.А., 1994). В этом плане использование указанного растительного состава в жидкой форме, содержащего комплекс биологически активных веществ, представляет несомненный интерес для клинической практики. Разработаны спектрофотометрические методики количественного определения флавоноидов, восстанавливающих моносахаров полисахаридного комплекса в «Тантоне». Количественно определено содержание аскорбиновой кислоты, установлено содержание дубильных веществ, органических кислот (Табл.6).
Таблица Результаты идентификации соединений в исходной композиции «Тантон» методом ВЭЖХ чай «Тантон» Вещества tR, мин tR, мин C, мкг/г 11,42 1,130, Гиперозид 11,600, Лютеолин-7- 11,80 Не более 11,890, глюкозид 11,80 Не более Рутин 11,890, 13,00 Не более Мирицетин 13,20, 16, Кверцетин 16,50,3 0,500, 1,55 5,900, Галловая кислота 1,560, III. Экстракты жидкие получили наиболее широкое применение в фармации и медицине. Они имеют ряд преимуществ - их легко и быстро дозировать, производство жидких экстрактов является доступным технологическим процессом, полученное извлечение не подвергается тепловой обработке, поэтому данная форма выбрана для получения указанного средства.
Установлены технологические свойства сырья: коэффициент поглощения экстрагента растительным материалом (к=1,2), фракционный состав растительной массы (от1,5до3,4% - пылевая фракции), содержание Таблица Количественное содержание основных БАВ в растительном чае «Тантон» БАВ f X,% S Sx P, t Х E,% % (P,f) Сумма 6 0,46 0,00592 0,023 95 2,45 0,01452 ±3, флавоноидов, в пересчете на рутин Сумма 7 0,03 0,22181 0,096 95 2,36 0,18562 ±4, восстанавлива ющих моносахаров полисахаридно го комплекса Аскорбиновой 4 1,87 0,02556 0,013 95 2,78 0,071 ±3, кислоты Органические 4 2,85 0,03536 0,015 95 2,78 0,0983 ±3, кислоты Дубильные 4 1,37 0,01586 0,046 95 2,78 0,0441 ±3, вещества экстрактивных веществ (36,20,05%), насыпная масса (0,130-0,133г/см3) и определена оптимальная степень измельчения растительного сырья. Для каждой морфологической группы в зависимости от степени измельчения растительного материала, изучены динамика извлечения флавоноидов и экстрактивных веществ (Табл.7). Для этого компоненты чая были разделены на 3 фракции: 1-листья, цветки, побеги, 2-корни и корневища, 3-плоды. Сырье измельчали до следующих размеров частиц: 0,5-1,0 мм, 2,0-3,0 мм, 5,0-7,0 мм, 7,0-10,0 мм.
Установлено, что оптимальной степенью измельчения являются для листьев и побегов 1,0-3,0 мм, плодов 0,5-1,0 мм, и для корней и корневищ 1,0-3,0мм.
Оптимизированы условия экстрагирования растительного сбора и способ экстракции. Контроль выхода БАВ осуществляли по суммарному содержанию флавоноидов и экстрактивным веществам. Установлено, что параметры экстракции сбора «Тантон»: 40% этанол, соотношение сырье экстрагент 1:15, наиболее рациональный способ экстракции - метод реперколяции с законченным циклом.
Разработаны показатели качества экстракта жидкого «Тантон» Одним из показателей качества экстракта жидкого «Тантон»- его УФ спектр (Рис.5).
Рисунок УФ-спектр раствора экстракта жидкого «Тантон» 2. A b s o r b a n c e (A U ) 1. 0. 200 300 400 500 600 700 800 900 Wavelength (nm) Таблица Влияние степени измельчения компонентов растительного чая «Тантон» на выход суммы флавоноидов и экстрактивных веществ Вид сырья Степень Содержание суммы Содержание измельчения, флавоноидов в экстрактивных мм пересчете на рутин, % веществ, % Листья, 0,5-1,0 1,020 37, цветки, 2,0-3,0 1,025 37, побеги 5,0-7,0 0,599 35, 7,0-10,0 0,468 35, Плоды 0,5-1,0 0,614 38, 2,0-3,0 0,344 34, 5,0-7,0 0,238 28, 7,0-10,0 0,193 24, Корни и 0,5-1,0 0,332 36, корневища 2,0-3,0 0,322 37, 5,0-7,0 0,230 37, 7,0-10,0 0,187 35, Установлено, что в УФ-спектре экстракта жидкого «Тантон» имеются характерные полосы поглощения при 198 нм и 274 нм и минимум поглощения при 656 нм. В экстракте жидком методом ТСХ идентифицированы в системе 5: рутин Rf (0,64), кверцетин Rf (0,93), гиперозид Rf (0,78), галловая кислота Rf (0,85);
в системе 7- аскорбиновая кислота Rf(0,92). Идентифицированы сесквитерпеновые лактоны в сравнении с извлечениями из корней девясила (так как они являются источниками сесквитерпеновых лактонов в экстракте жидком «Тантон»).
