Фармакогностические исследования по разработке лекарственных растительных средств с противоаллергической активностью
На правах рукописи
АФАНАСЬЕВА ЮЛИЯ ГЕННАДЬЕВНА Фармакогностические исследования по разработке лекарственных растительных средств с противоаллергической активностью 14.04.02. – фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук
Пермь 2013 2
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Официальные оппоненты:
-доктор фармацевтических наук, профессор Фурса Николай Сергеевич, ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия»;
-доктор фармацевтических наук, профессор Ханина Миниса Абдуллаевна, ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет»;
-доктор фармацевтических наук, профессор Федосеева Людмила Михайловна, ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет».
Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия»
Защита состоится «26» февраля 2013 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д при Пермской государственной 208.068. фармацевтической академии по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46.
Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.ru 23 ноября 2012 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России http://www.pfa.ru 26 ноября 2012 г.
Автореферат разослан «_» декабря 2012 г.
Учёный секретарь диссертационного совета Д 208.068. кандидат фармацевтических наук, доцент И.А Липатникова ВВЕДЕНИЕ АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Возрастающая по интенсивности деятельность человека на этапе развития технологии и науки привела к появлению в биосфере Земли огромных масс новых веществ. Большая часть этих веществ - впервые синтезированные или выделенные из природных источников соединения и количество их ежегодно увеличивается. При этом почти все химические соединения способны влиять на функции тех или иных биологических систем, вследствие чего и человек и среда обитания испытывают действие множества химических агентов, последствия которых не всегда предсказуемы. Не вызывает сомнения тот факт, что среди уже известных соединений могут быть найдены активные регуляторы процессов, протекающих в организме, и новые безопасные и эффективные лекарственные препараты. Однако из-за отсутствия знаний о полной биологической активности преобладающего количества соединений нет возможности всестороннего использования их ресурсов.
В тоже время, стремительное развитие технологической цивилизации приводит к ухудшению экологического состояния окружающей среды, что неизбежно ведет к нарушению иммунного статуса организма. Аллергические болезни, связанные с извращением иммунного ответа охватывают от 1% до 50% населения: в крупных промышленных центрах - 10%-20%, в сельской местности –2-4%;
в зарубежных странах 10-20%, а распространённость некоторых аллергических нозологий достигает Применение в терапии аллергических заболеваний 80%.
высокоэффективных лекарственных препаратов часто сопровождается побочным действием, которое практически отсутствует у растительных средств. Однако, из более видов лекарственного растительного сырья, включенных в "Государственный реестр лекарственных средств", при аллергических заболеваниях рекомендуется одно – череда трехраздельная.
В связи с этим, актуальными представляются исследования по выделению индивидуальных природных фармакологически активных соединений и изучению их биологических свойств, по выявлению лекарственного растительного сырья, обладающего иммуномодулирующим и противоаллергическим действием и создание на его основе безопасных и эффективных лекарственных препаратов.
Целью диссертационной работы является теоретическое и экспериментальное обоснование расширения ассортимента официнальных видов лекарственного растительного сырья на основе его фармакогностического и фармакологического исследования с целью создания фитопрепаратов для иммунокоррекции и лечения аллергических заболеваний.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
- разработать новый методологический подход к выбору лекарственного растительного сырья иммуномодулирующего действия для профилактики и комплексной терапии аллергических заболеваний;
- провести сравнительный фармакогностический анализ лекарственного растительного сырья с предполагаемым иммуномодулирующим и противоаллергическим действием;
- выделить и идентифицировать индивидуальные биологически активные соединения, ответственные за формирование фармакологического эффекта;
13 - комплексом физических методов анализа (ЯМР Си Н спектроскопии) исследовать биологические свойства идентифицированных биологически активных соединений (флавоноидов), ответственных за формирование фармакологического эффекта;
- провести сравнительную фармакологическую оценку иммуномодулирующей и противоаллергической активности официнальных видов исследуемого лекарственного растительного сырья;
провести изучение химического состава, предложить методики количественного определения суммы действующих веществ, отвечающих параметрам валидации, для листьев чая китайского;
составить проект Фармакопейной статьи;
- обосновать состав прописи сбора противоаллергического № 3, определить критерии подлинности, предложить методики количественного определения суммы действующих веществ, отвечающих параметрам валидации;
составить проект Фармакопейной статьи;
разработать состав и исследовать биофармацевтические показатели предлагаемых на основе лекарственного растительного сырья противоаллергических препаратов сухого водорастворимого экстракта, мази с сухим (присыпки, экстрактом);
разработать проекты нормативной документации на предлагаемые лекарственные формы.
Научная новизна Теоретически и экспериментально обоснованы закономерности выбора лекарственного растительного сырья и разработки растительных композиций, рекомендуемых для коррекции иммунного статуса, профилактики и терапии аллергических заболеваний различной этиологии.
С использованием комплекса современных физических, физико-химических методов анализа изучен качественный и количественный состав различных групп биологически активных соединений (БАС) исследуемых растительных объектов, их 13 композиций и препаратов на их основе. Методами ЯМР Си Н спектроскопии достоверно установлено присутствие в исследуемых растительных объектах соединений флавоноидной природы. Установлены микродиагностические признаки и предложены методы стандартизации для листьев чая китайского.
Впервые с использованием методов квантовой химии (MNDO) изучен биологический молекулярный механизм взаимодействия некоторых природных фенольных соединений – флавоноидов (кверцетина, кемпферола, мирицетина, физетина) с фосфолипидами клеточных мембран.
Впервые методами квантовой химии установлено изменение (MNDO) пространственной структуры флавоноидов и фосфатидилхолина при их взаимодействии.
13 Впервые методами ЯМР С, Н спектроскопии на молекулярном уровне экспериментально исследованы биологические свойства природных фенольных соединений – флавоноидов (Госконтракт 13/11 ФМ «Воздействие некоторых молекул группы флавоноидов на конформационное состояние и электронное строение клеточных фосфолипидов»).
Предложена рецептура сбора противоаллергического № 3, изучен его химический состав, определены критерии подлинности, предложены методики количественного определения суммы действующих веществ, составлен проект Фармакопейной статьи.
Разработаны и экспериментально обоснованы лекарственные формы: присыпка с иммобилизованным фитокомпонентом, мазь с сухим экстрактом из сбора противоаллергического. Изучены биофармацевтические показатели разработанных лекарственных форм, содержание в них основных групп биологически активных соединений, предложены методы их стандартизации.
Приоритет проведенных исследований защищен патентами РФ на изобретение «Мазь для лечения аллергических заболеваний кожи широкого спектра действия» «Средство для лечения аллергических заболеваний кожи широкого спектра действия» для профилактики и лечения аллергических заболеваний кожи различной этиологии.
Практическая значимость Осуществлён выпуск опытной партии присыпки с иммобилизованным фитокомпонентом на ЗАО «ФК Бионорм». Разработаны: проекты ФС «Species antiallergicae N 3» – сбор противоаллергический N 3», «Folia Theae - листья чая», “Extractum Species antiallergicae N 3 sicco» - экстракт сбора противоаллергического № сухой», присыпка с 3 «Aspercio cum phytoextracto immobilisato» иммобилизованным фитокомпонентом».
Результаты микродиагностических исследований листьев ореха грецкого использовались в работе ЗАО “ФК Бионорм” и рекомендованы для включения в нормативную документацию.
Проект ФС «Species antiallergicae N 3» – сбор противоаллергический N 3» принят к рассмотрению в ФГБУ «Научный Центр Экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Проведённые исследования показали целесообразность использования официнальных видов лекарственного растительного сырья для лечения и профилактики аллергических заболеваний различной этиологии и коррекции иммунного статуса организма. Эффективность проведённых исследований и разработанных лекарственных форм подтверждена в работе ГАУЗ Республиканского кожно-венерологического диспансера (г. Уфа).
Предлагаемый состав лекарственных форм позволяет использовать возможности флоры Республики Башкортостан при изготовлении растительных композиций и препаратов на их основе в заводских и аптечных условиях.
Данная работа проводилась в рамках государственной научно - технической программы технологии Республики Башкортостан: физико «Критические математические принципы и технические решения», реализуемой при участии ГБОУ ВПО государственный медицинский университет» «Башкирский Минздравсоцразвития России, и поддержана Госконтрактом № 13/11 ФМ «Воздействие некоторых молекул группы флавоноидов на конформационное состояние и электронное строение клеточных фосфолипидов» (2006 г.) и грантами РФФИ № 40/18-П (2008 г.);
АН РБ ГНТП № 3.2.1.7 (2009 г.).
Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедрах ГБОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразвития России и использовались при разработке учебных пособий для студентов, интернов и аспирантов.
Связь задач исследований с проблемным планом Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России по проблеме и фармация». Номер госрегистрации «фармакология 01200507996.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на региональных, всероссийских и международных научных и научно-практических конференциях: Уфа – 1999, 2002, 2003, 2005, 2006;
Самара – 1999, Санкт-Петербург – 1999;
Москва – Казань - Йошкар-Ола – 2000, 2001, 2002, 2003, 2004, 2005;
Новосибирск – 2005;
Томск – 2006.
Конкретное участие автора в получении научных результатов.
Приведенные в диссертации данные были получены под руководством и при личном участии автора. Основные разделы работы: методологические подходы комплексного изучения лекарственного растительного сырья и индивидуальных биологически активных соединений;
сравнительное фитохимическое исследование 26 видов лекарственного растительного сырья;
выделение и идентификация фенольных соединений;
исследования по разработке состава и стандартизации сбора противоаллергического № 3 выполнены лично автором. Раздел, касающийся изучения биологических свойств фенольных соединений выполнен в рамках Госконтракта № 13/11 ФМ «Воздействие некоторых молекул группы флавоноидов на конформационное состояние и электронное строение клеточных фосфолипидов» и грантов РФФИ № 40/18-П;
АН РБ ГНТП № 3.2.1.7 при участии кафедры медицинской физики с курсом информатики ГБОУ ВПО БГМУ (заведующий кафедрой, д.ф-м.н., профессор Руслан Сагитович Насибуллин). Раздел, касающийся фармакологического исследования, выполнен на базе лаборатории новых лекарственных средств Уфимского научного центра РАН (заведующий лабораторией к.б.н., доцент Наталья Жановна Басченко).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано печатных работы, из них в изданиях рекомендованных ВАК - 12.
