Структурно-функциональное исследование биополимеров растительного и грибного происхождения и совершенствование методов их анализа
На правах рукописи
Оленников Даниил Николаевич СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БИОПОЛИМЕРОВ РАСТИТЕЛЬНОГО И ГРИБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИХ АНАЛИЗА 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук
Улан-Удэ - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН
Научный консультант:
доктор химических наук, профессор РОХИН АЛЕКСАНДР ВАЛЕРЬЕВИЧ
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор кафедры неорганической и аналитической химии ФГБОУ ВПО Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления Минобрнауки России АНЦУПОВА ТАТЬЯНА ПЕТРОВНА доктор фармацевтических наук, профессор кафедры фармацевтической химии ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России КРАСНОВ ЕФИМ АВРААМОВИЧ доктор химических наук, профессор, заместитель директора по НИР ФГУН Байкальский институт природопользования СО РАН МОГНОНОВ ДМИТРИЙ МАРКОВИЧ
Ведущая организация:
ГНУ ВСЕРОССИЙСКИЙ ИНСТИТУТ ЛЕКАРСТВЕННЫХ И АРОМАТИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ РАСХН
Защита состоится “22” мая 2012 г. в 1000 час. на заседании диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Федеральном государственном учреждении науки Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г.
Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул.
Сахьяновой, 6.
Автореферат разослан “_” _ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ХОБРАКОВА В.Б.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Биополимеры в последние годы привлекают внимание многих исследователей в связи с тем, что ранее считавшиеся инертными, они оказались веществами с широким спектром биологической активности (Оводов, 1998, 2009;
Ebringerova et al., 2000). К числу наиболее часто изучаемых макромолекулярных соединений природного происхождения после белков относятся углеводные (полисахариды) и фенольные биополимеры (меланины) (Heinze et al., 2006). Наличие практической значимости и фармакологической активности выявлено для всех известных классов полисахаридов и меланинов, поэтому экспериментальные работы в настоящее время ориентированы в таких направлениях, как исследование структуры, разработка технологий производства, химическая модификация, поиск новых источников, определение биологической активности и расширение спектра их практического применения (Медведева и др., 2003;
Щербухин, Анулов, 1999).
Несмотря на более чем вековую историю химии биополимеров, объем экспериментальной и теоретической информации продолжает увеличиваться с каждым годом, что свидетельствует о неугасающем интересе к данным природным соединениям (Arifkhodzhaev, 2000).
Кроме макромолекулярных соединений растительного происхождения особый интерес вызывают грибные метаболиты как перспективные фармакологические агенты (Mizuno, 1985;
Moradali et al., 2007;
Wasser, 1999).
Учитывая недостаточную степень изученности базидиальных видов, актуальными остаются химико-биологические исследования грибов, произрастающих на территории России, а также полученных с применением биотехнологических способов (Babitskaya et al., 1996).
Биополимеры являются большей частью гидрофильными соединениями и входят в число обязательных компонентов практически любых экстракционных форм из лекарственного сырья. Однако степень изученности этих веществ даже для фармакопейных видов не превышает 30-40% (Зуева и др., 2010). С целью формирования полной картины химических и фармакологических влияний подобных препаратов на организм человека необходимо расширение сведений о структуре компонентов и биологической активности для видов, разрешенных к применению в медицинской практике.
Наряду с химическими исследованиями необходимыми остаются исследования по разработке современных методов стандартизации препаратов.
Анализ имеющейся к настоящему времени нормативной документации свидетельствует о том, что существующие подходы в ряде случаев не позволяют получать адекватные результаты: приемлемы для ограниченного числа объектов, обладают низкой воспроизводимостью результатов и мало пригодны для использования в системе надлежащей лабораторной практики (Бовтенко и др., 2009). В этой связи востребованными являются комплексные экспериментальные работы по созданию схем анализа, учитывающих индивидуальные особенности химического состава лекарственного сырья и препаратов и характеризующихся удовлетворительными валидационными параметрами.
Таким образом, исследования в области изучения структуры, биологической активности и разработки методов анализа биополимеров растительного и грибного происхождения являются актуальными.
ЦЕЛЬЮ РАБОТЫ является определение состава, структуры и биологической активности полисахаридов и меланинов растительного и грибного происхождения и совершенствование методов исследования углеводов в лекарственном сырье.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие ЗАДАЧИ:
1) провести химическое исследование полисахаридов семейств Lamiaceae, Fabaceae, Asteraceae, Ericaceae и Plantaginaceae для выявления перспективных источников биологически активных и промышленно важных полисахаридов;
2) провести химическое исследование пряно-вкусовых и суккулентных растительных видов как нетрадиционных источников полисахаридов;
3) провести химическое исследование полисахаридов биотехнологически перспективных видов базидиомицетов;
4) провести химическое исследование меланинов ферментированного растительного сырья семейства Lamiaceae и стерильных форм базидиомицетов;
5) разработать рациональные методические подходы к выбору критериев подлинности и количественному анализу лекарственного сырья, нормируемого по содержанию полисахаридов;
6) разработать унифицированную систему стандартизации углеводных компонентов в лекарственном сырье;
7) выявить особенности строения биополимеров, обусловливающих наличие иммуномодулирующей и антиоксидантной активности.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые проведено исследование и получены данные о содержании и строении биополимеров в 114 объектах растительного (111 видов, 17 сем.) и грибного происхождения (3 вида, 3 сем.) и выделено 183 полимера структурных типов углеводной (173) и фенольной природы (10), представителей классов гомо-, гетерополисахаридов и меланинов. Выделены полисахариды новых структурных типов: частично ацетилированные глюкоарабиногалактаны из семейства Lamiaceae, разветвленный -глюкан (пиптопоран I) из плодовых тел Piptoporus betulinus (Piptoporaceae).
В результате исследования полисахаридов 45 видов семейства Lamiaceae установлено присутствие в них -4,6-глюканов, глюко-1,2-фруктанов, арабино 3,6-галактанов, 1,6-галактанов, гомогалактуронанов, рамногалактуронанов, арабиногалактан-протеиновых комплексов. Выявлена возможность применения некоторых групп полисахаридов в качестве маркерных соединений при хемосистематической характеристике данного семейства.
В 12 видах семейства Fabaceae впервые выявлено присутствие галактоманнанов (Astragalus, Gleditsia, Glycyrrhiza, Gueldenstaedtia, Oxytropis). В родах Caragana, Onobrychis, Sophora и Vicia в качестве доминирующих определены -4,6-глюканы. Для скринингового анализа состава галактоманнанов предложен методический подход с использованием данных поляриметрического анализа.
Выявлены новые источники инулина в видах семейства Asteraceae и установлено, что для родов Cacalia, Cirsium, Echinops, Lactuca, Scorzonera, Stemmacantha характерно накопление линейных поли- и олигоглюкофруктанов. В составе полисахаридов листьев Cacalia hastata установлено присутствие арабиногалактанов и галактуронанов, обладающих гипогликемическим и ранозаживляющим действием.
Установлено, что доминирующими полисахаридами некоторых видов пряно вкусовых растений (Elettaria cardamomum, Myristica fragrans, Piper nigrum, Pimenta dioica, Zingiber officinale) являются -4,6-глюканы разной степени разветвленности. Выявлено, что доминирующими полисахаридами суккулентных видов являются галактуронаны, арабинаны, арабиногалактаны (Agave), фруктаны (Brasilopuntia, Opuntia), маннаны (Aloe, Kalanchoe), глюкозаминаны (Callisia).
В составе полисахаридов плодовых тел Laetiporus sulphureus, полученных с применением метода природных плантаций, установлено присутствие гетероглюканов, гликопротеидов, линейных -1,3-, -1,3-глюканов и разветвленного -3,6-глюкана. В склероциях Inonotus obliquus обнаружены линейные -1,3- и -1,3-глюканы.
Впервые установлено строение меланинов ферментированных листьев некоторых видов семейства Lamiaceae и показано, что они представляют собой высокомолекулярные соединения с м.м. 4-10 кДа, содержащие конденсированные участки и боковые группы в виде гидрокси- и метоксибензольных остатков.
Установлено, что склероции Laetiporus sulphureus способны к накоплению меланина дигидронафталинового типа, впервые обнаруженного в базидиальном виде. Показано, что меланин склероциев Inonotus obliquus представляет собой гетерогенный комплекс, состоящий из высокоароматичных полимеров с молекулярной массой 2-20 кДа, высоким содержанием карбоксильных и фенольных гидроксильных групп. Установлено, что химическая дериватизация (ацетилирование, дезацетилирование, восстановление) влияет на спектральные свойства меланинов. Показано, что растительные и грибные меланины обладают высокой антиоксидантной, антирадикальной и хелатирующей активностью.
Показано, что на выраженность иммуномодулирующей и антиоксидантной активности растительных полисахаридов оказывает влияние степень разветвления основной цепи макромолекулы.
Разработана методика ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.
количественного определения глюкофруктанов в растительном сырье с применением модифицированного резорцинового метода, рекомендованная для анализа сырья и препаратов корней девясила, лопуха и одуванчика. Разработана методика количественного определения полисахаридов в растительном сырье с применением модифицированного антрон-серного метода. Предложен методический подход для определения группового состава углеводов в растительном сырье с использованием комбинации экстракционного метода Бейли и модифицированного антрон-серного метода. Разработанная методика рекомендована для анализа полисахаридов в 23 видах растительного сырья и показана ее эффективность для дальнейшего использования в практике фармацевтического анализа. Разработана унифицированная схема анализа углеводов в растительном сырье, представляющая собой алгоритм выбора критериев подлинности и метода количественного определения для сырья, нормируемого по содержанию полисахаридов. Данная схема позволяет проводить адекватную стандартизацию растительных объектов.
НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ:
1.Результаты исследования структуры новых полисахаридов: частично ацетилированных глюкоарабиногалактанов из семейства Lamiaceae и разветвленного -глюкана (пиптопорана I) из плодовых тел Piptoporus betulinus.
2.Обоснование возможности использования полисахаридов как хемосистематических маркеров семейства Lamiaceae.
3.Данные о составе и строении полисахаридов из нетрадиционных видов растительного сырья: пряно-ароматических и суккулентных видов.
4.Результаты исследования меланинов ферментированного растительного сырья семейства Lamiaceae и стерильных форм базидиомицетов.
5.Обоснование возможности использования унифицированной схемы анализа углеводов в растительном сырье.