Методом ВЭЖХ установлено присутствие флавоноидов: апигенина, гесперидина, рутина, нарингенина, гиперозида;
фенолкарбоновых кислот:
галловой, коричной, хлорогеновой, цикориевой, феруловой (Рис.6).
Рисунок Хроматограмма экстракта жидкого «Тантон» 1 – апигенин (Rf=5,23), 2 – гесперидин (Rf=10,03), 3 – рутин(Rf=13,30), 4 – гиперозид (Rf=15,37), 5 – нарингенин(Rf =22,10), 6 – галловая кислота(Rf=4,73), 7 – коричная кислота(Rf=4,28), 8 – хлорогеновая кислота(Rf=5,23), 9 – цикориевая кислота(Rf =5,58), 10 – феруловая кислота(Rf =9,16), 11 – глицерризиновая кислота(Rf =20,06).
Установлен качественный и количественный аминокислотный состав экстракта жидкого «Тантон» (Табл.8).
В результате исследований установлено 23 свободных аминокислот, из них 6 незаменимых: треонин, метионин, фенилаланин, лизин, лейцин, триптофан;
после гидролиза обнаружено 17 аминокислот.
Количественная стандартизация экстракта жидкого «Тантон» Таблица Аминокислотный состав экстракта жидкого «Тантон» № Наименование Содержание в 1 г сухого остатка п/п аминокислоты жидкого экстракта, мкг свободных связанные аминокислот аминокислоты 1 гидроксипролин 2208, 2 476,4 3072, треонин 3 серин 411,4 9602, 4 аспаргин 1246,7 5 глутаминовая кислота 5608,2 6732, 6 глютамин 1426,7 7 -аминоадипиновая 9193,7 8 глицин 4745,9 892, 9 аланин 98,9 1648, 10 цитруллин 2538,4 11 цистин 1620,4 12 2978,6 103, метионин 13 цистатионин 2502,7 14 460,7 585, лейцин 15 тирозин 1048,6 380, 16 190,6 656, фенилаланин 17 бета-аланин 158,2 18 -аминоизомаслянная 87,8 кислота 19 этаноламин 334,0 20 орнитин 1204,9 21 36,3 426, лизин 22 гистидин 103,8 125, 23 166,1 триптофан 24 аргинин - 4305, 25 аспарагиновая кислота - 10929, 26 пролин - 9238, 27 валин - 1170, 28 изолейцин - 596, 29 -аминомаслянная кислота - 1204, Примечание: *- незаменимые аминокислоты, «-» - не обнаружено проводится по сумме флавоноидов (0,01940,0007%) и сумме восстанавливающих моносахаров полисахаридного комплекса (1,270,05%).
Разработка способа получения и стандартизация биологически активной добавки к пище - чая «Арура Тан №7» Чай «Арура Тан №7» является многокомпонентной растительной композицией, содержащей пять различных видов сырья: растения адаптогены (корневища и корни родиолы розовой, корневища и корни элеутерококка колючего), растение, обладающее широким спектром фармакологического действия (корни солодки), а также растения, способные возместить недостаток витаминов и микроэлементов (побеги черники, траву чабреца). Согласно схеме разработки средств на основе лекарственных растений учитывались фармакологические свойства, химический состав, официнальность каждого вида сырья и их сырьевая обеспеченность.
В результате проведенного исследования выбран состав из официнального растительного сырья (из расчета на 1 кг в г):
элеутерококка корневища и корни – 200,0;
родиолы розовой корневища и корни – 150,0;
солодки корни – 200,0;
черники побеги – 200,0;
чабреца трава – 250,0.