Основные положения, выносимые на защиту - результаты теоретических и экспериментальных, физико-химических, фитохимических, химико-биологических, фармакологических и технологических исследований официнальных видов лекарственного растительного сырья с целью их использования для лечения и профилактики аллергических заболеваний различной этиологии и коррекции иммунного статуса организма;
- результаты сравнительного исследования химического состава изучаемых растительных объектов, их композиций на содержание основных групп биологически активных соединений методами хроматографического (БХ, ТСХ), С-, 1Н-, спектрофотометрического (УФ, ЯМР Р), титриметрического и др. видов анализов;
- результаты сравнительной фармакологической оценки иммуномодулирующей и противоаллергической активности изучаемых растительных объектов;
С, 1Н и - результаты квантово-химического, спектрофотометрического ЯМР Р исследования биологического молекулярного механизма взаимодействия некоторых природных фенольных соединений флавоноидов – (кверцетина, кемпферола, мирицетина, физетина) с фосфолипидами клеточных мембран;
результаты исследования изменения конформационного состояния флавоноидов и фосфолипидов клеточной мембраны при их биологическом 13 1 взаимодействии, с использованием квантово-химических, ЯМР С, Ни Р спектрофотометрических методов.
Структура и объём диссертации Диссертационная работа изложена на 269 страницах машинописного текста и состоит из 6 глав: введения, обзора литературы, собственных исследований ( главы);
выводов, списка использованной литературы, включающего 287 источников, из которых 92 – иностранных авторов, содержит 60 таблиц, 65 рисунков и приложений.
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.
В первой главе, на основании обзора литература, изложены современные аспекты этиологии и патогенеза аллергических заболеваний и иммунодефицитных состояний, их фармакотерапия и возможности фитотерапии. Проведен анализ заболеваемости аллергическими болезнями и потребности в противоаллергических средствах в Республике Башкортостан. Отражены вопросы возможности использования лекарственного растительного сырья и извлечений из него для изготовления различных лекарственных форм. Особое внимание уделено противоаллергической и иммуномодулирующей активности природных фенольных соединений и вопросам механизмов формирования иммунобиологического и межмолекулярного взаимодействия веществ на уровне биологической мембраны.
Во второй главе приведены сведения об объектах исследования, используемых методах и приборах.
В третьей главе приведены результаты сравнительного фармакогностического и фармакологического исследования лекарственного растительного сырья с предполагаемой противоаллергической и иммуномодулирующей активностью. В этой же главе приведены результаты по выделению и исследованию методами 13 квантовой химии и ЯМР Н биологического молекулярного механизма C, взаимодействия некоторых природных фенольных соединений – флавоноидов (кверцетина, кемпферола, мирицетина, физетина) с фосфолипидами клеточных мембран.
В пятой главе приводятся результаты фармакогностического исследования сбора противоаллергического.
Шестая глава содержит экспериментальные данные по разработке и стандартизации рациональных лекарственных форм: присыпки с фитокомпонентом, сухого водорастворимого экстракта из сбора противоаллергического № 3, мази на основе сухого водорастворимого экстракта сбора противоаллергического № 3.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования Объектами сравнительного комплексного фармакогностического и фармакологического исследования служили образцы лекарственного растительного сырья различных морфологических групп, отвечающие требованиям (ЛРС) соответствующей нормативной документации.
Объектом фитохимических, химических и биофармацевтических исследований служили: сбор противоаллергический № 3;
сухие экстракты из отдельных видов лекарственного растительного сырья;
присыпка с иммобилизованными фитокомпонентами;
сухой экстракт сбора противоаллергического № 3 и мазь с сухим экстрактом сбора противоаллергического № 3.
В работе использовались реактивы, растворители, стандартные образцы и вспомогательные вещества, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации.
Числовые показатели отдельных растительных объектов и их композиций определялись в соответствии с требованиями к качеству лекарственного растительного сырья и препаратов из него, с использованием методик ГФ XI издания.
Подлинность растительных объектов исследования устанавливали по наличию диагностических признаков, которые определяли приёмами макро- и микроскопического методов анализа, описанных в соответствующих общих и частных статьях ГФ XI издания. Микропрепараты готовились по общепринятым методикам и просматривались с использованием микровизора µVIZO «Ломо».
Идентификацию биологически активных веществ растительных объектов исследования, их композиций и препаратов из них, проводили с использованием современных методов фитохимического анализа: хроматографического (на бумаге, в тонком слое сорбента), спектрофотометрического (УФ, ЯМР 13С, 31Р и 1Н) и др.
Хроматографические исследования проводили методами восходящей одномерной и двумерной хроматографии на бумаге марки «C» и «М» Санкт Петербургской фабрики № 2, и в тонком слое сорбента (ТСХ) на пластинках «Silufol UV – 254» в стандартных условиях с использованием различных систем растворителей. Идентификацию веществ осуществляли сравнительной хроматографией с аутентичными образцами, определением температуры плавления, в том числе, пробы смешения, элементным анализом, изучением УФ – спектров и батохромных сдвигов в сравнении со спектрами достоверных образцов веществ, С, 1Н полученных веществ и сравнение их со спектрами изучением спектров ЯМР ЯМР 13С стандартных образцов.
УФ – спектры снимали на спектрофотометре СФ – 46 в кюветах с толщиной слоя 10 мм с комплексообразующей добавкой или без неё. Элементный анализ осуществляли на C-N-H анализаторе 185 В Hewlett – Packard. Температуру плавления изолированных веществ определяли на блоке Кофлера.
Аутентичные образцы природных веществ (кверцетин, рутин, лютеолин, апигенин, гиперозид, салипурпозид, астрагалин, изоликвиретин, кемпферол, авикулярин, мирицетин, физетин) получали из ГБС СО РАН, ВНИИ ВИЛР, Института органической химии (Иркутск), БНЦ УО РАН, Сигма-Алдрич (11,481-2;
К 0133;
Q 0125).
13 Р и 1Н в CD3OD регистрировали на спектрометре Спектры ЯМР от ядер С, АМ-300 (Bruker, ФРГ). Идентификация спектров ЯМР исследуемых молекул проводилась сопоставлением, рассчитанных с помощью пакета программ ACD full спектров и экспериментально наблюдаемых картин. В некоторых случаях проводились дополнительные определения химических сдвигов по методам, предложенным программой “Природа”.
Для проведения расчетов структурных и электронных параметров, исследуемых молекул и молекулярных систем, использовался метод молекулярной механики ММ+ТМ и квантово-химический полуэмпирический метод MNDO, АМ 1. Программа была получена из фондов ИХКиГ РАН (Новосибирск), адаптирована под поставленную задачу и имеющиеся вычислительные ресурсы. Предварительные расчеты проводили, используя метод молекулярной механики (программа MMP2).
Количественное определение суммы флавоноидов, в исследуемых растительных объектах, проводили спектрофотометрическим методом на приборе СФ-46 с использованием комплексообразующей добавки или без неё, титриметрическим методом. Сумму катехинов определяли гравиметрическим методом. Количественное определение дубильных веществ проводили перманганатометрическим методом;
содержание аскорбиновой кислоты проводили титриметрическим и спектрофотометрическим методом методика), свободных (адаптированная органических кислот - титриметрическим методом.
Биотехнологические исследования присыпки с иммобилизованным фитокомпонентом, сухого экстракта, мази проводилось в соответствии с требованиями ГФ-XI (статьи – «Мази», «Экстракты», «Порошки»). Относительную биодоступность прописей мази определяли методом диализа в воду очищенную. Для определения высвобождения сухого экстракта из мазевых основ использовали метод диффузии в гель.
Фармакологические исследования проводились в лаборатории новые лекарственных средств института органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук. Влияние водных извлечений сырья на первичный и вторичный иммунный ответ оценивали с использованием модели индукции синтеза гемолизинов и агглютининов к эритроцитам овец. Сравнительное изучение противоаллергической активности, исследуемых растительных объектов, проводилось с использованием модели системного анафилактического шока и модели пассивной кожной анафилаксии. Определение антиоксидантной активности проводили с использованием модифицированной методики, основанной на реакции аутоокисления адреналина, предложенной Сирота Т.В. При расчёте антиоксидантной активности учитывали то, что экстракты имели свою окраску, которая поглощает определенную длину волны в видимой области спектра.
Статистическую обработку экспериментальных данных (Р=95%) проводили определением средней арифметической ошибки при различных значениях «n» по известным методикам.
Подбор и сравнительное фитохимическое исследование лекарственного растительного сырья с противоаллергической и иммуномодулирующей активностью Для реализации основной цели исследования на базе современной методологии и научного прогнозирования фармакологической активности лекарственного растительного сырья и индивидуальных природных биологически активных соединений предложена концепция комплексного исследования их неизвестных ранее биологических свойств представленная на рисунке 1.
Растительные объекты для исследования с предполагаемым противоаллер гическим и иммуномодулирующим действием подбирались с учетом этиологии и патогенеза аллергических заболеваний: имеющегося первичного и вторичного иммунодефицита;
нарушения секреции гормонов гипофиза, коры надпочечников, паращитовидных желез;
расстройства деятельности нервной системы;
нарушения обмена веществ;
ухудшение дезинтоксикационной функции печени, повышенной сенсибилизации организма. Кроме этиопатогенетического принципа рассматривался химический состав биологически активных веществ ЛРС, в частности флавоноидной природы: кверцетина, кемпферола, мирицетина, с учетом их фармакологического действия на организм и количественного содержания в растительных объектах.