6.Данные по иммуномодулирующей и антиоксидантной активности растительных полисахаридов.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты диссертации были доложены и обсуждены на: VI, VII Международных конференциях «Биоантиоксидант» (Москва, 2002, 2006);
IV Международной научно-практической конференции “Здоровье и образование в XXI веке” (Москва, 2003);
IV Международной конференции “Актуальные проблемы современной науки” (Самара, 2003);
Международных научных школах-конференциях “Экология Южной Сибири и сопредельных территорий” (Абакан, 2003, 2005);
Международной конференции “Дорно-орнийн анагаах ухааны хосолмол тогтолцоо” (Улан-Батор, 2005);
II Международном симпозиуме “Chemistry of Herbal Medicine and Mongolian Drugs” (Улан-Батор, 2006);
VII Международном симпозиуме по химии природных соединений (Ташкент, 2007);
IV Международном симпозиуме “Traditional Medicine and Herbal Drugs” (Улан-Батор, 2009);
Всероссийском научно практическом молодежном симпозиуме “Экология Байкала и Прибайкалья” (Иркутск, 1999);
VIII, IX, X Российском национальном конгрессе “Человек и лекарство” (Москва, 2001, 2002, 2003);
Всероссийской молодежной научно технической конференции “Молодые ученые Сибири” (Улан-Удэ, 2003);
II Всероссийской конференции “Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья” (Барнаул, 2005);
Всероссийской конференции “Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии” (Улан-Удэ, 2006);
IV Всероссийской конференции “Химия и технология растительных веществ” (Сыктывкар, 2006);
Всероссийской конференции “Экология в современном мире:
взгляд научной молодежи” (Улан-Удэ, 2007);
II съезде микологов России (Москва, 2008).
ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА. Вклад автора состоял в формировании направления исследования, активном участии во всех этапах исследования, постановке конкретных задач и их экспериментальном решении, интерпретации и обсуждении экспериментальных данных. Диссертационная работа представляет собой обобщение результатов многолетних исследований, полученных автором лично.
РАБОТАВЫПОЛНЕНА В РАМКАХ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ ПРОГРАММ И ПРИ ФИНАНСОВОЙ ПОДДЕРЖКЕ интеграционного проекта №54 “Научные основы разработки новых лекарственных препаратов. Перспективы использования возобновляемого сырья”;
гранта РФФИ 08-04-98045 “Влияние природных факторов среды на характер накопления биологически активных веществ в плодовых телах дереворазрушающих грибов Прибайкалья”;
проекта СО РАН №VI.52.1.3. “Молекулярно-клеточные механизмы стресс-индуцированных патологических состояний и коррекция их средствами природного происхождения”;
проекта №VI.44.1.7. “Структурная организация и динамика компонентов растительного покрова в условиях климатических изменений”;
Лаврентьевского конкурса молодежных проектов СО РАН, проект №6. “Структурно-функциональное исследование биополимеров растительного и базидиального происхождения как соединений с иммуностимулирующей и антиоксидантной активностью”.
ПУБЛИКАЦИИ. По результатам диссертационной работы получено 2 патента РФ на изобретение и опубликовано 112 научных работ, в том числе 68 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 310 печатных страницах, состоит из введения, основной части (6 глав), заключения, списка цитируемой литературы, состоящего из 463 источников, в том числе 447 на иностранных языках, и включает 55 рисунков, 101 таблицу и 3 приложения.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Объекты исследования были собраны в различных районах республики Бурятия, Алтайского края, Иркутской и Новосибирской областей, а также приобретены через аптечную сеть. Общее содержание углеводов определяли фенол-сернокислотным методом (Dubois et al., 1956), уроновых кислот – 3,5-диметилфенол-сернокислотным методом (Usov et al., 1995), белка – по методу Бредфорд (Bradford, 1976);
метоксильные/ацетильные группы определяли после гидролиза с NaOH/HCl методом ГЖХ (Tomoda et al., 1986). Реакцию на присутствие арабиногалактан-протеиновых комплексов (AGPs) проводили методом радиальной диффузии на агаровых дисках, импрегнированных реактивом Yariv (Biosupplies Australia Ltd.) (Diallo et al., 2001).
Полный кислотный гидролиз проводили в 2 М ТФУ (120°С, 6 ч), частичный кислотный гидролиз арабиногалактанов – 12.5 М (COOH)2 (100°С, 5 ч), галактуронанов – 1 М ТФУ (80°С, 6 ч), ферментативный гидролиз – с -амилазой и пектиназой. Получение частично метилированных альдитолацетатов проводили смесью NaOH/MeI в ДМСО с последующим гидролизом 90% НСООН и ацетилированием Ac2O в присутствии 4-N,N-диметиламинопиридина (Olennikov et al., 2009). Для определения состава аминокислот вещества гидролизовали 6 М HCl (110°С, 12 ч), и далее анализировали на автоматическом аминокислотном анализаторе ААА-339 (Microtechna).
Гель-хроматографию проводили на Сефадексе G-10, G-25, G-100, G- (Farmacia), Молселекте ДЭАЭ-25 (Reanal), Sephacryl 300 HR (Sigma-Aldrich Inc.), ионообменную хроматографию – на ДЭАЭ-целлюлозе (Sigma-Aldrich Inc.).
Диализ проводили в диализных тубах с пределом эксклюзии 2 кДа (Sigma-Aldrich Inc.). Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре СФ-2000 (ОКБ Спектр). ИК-спектры регистрировали на ИК-Фурье спектрометре ФТ-801 (Симекс) в пленке на ZnSe-окнах-подложках. ГХ/МС исследование проводили на хромато-масс-спектрометре 6890N, соединенном с масс квадрупольным детектором 5973N (Agilent Technologies). Спектры 1Н-, 13С-ЯМР регистрировали на ЯМР-спектрометре VXR 500S (Varian) для 1% растворов веществ в D2O, NaOD или d6-ДМСО.
ВЭЖХ моносахаридов проводили на жидкостном хроматографе Милихром А-02 (Эконова), колонка Separon 5-NH2 (802 мм, 5 м);
подвижная фаза MeCN H2O 3:1, v 0.1 мл/мин, Т 22°С;
УФ-детектор при 190 нм. ВЭЖХ полисахаридов проводили на жидкостном хроматографе Summit (Dionex), колонка TSK gel GMPxl (3007.8 мм, 5 м), подвижная фаза – H2O, v 1 мл/мин, Т 20°С, УФ детектор UVD 170S при 190 нм. Предварительную калибровку колонки проводили с применением стандартных декстранов с молекулярными массами 2000, 500, 100, 40 кДа (Sigma-Aldrich Inc.).
Иммуномодулирующую активность веществ определяли на модели азатиоприновой иммуносупрессии по методу Cunningham (1956) и согласно (Руководство …, 2005). При исследовании антиоксидантной активности определяли антирадикальную активность в отношении радикалов ДФПГ (DPPH) (Seyoum et al., 2006), АБТС (ABTS) (Ding et al., 2010), связывание супероксидных радикалов (SSA) – в неэнзиматической системе феназин метасульфата-НАДН (Ozen et al., 2011), инактивацию пероксида водорода (HIA) – в системе феноловый красны-пероксидаза (Badami, Channabasavaraj, 2007), связывание оксида азота (II) – с нитропруссидом натрия и реактивом Грисса (NOS) (Kumar et al., 2008), хелатирование ионов Fe2+ – фенантролиновым методом (FCA) (Оленников с соавт., 2009), Fe3+-восстановительную активность (FRAP) (Katalinic et al., 2006), пероксидную деградацию -каротина – в системе олеиновая кислота-ДМСО-Н2О (CBA) (Olennikov et al., 2011).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ УГЛЕВОДНЫЕ БИОПОЛИМЕРЫ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Полисахариды семейства Lamiaceae Впервые проведено систематическое исследование полисахаридных компонентов 45 видов семейства Lamiaceae. В составе нейтральных полимеров выявлено наличие представителей следующих классов:
-4,6-глюканы, глюко-1,2 фруктаны, арабино-3,6-галактаны, 1,6-галактаны. Присутствие полигалактуронанов как обязательных компонентов было обнаружено во всех изученных представителях Lamiaceae. Полимеры данного типа отличаются высоким содержанием галактуроновой кислоты (50-80%), наличием ацетилирования и метоксилирования основного кора и боковых цепей, общая степень этерификации может достигать 70% (высокоэтерифицированные пектины). В основной цепи макромолекулы всегда присутствуют остатки 1,2 связанной рамнозы, что позволяет определить пектины Lamiaceae как рамногалактуронаны. Присутствие белка, а также положительная реакция по Yariv указывает на наличие сложных арабиногалактан-протеиновых комплексов, также характерных для данного семейства.
Из некоторых представителей данного семейства выделены полимеры, отнесенные к новому классу полисахаридов – частично ацетилированные глюкоарабиногалактаны, обнаруженные в видах родов Glechoma, Lamium, Lophanthus, Panzerina, Schizonepeta и Scutellaria.
Частично ацетилированный глюкоарабиногалактан Panzerina lanata. Из надземной части P. lanata был выделен полисахарид PLWH-2 с м.м. 75.4 кДа, состоящий из Glc, Ara и Gal (1:1.5:4.0);
[]D20 +69 (с 1.8, Н2О). ИК-спектр (, см ): 3410, 2935, 1740, 1439, 1370, 1331, 1232, 1152, 1104, 1022, 921, 855, 829, 624, 534. По данным ГЖХ полисахарид содержит 12.3% ацетильных групп. В продуктах формолиза и гидролиза перметилата дезацетилированного полисахарида PLWH-2 обнаружены (ГХ/МС) 2,3,4-три-О-Ме-Galp, 3,4-ди-О-Ме Galp, 2,4-ди-О-Ме-Galp, 2,3,4-три-О-Ме-Arap, 2,3,4,6-тетра-О-Ме-Glcp в соотношении 1.50:1.14:1.09:1.49:1 и следы 2,3,4,6-тетра-О-Ме-Galp и 4-О-Ме Galp, т.е. основная цепь PLWH-2' построена из (16)-связанной галактопиранозы, часть которой замещена по С-2 и С-3 единичными остатками арабинопиранозы и глюкопиранозы.
Строение PLWH-2 и PLWH-2' далее исследовали с применением метода 13С ЯМР спектроскопии (табл. 1). Из положения сигналов атомов С-1 галактозы и глюкозы в спектре PLWH-2 следует, что их аномерные центры обладают конфигурацией, а арабиноза – -конфигурацией. Замещенные атомы С-2, С-3 и С 6 галактозы основной цепи резонируют при 81.74, 84.67 и 66.03 м.д., соответственно, а ацетильные группы – при 20.72 и 175.94 м.д. Для атома С- арабинозы наблюдается 2 сигнала, вызванных присутствием в PLWH-2 ее ацетилированных и неацетилированных остатков, соотношение интегральных интенсивностей которых составляет 1:3.95, т.е. 4 из 5 остатков арабинозы содержат ацетильную группу. Ацетилирование у С-3 арабинозы подтверждается наличием второго сигнала атома С-2 при 68.14 м.д., что вызвано -эффектом ацетилирования (смещение положения сигнала соседнего атома в сильное поле).