По числовым показателям образцы сырья соответствовали требованиям НД.
Химический состав чая «Арура Тан №7». Разработка показателей подлинности, чистоты и методик количественного определения БАВ Наличие БАВ (флавоноидов, дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот) установлено качественными реакциями с водными извлечениями и методом ТСХ в присутствии свидетелей ГСО, РСО, СОВС и чистых индивидуальных соединений, а также методами ВЭЖХ, ГХ. Проведен товароведческий анализ чая, определены числовые показатели:
экстрактивных веществ – не менее 15%, влажности – не более 12%;
золы общей – не более 10%;
золы нерастворимой в 10% НСl – не более 2%;
органической примеси – не более 2%;
минеральной примеси – не более1%.
Идентификация веществ методом ВЭЖХ Обнаружены: флавоноиды (апигенин, лютеолин, кверцетин, кемпферол, лютеолин-7-гликозид, рутин, ликурозид);
катехины (катехин, галлокатехингаллат, эпигаллокатехин);
оксикоричные кислоты (кофейная, хлорогеновая, галловая);
сирингинин, арбутин, глицирризиновая кислота (Рис.7).
Методом ВЭЖХ идентифицированы вещества: органические кислоты (щавелевая кислота, лимонная, винная, яблочная, янтарная);
свободные сахара (глюкоза, лактоза, рамноза, сахароза), сирингин, розавин.
Идентификацию компонентов эфирного масла чая «Арура Тан №7» выполняли методом ГХ-МС (Рис. 8). Выход эфирного масла составил Рисунок Хроматограмма извлечения чая «Арура Тан №7» 1 - галловая кислота, 2 – арбутин, 3 – кемпферол, 4 – катехин, 5 кофейная кислота, 6 - хлорогеновая кислота, 7 – эпигаллокатехин, 8 – галлокатехингаллат, 9 – лютеолин, 10 - лютеолин-7-гликозид, 11 – апигенин, 12 - глицирризиновая кислота, 13 – рутин, 14 – ликурозид, 15 – кверцетин Рисунок Хроматограмма эфирного масла чая «Арура Тан №7» Abundance TIC: 123.D 20. 28. 55000 26. 10. 20.33 29. 15.64 24. 27. 22. 11.86 24. 10000 26.55 29.06 31. 31. 7. 8. 8. 7.63 16. 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30. Time- меньше 0,1%. Выделенное эфирное масло желто-зеленого цвета, обнаружено 21 вещество, основным компонентом масла являются тимол (56,92% от эф. масла), -бисаболен (7,08%), спатчуленол (8,45%), п-цимол (4,98%), карвакрол (3,24%), окись кариофиллена (3,98%).
Количественное определение основных БАВ проводили с использованием физико-химических методов: восстанавливающих моносахаров полисахаридного комплекса- методом спектрофотометрии;
органических кислот и дубильных веществ – титриметрически;
суммы элеутерозидов, розавина и глицирризиновой кислоты - методом ВЭЖХ, разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов и суммы элеутерозидов (Табл.9).
Таблица Количественное содержание основных БАВ в чае «Арура Тан №7» БАВ f X, S Sx P, t Х E,% % % (P,f ) Глицирризинов 4 1,59 0,05 0,022 95 2,78 0,0622 ±3, ая кислота Сумма 4 0,03 0,0007 0,0003 95 2,78 0,0009 ±3, элеутерозидов 8 5 в пересчете на сирингин Розавин 4 0,05 0,0007 0,0003 95 2,78 0,0009 ±3, 7 6 Органические 4 1,28 0,019 0,0085 95 2,78 0,023 ±1, кислоты Дубильные 4 4,45 0,09 0,04 95 2,78 0,11 ±2, вещества Сумма 4 6,3 0,158 0,07 95 2,78 0,195 ±3, восстанавлива ющих моносахаров полисахаридно го комплекса Сумма 4 1,24 0,023 0,0103 95 2,78 0,0286 ±1, флавоноидов в пересчете на рутин Разработка и стандартизация экстракта сухого «Арура Тан №7» Оптимизирована технология получения экстракта сухого из растительного чая «Арура Тан №7». Изучено влияние технологических факторов на выход БАВ из растительной композиции, контроль выхода БАВ проводили по экстрактивным веществам и сумме флавоноидов. По результатам проведенных исследований предложена технологическая схема производства сухого экстракта из растительного чая «Арура Тан№7» : (экстрагент – вода, t=(80-90°C);
кратность экстракции - 3;
время первой экстракции 1 час, второй - 30 минут;
третьей – 30 минут.