Рисунок 1. Концепция комплексного исследования лекарственного растительного сырья и индивидуальных природных биологически активных соединений Информационным поиском выявлено 26 лекарственных растительных объекта для дальнейшего сравнительного фармакогностического и фармакологического исследований, из которых 23 включены в «Государственный Реестр»: почки берёзовые, листья берёзы, цветки бессмертника, плоды боярышника, листья брусники, корневища с корнями валерианы, трава горца птичьего, трава полыни горькой, корневища и корни девясила, трава зверобоя, листья крапивы, листья мяты перечной, столбики с рыльцами кукурузы, цветки ноготков, цветки липы, цветки ромашки, плоды рябины, корень солодки, листья толокнянки, трава фиалки, трава хвоща полевого, соплодия хмеля, трава череды, а так же: листья грецкого ореха ((ОСТ 7916/379), разрешены к применению в медицинской практике приказом МЗ РФ от 21.11.1995 за № 335 (Р.95.335.646)) и листья чая, ферментированные (ГОСТ и не ферментированные (ГОСТ 1939-90), широко использующиеся в 1938-90) пищевой промышленности.
При макро- и микроскопическом анализе растительных объектов были обнаружены признаки, описанные в специальных статьях ГФ XI для конкретных видов сырья. Для листьев ореха грецкого и листьев чая в нормативной документации отсутствует описание макро- и микродиагностических признаков, поэтому были проведены соответствующие исследования. Проведенные микроскопические исследования позволили выявить диагностически значимые признаки (ДЗП) измельчённого сырья листьев ореха грецкого: обрывки эпидермиса листа с изодиаметричными, извилистостенными или прямостенными клетками иногда с четковидными утолщениями, устьица округлые реже овальные крупные аномоцитного типа, волоски одиночные одноклеточные простые, иногда с содержимым, встречаются соединенные основанием (розеточные) волоски, друзы различного размера, кристаллы, пигментированные вместилища, желёзки с 4 или выделительными клетками, обрывки сосудов и мезофилла листа. Проявляемость ДЗП (Потанина О.Г., Самылина И.А. 2003 г.) составила 45,4 ± 2,2.
Выделение и идентификация фенольных соединений исследуемых растительных объектов Растительное сырье, отобранное для исследования, содержит различные группы химических соединений: флавоноиды, дубильные вещества, витамины, фенолкарбоновые кислоты, полисахариды, каротиноиды, эфирные масла и др., которые участвуют в обеспечении лечебного действия. Выделение этих веществ, установление их качественного состава и количественного содержания является необходимым условием поиска растительных объектов, для расширения номенклатуры эффективных и безопасных лекарственных средств.
В растительных объектах исследования установлено присутствие флавоноидов различных групп: флавонола, флавона, флавана, флаванонола, катехинов и халконов - в форме агликонов и гликозидов. Присутствие аскорбиновой кислоты было обнаружено во всех исследованных растительных объектах, кроме корневищ с корнями валерианы, листьях чая ферментированных и цветках липы.
Качественный анализ дубильных веществ показал присутствие их во всех видах анализируемого сырья: в листья чая ферментированных и не ферментированных, листьях ореха грецкого, листьях толокнянки, листьях берёзы, листьях крапивы, листьях мяты, цветках ноготков, цветках ромашки, корневищах с корнями валерианы - преимущественно пирогалловой группы;
в листьях брусники, траве череды, траве зверобоя, траве фиалки, траве горца птичьего, траве полыни горькой, траве хвоща полевого, цветках бессмертника, цветках липы, корнях солодки, корневищах и корнях девясила, столбиках с рыльцами кукурузы, почках берёзовых, плодах боярышника, плодах рябины, соплодиях хмеля - преимущественно пирокатехиновой.
Из природных соединений при аллергической патологии наибольшую фармакологическую активность проявляют фенольные соединения класса флавоноидов. Как основные вещества, формирующие противоаллергическое действие они могут быть использованы, в дальнейшем, для стандартизации, лекарственного сырья и различных суммарных препаратов, получаемых из него.
Исходя из этого, проведены исследования по выделению и идентификации веществ этой группы, а также изучению их биологических свойств.
Хроматографическое исследование, препаративное выделение, сравнение с достоверными образцами позволило определить присутствие в исследуемых растительных объектах следующих флавоноидов: рутина, кверцетина, кемпферола – листья берёзы, листья крапивы, листья ореха грецкого, листья толокнянки, трава хвоща полевого, трава горца птичьего, цветки липы, цветки ромашки, корни солодки, соплодия хмеля, корневища и корни девясила;
мирицетина, кверцетина – листья ореха грецкого, листья толокнянки, листья берёзы, трава горца птичьего;
рутина, лютеолина, апигенина – листья мяты, листья берёзы;
рутина, апигенина – листья чая, ферментированные и не ферментированные, трава полыни горькой, трава фиалки, плоды боярышника, корень солодки;
рутина, лютеолина – трава череды, трава хвоща полевого, цветки ромашки;
кверцетина, кемпферола, апигенина – корневища с корнями валерьяны, цветки бессмертника, почки берёзовые, листья берёзы;
рутина – столбики с рыльцами кукурузы. Для достоверного подтверждения присутствия в исследуемых растительных объектах кверцетина, кемпферола, С и 1Н.
мирицетина и апигенина было проведено ЯМР исследование на ядрах С и 1Н спектры выделенных флавоноидов (рис. 2, 3, 4, 5) Полученные ЯМР совпадали со спектрами стандартных образцов флавоноидов.
С и 1Н спектроскопии, хроматографии и Таким образом, методами ЯМР качественными реакциями, достоверно доказано присутствие в исследуемых видах сырья флавоноидов кемпферола, мирицетина, апигенина) и (кверцетина, аскорбиновой кислоты - основных групп биологически активных соединений, ответственных за формирование фармакологического эффекта.
Рисунок 2. Идентификационный Рисунок 3. Идентификационный Рисунок 4. Идентификационный ЯМР 13С спектр мирицетина ЯМР 13С спектр кемпферола ЯМР 13С спектр кверцетина Рисунок 5. ЯМР Н спектр апигенина Биологические свойства фенольных соединений исследуемых растительных объектов Реализация основных механизмов регуляции в организме происходит вследствие изменения характера биофизических, биохимических и энергетических динамических процессов, происходящих при непосредственном участии мембран клеток. Фармакологическое действие практически любого лекарственного средства обусловлено его взаимодействием с рецепторами клеточной мембраны, а эффективность в значительной степени зависит от ее физических свойств – проницаемости, плотности, вязкости и т.д.
Группа природных фенольных соединений – флавоноидов (ФЛ), имеет сопряженные шестичленные циклы, что определяет широкий спектр их фармакологической активности. Биологическая активность молекул флавоноидов сохраняется при изменении числа и положения гидроксильных групп и других радикалов, в том числе в тех случаях, когда заместители создают стерические препятствия для сближения молекул на расстояние необходимое для химического, а соответственно и биологического взаимодействия. Ядро флавоноидов является достаточно химически устойчивой структурой, поэтому биологические и фармакологические свойства этих природных фенольных молекул реализуются через межмолекулярные физические взаимодействия. Следовательно, активность флавоноидов в конечном счёте определяется поведением во времени и распределением электронов и ядер (электронной плотности) взаимодействующих молекул. Изучение распределения электронной плотности разнообразных по структуре биологически активных молекул позволяет не только объяснить молекулярные механизмы их действия, но и прогнозировать их биологические и фармакологические эффекты.
Исследование молекулярного механизма взаимодействия любых молекул сводится к определению геометрической структуры и электронного строения, а также их изменений, которые обусловлены элементарными взаимодействиями, описываемыми принципами квантовой механики. Эти взаимодействия определяют измеряемые макросвойства молекул и характеристики биологических систем.
Для проведения расчетов структурных и электронных параметров исследуемых молекулярных систем использовался метод молекулярной механики ММ+ТМ, полуэмпирический метод MNDO и методы функционала плотности. Исходные структуры молекул флавоноидов (ФЛ) и фосфатидилхолина (лецитин, ФХ) оптимизировались с использованием метода молекулярной механики ММ+ТМ, затем система рассчитывалась методами MNDO.
С использованием выбранной программы проводили оптимизацию структуры фосфатидилхолина и отдельных молекул флавоноидов, и затем строился их комплекс. Пространственное расположение молекул флавоноидов относительно молекулы ФХ задавалось расстоянием от центров колец А, В и С флавоноида до атома азота (N) ФХ в ~5 ангстрем () и углом 90° между плоскостью колец ФЛ и ориентационной осью фосфатной группы ФХ (рис. 6).
Для нахождения структуры изучаемой молекулярной системы, соответствующей минимуму энергии, проводилось варьирование взаимного пространственного расположения молекул ФЛ и ФХ относительно друг друга с одновременной оптимизацией геометрии с использованием метода молекулярной механики ММ+ТМ и MNDO.
CR2 - центр кольца С;
CR1 - центр кольца А;
1: CR2 – CR1- N [1,1] - С[5,1] 2: CR1 – CR2- N [1,2] - С[5,2] Начальные условия:
1= 2= CR2 – CR1- N [1,1] = 900;
CR1 – CR2 - N [1,2 ]= 900;
CR1 – N [1,1] – С[5,1] = 1800;
CR2 – N[1,2] - С [5,2] = 1800;
Рисунок 6. Построение и параметры, определяющие взаимное расположение молекул флавоноидов и фосфатидилхолина относительно друг друга Многократно проведенные расчеты из различных точек локализации показали, что флавоноиды, через -системы электронов колец А, В, С, образуют с ФХ многочисленные комплексы (рис. 6). Однако, энергия образования комплексов имеет неодинаковое значение: с кольцом А – 7,55 кДж/моль, с кольцом В – 8,15 кДж/моль и С и 1Н также с кольцом С – 8,50 кДж/моль. Проведённые расчёты и спектры ЯМР показывают, что кольцо С флавоноидов обладает большей степенью делокализации электронов -системы. Следовательно комплекс с кольцом С будет более устойчивым и будет иметь более продолжительное время жизни. В дальнейшем исследовался именно этот комплекс. Изменяя угол (рис. 6) шагом 10, определяющим ориентацию молекул относительно друг друга, было определено минимальное значение энергии образования комплекса. Полученная картина зависимости энергии комплексообразования от угла поворота на примере кверцетина представлена на рисунке 7.