Сигнал С-2 глюкозы смещается в слабое поле относительно такового свободной -глюкопиранозы, что обусловлено -эффектом ацетилирования у атома С-3, приводящим к смещению положения сигнала соседнего атома углерода в слабое поле.
Таблица 1. Данные 13С-ЯМР PLWH-2 и PLWH-2' (13С), м.д.
Моносахаридный остаток С-1 С-2 С-3 С-4 С-5 С-6 ацетат PLWH- 6-Galp--1 100.29 70.04 71.42 70.11 72.03 66. 81.74 84. 20. Arap--1 100.83 69.53 69.83 70.52 63. 175. 68.14 68. Glcp--1 99.06 74.01 76.07 70.63 73.08 60. PLWH-2' 6-Galp--1 100.27 70.01 71.39 70.09 71.98 66. 81.80 84. Arap--1 100.95 69.54 69.87 70.48 63. Glcp--1 99.10 72.77 74.42 70.75 73.12 61. В 13С-ЯМР-спектре полимера PLWH-2' исчезают сигналы углеродных атомов ацетильных групп, а также сигналы, обусловленные ацетилированием остатков арабинозы (68.14 и 68.39 м.д. у PLWH-2). Также наблюдается смещение в сильное поле сигналов атомов С-2 и С-3 глюкозы, что является следствием дезацетилирования. В результате проведенных исследований установлено, что доминирующий полимер комплекса водорастворимых полисахаридов надземной Panzerina lanata части представляет собой ацетилированный глюкоарабиногалактан, основная цепь которого построена из -(16) галактопиранозных остатков, содержащих у атомов С-2 и С-3 единичные остатки арабинопиранозы и глюкопиранозы, которые в свою очередь ацетилированы по положению С-3.
Водорастворимые полисахариды как хемотаксономические маркеры в семействе Lamiaceae. Сведения о составе и строении полисахаридных компонентов позволяет в ряде случаев решать не только химические задачи, но также рассматривать возможность использования полисахаридов как хемосистематических маркеров в рангах определенного таксона наряду с традиционными хемо-маркерами, представителями групп низкомолекулярных фенольных, терпеновых и азот-содержащих соединений. Так, с использованием данных литературы и полученных экспериментальных данных, нами рассмотрен вопрос об особенностях строения полисахаридов семейства Lamiaceae.
Исследования данного семейства показали, что для более архаичных родов подсемейства Ajugoideae в составе водорастворимых полисахаридов отмечено присутствие глюкофруктанов (GF), отсутствующих в более продвинутых подсемействах (рис. 1). В составе пектиновых веществ гомогалактуронаны доминируют над рамногалактуронанами (RG). Для подсемейства Scutellaroideae, а также некоторых представителей колена Nepeteae выявлено наличие глюкоарабиногалактанов (GAG), которые, вероятно, являются некоторой промежуточной формой арабиногалактанов (AG), типичных для продвинутых колен подсемейства Saturejoideae. Наличие арабиногалактан-протеиновых комплексов (AGP) характерно для более продвинутых подсемейств.
Рис. 1. Распределение структурных типов полисахаридов в семействе Lamiaceae.
Таким образом, можно предположить, что архаичные таксоны семейства Lamiaceae продуцируют условно «простые» группы полисахаридов – гомоглюканы и гомогалактуронаны, а для эволюционно более поздних таксонов наблюдается усложнение структуры биополимеров, объясняемое, по всей видимости, бльшими биохимическими возможностями их представителей.
Полисахариды семейства Fabaceae Галактоманнаны семян. В ходе химического изучения семян 20 видов сем.
Fabaceae присутствие галактоманнанов (ГМ) было выявлено в 12 из них, представителях родов Astragalus, Gleditsia, Glycyrrhiza, Gueldenstaedtia и Oxytropis (табл. 2). Наличие ПС данного класса не было обнаружено в видах Caragana (C. arborescens, C. buriatica, C. pygmaea, C. spinosa), Onobrychis (O.
arenaria, O. sibirica), Sophora flavescens, Vicia megalotropis, для которых доминирующими ПС-компонентами являются -4,6-глюканы.
Исследования тонкой структуры ГМ показало, что их макромолекулы построены по типу “гребня” (основная цепь состоит из остатков -Manp, соединенных (14)-связью, причем часть из них замещены по положению С- единичными остатками -Galp) и имеют строение, характерное для большинства ГМ семян семейства Fabaceae. Исключение составляет ГМ семян Gueldenstaedtia monophylla, у которого боковые заместители в основной цепи представлены единичными остатками -Galp (~90%) и 6-О--Galp-Galp (~10%). ГМ с подобным строением были ранее выделены из семян Cassia angustifolia, Gleditsia ferox, G.
amorphoides и Trifolium repens (Alam, Gupta, 1986;
Grasdalen, Painter, 1980;
Srivastava, Kapoor, 2006).
Таблица 2. Характеристика ГМ семян 12 видов сем. Fabaceae* Вид WGm, % Gal:Man [], мл/г []D, ° М.м., кДа Ksub, % RM Astragalus A. alpinus 0.59 1:1.48 870.3 +67.9 999 67 16:55: A. cicer 5.90 1:1.39 925.5 +71.9 1064 72 18:20: A. danicus 3.39 1:1.40 471.7 +73.1 472 71 18:25: A. sericeocanus 3.58 1:1.58 764.6 +65.3 876 63 15:51: A. tibetanus 4.65 1:1.33 1337.1 +76.4 1549 75 10:42: Gleditsia G. sinensis 15.00 1:2.69 1064.0 +21.4 1230 37 23:47: Glycyrrhiza G. uralensis 2.06 1:1.52 1193.1 +64.8 1379 66 25:19: Gueldenstaedtia G. monophylla 2.05 1:1.91 664.7 +45.2 808 50 23:42: Oxytropis O. campanulata 2.91 1:1.09 1363.6 +91.9 1580 - O. lanata 3.68 1:1.36 1697.7 +76.8 1976 74 14:44: O. recognita 4.11 1:1.06 1287.8 +94.4 1491 - O. trichophysa 3.78 1:1.14 1239.1 +86.7 1433 - * WGm – выход, м.в.с.с;
Ksub – степень замещения основной цепи;
RM – соотношение различно замещенных маннозных блоков [Man-Man : (Gal)Man-Man / Man-Man(Gal) : (Gal)Man-Man(Gal)].
Микроскопическое обнаружение галактоманнанов. Предварительная оценка наличия ГМ может быть дана по результатам микроскопического исследования поперечных срезов эндоспермов семян после гистохимического окрашивания реактивом Фелинга и/или реактивом Люголя (рис. 2).
Astragalus cicer Glycyrrhiza uralensis Astragalus alpinus Рис. 2. Фрагменты поперечных срезов эндоспермов семян. Зерна ГМ представляют собой темные округлые образования внутри клеток.
Зависимость оптического вращения от состава галактоманнанов. Ранее для описания зависимости состава ГМ от величины []D предложено уравнение:
[]D = 3.2XGal – 61.55, где XGal – содержание галактозы в полисахариде (%) (Mestechkina et al., 2006).
Учитывая полученные сведения и данные литературы (около 150 ГМ), с применением корреляционного анализа было показано, что зависимость []D - XGal линейна и описывается уравнением:
[]D = 2.443XGal – 33.864, с величиной коэффициента регрессии r2 = 0.9021 (рис. 3). Следует отметить, что наиболее достоверные результаты расчета наблюдаются для ГМ подсем.
Faboideae и полимеров с содержанием галактозы 25-50%. Ошибка определения содержания галактозы в реальных объектах с использованием данной формулы не превышает 10-12%.
-Глюканы подземных органов. В корнях некоторых видов сем. Fabaceae (Astragalus membranaceus, Gueldenstaedtia monophylla, Sophora flavescens) установлено наличие полисахаридов группы -глюканов, представляющие собой разветвленные 0 20 40 - гомоглюканы, содержащие в основной цепи Рис. 3. Зависимость содержания остатки -(14)-связанной глюкопиранозы, галактозы (%) от величины удельного замещенной по положению С-6 единичными вращения ([]D, °) для ГМ.
остатками -глюкопиранозы (табл. 3).
Таблица 3. Характеристика -глюканов подземных органов сем. Fabaceae* Вид Название BV М.м., кДа Kbr, % []D, ° Astragalus membranaceus AmP-2-1 +87.1 0.104 90 0. AmP-2-3 +195.7 0.385 204 12. Gueldenstaedtia monophylla GmP-1-2/1 +150.3 0.264 164 8. Sophora flavescens SfP-1-1/2 +157.4 0.364 85 10. * BV – “голубое число”, оптическая плотность при 610 нм;
Kbr – степень замещения основной цепи.
Полисахариды семейства Asteraceae Глюкофруктаны подземных органов. Учитывая приуроченность накопления глюкофруктанов (ГФр) к подземным органам, было проведено исследование корней и корневищ около 30 видов данного сем., в результате чего выявлено присутствие ГФр в 12 родах, в т.ч. Arctium, Aster, Cacalia, Cichorium, Cirsium, Echinops, Inula, Lactuca, Rhaponticum, Saussurea, Scorzonera и Taraxacum;
следовое содержание или отсутствие характерно для родов Artemisia, Bidens, Carduus, Centaurea, Echinops, Gnaphalium, Tanacetum и Таблица 4. Содержание спирто- (СР-ГФр) и Tussilago. Перспективными для водорастворимых ГФр (ВР-ГФр) в подземных органах дальнейших исследований были 8 видов сем. Asteraceae, % Вид СР-ГФр ВР-ГФр признаны 8 видов: Cacalia esculentum, Cacalia hastata 13.08±0.27 13.55±0. hastata, Cirsium Cirsium esculentum 17.92±0.23 11.33±0. Echinops latifolius, Lactuca Echinops latifolius 11.80±0.21 9.66±0. sibirica, Stemmacantha Lactuca sibirica 16.05±0.24 20.58±0. carthamoides, Saussurea lappa, Saussurea lappa 10.73±0.14 43.05±0. Scorzonera austriaca 10.33±0.11 9.46±0. Scorzonera austriaca, Taraxacum officinale (табл. 4), содержание Sthemmacantha carthamoides 2.76±0.04 10.07±0. ГФр в которых составило 12.83- Taraxacum officinalis 15.35±0.31 28.39±0. 53.78% (м.в.с.с.). Структурные исследования доминирующих компонентов показали, что они являются линейными -(21)-фруктофурананами с м.м. 2.5-70 кДа (рис. 4).
