Мягкая рентгеновская синхротронная спектроскопия биоорганических материалов, воды и водных растворов

На правах рукописи

ЗУБАВИЧУС Ян Витаутасович МЯГКАЯ РЕНТГЕНОВСКАЯ СИНХРОТРОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ БИООРГАНИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ, ВОДЫ И ВОДНЫХ РАСТВОРОВ 01.04.01. – Приборы и методы экспериментальной физики

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва 2012

Работа выполнена в Институте синхротронно-нейтронных исследований Курчатовского НБИКС-центра, НИЦ «Курчатовский институт» доктор физико-математических наук, профессор,

Научный консультант:

член-корреспондент РАН Ковальчук Михаил Валентинович Виноградов Александр Степанович, доктор

Официальные оппоненты:

физико-математических наук, профессор. Кафедра электроники твердого тела физического факультета Санкт-Петербургского государственного университета Домашевская Эвелина Павловна, доктор физико математических наук, профессор. Кафедра физики твердого тела физического факультета Воронежского государственного университета Чвалун Сергей Николаевич, доктор химических наук, профессор. Отделение кристаллографии и материаловедения Курчатовского НБИКС-центра, НИЦ «Курчатовский институт» Южный федеральный университет, г. Ростов-на

Ведущая организация:

Дону

Защита состоится «_» _ 20 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 520.009.01 при НИЦ «Курчатовский институт» по адресу: пл. Академика Курчатова 1, г. Москва.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИЦ «Курчатовский институт» Автореферат разослан «» 20 года

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат физико-математических наук А.В. Мерзляков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Огромный прогресс в биологических науках, достигнутый в последние годы, во многом определяется все более широким распространением экспериментальных методов, традиционно считающихся физическими. Среди таких методов, вызвавших настоящую революцию в молекулярной биологии, достаточно упомянуть белковую кристаллографию и магнитно-резонансную спектроскопию/томографию. Данная диссертационная работа посвящена адаптации методов спектроскопии мягкого рентгеновского диапазона (энергии фотонов в интервале 100-1000 эВ), реализуемых на синхротронных источниках (исследовательских мега установках типа ускорителей элементарных частиц, перешедших в прикладную науку из физики высоких энергий), к задачам структурно-функциональной диагностики биоорганических материалов. Использование рентгеноспектральных методов, дающих информацию об электронной структуре исследуемого материала, позволяет рассчитывать на возможность детектирования элементарных стадий биохимических процессов, связанных с переносом протона или электрона. Поскольку электронная структура материала находится в тесной взаимосвязи с его атомной структурой, рентгеноспектральные данные несут в себе специфическую информацию и о локальной атомной/геометрической структуре, которая может быть восстановлена с использованием различных подходов, в том числе путем квантово-механического моделирования.

Цель данной диссертационной работы состояла в создании методических основ использования рентгеноабсорбционной спектроскопии NEXAFS, рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии XPS и рентгеноэмиссионной спектроскопии XES (в резонансном и нерезонансном режимах) на базе синхротронного излучения для анализа биоорганических материалов в виде порошков, тонких пленок и водных растворов. Для достижения поставленной цели решались следующие конкретные задачи:

1. анализ побочных радиационно-индуцированных процессов, неизбежно сопровождающих облучение деликатных биоорганических материалов высокоинтенсивными фотонными потоками, и разработка способов их подавления;

2. проведение систематических измерений на обширных сериях реперных образцов биологически значимых низко- и высокомолекулярных органических соединений, воды(льда) и водных растворов в рамках логики «от простого к сложному»;

3. совершенствование инструментальной базы проведения рентгеноспектральных исследований, включая разработку микрофлюидной проточной ячейки для исследования водных растворов и оптимизацию оптической схемы спектрометра для расширения его функциональных возможностей, улучшения энергетического разрешения, снижения радиационной нагрузки на исследуемые образцы.

Научная новизна. На момент начала диссертационной работы в научной литературе были опубликованы лишь первые разрозненные результаты измерений синхротронных спектров NEXAFS и NEXAFS/XPS для простейших биоорганических молекул – аминокислот, молекулярных фрагментов ДНК и т.п. Некоторые опубликованные спектры характеризовались низким качеством и содержали артефакты процедуры приготовления и радиационных повреждений. 1, В рамках настоящей работы впервые были детально и систематично проанализированы различные экспериментальные проявления радиационного разложения биоорганических молекул (на примере аминокислот) под рентгеновским пучком разной интенсивности в ряду рентгеновская трубка – синхротронный источник на поворотном магните – микрофокусный ондуляторный канал на источнике СИ 3-го поколения.

Опубликованная нами «библиотека» экспериментальных спектров NEXAFS на К-краях поглощения C, N и O протеиногенных аминокислот стала на тот момент наиболее качественным и полным набором спектров, измеренных в идентичных условиях со строгой единообразной взаимной калибровкой энергетической шкалы.

Развитие многих экспериментальных направлений нашей работы (исследование вакуумно-напыленных пленок аминокислот, пептидов, белков, компонентов ДНК/РНК, модельных органических поверхностей на базе самоорганизованных монослоев, льда и жидкой воды) шло параллельно с деятельностью других исследовательских групп.

Особенно это касается развития техники измерения мягких рентгеновских спектров для легкокипящих жидкостей, включая оптимизацию конструкции жидкостной ячейки и оптической схемы эмиссионного спектрометра, где конкуренция была исключительно острой. Но концепция проточной жидкостной ячейки с тонкой мембраной для исследования растворов была впервые предложена и реализована именно научным коллективом с участием автора.