Как видно из рисунка 7, имеется несколько достаточно устойчивых состояний комплекса ФЛ ФХ, соответствующих различным значениям угла вращения. Однако наиболее прочный комплекс формируется вблизи угла Такое 100°.
формирование комплексов качественно повторяется для всех Рисунок 7. Зависимость потенциальных кривых исследованных молекул.
комплекса ФЛ - ФХ от угла поворота Квантово-химические расчёты формирования комплекса ФЛ – ФХ показали изменения электронного строения их молекул. Меняется величина заполнения состояний Рz орбитали атома кислорода О1 молекул флавоноидов (рис. 8), которая меняется, например у кверцетина с 0,901 (свободный) на 1,453 (в комплексе).
Изменения электронного строения приводят к изменению пространственного строения ФЛ: кольца А и В молекул флавоноидов теряют плоский характер (рис. 8, 9), атом кислорода выходит из плоскости кольца В на расстояние ~ 0,2, двугранный угол между плоскостями колец А и В, равный 180, становится равным 176, что приводит к удлинению связи С9 - С10 и сокращению одинарных прилегающих связей С8 - С9 и С5 - С10. Возникает структура типа «бабочка» (рис. 9).
Одновременное взаимодействие флавоноидов с холиновой и фосфатной группами лецитина вызывает поворот вокруг связи О1 - С2 - С3 кольца С молекул флавоноидов (рис. 8, 9) относительно плоскости кольца В (например, для кверцетина – на угол 32). Такие изменения наблюдаются со всеми исследованными молекулами ФЛ.
Рисунок 8. Пространственная структура Рисунок 9. Пространственная структура флавоноидов в свободном состоянии флавоноидов в комплексе с ФХ Меняется при формировании комплекса и электронное строение фосфатидилхолина. Наиболее значительные изменения происходят с Рz орбиталью атома азота (N35) ФХ. Населённость S орбиталей меняется незначительно.
Одновременно происходят изменения в электронном строении прилегающих к азоту углеродных атомах (С36, С37, С38) (рис. 10, табл.1). Значимые изменения происходят с электронным строением атома фосфора - Р53, меняется электронное строение на атоме углерода С58, который расположен на узле углеводородных хвостов (рис. 10).
Заметные изменения происходят в распределении заряда при образовании комплекса: меняется заряд на атоме азота и прилегающих к нему атомах углерода С36, С37, С38 ФХ, меняется заряд и на фосфоре - Р53 (рис. 10, табл. 1).
Рисунок 10. Пространственная структура фосфатидилхолина Таблица Плотность зарядов атомов фосфатидилхолина в свободном состоянии и в комплексе с флавоноидами, атом Заряд атома ФХ Заряд атома ФХ Заряд атома ФХ Заряд атома ФХ свобод- с кверце- свобод- с кемп- свобод- с мири- свобод- с физе ный тином ный феролом ный цетином ный тином 1 2 3 4 5 6 7 8 N35 -0,133 -0,138 -0,133 -0,138 -0,133 -0,139 -0,133 -0, С36 0,105 0,109 0,105 0,109 0,105 0,108 0,105 0, С37 0,123 0,130 0,123 0,130 0,123 0,128 0,123 0, С38 0,101 0,104 0,101 0,104 0,101 0,105 0,101 0, Р53 1,347 1,371 1,347 1,370 1,347 1,367 1,347 1, Из изменения распределения электронной плотности видно, что происходит перенос заряда с молекулы ФЛ на молекулу ФХ (табл. 1). Величина переносимого заряда меняется, и максимальное значение отмечается у комплекса фосфатидилхолина с кольцом С 3,5,7,4'-тетраоксифлавонола (кемпферола) и составляет 0,12. Плотность заряда на N35 фосфатидилхолина увеличивается (табл.
1). В меньшей степени плотность заряда увеличивается и на некоторых других атомах ФХ, примыкающих к атомам азота С36, С37, С38, а также на ближайших к фосфору атомах углерода С34, С57 (рис. 10, табл. 1). Такое перераспределение заряда показывает, что заметный вклад в энергию образования комплекса вносится электростатическими взаимодействиями. Это приводит к изменению дипольных моментов (табл. 2), и, следовательно, кинетических характеристик молекул.
Таблица Значение дипольных моментов, дб Значения дипольных моментов изолированный фосфатидилхолин в комплексе с фосфатидилхолин мирицетином кверцетином кемпферолом физетином 18,235 16,776 17,434 17,648 18, Изменение электронного строения на атомах азота (N35) и фосфора (P53) вызывают изменение заполнения орбиталей атома С58 (рис. 10). При образовании комплекса происходит возрастание наполнения Py орбитали у С58 на ~0,24, что приводит к изменению угла О59 - С58- С60 (рис. 10). Вследствие этого происходит раздвижение углеводородных хвостов на 0,6. Одновременно меняется угол двугранного глицеринового хвоста с 113,9 на 115,1. Изменение этого угла меняет пространственную структуру ФХ, делая его молекулу более скрученной. Это приводит к тому, что сечение молекулы фосфатидилхолина возрастает на 4,6 2, следовательно, клеточная мембрана становиться более рыхлой и меняется её проницаемость. Эти структурные изменения прослеживаются при образовании комплексов фосфатидилхолина со всеми исследованными молекулами флавоноидов.
Для подтверждения образования комплексов флавоноидов с фосфатидилхолином проводились исследования методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Спектры ЯМР С флавоноидов, фосфатидилхолина и их смесей записывались на спектрометре АМ-300 («Вruker» ФРГ) с рабочей частотой на ядрах С – 75 Мгц и регистрировались с помощью стандартных методик. Рабочая температура - 30С, поддерживалась с точностью 0,2С, однако в некоторых случаях для торможения обменных процессов температура снижалась. Для снижения зависимости химического сдвига (ХС) спектра ЯМР С от pD среды, значение pD поддерживалось равным 7,1 (точность измерений - 0,01, прибор ОР-156/3).
Длительность импульсов - 45, задержка между ними – 1,5 сек, число накоплений до 20000, на 128к точек с шириной развертки 100 м.д., время выборки - 8,65 с, цифровое разрешение - 0,06 Гц. В этих условиях значение ХС определяется с точностью до 0,001 м.д.
Для работы использовались стандартные образцы 7,3',4'-триоксифлавонола (физетина), 3,5,7,4'- тетераоксифлавонола (кемпферола), 3,5,7,3',4'- пентаоксифлаво нола (кверцетина), 3,5,7,3',4',5'- гексаоксифлавонола (мирицетина) (Сигма-Алдрич 11,481-2;
К 0133;
Q 0125). Чистота фосфатидилхолина контролировалась по ЯМР спектрам. Исследовались растворы с концентрацией лецитина М, 0, концентрация флавоноидов менялась.
Наблюдаемая величина химических сдвигов при образовании комплекса для исследованных молекул находится в пределах 1,2 – 1,31 м.д. Это говорит о том, что при образовании комплекса флавоноид – фосфатидилхолин возникает связь между фосфатной группой и гидроксилом у С6 кольца А (рис. 11).
Рисунок 12. ЯМР 13С спектр чистого Рисунок 11. Схема формирования и расчетный спектр ЯМР 13С образования фосфатидилхолина в CD3OD комплекса флавоноид – фосфатидилхолин Формирование комплексов лецитина с кольцом С флавоноидов сопровождается С кольца С. При образовании комплекса с участием p изменением ХС от ядер системы электронов ХС углеродов данного цикла сближаются.
В данном случае, при введении фосфатидилхолина в 0,008М растворы 3,5,7,4' тетраоксифлавонола;
3,5,7,3',4'- пентаоксифлавонола;
3,5,7,3',4',5'- гексаоксифлаво нола и 7,3',4'-триоксифлавонола, химический сдвиг у С16 (рис. 11) уменьшается соответственно на 0,24;
0,19;
0,17 и 0,10 м.д.
При образовании комплексов возникает изменение ХС и от углеродов холиновой группы фосфатидилхолина. ХС от С36, С37, С38 (рис. 10) равный ~53, м.д. у свободного лецитина (рис. 12) смещается в слабое поле при формировании комплекса с на м.д.;
с 3,5,7,4'-тетраоксифлавонолом 1,781 3,5,7,3',4' пентаоксифлавонолом на 1,585 м.д.;
с 3,5,7,3',4',5'- гексаоксифлавонолом на 1, м.д. и с 7,3',4'-триоксифлавонолом на 1,160 м.д. (рис. 13, 14, 15, 16).
Рисунок 13. Спектр ЯМР 13С 0,01 моль Рисунок 14. Спектр ЯМР 13С 0,01 моль раствор фосфатидилхолина с 0,008 моль раствор фосфатидилхолина с 0,008 моль раствором кверцетина раствором мирицетина (3,5,7,3',4',5' (3,5,7,3',4'- пентаоксифлавонола) в CD3OD гексаоксифлавонола) в CD3OD.
Рисунок 16. Спектр ЯМР 13С 0,01 моль Рисунок 15. Спектр ЯМР 13С 0,01 моль раствор фосфатидилхолина с 0,008 моль раствор фосфатидилхолина с 0,008 моль раствором физетина раствором кемпферола (3,5,7,4' (7, 3',4'- триоксифлавонола) в CD3OD тетраоксифлавонола) в CD3OD Одновременно наблюдается изменение ХС от С34 (рис. 10), примыкающего к фосфатной группе лецитина, в сторону сильного поля на ~ 2,0 м.д., при формировании всех комплексов. Полученные величины изменений ХС качественно согласуются с рассчитанными значениями изменения электронной плотности (табл.