Содержание низкомолекулярных ГФр (олигофруктанов) в корнях исследованных видов составляет 2.76-17.92%, и они представлены (1F--фруктофуранозил)n-производных набором нистозы (табл. 5). Согласно данным ИЭ-ВЭЖХ доминирующими компонентами являются кестоза, нистоза, 1F--фруктофуранозил-нистоза и 1F- фруктофуранозил-1F--фруктофуранозил-нистоза.
Учитывая важную биологическую функцию Рис. 4. Хроматограмма (ВЭЖХ) низко- и высокомолекулярных ГФр, можно рекомендовать исследованные виды в качестве ГФр Saussurea lappa.
перспективного лекарственного сырья для получения препаратов гипогликемического и пробиотического действия.
Таблица 5. Содержание олигофруктанов в корнях 6 видов сем. Asteraceae, мг/г м.в.с.с.
ГФр* C. hastata E. latifolius L. sibirica S. lappa S. austriaca T. officinale GF 11.09±0.12 22.18±0.24 17.46±0.19 21.03±0.18 11.47±0.12 34.54±0. GF2 21.77±0.22 6.14±0.07 13.90±0.15 11.43±0.12 15.19±0.17 14.89±0. GF3 3.31±0.04 4.13±0.05 3.56±0.04 2.21±0.03 5.17±0.05 3.68±0. GF4 11.73±0.12 19.00±0.21 24.22±0.27 8.36±0.10 6.40±0.07 16.12±0. GF5 11.52±0.12 5.19±0.06 20.08±0.22 6.76±0.07 8.06±0.09 4.61±0. * GF – сахароза, GF2 – 1-кестоза, GF3 – нистоза, GF4 – 1F--фруктофуранозил-нистоза, GF5 – 1F--фруктофуранозил F 1 --фруктофуранозил-нистоза.
Полисахариды листьев Cacalia hastata. Из листьев C. hastata выделено три полисахарида – какаланы А-С, являющиеся арабиногалактанами;
в составе пектиновых веществ выявлено присутствие гомогалактуронана и рамногалактуронана. По данным фармакологических исследований полисахариды C. hastata обладают выраженным гипогликемическим и ранозаживляющим действием.
Полисахариды пряно-вкусовых растений Исследование 14 видов пряно-вкусовых растительных видов, используемых в качестве пряностей и специй, показало, что для данных объектов характерно высокое содержание свободных углеводов (70.57-326.90 мг/г) и полисахаридов (3.66-55.30 мг/г) (табл. 6). По характеру доминирования определенных классов полисахаридов виды делятся на глюкан-содержащие (Curcuma longa, Elettaria cardamomum, Kaempferia galanga, Myristica fragrans, Piper longum, Piper nigrum, Zingiber officinale) и галактуронан-содержащие (Carthamus tinctorius, Cinnamomum verum, Crocus sativus, Illicium verum, Laurus nobilis, Pimenta dioica, Syzygium aromaticum). Исследование структуры доминирующих полисахаридов Curcuma longa, Elettaria cardamomum, Kaempferia galanga, Myristica fragrans, Piper nigrum и Zingiber officinale показало, что они являются глюканами различной степени разветвленности, в основной цепи которых присутствуют остатки -(14) связанной глюкопиранозы с замещением по С-6 единичными (реже более длинными) остатками (цепями) -глюкопиранозы.
Таблица 6. Содержание и характеристика свободных углеводов (СУ) и ВРПС некоторых пряно-вкусовых растений Тривиальное СУ, ВРПС, Доминирующий 1а 2б Вид класс ПС в название мг/г мг/г Carthamus tinctorius сафлор 326.90 13.04 - + AGP, RG Cinnamomum verum корица 70.57 4.65 - + AGP, RG Crocus sativus шафран 213.84 14.15 - ± RG, AG Curcuma longa куркума 104.93 40.44 + - G, AGl Elettaria cardamomum кардамон 122.05 16.93 + ± G Illicium verum бадьян 134.52 13.15 - ± RG, AG Kaempferia galanga галанг 51.43 5.14 + ± G Laurus nobilis лавровый лист 187.60 3.66 - + RG, AGP Myristica fragrans мускатный орех 117.99 18.60 + - G Pimenta dioica перец душистый 115.88 6.96 - ± RG Piper longum перец длинный 112.54 55.30 + ± G, AGP Piper nigrum перец черный 78.95 36.24 + + G, AGP Syzygium aromaticum гвоздика 118.89 4.93 - + RG Zingiber officinale имбирь 150.48 51.43 + - G а реакция Сакса;
б реакция с реактивом Yariv;
в AG – арабиногалактан, AGP – арабиногалактан-протеиновый комплекс, AGl – арабиноглюкан, G – глюкан, RG – рамногалактуронан.
Полисахариды суккулентных видов Исследование полисахаридных компонентов суккулентных видов было проведено для представителей родов Agave (Asparagaceae), Aloe (Asphodelaceae), Brasilopuntia, Opuntia (Cactaceae), Callisia (Commelinaceae), Kalanchoe (Crassulaceae). Установлено, что доминирующими компонентами ВРПС указанных видов являются галактуронаны (HGU, RG), арабинаны, арабиногалактаны (Agave), фруктаны (Brasilopuntia, Opuntia), маннаны (Aloe, Kalanchoe). Все исследованные виды отличаются высоким содержанием пектиновых веществ (15-40% м.в.с.с.) и могут рассматриваться в качестве сырьевых источников получения пектиновых препаратов, особенно виды Aloe и Kalanchoe, широко применяющиеся для получения лекарственных препаратов.
Глюкозаминан побегов Callisia fragrans. Из побегов C. fragrans был выделен полимер CFP-1-2 (м.м. 44 кДа), содержащий 30.1% нейтральных моносахаридов (Gal:Ara:Glc 4.2:3.7:1) и 67.8% гексозаминов (GlcN:GalN 8.4:1). С использованием методов термического анализа (ТГ, ДТГ, ДСК) установлено, что на кривой ДСК для CFP-1-2 присутствуют характерные для хитина экзотермический максимум в области 300-330°С (321.2°С) высотой 0.21 В/г и эндотермический максимум в области 60-90°С (74.3°С) (рис.
5). Оба максимума присутствуют на кривой ДСК для исходного полимера CFP 1-2 (312.3 и 88.7°С), на которой также отмечен выраженный эндо-пик при 163.3°С, свойственный галактанам и Рис. 5. ТГ- для CFP-1-2 ([2]) и ДСК ([1]), ДТГ- ДСК термограммы ([3]) и уронид-содержащим полимерам. В 13С- термограмма для хитина ([2]-2).
ЯМР-спектре CFP-1-2 наблюдаются химические сдвиги при 103.9 (С-1), 56.4 (С-2), 74.2 (С-3), 83.3 (С-4), 77.4 (С-5) и 60.7 (С-6), что позволяет охарактеризовать полимер как -(14)-глюкозаминан, содержащий в боковых цепях остатки нейтральных моносахаридов.
Полисахариды рода Kalanchoe. Впервые проведено исследование полисахаридных компонентов четырех видов Kalanchoe: K. daigremontiana, K.
laciniata, K. pinnata и K. tubiflora. Установлено, что доминирующими углеводными полимерами данного рода являются 1,4-маннаны, ранее обнаруженные в видах Aloe.
Полисахариды семейств Ericaceae и Plantaginaceae ВРПС семейства Ericaceae отличаются относительно высоким содержанием маннозы (22.1-50.8 моль%), глюкозы (6.2-25.7 моль%) и реже рамнозы (Rhododendron dauricum – 14.8 моль%), что наравне с другими показателями свидетельствует о присутствии глюкозо- и маннозосодержащих полимеров (табл.
7). Из фракции ВРПС Rh. dauricum был выделен полимер RdW-1, состоящий из маннозы и дающий растворы с высокими значениями вязкости ([] 2193.8 мл/г), охарактеризованный как 1,4-маннан. Полисахариды данного семейства ранее не изучались.
Для ВРПС и ПВ трех видов Plantago характерно высокое содержание уроновых кислот (52.7-64.7 моль%) и высокая степень этерификации 66.4-91.5%, что позволяет отнести полисахариды данного рода к высокоэтерифицированным пектинам. Выявлено, что полисахариды Plantago обладают антирадикальной (IC 1.42-2.58 мг/мл) и антиатерогенной активностью. Степень связывания атерогенных липопротеидов сыворотки крови составляет 39.15-42.77% от таковой гепарина.
Таблица 7. Характеристика полисахаридов некоторых видов семейств Ericaceae и Plantaginaceae* Выход, Вид []D, ° Ara Fuc Gal Glc Man Rha Xyl UA % Ericaceae A. uva-ursi (1) 0.4 +24.9 6.3 - - 22.4 49.7 8.2 - 13. A. uva-ursi (2) 0.3 +34.2 9.7 - - 21.7 42.6 1.1 1.8 23. A. uva-ursi (3) 3.2 +144.0 14.5 - 17.3 4.5 - 1.8 2.6 59. Rh. dauricum (2) 1.8 +27.3 14.0 3.3 14.8 6.2 22.1 14.8 2.5 22. Rh. aureum (2) 2.2 +25.7 5.6 2.0 3.7 12.5 50.8 0.3 4.0 20. V. myrtillus (2) 1.9 +27.3 16.9 - 17.3 25.7 27.4 сл. 0.7 11. V. vitis-idaea (2) 2.4 +30.9 15.9 - 14.2 22.3 30.1 0.2 1.9 15. Plantaginaceae P. depressa (2) 6.7 +109.2 19.6 0.6 6.4 4.5 3.1 0.9 6.1 58. P. depressa (3) 5.5 +126.4 11.5 сл. 15.4 1.5 4.0 0.6 7.3 59. P. media (2) 8.0 +115.7 8.6 0.4 19.7 4.3 6.9 1.1 6.2 52. P. media (3) 3.5 +137.8 9.4 сл. 13.6 2.8 5.4 0.4 7.3 61. P. salsa (2) 7.3 +112.7 12.4 0.9 14.9 6.3 4.1 1.8 2.2 57. P. salsa (3) 5.7 +140.3 11.7 0.2 15.7 2.1 2.5 2.2 1.3 64. * Виды родов Arctostaphyllos (A.), Rhododendron (Rh.), Vaccinium (V.), Plantago (P.);
фракции ПС: водорастворимые полисахариды, экстрагируемые при 20 (1) и 90°С (2), пектиновые вещества (3);
сл. - следы.