Полученный сухой экстракт представляет собой аморфный порошок от светлокоричневого до коричневого цвета со специфическим запахом.
Гигроскопичен, комкуется. Насыпная масса свободнонасыпанного порошка экстракта сухого (В) составляет 0,480г/см3, сыпучесть – 1,90 г/с, угол естественного откоса 35-37°. Потеря в массе при высушивании - не более 6%. Экстракт сухой растворим в горячей воде, водно-спиртовых смесях (20-60%). Сульфатная зола из 1,00 г выдерживает испытания на тяжелые металлы – не более 0,001%. Количественная стандартизация полученного продукта осуществлена по флавоноидам.
Проведено фитохимическое исследование полученного экстракта сухого методами бумажной, тонкуослойной хроматографии и ВЭЖХ.
Установлено наличие в экстракте основных групп БАВ: дубильные вещества, флавоноиды, сахара, тритерпеноидные сапонины, органические кислоты, глицирризиновая кислота, сирингин и розавин. Количественное содержание основных БАВ приведено в таблице 10.
По разработанной схеме получено пять серий экстракта, заложенных на хранение. Разработанные показатели качества: описание внешенего вида, подлинность, потеря в массе при высушивании, содержание суммы флавоноидов, которые включены в нормативные документы. Срок хранения экстракта сухого «Арута Тан№7» установлен в обычных условиях и составляет – не менее 2 лет.
Разработка и стандартизация средства «Иммунофит» Считается, что высокая фармакотерапевтическая эффективность многокомпонентных средств обусловлена гармоничным сочетанием содержащихся биологически активных веществ в исходных видах растительного сырья (Николаев С.М., 1986). В настоящее время существуют различные подходы к составлению сложных комплексных лекарственных препаратов. В тибетской и монгольской медицинских системах все лекарственные средства применяются в виде многокомпонентных смесей. В рецепты входят от трех до несколько десятков ингредиентов. Такая сложность рецептуры находит свое обоснование в принципах лечения, принятых в традиционной медицине Таблица Количественное содержание основных БАВ в экстракте сухом «Арура Тан №7» БАВ f X,% S Sx P, t Х E,% % (P,f) Глицирризиновая 4 3,01 0,06 0,027 95 2,78 0,075 ±2, кислота Сумма 4 0,04 0,00078 0,000 95 2,78 0,001 ±2, элеутерозидов, в 35 пересчете на сирингин Розавин 4 0,06 0,00077 0,000 95 2,78 0,000 ±1, 36 Органические 4 2,28 0,030 0,013 95 2,78 0,036 ±1, кислоты Дубильные вещества 4 8,71 0,2000 0,089 95 2,78 0,254 ±2, 93 Сумма 4 15,3 0,158 0,07 95 2,78 0,195 ±1, восстанавливающих моносахаров полисахаридного комплекса Сумма флавоноидов, 4 2,05 0,04 0,018 95 2,78 0,050 ±2, в пересчете на рутин Тибета и Монголии. Согласно этим принципам лекарство должно одновременно действовать не только на разные симптомы болезни или на ее причину, но также регулировать обмен веществ и укреплять организм больного. Суть заключается в одновременном применении препаратов из трех основных групп: направленных на устранение (ослабление) причины заболевания, уменьшение патогенетических изменений, которые сопровождают болезнь, и усиление (мобилизацию) защитных, компенсаторно-приспособительных механизмов организма. Таким образом, многокомпонентные сборы - это своеобразные регулирующие комплексы, которые действуют на различных уровнях организации функциональных систем организма.