1, 3), если учитывается одновременно взаимодействие -системы электронов флавоноидов с холиновой и фосфатной группами лецитина.
Таблица Изменение величины химического сдвига от С36, С37, С38 фосфатидилхолина при формировании комплекса Химический сдвиг Величина Молекула Чистый изменения ХС, м.д.
В комплексе с фосфатидилхолин Фосфатидилхолин - 3,5,7,3',4',5' гексаоксифлавонолом 54,804 1, (мирицетином) 3,5,7,3',4' пентаоксифлавонолом 54,815 1, (кверцетином) 53, 3,5,7,4' тетраоксифлавонолом 55,011 1, (кемпферолом) 7,3',4' триоксифлавонолом 54,390 1, (физетином) Результаты квантово-химических расчетов изменения заряда, возникающие при взаимодействии тетраоксифлавонола;
пентаоксифлавонола;
3,5,7,4'- 3,5,7,3',4' 3,5,7,3',4',5'- гексаоксифлавонола и 7,3',4'-триоксифлавонола с фосфатидилхолином, а также спектры ЯМР на ядрах С позволяют предположить, что для исследованной группы молекул наиболее вероятными являются комплексы с участием -системы электронов кольца С с одновременным формированием водородной связи –ОН группы кольца А с фосфатной группой фосфатидилхолина (рис. 10, 11). Такой комплекс является достаточно прочным.
Устойчивость формирующегося комплекса подтверждается проведенным нами экспериментом.
При введении в раствор, содержащий комплекс ФЛ – ФХ, аллергена (в данном случае использовалась бензилпенициллина натриевая соль) спектр от ядер 1Н (рис. 17) холиновой группы ФХ (5,25 PPM) оставался неизменным, следовательно, точки Рисунок 17. Фрагменты спектра ЯМР Н связывания на холиновой группе комплексов фосфатидилхолин – флавоноид фосфатидилхолина остаются (кверцетин) (А) и фосфатидилхолин – флавоноид (кверцетин) с добавлением блокированными.
бензилпенициллина натриевой соли (Б).
Сравнительное изучение количественного содержания биологически активных веществ в исследуемых растительных объектах Проведённый сравнительный анализ количественного содержания основных групп биологически активных соединений позволил выделить виды лекарственного растительного сырья, содержащие наибольшее их количество (табл. 4).
Таблица Лекарственное растительное сырье, содержащее наибольшее количество биологически активных веществ Содержание Суммы Наименование Флавоноидов, в Аскорбиновой окисляемых сырья пересчёте на,% Катехинов, г кислоты, % соединений, рутин кверцетин % Корень солодки 0,63±0,02 0,29±0,01 1,10±0,04 6,96±0, 1,73±0, Листья берёзы 1,08±0,02 0,49±0,02 0,78±0,03 1,33±0,02 17,89±0, Почки берёзовые 1,01±0,02 1,26±0,04 1,18±0, 0,56±0,02 2,34±0, Листья брусники 1,01±0,02 0,46±0,02 6,89±0,21 1,67±0,07 20,16±0, Листья толокнянки 1,00±0,02 0,60±0,03 4,42±0,20 1,69±0,07 20,13±0, Листья крапивы 1,99±0,07 0,99±0,03 3,02±0, 3,32±0,06 1,52±0, Листья мяты 2,05±0,10 1,31±0,05 3,46±0,14 1,74±0,07 7,30±0, перечной Листья ореха 1,12±0, 1,55±0,06 0,71±0,02 1,57±0,06 8,86±0, грецкого Цветы ромашки 1,06±0,03 0,48±0,02 0,42±0,02 3,28±0, 4,37±0, Листья чая 1,29±0,04 1,24±0, 0,59±0,02 2,24±0,09 16,45±0, ферментированные Листья чая не 1,14±0, 1,55±0,06 0,71±0,02 2,93±0,11 14,44±0, ферментированные Трава горца 1,79±0,06 0,83±0,03 1,75±0, 1,78±0,04 0,81±0, птичьего Трава фиалки 0,99±0, 1,54±0,06 0,70±0,02 1,85±0,07 5,21±0, Трава череды 1,05±0, 2,99±0,08 1,37±0,05 1,83±0,07 10,07±0, Трава зверобоя 1,18±0,03 1,21±0, 3,68±0,09 1,68±0,06 15,72±0, Трава хвоща 0,55±0,02 4,80±0, 0,61±0,01 2,48±0,17 1,75±0, полевого Цветки 1,12±0,05 0,76±0, 3,96±0,09 1,81±0,07 5,36±0, бессмертника Цветки ноготков 1,09±0,05 3,34±0, 1,61±0,06 0,79±0,03 1,87±0, Соплодия хмеля 0,58±0,01 0,26±0,01 0,71±0,02 2,49±0, 2,35±0, Столбики с рыль цами кукурузы 1,04±0,04 0,47±0,02 1,15±0,04 4,97±0, 2,12±0, Сравнительное фармакологическое исследование лекарственного растительного сырья Изучение антиоксидантной активности исследуемых растительных объектов Развитие аллергической реакции может активироваться перекисным окислением липидов мембран клеток. Это приводит к активации ферментных систем, мобилизации внутриклеточных запасов Ca2+ и освобождению медиаторов аллергии. В связи с этим было проведено химико-биологическое изучение антиоксидантных свойств исследуемых видов лекарственного растительного сырья.
В качестве раствора сравнения использовался 0,1% раствор рутина.
Антиоксидантная активность водных извлечений из исследованного лекарственного растительного сырья оказалась достаточно высокой ( 10%), и колебалась в пределах от 3,26±0,13 (для столбиков с рыльцами кукурузы) до 38,05±1,66 (для листьев крапивы). Наиболее активные природные антиоксиданты:
листья крапивы (38,05±1,66), листья брусники (32,28±1,39), листья толокнянки (30,71±1,38), трава хвоща полевого (27,57±1,26), плоды рябины (23,11±1,07), листья чая не ферментированные (21,59±1,02), почки берёзовые (20,23±1,01), корень солодки (19,29±0,91), трава череды (19,08±0,92), цветки ромашки (17,61±0,85), трава горца птичьего (14,57±0,71).
Изучение иммунномодулирующей и противоаллергической активности Влияние водных извлечений сырья на первичный и вторичный иммунный ответ оценивали с использованием модели индукции синтеза гемолизинов и агглютининов к эритроцитам овец. Водные извлечения – настои и отвары, готовили по методикам, описанным в ГФ-XI изд. (ст. «Настои и отвары»).
Поскольку изученный спектр антител включал два их типа – гемагглютинины и гемолизины, то к реальным стимуляторам иммуногенеза можно отнести: корень солодки, траву фиалки, листья ореха грецкого, траву зверобоя, листья чая не ферментированные, цветки календулы, так как вытяжки из этого растительного сырья оказались способными активизировать одновременно синтез обоих типов антител, что важно для коррекции иммунного статуса организма и разработки эффективных и безопасных иммуномодулирующих препаратов.
Виды сырья, подавлявшие во вторичном иммунном ответе, синтез изученных антител на фоне стимуляции первичного иммунного ответа, характеризуются иммуномодулирующим действием со склонностью к иммуносупрессии, что более важно при лечении аллергических заболеваний. К таким видам лекарственного растительного сырья по результатам наших исследований относятся: листья берёзы, листья брусники, листья крапивы, соплодия хмеля.
Сравнительное изучение антианафилактической и противоаллергической активности изучаемых растительных объектов проводилось с использованием модели системного анафилактического шока и модели пассивной кожной анафилаксии.
В результате исследований установлено, что применение в течение 21 дня водных извлечений исследуемых растительных объектов не равнозначно влияет на развитие системного анафилактического шока. Растения, обладающие выраженным иммуностимулирующим действием, значительно уменьшали время наступления анафилаксии и увеличивали выраженность анафилактических проявлений. В некоторых случаях наблюдалась гибель части животных от анафилактического шока.
К такому лекарственному растительному сырью относятся: трава череды, трава зверобоя, трава полыни горькой, листья чая не ферментированные, листья толокнянки.
Напротив, растительные объекты исследования, показавшие способность к иммуносупрессии в несколько раз удлиняли время наступления анафилактических проявлений и уменьшали степень их выраженности. Наиболее активными в данном случае оказались: корни солодки, листья берёзы, листья брусники, листья крапивы, листья мяты, листья грецкого ореха, трава фиалки, трава хвоща полевого, соплодия хмеля и цветки липы.
Ингибирующим действием на развитие и степень проявления пассивной кожной анафилаксии обладали не все виды исследованного растительного сырья. Наиболее активными оказались: корни солодки, листья берёзы, листья брусники, листья крапивы, листья мяты, листья грецкого ореха, листья чая не ферментированные, трава зверобоя, трава хвоща полевого, соплодия хмеля, цветки липы, цветки ромашки и столбики с рыльцами кукурузы.
На основании проведённых исследований можно сделать вывод, что исследованные растительные объекты обладают достаточно выраженной иммуномодулирующей активностью и могут в дальнейшем использоваться как иммуностимуляторы для лечения и профилактики иммунодефицитных состояний, и иммуносупрессоры для лечения аллергических заболеваний, различной этиологии.
Лекарственное растительное сырьё, показавшее наиболее выраженную фармакологическую активность, по данным количественного содержания биологически активных веществ, в основном превалируют над другими видами исследованного сырья. Наибольший интерес представляет группа природных фенольных соединений, в частности флавоноидов и органических кислот, ответственных за формирование данного фармакологического эффекта. Это также подтверждается проведенными исследованиями взаимодействия некоторых молекул из группы флавоноидов с фосфатидилхолином клеточных мембран методами квантовой химии и ЯМР спектроскопии на ядрах 13С.