УГЛЕВОДНЫЕ БИОПОЛИМЕРЫ ГРИБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Полисахариды плодовых тел Laetiporus sulphureus. Из плодовых тел Laetiporus sulphureus, полученных с применением метода природных плантаций, выделены водорастворимые эндополисахариды. При исследовании доминирующего полисахарида – латипорана А (0.28% м.в.с.с., м.м. 56 кДа) установлено, что он представляет собой -1,3-глюкан, содержащий в положении С-6 остатки маннозы, галактозы, фукозы, ксилозы и рамнозы. Также выявлено присутствие двух гликопротеидов (латипораны B и D). В экспериментах in vivo установлено наличие антиоксидантного эффекта латипорана А. Были получены щелочерастворимые полисахариды с выходом 42.7%. Установлено строение доминирующего полимера (16.05% от массы плодовых тел), названного латиглюкан I, представляющего собой линейный -1,3-глюкан (молекулярная масса 180 кДа, []D -17). Минорные латиглюканы II и III являются -3,6- и 1,3-глюканами, соответственно.
Разветвленный -глюкан плодовых тел Piptoporus betulinus. Из щелочерастворимых компонентов P. betulinus был выделен полисахарид PBA-3- с м.м. 270 кДа (рис. 6). PBA-3-2. Glc 98.2%, []D +107 (1.0, 5% KOH). ИК-спектр (, см-1): 1418, 1361, 1263, 1205, 1145, 1083, 1026, 929, 890 (-связь), 847 ( связь), 824 (1,3-связь).
Согласно данным ГХ/МС, после метилирования в составе продуктов гидролиза PBA 3-2 обнаружены 2,3,4,6-тетра-Me-O-Glcp, 2,4,6-три Me-O-Glcp и 2,4-ди-Me-O-Glcp в соотношении 1:4.8:1. Полученные данные свидетельствуют о том, что основная цепь PBA-3-2 состоит из остатков незамещенной (13)-связанной Glcp и имеется небольшое число точек ветвления основной цепи по цепи Рис. 6. Гель-хроматограмма положению С-6, причем боковые представлены единичными остатками Glcp. В фракции щелочерастворимых составе продуктов метилирования PBA-3-2-d полисахаридов P. betulinus. 2 – На врезке PBA-3-2. – обнаружена 2,4,6-три-Me-O-Glcp и следы 2,3,4,6- хроматограмма PBA-3-2 (2).
тетра-Me-O-Glcp, что указывает на линейный характер полимера, который представляет собой основную цепь макромолекулы PBA-3-2. Сведения о строении PBA-3-2 указывают на то, что он является (13)-глюканом, содержащим небольшое количество боковых цепей у атомов С 6, однако остается невыясненным факт наличия полосы -связей в ИК-спектре PBA-3-2. Для исследования данного вопроса было проведено изучение PBA-3-2 и PBA-3-2-d с применением 13С-ЯМР-спектроскопии (рис. 7, табл. 8).
В аномерной области спектра присутствуют три сигнала при 101.5, 101.8 и 106.3 м.д., отнесенные к атомам С-1 остатков незамещенной и замещенной Glcp основной цепи и Glcp боковых цепей, соответственно. Положения первых двух сигналов указывают на -конфигурацию аномерных центров Glcp в основной цепи. Для сигналов С-1 Glcp боковых цепей наблюдается сильное смещение в слабое поле, что объясняется ее -конфигурацией. Смещение сигналов атомов С- замещенной и незамещенной Glcp основной цепи в слабое поле (85.3 и 86.3 м.д.) относительно такового свободной -Glcp указывает на их участие в образовании связи (13)-типа, а расположение сигнала атома С-6 замещенных остатков при 68.1 м.д. подтверждает наличие замещения по данному положению. Следует также отметить наличие сдвига сигнала атома С-5 замещенной Glcp в сильное поле (73.5 м.д.), что подтверждает присутствие заместителя у атома С-6.
Соотношение интегральных интенсивностей сигналов С-3 незамещенной и замещенной Glcp основной цепи составляет 4.77, что близко к результатам, полученным ранее методом метилирования (4.76). Значения химических сдвигов атомов С-2-С-6 Glcp боковых цепей близки к таковым свободной -Glcp, т.е., в боковых цепях присутствуют единичные остатки -Glcp.
Таблица 8. Данные 13С-ЯМР PBA-3- (13С), м.д.
Моносахарид ный остаток С-1 С-2 С-3 С-4 С-5 С- 3--Glcp-1 101.5 72.6 85.3 70.1 73.8 61. 3,6--Glcp-1 101.8 72.6 86.3 70.1 73.5 68. -Glcp-1 106.3 73.1 76.1 71.3 75.8 61. -Glcp* 92.7 72.1 73.4 70.4 72.1 61. -Glcp 96.5 74.8 76.4 70.3 76.6 61. * (Шашков, Чижов, 1976).
Рис. 7. 13С-ЯМР-спектр PBA-3-2. А – остаток 3-О--D глюкопиранозы, В – остаток 3,6-ди-О-замещенной--D глюкопиранозы, С – остаток -D-глюкопиранозы, 1-6 – номер атома углерода. На врезке – участок 13С-ЯМР спектра в диапазоне 72-74 м.д.
Таким образом, проведенные исследования показали, что полисахарид PBA 3-2 из P. betulinus, названный пиптопоран I, является разветвленным глюканом, основная цепь которого построена из остатков -(13)-Glcp, замещенной на 17.3% по положению С-6 единичными остатками -Glcp. Глюканы смешанного типа, содержащие одновременно - и -связи, ранее были обнаружены в видах Pleurotus (Pramanik et al., 2005;
Rout et al., 2005), однако полисахариды со структурой, аналогичной пиптопорану I, ранее описаны не были.
Полисахариды склероциев Inonotus obliquus. Впервые в составе щелочерастворимых полисахаридов I. obliquus было выявлено присутствие линейных -(13)- и -(13)-глюканов, потенциальных противоопухолевых соединений.
ФЕНОЛЬНЫЕ БИОПОЛИМЕРЫ РАСТИТЕЛЬНОГО И ГРИБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Наравне с исследованиями углеводных биополимеров, особый интерес представляет изучение фенольных макромолекулярных компонентов растительной и базидиальной флоры, условно называемые меланинами, и вызывающими пигментацию растений и грибов.
Растительные меланины Меланин ферментированных листьев Orthosiphon stamineus. Из O.
stamineus был выделен темный пигмент OS-M с м.м. 4.4 кДа;
C 57.14%, H 3.92%, N 2.024%, O 36.92%. В составе функциональных групп выявлено присутствие карбоксильных (9.31±0.32%), карбонильных (7.07±0.24%), фенольных гидроксильных (8.67±0.28%) и пирокатехиновых групп (3.52±0.11%). Согласно данным химических превращений, УФ, ИК, ВЭЖХ, полимер охарактеризован как меланин. Структурные исследования OS-M показали, что для макромолекулы характерно присутствие монозамещенных 2-гидрокси-, 4-гидроксибензольных, тризамещенных 3,4,5-тригидроксибензольных, частично метоксилированных дизамещенных фрагментов, а также монозамещенных 2-гидроксибензольных остатков, связанных через кислородный мостик с основным скелетом макромолекулы. Установлено, что процессы химической дериватизации меланинов (ацетилирование, дезацетилирование, метилирование, восстановление) влияют на характер УФ- и ИК-спектров получаемых производных. Разработана методология УФ-спектрального анализа меланинов с целью выявления индивидуальных характеристик (логарифмический наклон поглощения, хроматический коэффициент). Рассмотрена возможность использования дифференциального варианта анализа (-метод).
В результате показано, что метилирование, ацетилирование, деэтерификация и восстановление смещают положение первичной В-полосы в УФ-спектре в коротковолновую сторону при одновременном батохромном сдвиге положения вторичной В-полосы как в нейтральной, так и щелочной средах. При всех видах дериватизации слабая К-полоса исчезает. В дифференциальных спектрах всех производных, кроме восстановленного образца меланина, отсутствует первичная В-полоса. Наиболее стабильными являются вторичная В-полоса и К-полоса, хотя они претерпевают значительные изменения в положении и интенсивности. При метилировани и ацетилировании происходит гипсохромный сдвиг вторичной В полосы, а при восстановлении – батохромный сдвиг. При деэтерификации полоса вырождается в слабое плечо. К-полоса при всех видах дериватизации смещается в коротковолновую сторону спектра при одновременном снижении интенсивности.
Установлено, что значение хроматического коэффициента зависит от величины логарифмического наклона поглощения (LOA) прямо пропорционально (рис.8). Чем меньше величина коэффициента, определяющая степень ароматичности меланина, тем ниже показатель LOA. Таким образом, значение LOA может служить одним из показателей ароматичности меланинов.
Зависимость Для ИК-спектров производных меланинов Рис. 8.
выявлено, что метилирование не вызывает логарифмического наклона поглощения от хроматического смещение полос при 1714 и 1633 см-1, однако коэффициента.
интенсивность последней полосы возрастает;
при ацетилировании наблюдается смещение полосы при 1714 до 1757 см-1, что вызвано образованием сложноэфирных группировок. Положение полосы при 1515 см-1, вызванной скелетными колебаниями ароматического кольца, остается практически неизменным при всех видах дериватизации. Для слабой полосы при 1443 см-1 в нативном меланине наблюдается увеличение интенсивности после метилирования и ацетилирования, что подтверждает ее отнесение к сумме колебаний алифатических цепочек, а также симметричных и асимметричных колебаний С-Н связей в метоксильных группах. В спектре ацетилированного образца меланина наблюдается увеличении интенсивности полосы при 1370 см-1, которая отсутствует в спектрах других производных меланина и, вероятно, отвечает за колебания присутствующих ацетильных групп. После ацетилирования наблюдается увеличение интенсивности полосы при 1209 см-1, что позволяет связать ее появление с колебаниями С-О-С групп в простых и сложных эфирах. В то же время метилирование вызывает появление полосы при 1262 см-1, связанной с колебаниями С-О-С групп в метоксильных группах.