Прототипом модифицированного адаптогенного средства с иммуномодулирующим эффектом послужила тибетская пропись «ли-ши сум-тханг», что означает в переводе с тибетского «Гвоздика-3». В практике традиционной медицины Тибета и Монголии отвар лекарственной смеси «Гвоздика-3» применяется при расстройстве системы мкхрис (пищеварения), а также заболеваниях селезенки (Тибетский чжор – новый сборник рецептов, 1975;
Ганбаяр,2001). В состав прописи входят бутоны цветков гвоздики, плоды шиповника и боярышника. Для усиления иммуномодулирующих свойств в состав сбора были включены четыре официнальных растения, обладающие выраженными иммуномодулирующими свойствами. При разработке нового лекарственного препарата на основе тибетской прописи "гвоздика 3" отбор растений для фитосбора проведен из списка официальных растений, применяемых в тибетской медицине. Разработка рецептуры нового лекарственного препарата "гвоздика-7" осуществлена путем анализа сведений из источников тибетской медицины, а также современных данных о фармакологической активности официнальных лекарственных растений. В состав нового фитосбора "гвоздика-7" включены: 1. горец птичий;
2. девясил высокий;
3. крапива двудомная;
4.
подорожник большой (Баторова С.М. и др, 1989).
Химическая характеристика растительной композиции «Иммунофита» В составе композиции содержатся лекарственные растения - девясил высокий (Inula helenium L., сем. Asteraceae Dumort) и гвоздика (Eugenia caryophyllata Thunb, сем. Myrtaceae), одним из основных действующих веществ которых является эфирное масло (Машанов, Покровский, 1991).
Методом перегонки с водяным паром выделено эфирное масло из композиции, выход составил 0,72±0,03%. Методом ГХ-МС исследован компонентный состав масла. Хроматограмма эфирного масла сбора представлена на рисунке 9.
Рисунок Хроматограмма эфирного масла растительной композиции «Иммунофит» Время удерживания, мин Идентифицировано более 20 соединений. Основные из них – оксид кариофилена, эвгенол, кариофилен, -кариофилен, -фарнезен и другие – представлены в таблице 11. Известно, что эвгенол является основным компонентом эфирного масла бутонов гвоздики, содержание его в эфирном масле бутонов гвоздики достигает 40% (Машанов В.И., Покровский А.А., 1991).
Таблица Основные компоненты эфирного масла растительной композиции «Иммунофит» Наименование вещества Время удерживания, мин Эвгенол 22, Кариофилен 24, 25, - кариофилен 25, -фарнесен Миртенил ацетат 27, Оксид кариофилена 28, Дибутилфталат 36, Производное нафтофурана 36, Методом ВЭЖХ обнаружены апигенин, рутин, коричная и феруловая кислоты (Рис.10).
Рисунок Хроматограмма флавоноидов растительной композиции «Иммунофит» Время удерживания, мин 1 – апигенин, 2 – коричневая кислота, 3 – феруловая кислота, 4 – рутин Разработка, стандартизация и внедрение рациональной готовой формы Установлены технологические свойства чая. Разработана и оптимизирована технология получения экстракта жидкого «Иммунофит»:
оптимальный экстрагент 35-40% спирт этиловый, степень измельчения (2-3)мм, соотношение сырье-экстрагент (1:10-12), коэффициент поглощения сырья - 1,2. Контроль выхода БАВ из чая осуществляли по выходу суммы флавоноидов и экстрактивных веществ. Для количественной стандартизации разработана методика количественного определения флавоноидов в пересчете на рутин.
Таблица Аминокислотный состав растительного средства «Тантон» Содержание аминокислот, мкг/г Высушенное водное Высушенный экстракт Аминокислоты извлечение сбора (1:10) «Тантон» свободные связанные свободные связанные Аспарагиновая к-та 471,31 7420,33 936,49 6362, 327,05 786,06 308,23 533, Треонин Серин 660,34 1139,28 489,87 795, Аспарагин 3352,43 - 1682,43 Глутаминовая кислота 838,32 7128,47 1496,01 4485, Глутамин 898,55 - 9332,38 Пролин 4715,76 6679,25 6006,95 5764, Глицин 66,91 1090,45 41,01 627, Аланин 943,48 1814,08 1053,96 1256, 1156,71 1559,77 748,97 875, Валин Цистин 1943,79 - 3913,05 777,78 80,57 1336,53 76, Метионин 348,21 763,58 398,55 585, Изолейцин 446,00 839,68 524,54 447, Лейцин Тирозин 232,12 654,13 234,65 462, 260,69 758,27 223,35 488, Фенилаланин 597,67 1155,75 578,39 808, -аминомаслянная кислота Орнитин 58,30 - 32,78 107,75 725,15 65,94 423, Лизин Гистидин 150,23 725,15 62,24 423, 60,86 - 55,24 -аланин Цистеиновая кислота 306,42 - 772.23 Аргинин - 4900,25 - 3267, Примечание: *- незаменимые аминокислоты, «-» - не обнаружено Установлен аминокислотный состав водного извлечения из растительной композиции и экстракта жидкого. Результаты исследований представлены в таблице 12. Как следует из представленных в таблицах данных, разработанное средство богато аминокислотами. Обнаружено аминокислоты в свободном состоянии и 17 аминокислот после кислотного гидролиза. Отмечается значительное содержание аспарагиновой кислоты, аспарагина, пролина, валина, цистина, аргинина, глутаминовой кислоты, глицина, аланина, -аминомаслянной кислоты. В исследуемом средстве обнаружено 7 незаменимых аминокислот - треонин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин.