Фармакогностические исследования по стандартизации листьев чая китайского Качественный анализ листьев чая показал наличие в них основных групп биологически активных соединений: флавоноидов флавонола, (производных флавона, флаванонола, катехинов и халконов – в форме агликонов и гликозидов);
дубильных веществ, преимущественно конденсированной природы;
органических кислот том числе аскорбиновой) и тритерпеновых сапонинов.
(в Хроматографический анализ, препаративное выделение индивидуальных соединений, сравнение с достоверными образцами и литературными данными позволило предположить наличие в листьях чая ферментированных и не ферментированных: мирицетина, кверцетина, лютеолина, кемпферола, апигенина.
Количественное содержание основных групп биологически активных соединений в листьях чая представлено в таблице 5.
Таблица 5.
Количественное содержание основных групп БАС в листья чая листья чая Показатель ферментированные не ферментированные 3,19±0,07 1,53±0, Содержание флавоноидов в 3,21±0,08 1,52±0, пересчёте на апигенин, % 3,22±0,09 1,55±0, 1,24±0,04 1,12±0, Содержание катехинов, г 1,23±0,01 1,14±0, 1,25±0,02 1,15±0, 15,25±0,17 14,75±0, Содержание суммы 17,37±0,19 13,84±0, окисляемых соединений,% 16,46±0,25 15,99±0, 2,71±0,03 3,62±0, Содержание свободных 2,73±0,05 3,66±0, органических кислот, мг% 2,75±0,05 3,67±0, 2,23 ± 0,01 2,87 ± 0, 2,21 ± 0,07 2,88 ± 0, Содержание аскорбиновой 2,27 ± 0,09 2,98 ± 0, кислоты, % 2,30 ± 0,09 2,96 ± 0, 2,20 ± 0,06 2,89 ± 0, 2,28 ± 0,07 2,86 ± 0, Количественное содержание аскорбиновой кислоты определяли спектрофотометрическим методом, по адаптированной методике, предлагаемой для количественного определения содержания аскорбиновой кислоты в препарате «Виратон». Адаптацию метода на выявление оптимального соотношения сырья и экстрагента проводили на примере листьев чая не ферментированных.
Предварительным экспериментом было выявлено оптимальное соотношение сырья и экстрагента –1 : 50. При использовании соотношений 1 : 10 и 3 : 50 показания оптической плотности испытуемого раствора были аналитически недостоверные (порядка 3,235 – 4,358). Поэтому для дальнейших исследований нами использовалось соотношение 1 : 50.
Метрологическая характеристика адаптированной методики количественного определения аскорбиновой кислоты в лекарственном растительном сырье представлена в таблице 6. Данные метрологической характеристики методики анализа находятся в достоверных пределах и показывают её воспроизводимость.
Таблица Метрологическая характеристика адаптированной методики количественного определения аскорбиновой кислоты Объект `x Dx S2,% f S P t (P, f) исследования листья чая 6 2,52 0,0012 0,0346 95 2,57 0,0921 3, Количественное содержание аскорбиновой кислоты в листьях чая ферментированных и не ферментированных представлено в таблице 5.
Проведённый анализ позволил предложить показатели качества листьев чая:
внешние признаки: кусочки листьев, различного размера: от 0,5 до 10 мм, свернутые в трубочки, цвет от тёмно-коричневого до почти чёрного, запах ароматный, терпкий, специфический, вкус вяжущий (ферментированные) или цвет зелёный, запах ароматный, специфический, вкус слегка горьковатый (не ферментированные).
Микроскопия: клетки эпидермиса толстостенные, слабоизвилистые;
нижний эпидермис богат устьицами аномоцитного типа;
волоски одноклеточные толстостенные, с характерным основанием, загнутым в виде хоккейной клюшки, загиб погружен в эпидермис и часто одревесневает;
верхний эпидермис подстилается двухрядной палисадной паренхимой;
в мезофилле имеются характерные крупные идиобласты в виде ветвящихся или рогатых склереид;
в паренхиме обильно представлены друзы оксалата кальция. Числовые показатели: влажность не более зола общая не более не более 3%;
8% (ферментированные), 7% (не ферментированные);
зола, не растворимая в хлористоводородной кислоте не более 7% (ферментированные), не более 6% (не ферментированные);
содержание флавоноидов в пересчете на апигенин, не менее 3% (ферментированные), не менее 6% (не ферментированные);
содержание дубильных веществ (СОС) не менее 15 % (ферментированные), не менее 13,5% (не ферментированные).
Фармакогностические исследования по стандартизации сбора противоаллергического Основываясь на проведенных сравнительных фармакогностических и фармакологических исследованиях составлена пропись сбора противоаллергического № 3, содержащего: листья крапивы, листья берёзы, траву череды, траву хвоща полевого, траву фиалки, столбики с рыльцами кукурузы, корень солодки и соплодия хмеля.
Лекарственное растительное сырьё для приготовления сбора бралось в равных количествах и отвечало требованиям, соответствующей нормативной документации.
Сбор готовили в соответствии со статьёй ГФ XI «Сборы». Приготовленный сбор был проанализирован на содержание радионуклидов и определена его острая токсичность. По степени действия на организм сбор отнесён к 4-му классу опасности (мало опасное вещество). Согласно требованиям, предъявляемым к проекту ФС ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» проведено исследование сбора с цель установления его морфолого-анатомических признаков подлинности и граничных числовых показателей доброкачественности.
Макро- и микроскопическим анализом выявлены элементы растительного сырья с признаками, описанными в соответствующей нормативной документации на отдельные компоненты сбора. Исследованиями серий сбора установлены граничные нормы на изученные числовые показатели: влажность - не более 12%, золы - не более 12%, золы, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты - не более 2,5%, частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 5 мм» не более 3%, частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,18 мм - не более 2%, органические примеси - не более 1,5%, минеральные примеси» - не более 1%.
Изучение фенольных соединений сбора противоаллергического Качественными реакциями установлено присутствие в сборе следующих групп флавоноидов: флавона, флаванонола, катехина в форме агликонов и гликозидов.
Хроматографический анализ очищенных спиртовых растворов сумм веществ (флавоноидов (ФЛ), фенолкарбоновых кислот (ФКК)) проводили с использованием методов БХ и ТСХ в различных системах. Хроматограммы просматривали в видимом и УФ-свете до и после обработки хромогенными реактивами, в сравнении с достоверными образцами веществ (табл. 7, 8).
Таблица Результаты хроматографического исследования флавоноидов в сборе противоаллергическом № (система: н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5)) Окраска пятен до проявления после проявления Rf вещество ВС УФС 5% спиртовый ALCL3 Пары аммиака ВС УФС ВС УФС ФЛ – 1 жёлто-зелёная тёмно-жёлтая жёлто-коричневая жёлтая ярко-жёлтая жёлтая ~0, Рутин тёмно-жёлтая жёлто-коричневая жёлтая ярко-жёлтая жёлтая жёлто-зелёная 0, ФЛ - 2 бледно-жёлтая ярко-жёлтая жёлтая жёлто-зелёная жёлтая жёлтая ~0, Мирицетин бледно-жёлтая ярко-жёлтая жёлтая жёлтая жёлтая жёлто-зелёная 0, ФЛ – 3 жёлтая жёлтая жёлтая жёлто-зелёная жёлтая ярко-жёлтая ~0, Кверцетин ярко-жёлтая жёлтая жёлтая жёлтая жёлто-зелёная жёлтая 0, ФЛ – 4 жёлто- зелёная коричневая жёлтая жёлто-зелёная жёлтая зелёная ~0, Гиперозид жёлто- зелёная коричневая жёлтая жёлто-зелёная жёлтая зелёная 0, ФЛ – 5 жёлто- зеленая светло-коричневая жёлтая ярко-жёлто-зелёная жёлтая зелёная ~0, Лютеолин жёлто- зеленая светло-коричневая жёлтая ярко-жёлто-зелёная жёлтая зелёная 0, ФЛ – 6 жёлтая коричневая светло-жёлтая зелёно-голубая жёлто-коричневая голубовато-фиолетовая ~0, Кемпферол светло-жёлтая зелёно-голубая жёлто- коричневая голубовато-фиолетовая жёлтая коричневая 0, ФЛ – 7 жёлтая коричневая жёлтая светло-коричневая жёлтая зелёная ~0, Апигенин жёлтая светло-коричневая жёлтая зелёная жёлтая коричневая 0, Таблица 8.
Результаты хроматографического исследования фенолкарбоновых кислот в сборе противоаллергическом № Окраска пятен Rf в системах до проявления после проявления вещество 5% спиртовый ALCL3 пары аммиака диазосульфокислота УФС ВС УФС ВС УФС ВС УФС ФКК1 фиолетовая бледно-розовая розовая фиолетовая коричневая фиолетовая синяя ~0,53 ~0, галловая фиолетовая бледно-розовая розовая фиолетовая коричневая фиолетовая синяя 0,54 0, ФКК2 бледно-голубая голубая зелёно-голубая оранжевая ярко-голубая св.-коричневая ярко-желтая ~0,79 ~0, кофейная бледно-голубая голубая зелёно-голубая оранжевая ярко-голубая св.-коричневая ярко-желтая 0,80 0, ФКК3 голубая голубая зелёно-голубая жёлто-зелёная зелёная бурая коричневая ~0,70 ~0, хлорогеновая голубая голубая зелёно-голубая жёлто-зелёная зелёная бурая коричневая 0,71 0, ФКК синяя светло-бурая коричневая темно-синяя фиолетовая светло-жёлтая ярко-жёлтая ~0,84 ~0, (не идентиф.) Проведенным хроматографическим анализом установлено присутствие в сборе противоаллергическом № 3 семи основных соединений флавоноидов, которые идентифицированы как рутин, кверцетин, мирицетин, лютеолин, гиперозид, кемпферол и апигенин (табл. 7). Хроматографический анализ фенолкарбоновых кислот на бумаге в системах: 2 (н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5) и 8 (2% раствор уксусной кислоты) позволил предположить присутствие в сборе галловой, кофейной и хлорогеновой фенолкарбоновых кислот (табл. 8).