Изучение антиоксидантной активности OS-M с использованием методов in vitro показало, что OS-M оказывает выраженное антиоксидантное действие в отношении свободных радикалов, молекул NO, инактивирует молекулы пероксида водорода и хелатирует ионы Fe (табл. 9). Сравнительный анализ полученных данных показал, что в ряде случаев антиоксидантная активность меланина близка и иногда может превышать таковую розмариновой кислоты – известного антиоксидантного соединения из O. stamineus.
Таблица 9. Антиоксидантная активность OS-M, розмариновой кислоты (RA), водного экстракта листьев Orthosiphon stamineus (AEOS) и галловой кислоты (GA), IC50, мкг/мл a Объект DPPH ABTS SSA NOSA HIA FCA CBA OS-M 7.91 3.36 43.49 22.22 13.36 11.41 12. RA 3.91 1.78 10.02 6.96 3.52 500 42. AEOS 15.48 11.85 11.38 8.11 185.73 22.31 41. GA 0.98 0.311 76.42 7.24 5.14 500 12. a • DPPH – антирадикальная активность в отношении радикала DPPH, ABTS – антирадикальная активность в отношении катион-радикала ABTS•+, SSA – связывание супероксид-анион радикалов, NOSA – связывание молекул NO, HIA – инактивания молекул H2O2, FCA - Fe2+ хелатирующая активность, CBA - -carotene bleaching assay (CBA).
Присутствие фенольных биополимеров, близких по строению и физико химическим свойствам к OS-M, было также выявлено в ферментированных листьях других представителей семейства Lamiaceae: Dracocephalum foetidum, Lophanthus chinensis, Mentha piperita, M. canadensis, Schizonepeta multifida (табл.
10).
Таблица 10. Физико-химическая характеристика меланинов некоторых видов Lamiaceae Вид Содержание, % м.м., Кда Е465/Е665 С, % Н, % О, % N, % Dracocephalum foetidum 0.22 6.1 4.68 56.2 3.9 38.8 1. Lophanthus chinensis 0.74 5.2 4.93 58.3 4.0 36.3 1. Mentha piperita 0.57 6.8 4.21 59.6 3.7 35.8 0. M. canadensis 0.18 7.7 4.04 57.4 3.8 36.1 2. Schizonepeta multifida 0.23 9.2 4.61 57.9 4.0 36.1 2. Сведения о высокой антиоксидантной активности меланина O. stamineus позволяют рекомендовать для дальнейшего химического и биологического исследования растительные продукты, полученные в результате ферментации сырья, традиционно используемого в неферментированном состоянии.
Грибные меланины Меланины склероциев Laetiporus sulphureus. Из склероциев L. sulphureus был выделен меланиновый комплекс, представляющий собой смесь трех полимеров фенольной природы ЛМ-1, ЛМ-2 и ЛМ-3 с молекулярными массами 63, 34 и 9.1 кДа, соответственно;
компонент ЛМ-3 был доминирующим. С применением химических и спектральных методов установлено, что меланин L.
sulphureus относится к дигидронафталиновому типу и характеризуется доминированием конденсированных фенольных фрагментов. К настоящему времени меланины дигидронафталинового типа обнаружены в микромицетах классов дейтеромицетов (Aspergillus carbonarius, Alternaria alternata, Paecilomyces variotti) (Babitskaya et al., 2006), аскомицетов (Asperisporium caricae, Pleurophragmium sp., Tuber melanosporum) (Paim et al., 1990), дотидеомицетов (Phyllosticta capitalensis) (De Angelis et al., 1996) и леотиомицетов (Sclerotinia sclerotiorum) (Butler et al., 2009). Следует отметить, что исследования меланинов базидиомицетов немногочисленны: известно, что они отличаются высокой степенью ароматичности (Cerrena maxima) (Koroleva et al., 2007) и могут принадлежать к пирокатехиновому (Inonotus obliquus, Phellinus robustus) и глутаминил-п-оксибензольному типам (Babitskaya et al., 2002). Присутствие меланина дигидронафталинового типа в базидиальном виде установлено впервые.
Результаты изучения биологической активности меланина L. sulphureus показали, что его можно рекомендовать для использования в качестве эффективного и безопасного пищевого или фармацевтического антиоксиданта.
Меланины склероциев Inonotus obliquus. Проведено фракционирование полимерных компонентов меланина склероциев Inonotus obliquus, в результате чего было выделено 6 пигментных фракций (суммарный выход 52.13% м.в.с.с.). С применением элементного анализа, УФ-, ИК-, 13С-ЯМР спектроскопии и гель хроматографии установлено, что выделенные фракции различаются по степени ароматизации, данным молекулярно-массового распределения и содержанию функциональных групп. Доминирующие компоненты представляют собой высокоароматичные полимеры с молекулярной массой 2-20 кДа, высоким содержанием карбоксильных и фенольных гидроксильных групп.
Анализ полученных результатов и данных литературы для других представителей грибных меланинов с использованием диаграммы Ван Кревелена показал, что выделенные фракции можно условно разделить на группы с большей и меньшей степенью ароматичности (рис. 9). Элементный состав первой группы близок к таковому меланинов Cerrena maxima, Aspergillus glaucus, Eurotium echinulatum, Oidiodendron tenuissimum и синтетического феомеланина (Knicker et al., 1995;
Koroleva et al., 2007), а данные для второй группы – к меланинам Hendersonula toruloidea, Ulocladium atrum и ранним сведениям о меланинах I.
obliquus (Babitskaya et al., 2000). Расположение в зоне гуминовых и фульвокислот почв и торфа может указывать на близость меланинов I. obliquus к группе гуминоподобных веществ.
Дополнительно нами был использован структурный параметр (Gyulmaliev et al., 2007), не зависящий от молекулярной массы соединения и ранее не применявшийся для анализа грибных пигментов. Установлено, что диапазон значений для данной группы соединений составляет 2.06-3.85, а для I. obliquus – 2.46-3.16. Корреляционный анализ выявил, что наблюдается прямо пропорциональная линейная зависимость соотношения Н/С от, описываемая уравнением регрессии = 1.453 · Н/С + 1.057 (r2 = 0.9078), т.е. возрастание свидетельствует о большей алифатичности соединений, а снижение характерно для ароматических и конденсированных компонентов. Для олигомерных производных гиспидина величины Н/С и находятся в интервалах 0.60-0.90 и 1.9-2.1, соответственно, что близко к нижней границе для грибных меланинов и указывает на их сравнительно большую ароматичность.
2 Н/С IOM- 1, СН IOM- FM IOM-4 1 1,2 Hp IOM- 0,8 P IOM-3 B HA/FA IOM-2 N 4 0, 5 G О/С Н/С 0 1 2 0 0,5 1 1, а б Рис. 9. а. Диаграмма Ван Кревелена для грибных меланинов и индивидуальных соединений. 1 – пигментные фракции Inonotus obliquus, 2 – меланин I. obliquus, 3 – грибные меланины, 4 – ДОПА-меланин, 5 – феомеланин. HA/FA – зона гуминовых и фульвокислот почв и торфа. б.
Диаграмма зависимости С/Н от. FM – грибные меланины, Hp – производные гиспидина, B – бензол, G – графит, N – нафталин, P – фенол.
Общая антиоксидантная емкость пигментных фракций I. obliquus составила 150.51-569.40 мг/г. Наиболее выраженной активностью исследованные образцы обладают в отношении свободных радикалов (DPPH•, ABTS•+) и некоторых активных форм кислорода (O2•-, OH•, H2O2). Значения IC50DPPH• составили 6.85 54.17 мкг/г, IC50ABTS•+ 6.69-28.07 мкг/г, IC50O2•- 6.11-67.24 мкг/г, IC50OH• 0.98-7. мкг/г и IC50H2O2 5.21-11.92 мкг/г. Установлено наличие значительной Fe2+ хелатирующей и Fe3+-восстановительной способности – 2.07-33.91 Fe2+/мг и 0.96 3.73 мМ Fe2+/мг, соответственно. На модели окислительной деградации каротина выявлена высокая антиоксидантная активность (IC50 14.62 мкг/мл), сравнимая с эффективностью галловой кислоты (IC50 12.30 мкг/мл). Менее заметное влияние исследованные фракции оказывают на процесс связывания молекул оксида азота (II) – от 335.24 до 1000 мкг/мл. С применением регрессионного анализа было выявлено, что для фракций с высоким содержанием пирокатехиновых, кислород-содержащих функциональных групп (соотношение О/С) и высокой степенью ароматичности (соотношение Н/С) характерна большая антиоксидантная активность. Сравнительный анализ сведений об антирадикальной активности производных гиспидина показал меньшую эффективность низкомолекулярных метаболитов в инактивации свободных радикалов. Данное обстоятельство, возможно, объясняется наличием у полимерных пигментов более сложной сетчатой структуры, позволяющей исполнять роль “ловушек” свободных радикалов.
Следует отметить, что сведения о спектральных свойствах пигментных фракций I. obliquus и производных гиспидина указывают на их возможную структурную близость и позволяют высказать предположение, что низкомолекулярные вещества являются биогенетическими предшественниками полимерных соединений. Предположительно, биосинтез производных гиспидина идет от ацетата или 3,4-дигидроксибензальдегида через ряд присоединений ацетильных групп с последующими декарбоксилированием и димеризацией образовавшихся интермедиатов. Вероятно, данный процесс не заканчивается на образовании олигомеров и в итоге приводит к появлению более сложных структур, формирующих пигментный комплекс I. obliquus. Таким образом, проведенные исследования показали, что способ выделения меланина из склероциев I. obliquus влияет на физико-химические свойства получаемых экстрактов и их активность, что следует учитывать при создании экстракционных препаратов из чаги.
Иммуномодулирующая активность растительных -глюканов Исследование иммуномодули рующего действия растительных ECW-1- глюканов показало, что наибольшее влияние на активность оказывает AmG-2- степень разветвления кора AcWG-2 RE SfP-1-1/ макромолекулы. Так для линейного AmG-2- глюкана Astragalus membranaceus 400 PtWP-2/1- (AmG-2-1) она минимальная, а для Elettaria cardamomum глюкана (ECW-1-2) со степенью разветвления SbRP-1'' кора 46.1% – наибольшая (рис. 10).
Полученные результаты описыва- 0 10 20 30 ются линейной зависимостью со Рис. 10. Влияние -4,6-глюканов на гуморальный значением коэффициента детерми- иммунитет в условиях азатиоприновой нации 0.6. Также было отмечено иммуносупрессии. По оси абсцисс – степень br массы разветвленности (K6 ), %;
по оси ординат – влияние молекулярной полимеров на проявление у них количество АОК/10 спленоцитов. RE – график иммуностимулирующей активности, уравнения линейной регрессии: y = 14.021x + 78.596, r2 = 0.6645.