Определен микроэлементный состава указанной композиции и полученного экстракта жидкого. Отмечается наибольшее содержание кальция, магния, натрия, кремния, фосфора, а также присутствие в значительных количествах марганца, железа, бария, меди, натрия, которые легко переходят в жидкий экстракт. Фармакологическими исследованиями подтверждена безопасность, общая фармакологическая и специфическая адаптогенная активность полученных средств.
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 1. Cформулированы научно-методические подходы к поиску и изучению растительных адаптогенных средств, которые заключаются в отборе растений с адаптогенным, иммуномодулирующим действием, имеющих достаточный ресурсный потенциал, поэтапном фармакогностическом изучении и разработке новых растительных средств на их основе в виде чаев, экстрактов (жидких, сухих) и гранул.
2. Экспериментально обоснованы составы многокомпонентных растительных композиций для получения экстракционных средств «Тантон», «Арура Тан №7», «Иммунофит», обладающих адаптогенной активностью.
3. Впервые в побегах P. fruticosa идентифицировано высокомолекулярных жирных кислот, из них незаменимые - линоленовая, арахидоновая, докозагексановая;
установлено содержание суммы флавоноидов (от 2 до 5%), дубильных веществ (от 11 до 19%), полисахаридов (от 1 до 3%), аскорбиновой кислоты (от 1 до 2%);
идентифицированы кислоты - коричная, хлорогеновая, кофейная, цикориевая, феруловая;
флавоноиды - лютеолин-7-гликозид, апигенин, робинин, гиперозид, рутин, дигидрокверцетин, кверцетин;
качественно и количественно определено 21 аминокислоты, из них 7 незаменимых.
4. Для растительного сырья - побегов P. fruticosa установлены основные анатомо-диагностические признаки, необходимые для подтверждения подлинности, заключающиеся в особенностях строения верхнего и нижнего эпидермиса;
определена урожайность побегов P.
fruticosa в пяти ценопопуляциях в Баргузинском, Селенгинском, Тарбагатайском районах Республики Бурятия.
5. Изучен качественный и количественный состав трех исходных чаев «Тантон», «Арура Тан №7», «Иммунофит»;
установлен компонентный состав эфирных масел «Тантон», «Иммунофит», «Арура Тан №7»;
в чае «Тантон» установлено содержание гиперозида 1,130, мкг/г, кверцетина 0,500,02 мкг/г, галловой кислоты 5,900,30 мкг/г;
в чае «Арура Тан №7» - глицирризиновой кислоты 1,590,06%, розавина 0,500,09 мг/г;
в чае «Иммунофит» идентифицированы апигенин, рутин, кислоты – коричная, феруловая;
определен аминокислотный, жирнокислотный, минеральный состав средств;
количественно установлено содержание основных БАВ в чаях и готовых формах «Тантон», «Иммунофит», «Арура Тан №7».
6. Разработаны по доминирующим биологически активным веществам показатели качественной и количественной стандартизации сырья, сухого экстракта, гранул побегов P. fruticosa;
чаев и экстрактов «Тантон», «Арура Тан №7», «Иммунофит»;
разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в чаях «Тантон», «Арура Тан №7», «Иммунофит»;
полисахаридов в чае «Тантон».
7. В результате проведенных исследований определены физико химические свойства экстракта сухого Pentaphylloidi fruticosae, а также технологические характеристики: экстракт не обладает сыпучестью, гигроскопичен, имеет небольшую насыпную массу, неоднородный фракционный состав;
с учетом этого обоснован режим грануляции.