Изучение основных групп биологически активных соединений сбора противоаллергического№ Определение содержания основных групп биологически активных соединений в сериях сбора противоаллергического № 3 проводили по общепринятым и известным методикам. Результаты представлены в таблице 9.
Таблица Количественное содержание основных групп биологически активных соединений в сборе противоаллергическом № Дубильных ФКК, в пересчете № Аскорбиновой веществ (СОС), % на кофейную серии кислоты, % кислоту, % 01 3,16 ± 0,03 2,61 ± 0,04 2,13 ± 0, 02 3,13 ± 0,08 2,57 ± 0,07 2,14 ± 0, 03 3,12 ± 0,03 2,52 ± 0,05 2,11 ± 0, 04 2,81 ± 0,05 2,56 ± 0,06 2,12 ± 0, 05 3,11 ± 0,08 2,58 ± 0,08 2,15 ± 0, В нормативную документацию на сбор противоаллергический № 3 предлагаем внести показатель: «суммы окисляемых соединений не менее 2%», с использованием титриметрического метода их определения (ГФ XI, вып. 1, стр.286). Использование именно этой методики на наш взгляд дает более полное представление о содержании в сборе тех групп биологически активных соединений (флавоноидов, органических кислот, дубильных веществ), которые определяют фармакологический эффект.
Учитывая известные фармакологические свойства ФФК (активность в отношении поверхностных дерматитов), в нормативную документацию на сбор противоаллергический № 3, использующийся для приготовления сухого экстракта и в дальнейшем - мази для наружного применения на его основе, вместо показателя «Содержание суммы окисляемых соединений» предлагаем внести показатель «Содержание фенолкарбоновых кислот, в пересчете на кофейную кислоту – не менее 3 %».
Количественное содержание флавоноидов в предлагаемой прописи сбора противоаллергического № 3 определяли с использованием авторской методики (Афанасьева Ю.Г., 1997 г.). Поскольку данные метод предложен для определения содержания флавоноидов в сборе «Аллерфит 3», нами были проведены исследования по адаптации и валидации данной методики применительно к прописи сбора противоаллергического № 3. Проанализированы УФ-спектры спиртового экстракта сбора противоаллергического № 3, изучено влияние на выход флавоноидов из сбора концентрации экстрагента (спирта этилового), соотношения сырья и экстрагента и времени экстракции (рис. 18, 19, табл. 10, 11).
Рисунок 18. УФ спектры спиртового экстракта Рисунок 19. Влияние времени экстракции на сбора противоаллергического № 3 и раствора полноту извлечения флавоноидов из сбора РСО апигенина противоаллергического № 3.
Таблица Влияние концентрации экстрагента на полноту извлечения флавоноидов из сбора противоаллергического № Концентрация 40% этанол 60% этанол 70% этанол 96% этанол экстрагента Содержание 1,79 ± 0,06 2,06 ± 0,08 2,32 ± 0,07 2,37 ± 0, флавоноидов, % Таблица Влияние соотношения сырья и экстрагента на полноту извлечения флавоноидов из сбора противоаллергического № Соотношение сырья (г) и 1 : 10 1 : 20 1 : 30 1 : экстрагента (96% этанол) Содержание флавоноидов, % 2,41 ± 0,06 2,29 ± 0,06 2,12 ± 0,05 2,05 ± 0, Установлено, что оптимальными условиями экстракции являются использование в качестве экстрагента 96% этилового спирта в соотношении сырьё :
экстрагент - 1:10 и нагревание на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 60 минут. Измерение оптической плотности исследуемого экстракта сбора противоаллергического № 3 проводилось при экспериментально установленной аналитической длине волны 269 нм что совпадает с одним из максимумов поглощения апигенина Результаты количественного содержания (рис. 18).
флавоноидов, в пересчете на апигенин представлены в таблице 12.
Таблица Содержание флавоноидов в сборе противоаллергическом № 3, % № серии 01 02 03 04 Содержание ФЛ в пересчете на 2,341 ± 0,078 2,415 ± 0,049 2,287 ± 0,056 2,410 ± 0,048 2,379 ± 0, апигенин Метрологическая характеристика методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на апигенин представлена в таблице 13.
Таблица Метрологическая характеристика методики количественного определения флавоноидов в сборе противоаллергическом № Объект `x Dx S2,% f S P t (P,f) исследования cбор 5 2,3664 0,00057 0,024 95 2,78 0,066 2, Отсутствие систематической ошибки методики подтверждено «опытами с добавками» РСО апигенина к навеске сырья перед экстракцией (табл. 14).
Таблица Результаты опытов с добавками апигенина в навеску сбора противоаллергического № Содержание Добавлено Должно быть Найдено Dx, мг e, % флавоноидов, мг апигенина, мг флавоноидов, мг флавоноидов, мг 25,41 2,52 27,93 27,71 -0,22 0, 23,97 1,17 25,14 24,94 -0,20 0, 24,39 1,25 25,64 25,43 -0,21 0, 23,65 2,34 25,99 25,68 -0,31 1, 25,24 1,73 26,97 26,75 -0,22 0, По результатам проведённых исследований составлена фармакопейная статья «Species antiallergicae N 3» – сбор противоаллергический № 3», принятая к рассмотрению в ФГБУ «Научный Центр Экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Получение, исследование и стандартизация противоаллергических лекарственных препаратов на основе лекарственного растительного сырья Одним из направлений развития фармацевтической науки является создание рациональных лекарственных форм, в том числе на основе лекарственного растительного сырья. Несмотря на обширную номенклатуру противоаллергических препаратов, объём предложений на рынке средств природного происхождения не соответствует потребности, рост которой отмечается в последние годы.
Разработка состава, исследование и стандартизация присыпки с иммобилизированным фитокомпонентом В качестве лекарственной формы для использования в аллергологической и дерматологической практике, в том числе и в педиатрии, была выбрана лекарственная форма для наружного применения присыпка с – иммобилизованным фитокомпонентом.
На основании проведенных исследований, для включения в состав присыпки, были выбраны следующие виды лекарственного растительного сырья:
листья крапивы, трава горца птичьего, листья берёзы, листья брусники, трава фиалки, корень солодки и соплодия хмеля. Отобранные виды растительного сырья обладают мягким иммуномодулирующим и иммуносупрессивным действием.
Фитокомпоненты в состав присыпки вводились в виде измельченного сырья, в виде сухого суммарного экстракта и в виде раствора сухого суммарного экстракта. В качестве экстрагента для получения экстрактов использовалась вода очищенная. Составы исследуемых прописей присыпок с фитокомпонентами и стандартной детской присыпки (№ 4) представлены в таблице 15.
Таблица Компонентный состав прописей присыпок Смесь Сухой № прописи Цинка лекарственного Раствор Тальк Крахмал суммарный присыпки окись растительного ССЭ экстракт (ССЭ) сырья (ana) 1 10,0 80,0 10,0 10, 2 10,0 80,0 10,0 10, 3 10,0 80,0 10,0 15,088* 4 10,0 80,0 10, * - экспериментально установлено оптимальное соотношение сухого суммарного экстракта и растворителя 1:3.
С целью доказательства целесообразности предложенных прописей присыпок проведено их фитохимическое и биофармацевтическое исследование.
На основании проведенных исследований, с учетом полученных данных предложена пропись присыпки № с иммобилизованным 3 (табл. 15) фитокомпонентом (сухим суммарным экстрактом), противоаллергического и иммуномодулирующего действия (Патент на изобретение № 2373949).
Получение, исследование и стандартизация сухого водорастворимого экстракта из сбора противоаллергического № Сухой водорастворимый экстракт получали из предложенного сбора противоаллергического № 3. Для увеличения выхода сухого экстракта применяли метод ремацерации с оптимизацией условий экстрагирования. Переменными факторами явились: измельчённость сырья (Х1 от 0,5 до 4), соотношение сырья и экстрагента (Х2 от 1:5 до 1:15), время одной мацерации (Х3 от 15 до 45 мин), число настаиваний (Х4 от 2 до 4), температура (Х5 от 20 до 100С).
Экспериментально установлено: Х2 – 1:10;
Х3 – 30 мин;
Х4 – 3;
Х5 - 100 С;
коэффициент водопоглащения – 1,32. Максимальное количественное содержание основных групп биологически активных веществ в сухом экстракте составило:
флавоноидов, в пересчёте на рутин 2,52±0,12;
дубильных веществ 6,14±0,25.
Установлены показатели качества сухого водорастворимого экстракта:
флавоноидов, в пересчёте на рутин - не менее 2%;
суммы окисляемых соединений - не менее 4,5%;
экстрактивных веществ, извлекаемых водой - не менее 90%;
влажность - не более 5%;
рН водного извлечения 5,0 – 5,5.
Разработка состава, исследование и стандартизация мази с сухим экстрактом из сбора противоаллергического № Наиболее часто употребляемая в дерматологии лекарственная форма – мазь. В связи с этим проведены исследования по разработке состава мазевой лекарственной формы для наружного применения, содержащей сухой водорастворимый экстракт из сбора противоаллергического № 3.
В качестве носителей были выбраны традиционные и современные основы (вазелин, вазелин-ланолин, Кутумовой, Грецкого, метилцеллюлоза (МЦ), натрий карбоксиметилцеллюлоза (Nа-КМЦ)) и вспомогательные вещества, наиболее часто используемые в фармацевтической практике.
С целью подбора оптимального состава мазевой основы проведены биофармацевтические исследования in vitro: оценка динамики высвобождения действующих веществ (флавоноидов, в пересчёте на рутин), из исследуемых мазевых основ методом диализа в воду очищенную и диффузии в гель.