причем в ряду от глюкозы до полимеров с м.м. 100-300 кДа она возрастала, 400 a b a b после чего снижалась.
Присутствие глюканов в составе таких как растительных иммуномодуляторов Scutellaria baicalensis, Sophora flavescens, Astragalus membranaceus и др. помимо других классов соединений, например, фенольной или терпеновой природы, указывает на их возможное 100 совместное участие в формировании общего 1 2 3 4 действия на организм. В связи с этим для ряда растительных объектов нами было проведено Рис. 11. Влияние глюкана SfP-1-1/2, софорафлавонона G и кураринона на сравнительное исследование иммуномодули- антителообразование (АОК/ рующей активности полисахаридов и спленоцитов;
a) и выраженность доминирующих низкомолекулярных метаболи- реакции ГЗТ, % (б).
тов. На примере компонентов корней софоры Экспериментальные группы: 1 – желтоватой было установлено, что в условиях интактная, 2 – азатиоприн (50 мг/кг, азатиоприновой иммуносупрессии у мышей А), 3 – А + SfP-1-1/2 (50 мг/кг), 4 – А + софорафлаванон G (50 мг/кг), 5 – А глюкан и два доминирующих пренилированных + кураринон (50 мг/кг).
флаванона – софорафлаванон G и кураринон, обладали близкой степенью активности, причем глюкан SfP-1-1/2 по выраженности реакции ГЗТ превосходил активностью флавоноиды (рис. 11).
Антиоксидантная активность полисахаридов Учитывая возрастающий интерес к антиоксидантным свойствам полисахаридов, было проведено сравнительное исследование выделенных полимеров с применением витральных моделей (DPPH, ABTS, FRAP, CBA, FCA).
В результате было установлено, что отсутствие или слабая выраженность антиоксидантных свойств наблюдалась для глюканов, арабиногалактанов, галактоманнаннов и глюкофруктанов (рис. 12).
Рис. 12. Антиоксидантная активность полисахаридов.
GalUA – галактуроновая кислота, AG – арабиногалактаны, HGA – гомогалактуронаны, RG – рамногалактуронаны, ПВ – пектиновые вещества.
Наличие данного вида активности было отмечено только для представителей так называемого «пектинового комплекса». Было выявлено, что антирадикальные свойства возрастают в процессе усложнения структуры пектина: так у суммарного очищенного комплекса пектина, не содержащего фенольной примеси, активность всегда была выше, чем у компонентов. Подобный характер влияния был отмечен при проверке мембраностабилизирующих свойств (перекисный, осмотический, свободнорадикальный типы гемолиза), а также по действию на активность ферментов антиоксидантной защиты организма – супероксиддисмутазу и каталазу. Металлохелатирующая активность была более выражена у галактуронановых кров, что объясняется более высоким содержанием свободных карбоксильных групп.
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ АНАЛИЗА УГЛЕВОДОВ В ЛЕКАРСТВЕННОМ СЫРЬЕ Модифицированный резорциновый метод реакции фруктозы с резорцином. Исследована Исследование колориметрическая реакция фруктозы с резорцином и выявлены оптимальные условия ее проведения. Определение состава проводили групповым методом с последующим представлением полученных данных в виде поверхностей, а также построением изоадсорбатных карт, являющихся плоскостными моделями поверхностей отклика в координатах cHCl–cEtOH и позволяющим наглядно представить результаты эксперимента (рис. 13).
3D-модель поверхности отклика Проекция поверхности Рис. 13. Поверхность отклика для продуктов реакции инулина с резорцином и ее проекция на ось сEtOH – сHCl, %.
Спектральный анализ показал, что спектр поглощения комплекса фруктозы с резорцином обладает двумя экстремумами в видимой области – 400 и 480 нм (рис. 14). Компоненты раствора по отдельности не влияют на интенсивность максимумов. В качестве аналитической длины волны была выбран максимум при 480 нм по причине его удаленности от коротковолновой области, в которой могут находиться полосы поглощения сопутствующих веществ фенольной природы.
Установлено, что в присутствии 16% HCl и 48% этанола достигается максимальная оптическая плотность при минимальной относительной ошибке определения (2.03%). Для стабилизации окрашенного комплекса фруктозы с резорцином предложено введение в реакционную смесь тиомочевины.
Изучены спектральные характеристики окрашенных комплексов с резорцином других моносахаридов и установлено, что наименьшее влияние на интенсивность оптической плотности растворов фруктозы в выбранных условиях оказывают арабиноза и рамноза. Рис. 14. Спектры поглощения комплексов с Исследование реакции инулина с резорцином фруктозы (1), инулина (2) и резорцином. Определены оптимальные водного извлечения Inula helenium (3).
условия проведения реакции инулина с резорцином и проведены исследования по установлению состава реакционной смеси. Определено, что в состав реакционной смеси должны входить 15% HCl, 52% этанола, что позволяет добиться максимальной оптической плотности.
Введение тиомочевины замедляет процесс разрушения аналитического компонента. Выявлено, что инулин обладает частичной растворимостью в водных растворах этанола различной концентрации;
так 50% растворимость наблюдается уже для растворов этанола с концентрацией 61-65%, поэтому при проведении процедур подготовки растительного сырья для анализа рекомендуется использовать только 95% этанол, который при 3-кратной экстракции позволяет практически полностью извлечь низкомолекулярные углеводы. Разработанные методические подходы были применены для анализа глюкофруктанов в трех видах лекарственного сырья: корневищах и корнях девясила высокого, корнях лопуха и корнях одуванчика лекарственного. Проведенный метрологический анализ показал, что методики воспроизводимы и достоверны. В ходе разработки изменений к существующим ФС было выявлено, что применение в качестве критерия подлинности хроматографической (ВЭТСХ) картины состава олигомерных глюкофруктанов не позволяет отличать данные виды сырья, т.к.
состав указанной группы соединений у них близкий. В этой связи было предложено введение показателей состава и количественного содержания второго доминирующего класса соединений – фенилпропаноидов.
Модифицированный антрон-серный метод Рассмотрена возможность модификации антронового метода Дрейвуда для спектрофотометрического определения углеводов, результатом чего является увеличение точности и воспроизводимости получаемых результатов. Для устранения недостатков классического метода рассмотрена возможность разведения пробы 95% этанолом. Относительная ошибка определения модифицированного метода не превышает 4% (для классического варианта 8 10%). Исследование спектров поглощения продуктов взаимодействия антрона с моносахаридами показало, что они обладают характерным максимумом в области 405-411 нм, за исключением галактуроновой кислоты, экстремум которой находится при 424 нм.
Время, достаточное для образования окрашенного комплекса при 100С, составляет 10 мин. Введение дополнительной процедуры охлаждения реакционной смеси после добавления концентрированной серной кислоты нецелесообразно, т.к. это не оказывает влияния на интенсивность окраски конечного комплекса. Устойчивость оптической плотности растворов после добавления этанола наблюдается в течение 10-12 часов. При исследовании продуктов взаимодействия антрона и моносахаридов в среде этанола методом изомолярных серий установлено, что они реагируют в эквимолярном соотношении. Разработанный метод был применен для количественного анализа полисахаридов в ряде растительных объектов и препаратов.
Для анализа полисахаридов в объектах, дающих вязкие извлечения при использовании воды в качестве экстрагента, предложено использование 1% раствора натрия хлорида. Результатом применения является улучшение реологических параметров получаемых экстрактов и, как следствие, повышение выхода полисахаридов и сокращение времени аналитического процесса.
Исследование основных физико-химических свойств полученных образцов ВРПС показало, что общее содержание углеводных компонентов в данном случае увеличивается на 17-35%. Предварительное измельчение сырья приводит к ухудшению реологических параметров извлечений и снижению содержания полисахаридов.
Методика количественного анализа группового состава углеводного комплекса растительных объектов. Разработана методика количественного определения группового состава углеводного комплекса растительных объектов (свободные углеводы, водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества и гемицеллюлозы) из одной навески, основанная на объединении известной схемы разделения углеводов по Бейли и модифицированного спектрофотометрического метода Дрейвуда. Проведенный метрологический анализ показал, что относительная ошибка определения не превышает 5%. Разработанная методика была апробирована на ряде видов растительного сырья, относящегося к разным морфологическим группам.
Создание унифицированной схемы анализа углеводов в растительном сырье Критерии подлинности. Для существующей в настоящее время нормативной документации на растительное сырье (ФС, ФСП, ТУ) характерно использование ряда неспецифичных методов качественного определения полисахаридных компонентов.
1. Реакция преципитации водных извлечений из растительного объекта этанолом, приводящая к образованию осадка (взвеси, мути). Положительный результат при использовании данного метода дают все растительные объекты, т.к.
полисахариды являются их обязательными составляющими.
2. Реакции, основанные на образовании окрашенных комплексов между моносахаридами, образующимися после кислотного гидролиза водного извлечения, и фенолами (нафтол, карбазол, резорцин, антрон, фенол и др.).
Положительный результат проявляется для любых объектов растительного происхождения, т.к. они содержат сахарозу, при гидролизе которой выделяется фруктоза, реагирующая с нафтолом или резорцином, либо галактуроновую кислоту – компонент водорастворимой части пектиновых веществ (реакция с карбазолом), или любой другой моносахарид, реагирующий с общими реактивами на углеводы (антрон, фенол и др.).