8. Оптимизированы режимы экстрагирования биологически активных веществ из многокомпонентных растительных композиций «Тантон», «Арура Тан №7», «Иммунофит», обеспечивающие максимальный выход БАВ, и с учетом этого разработаны технологии получения экстрактов жидких «Тантон», «Иммунофит» и экстрактов сухих из побегов P.
fruticosa и «Арура Тан №7».
9. Разработана и представлена нормативная документация на биологически активные добавки к пище, обладающие адаптогенной активностью – «Арура Тан №7», «Арура-Тан№8» (ТУ, ТИ, Рецептура);
зарегистрированы БАД к пище «Арура Тан №7», «Арура-Тан№8», (№ РУ 77.99.11.3.У.2757.4.10 от 28.04.2010, №РУ 77.99.11.3.У.3233.4.10 от 14.04.2010).
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ 1. Николаева И.Г. Химико-фармакологическое изучение экстракта пятилистника кустарникового сухого /И.Г. Николаева, Т.А. Асеева, О.Д.
Цыренжапова, Л.Б. Бураева, С.М. Николаев, П.Б. Лубсандоржиева, Г.Г.
Николаева //Химико-фармацевтический журнал. -1999. - 33, №7. - С. 36 37.
2. Хобракова В.Б. Иммуномодулирующие свойства сухого экстракта из побегов Pentaphylloides frutucosa (L.)О.Schwarz /В.Б.
Хобракова, С.Д. Жамсаранова, С.М. Николаев, С.Н. Лебедева, О.Д.
Цыренжапова, И.Г. Николаева // Растительные ресурсы. – 2000. – Т.36. вып. 1. - С.45-52.
3. Николаева И.Г. Запасы сырья Pentaphylloides fruticosa (L.) O.Schwarz в некоторых районах Бурятии /И.Г. Николаева, С.С. Ломбоева, Т.А. Асеева //Растительные ресурсы. – 2004. – вып. 2. - С. 38-42.
4. Парьева К.В. Изучение химического состава многокомпонентного растительного сбора «Тантон» хроматографическими методами /К.В. Парьева, Г.Г. Николаева, И.Г.
Николаева, А.Л. Верещагин, А.Г. Горшков //Сибирский медицинский журнал. – 2004. – Т. 44, №3. – С. 66-69.
5. Николаева И.Г. Разработка и исследование нового средства «Иммунофит», созданного на основе прописей тибетской медицины /И.Г.
Николаева, В.Б. Хобракова, С.М. Баторова, Г.Г. Николаева, С.М.
Николаев, А.Г. Горшков, А.Л. Верещагин, К.В. Парьева, Х.П. Монголов //Химико-фармацевтический журнал. – 2005. -Т. 39. -№8. – С. 37-40.
6. Николаева И.Г. Компонентный состав эфирного масла нового иммуномодулирующего средства /И.Г. Николаева, Г.Г. Николаева, К.В.
Парьева, В.Б. Хобракова, С.М. Баторова//Вестник БГУ, Химия, Вып.2. – 2005. - С. 147-149.
7. Парьева К.В. Изучение химического состава многокомпонентного растительного сбора «Тантон» хроматографическим методом /К.В.
Парьева, Г.Г. Николаева, И.Г. Николаева, И.Г. Етобаева //Вестник БГУ, Химия. Вып. 2. - 2005. – С. 143-146.
8. Николаева И.Г. Аминокислотный состав многокомпонентного растительного средства /И.Г. Николаева //Вестник БГУ. Медицина. Вып.
6. - 2006. – С. 107-110.
9. Nikolaeva I.G. Polyphenolic compounds from Pentaphylloides fruticosa and P. parvifolia /I.G. Nikolaeva //Chemistry of Natural Compounds Vol. 43, No. 4. - 2007. – P. 476-477.
10. Николаева И.Г. Разработка растительного средства, обладающего стресс-протективным действием /И.Г.Николаева, Л.Н. Шантанова, Г.Г.
Николаева, С.М. Николаев, К.В. Парьева, И.К. Иванова //Химико фармацевтический журнал. - Т. 41, №11. – 2007. – С. 41-45.
11. Nikolaeva I.G. Amino acids from Pentaphylloides fruticosa and P.
parvifolia / I.G. Nikolaeva//Chemistry of Natural Compounds - Vol. 43. -№ 6. 2007.- P. 760-761.