Результаты определения биодоступности методом диализа через полупроницаемую мембрану и диффузии в 6% желатиновый гель показывают, что наибольшей высвобождающей способностью обладают мази на гидрофильных основах: Nа-КМЦ, МЦ. Максимальные значения высвобождения флавоноидов в 6% желатиновый гель: из мази, полученной на основе Na-КМЦ 3,46±0,02 и на основе МЦ - 1,25±0,03.
Проведенные исследования позволили выделить оптимальные составы прописи мази противоаллергического действия, для наружного применения, содержащей сухой водорастворимый экстракт: сухого экстракта – 5,0;
Nа-КМЦ – 5,7;
воды очищенной – 79,8;
глицерина – 9,5;
нипагин-нипазола (7,5:2,5) – 0, (Патент № 2353348).
Общие выводы 1. Сформулированы теоретически и обоснованы экспериментально научно методологические подходы к комплексному изучению неизвестных ранее свойств отдельных видов лекарственного растительного сырья и индивидуальных биологически активных соединений.
2. На основании сформулированных научно - методологических подходов выделены перспективные иммуномодулирующие и противоаллергические лекарственные растительные объекты и проведено их сравнительное комплексное фармакогностическое исследование.
3. Качественными реакциями, методами ЯМР С, хроматографическими методами, достоверно подтверждено присутствие в исследуемых видах лекарственного растительного сырья основных групп биологически активных веществ, ответственных за формирование фармакологического эффекта:
флавоноидов, аскорбиновой кислоты и суммы окисляемых соединений.
4. Из исследуемых видов лекарственного растительного сырья выделены и идентифицированы методами ЯМР С индивидуальные соединения флавоноидов: рутин, кверцетин, мирицетин, кемпферол, физетин.
5. Изучены неизвестные ранее биологические свойства препаративно выделенных из исследуемого растительного сырья флавоноидов. Определены условия взаимодействия и доказано образование устойчивого комплекса флавоноид – фосфатидилхолин клеточной мембраны. Установлено, что при формировании данного комплекса происходит изменение пространственной структуры фосфатидилхолина, что приводит к изменению физических свойств всей клеточной мембраны.
6. Проведено сравнительное изучение количественного содержания основных групп биологически активных соединений в исследуемых растительных объектах. Выделены виды, содержащие наибольшее количество биологически активных соединений, ответственных за формирование фармакологического эффекта.
7. Фармакологическими исследованиями определены не известные ранее свойства лекарственного растительного сырья. Выделены виды лекарственного растительного сырья, относящиеся к стимуляторам иммуногенеза: корень солодки, толокнянки, листья ореха грецкого, трава зверобоя, листья чая не ферментированные, цветки календулы и виды сырья иммуномодулирующего действия со склонностью к иммуносупрессии (противоаллергическое действие):
листья берёзы, брусники, крапивы, трава фиалки, соплодия хмеля, столбики с рыльцами кукурузы. Определена антиоксидантная активность водных извлечений из исследуемого лекарственного растительного сырья, как один из механизмов формирования аллергической реакции.
8. Проведен фитохимический и товароведческий анализ листьев чая ферментированных и не ферментированных. Выделены анатомо-диагностические признаки листьев чая, определена проявляемость диагностически значимых признаков для измельченного сырья. Определены граничные нормы числовых показателей для внесения в проект нормативной документации. Предложен метод количественного определения флавоноидов в листьях чая. Разработан проект ФС «Folia Theae – листья чая».
9. На основании теоретических и экспериментальных исследований разработана пропись сбора противоаллергического № 3. Проведено его фитохимическое исследование. Определены критерии подлинности, предложены методики количественного определения действующих веществ в сборе противоаллергическом № 3. Осуществлен дифференциальный подход к стандартизации сбора противоаллергического № 3 в зависимости от путей его использования: по содержанию суммы окисляемых соединений и фенолкарбоновых кислот.
10. На основе исследованного лекарственного растительного сырья и сбора противоаллергического № 3 предложены рациональные лекарственные формы – присыпка, сухой экстракт, мазь. Проведено фитохимическое изучение основных групп биологически активных веществ предлагаемых лекарственных форм, изучены их биотехнологические характеристики. Предложены показатели стандартизации.
11. На основании проведенных исследований разработана нормативная документация - Фармакопейная статья «Species antiallergicae N 3» – сбор противоаллергический N 3», принятая к рассмотрению в ФГБУ «Научный Центр Экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации;
разработаны ФС », «Folia Theae - листья чая», “Extractum Species antiallergicae N 3 sicco» - экстракт сбора противоаллергического № 3 сухой», «Aspercio cum phytoextracto immobilisato» присыпка с иммобилизованным фитокомпонентом».
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Никитина, Т.И. Получение и исследование сухого экстракта на основе сбора с противоаллергическим действием / Т.И. Никитина, Ю.Г. Афанасьева, Ф.Х.
Кильдияров, [и др.] // Теоретическая и практическая медицина: материалы юбилейной научной конференции молодых ученых, посвященной V-летию Ассоциации молодых ученых БГМУ.- Уфа, 1999. - С.28-33.
2. Никитина, Т.И. Получение и исследование водорастворимых гранул на основе противоаллергического сбора / Т.И. Никитина, Ю.Г. Афанасьева // Сборник материалов научно-практической конференции, посвящённой 80-летию Фармацевтической службы Самарской области, СГМУ и Самарского аптечного склада. - Самара, 1999.- С.110.
3. Никитина, Т.И. К вопросу нетрадиционного послеоперационного лечения артроза / Т.И. Никитина, Н.В. Кудашкина, Ю.Г. Афанасьева Ю.Г., [и др.] //Здравоохранение Башкортостана, Уфа,1999.- № 5. - С. 56.
4. Шайдуллина, Г.Г. К вопросу разработки пищевых добавок на примере эхинацеи пурпурной / Г.Г. Шайдуллина, Т.И. Никитина, Ю.Г. Афанасьева [и др.] // Новое поколение биорегуляторов в программе «Здоровье и долголетие».-Уфа, 1999. - С. 20 21.
5. Модулирующие сборы – новое направление в фитотерапии / Т.И. Никитина, Х.М. Насыров, Ю.Г. Афанасьева, С.Р. Хасанова // Фармация в XXI веке: инновации и традиции: материалы международной научной конференции. - Санкт-Петербург, 1999. - С. 184.
6. Афанасьева, Ю.Г. Комплекс с 3,5,7,3,4-пентаоксифлавонола фосфатидилэтаноламином / Т.И. Никитина, Ю.Г. Афанасьева, Р.С. Насибуллин // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения, № 2, 1999. – Режим доступа: www.chem.kstu.ru 7. Никитина, Т.И. Подбор основы и разработка технологии получения мазевой лекарственной формы на основе растительного экстракта / Т.И. Никитина, Ю.Г.
Афанасьева, Ф.Х. Кильдияров // Фармация на современном этапе - проблемы и достижения: научные труды НИИФ, том XXXIX, часть 1, М. - 2000, С. 257-260.
8. Никитина, Т.И. Комплекс с 3,5,7,3,4-пентаоксифлавонола фосфатидилэтаноламином / Т.И. Никитина, Р.С. Насибуллин, Ю.Г. Афанасьева // Структура и динамика молекулярных систем: материалы. VII Всероссийской.
конференции, Москва-Казань-Йошкар-Ола, 2000, - С. 125.
9. Никитина, Т.И Комплекс с 3,5,7,3,4-пентаоксифлавонола фосфатидилэтаноламином / Т.И. Никитина, Р.С. Насибуллин, Ю.Г. Афанасьева // Структура и динамика молекулярных систем: материалы VII Всероссийской конференции, Москва-Казань-Йошкар-Ола, 2000, - С. 479 – 481.
10. Никитина, Т.И. Исследование комплекса 3,5,7,3,4-пентаоксифлавонола с фосфатидилэтаноламином / Т.И. Никитина, Р.С. Насибуллин, Ю.Г. Афанасьева, [и др.] // Структура и динамика молекулярных систем: материалы VIII Всероссийской конференции, Москва-Казань-Йошкар-Ола, 2001, - С. 199-200.
11. Никитина, Т.И. Исследование комплекса 3,5,7,3,4-пентаоксифлавонола с фосфатидилэтаноламином / Т.И. Никитина, Р.С. Насибуллин, Ю.Г. Афанасьева, [и др.] // Структура и динамика молекулярных систем: материалы VIII Всероссийской конференции, Москва-Казань-Йошкар-Ола, 2001, - С. 265 -268.
12. Плеханова, Т.И. Сравнительное изучение лекарственных растений на противоаллергическую активность /Т.И. Плеханова, Ю.Г. Афанасьева, Н.А.
Асташина, [и др.] // Здравоохранение Башкортостана. – 2002. - №2. - С. 86 – 88.
13. Насибуллин, Р.С. Комплекс 7,3’,4’- триоксифлавонола с фосфатидилхолином / Р.С. Насибуллин, Т.И. Никитина, Ю.Г. Афанасьева, [и др.] // Структура и динамика молекулярных систем: материалы. IX Всероссийской конференции, Москва-Казань Йошкар-Ола, 2002. - С. 71 – 74.
14. Насибуллин, Р.С. Комплекс 3,5,7,3’,4’- пентаоксифлавонола с фосфатидил холином / Р.С. Насибуллин, Т.И. Никитина, Ю.Г. Афанасьева, [и др.] // Химико фармацевтический журнал. – 2002. - Т.36. - № 9. - С. 33 – 36.
15. Complex of 3,5,7,3,4-pentahedroxyflavonol with phosphatidylcholine / R.S.
Nasibullin, T.I. Nikitina, Yu.G. Afanas'eva, [et al.] // Pharmaceutical Chemistry Journal.
2002.- Т. 36. - № 9.- С. 492-495.
16. Плеханова, Т.И. Противоаллергическая активность некоторых видов лекарственного растительного сырья / Т.И. Плеханова, Ю.Г. Афанасьева, Н.А.