Таблица 11. Критерии подлинности лекарственного сырья, нормируемого по содержанию полисахаридов Определяемая группа Детектируемые Объект Метод соединений компоненты Использование качественных реакций (КР) Laminaria, Fucus Фуканы КР с реактивом Фукоза Дише Callisia fragrans Свободные КР с реактивом Глюкозамин аминосахара Эльсона-Моргана Определение моносахаридного состава Althaea officinalis Арабинаны ВЭТСХ Арабиноза Armeniaca vulgaris Глюкуроноарабино- ВЭТСХ Арабиноза, галактоза галактаны Linum usitatissimum, Арабиноксиланы ВЭТСХ Арабиноза, ксилоза Plantago psyllium Trigonella foenum- Галактоманнаны ВЭТСХ Галактоза, манноза graecum Салеп Глюкоманнаны ВЭТСХ Глюкоза, манноза Трагакант Арабиноглюкуронаны ВЭТСХ Арабиноза, глюкуроновая кислота Определение состава свободных углеводов Arctium sp., Echinacea Глюкофруктаны ВЭТСХ Фруктоза, сахароза, purpurea, Inula 1-кестоза, нистоза helenium, Taraxacum officinale Определение неуглеводных компонентов Aloe arborescens Пироны ВЭТСХ, ВЭЖХ Алоэнин Bidens tripartita Флавоноиды, ВЭТСХ, ВЭЖХ Лютеолин-7-глюкозид, фенилпропаноиды хлорогеновая кислота Cetraria islandica Депсиды ВЭТСХ, ВЭЖХ Усниновая кислота Plantago major Флавоноиды, ВЭТСХ, ВЭЖХ Лютеолин-7-глюкозид, фенилпропаноиды хлорогеновая, кофейная кислоты Kalanchoe pinnata Флавоноиды ВЭТСХ, ВЭЖХ Кверцетин, кемпферол Sambucus nigra Флавоноиды, ВЭТСХ, ВЭЖХ Рутин, изокверцитрин, фенилпропаноиды хлорогеновая, кофейная кислоты Tussilago farfara Фенилпропаноиды ВЭТСХ, ВЭЖХ Хлорогеновая, кофейная кислоты Tilia sp. Флавоноиды ВЭТСХ, ВЭЖХ Гиперозид, рутин Viola tricolor Фенолокислоты ВЭТСХ, ВЭЖХ Салициловая кислота Исключение составляют специфические методы детекции ряда моносахаридов, например реакция Дише для фукозы (на фукоинданы Laminaria sp. и Fucus sp.) или реакция Эльсона-Моргана для аминосахаров (свободный глюкозамин в соке Callisia fragrans). Однако применение указанных методов ограничено крайне редкой встречаемостью определяемых ими групп углеводов (табл. 11). В этой связи при определении подлинности растительного сырья следует использовать более специфичные свойства полисахаридов, как, например, моносахаридный состав. Процедура анализа состоит в предварительном гидролизе фракции полисахаридов, полученной после осаждения этанолом, в среде 3 М ТФУ с последующим хроматографическим анализом с применением ТСХ, ВЭТСХ, ВЭЖХ или ГЖХ (ГХ/МС). Несмотря на бльшую стоимость и длительность данного метода анализа, полученные результаты могут более достоверно характеризовать объект.
В ряде случаев возможно определение не мономерных составляющих полисахаридов, а их олигомерных предшественников, постоянно присутствующих в сырье, каковыми являются олигомерные глюкофруктаны, сопутствующие полиглюкофруктанам. Так в составе спирторастворимых компонентов корней Inula helenium, Arctium sp., Taraxacum officinale и др. всегда идентифицируется наличие 1-кестозы, нистозы и более высокомолекулярных глюкофруктанов, анализ которых может быть проведен с использованием методов ТСХ или ВЭТСХ.
В ходе анализа объектов, для которых характерны сходные составы свободных углеводов и полисахаридов, необходимо использование других классов соединений как идентификаторов подлинности (табл. 11).
Количественный анализ. Для проведения количественного анализа полисахаридов в лекарственном сырье достаточным является использование двух основных методов: резорцинового метода (для определения глюкофруктанов) и антрон-серного метода (для определения суммарного содержания полисахаридов) (табл. 12). Дополнительным методом анализа углеводов может считаться метод Эльсона-Моргана, используемый для характеристики сырья и препаратов Callisia fragrans. Исследование различных параметров (аналитические характеристики, безопасность, правильность результатов) других методов, используемых в настоящее время в фармакопейном анализе (гравиметрический, пикриновый, фенол-серный, карбазольный методы), указывает на их несоответствие требованиям надлежащей лабораторной практики.
Следует отметить, что включение количественного определения полисахаридов в спецификацию на растительное сырье оправдано только в двух случаях:
1) если растительный объект является концентратором данной группы биополимеров, (например, корни алтея лекарственного, корневища и корни девясила высокого и др.);
2) если полисахаридные компоненты являются носителем (или одним из важных составляющих) фармакологического эффекта извлечений (препаратов) из растительного объекта. Во всех остальных случаях количественное определение полисахаридов не может являться показателем качества растительного сырья, т.к.
они являются обязательными компонентами любой растительной ткани и всегда будут присутствовать в составе экстрактивных веществ. В таблице 12 приведены примеры использования предложенных подходов для анализа полисахаридов в лекарственном сырье.
Таблица 12. Количественный анализ лекарственного сырья, нормируемого по содержанию полисахаридов Рекомендуемый Группа Метод а РСО б показатель, Объект углеводов не менее, % Aloe arborescens полисахариды АСМ GalA 10. Arctium sp. глюкофруктаны РМ Frc 10. Althaea officinalis полисахариды АСМ Ara 8. Armeniaca vulgaris полисахариды АСМ Ara 20. Bidens tripartita полисахариды АСМ GalA 3. Callisia fragrans аминосахара МЭМ GlcN 1. Cetraria islandica полисахариды АСМ Glc 15. Echinacea purpurea глюкофруктаны РМ Frc 10. Fucus sp. полисахариды АСМ Glc 30. Inula helenium глюкофруктаны РМ Frc 15. Kalanchoe pinnata полисахариды АСМ Man 8. Laminaria sp. полисахариды АСМ Glc 30. Linum usitatissimum полисахариды АСМ Xyl 4. Plantago major полисахариды АСМ GalA 2. Plantago psyllium полисахариды АСМ Xyl 6. Sambucus nigra полисахариды АСМ GalA 2. Taraxacum officinale глюкофруктаны РМ Frc 15. Tilia sp. полисахариды АСМ GalA 2. Trigonella foenum-graecum полисахариды АСМ Man 15. Tussilago farfara полисахариды АСМ GalA 2. Viola tricolor полисахариды АСМ GalA 5. Салеп глюкоманнаны АСМ Man 80. Трагакант полисахариды АСМ GlcA 70. а АСМ – антрон-серный метод, МЭМ – метод Эльсона-Моргана, РМ – резорциновый метод;
б Ara – арабиноза, Frc – фруктоза, GalA – галактуроновая кислота, GlcA – глюкуроновая кислота, Man – манноза, Xyl – ксилоза.
В ходе разработки аналитических процедур при работе с нефармакопейными видами сырья необходимо придерживаться следующего алгоритма действий (рис.
15).
1. На первом этапе изучения нефармакопейных видов лекарственного сырья наравне с проведением анатомических, ресурсоведческих и технологических исследований, осуществляется расширенный химический анализ экстрактивных веществ, включая низко- и высокомолекулярные соединения.
2. Если полисахаридные компоненты представляют потенциальный интерес как возможный класс действующих веществ, то проводится исследование состава, структуры и биологической активности для суммарных фракций или индивидуальных полимеров.
3. С применением методов количественного анализа определяется возможность отнесения полисахаридов к группе доминирующих соединений комплекса экстрактивных веществ. Если количественное содержание полисахаридов не превышает 0.5-1%, то в качестве соединений, содержание которых следует нормировать в лекарственном сырье, выбирается другой класс веществ.
ЛЕКАРСТВЕННОЕ СЫРЬЕ 1. Известен ли химический состав?
ДА НЕТ 1а. Химическое исследование ПОЛИСАХАРИДЫ (ПС) 2. Известны ли данные о составе, структуре и биологической активности ПС?
ДА НЕТ 2а.Химико-биологическое исследование 3. Являются ли ПС доминирующей (одной из) группой соединений?
ДА НЕТ 3а. Выбор другого класса соединений 4. Являются ли ПС действующей (одной из) группой соединений?
ДА НЕТ 4а. Выбор другого класса соединений (выбор метода определения подлинности) 5. Доминирующий класс ПС – глюканы и (или) галактуронаны ДА НЕТ Определение неуглеводных компонентов Применение качественных реакций (ВЭТСХ, ВЭЖХ) (фуканы, глюкозаминаны), анализ моносахаридного состава (ВЭТСХ – арабинаны, галактаны, маннаны, ксиланы), анализ олигосахаридного состава (ВЭТСХ – глюкофруктаны) (выбор метода количественного анализа) 6. Доминирующий моносахарид ПС Фруктоза Аминосахара Другие моносахариды резорциновый метод метод Эльсона-Моргана антрон-серный метод Рис. 15. Алгоритм выбора критериев подлинности и метода количественного анализа для лекарственного сырья, нормируемого по содержанию полисахаридов.
4. На следующем этапе исследования проводится изучение фармакологических (биологических) свойств экстрактивных веществ объекта и определяются соединения, ответственные за проявление фармакологического (биологического) эффекта. Определяется степень выраженности эффекта для полисахаридов. Если данный класс соединений не вносит значительного вклада в наличие у препаратов из объекта того или иного вида активности, то в качестве соединений, содержание которых следует нормировать в лекарственном сырье, выбирается другой класс веществ.
5. Если полисахариды являются одним из действующих классов соединений, то принимается решение о включении данных веществ в число нормируемых и выбирается метод определения подлинности объекта на основании сведений об особенностях строения полисахаридов. Если в качестве доминирующих компонентов определены представители классов глюканов или галактуронанов, то определение критериев подлинности проводится по неуглеводным соединениям.
6. В случае доминирования в полисахаридном комплексе представителей классов фуканов, глюкозаминанов, арабинанов, галактанов, маннанов, ксиланов или глюкофруктанов в качестве критериев подлинности выбирают один из подходящих методов, включая применение качественных реакций, анализ моно- и олигосахаридного состава.
7. Далее, исходя из сведений о моносахаридном составе (или принадлежности полисахаридов к одному из полимерных классов), выбирается метод количественного анализа объекта.
Использование данного алгоритма позволяет рационально подойти к выбору критериев подлинности и методов количественного анализа лекарственного сырья.
В заключении следует отметить, что, несмотря на необходимость проведения фундаментальных научных исследований в области изучения структуры и биологической активности природных биополимеров, актуальной остается задача использования лекарственных средств, содержащих данные соединения. Анализ имеющейся номенклатуры лекарств, разрешенных к применению в официнальной практике, свидетельствует о том, что ассортимент полисахарид- и меланин содержащих препаратов ограничен, в связи с чем необходимыми являются исследования по созданию лекарственных средств с использованием рациональных технологий производства, а также разработка современных методов стандартизации подобных препаратов.
ВЫВОДЫ 1. В результате проведенных исследований выделены растительные полисахариды новых структурных типов. В надземной части некоторых представителей сем. Lamiaceae (Lophanthus, Panzerina, Scutellaria) выявлено присутствие нового класса полисахаридов – частично ацетилированных глюкоарабиногалактанов, представляющих собой -(16)-галактаны, содержащие у С-2 и С-3 единичные остатки арабинопиранозы и глюкопиранозы, ацетилированых по положению С-3.