Для немногих теоретических расчетов, включенных в данную диссертацию, использована программа FEFF8 (реализующая пропагаторный подход функций Грина с полным учетом многократного рассеяния для квантово-механического расчетов остовно возбужденных состояний и спектрального моделирования). Это весьма нехарактерно для мягкой рентгеновской спектроскопии органических молекулярных систем. Большинство теоретических работ по моделированию спектров NEXAFS, особенно ранних, было *-резонансов нацелено на максимально точное предсказание положений для изолированных органических молекул в специфической конформации в рамках прямого молекулярно-орбитального представления. Но в таких стандартных схемах спектрального моделирования затруднен учет сильных межмолекулярных взаимодействий, необходимый для корректного расчета спектров конденсированных фаз - в частности, молекулярных кристаллов на основе цвиттер-ионных аминокислот (простейшая аминокислота глицин с молекулярной массой всего 75 а.е.м. плавится с заметным разложением только при 230 250°C, что скорее характерно для органических полимеров). А для FEFF именно такой подход является стандартным. Другим важным преимуществом FEFF является относительная простота моделирования поляризационной зависимости спектров NEXAFS для анализа эффектов линейного дихроизма.

На защиту выносятся следующие положения:

• Методика мониторинга глубокой радиационно-индуцированной химической трансформации аминокислот под рентгеновским пучком на базе совместного анализа данных фотоэлектронной спектроскопии, спектроскопии NEXAFS и масс-спектрального контроля остаточной атмосферы в вакуумной камере спектрометра. Классификация радиационно-индуцированных процессов в аминокислотах и их экспериментальных проявлений, а также анализ влияния различных функциональных групп на радиационную стабильность молекул аминокислот. Методические рекомендации по проведению эксперимента для минимизации эффектов радиационного разложения и получению экспериментальных данных максимально высокого качества.

• База данных эталонных спектров NEXAFS на К-краях поглощения C, N, O биологически значимых органических соединений, включающая аминокислоты, ионные соли аминокислот (хлорид глициния, глицинат натрия и пр.), олигопептиды (глицилглицин, глицилглицилглицин, 2,5-дикетопиперазин и пр.), гомополипептиды (полиизолейцин, политирозин, полигистидин), функциональные белки (бычий сывороточный альбумин, овальбумин, лизоцим и коллаген), азотистые основания нуклеиновых кислот (A, G, T, C, U).

• Принципиальная схема теоретического моделирования рентгеновских спектров аминокислот и их производных на основе кристаллографических данных в рамках формализма полного учета многократного рассеяния в программе FEFF.

• Классификация спектральных вкладов различных функциональных групп в спектрах NEXAFS аминокислот/пептидов и азотистых оснований. Оценка потенциальной информативности и границ применимости подхода строительных блоков к интерпретации спектров сложных молекул.

• Методика комплексной характеризации тонких вакуумно-напыленных пленок аминокислот на основе данных рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (остовные уровни/валентная зона, анализ угловой зависимости спектров) и NEXAFS (с использованием эффектов линейного дихроизма).

• Методика исследования взаимодействий органическая пленка-вода в условиях сверхвысокого вакуума при температуре жидкого азота. Возможность рентгеноспектральной регистрации процессов переноса протона с молекул воды на органические молекулы в пленке и структурной реорганизации пленки для достижения органическими молекулами максимально выгодных водородно-связанных конфигураций.

Качественный анализ ионогенных свойств органического интерфейса по эффектам проявления поверхностного дипольного момента.

• Зависимость режима роста и структурно-морфологических характеристик макроскопически толстых пленок льда (~1 мкм) от интерфейсных свойств органической подложки. Аномальная локальная структура вакуумно-напыленных пленок льда, не согласующаяся с общепринятой моделью льдов низкой плотности (близкой к структуре кристаллических фаз льда Ic и Ih).

• Методика измерения спектров NEXAFS в режиме регистрации выхода флуоресценции, спектров XES и двумерных карт резонансного неупругого рентгеновского рассеяния RIXS для жидкой воды и водных растворов (в том числе биоорганических материалов) с возможностью варьирования температуры и pH с использованием техники проточной жидкостной ячейки с тонкой мембраной из Si3N4/SiC.

• Интерпретация аномального изотопного и температурного эффекта в резонансных рентгеноэмиссионных спектрах линии O K для жидкой воды и льда.

Практическая значимость работы. Полученные результаты открывают перспективы максимально эффективного использования методов мягкой рентгеновской спектроскопии для исследования биоорганических систем, в том числе на источниках синхротронного излучения второго поколения (в частности, на вводящейся в строй станции «НАНОФЭС» КИСИ), для исследования биоорганических систем. Наибольшая информативность разработанного методического арсенала может быть реализована при решении скорее бионанотехнологических (а не чисто биологических) задач в структурной диагностике искусственных биомиметических тонкопленочных структур или молекулярных устройств, включающих элементы белков или ДНК,3 в условиях сверхвысокого вакуума.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на V и VII Национальных конференциях по использованию рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов «РСНЭ» (2005, 2009, Москва);

XVII Международной конференции по использованию синхротронного излучения «СИ-2008» (Новосибирск);

съездах физического общества Германии (2003, Дрезден, 2004, Регенсбург, 2006, Дрезден, 2008, Берлин);

Международном семинаре “Supramolecular biostructures: challenges in optical nanoscopy, X-ray microsopy and spectroscopy” (2003, Берлин);

15й Международной конференции «Vacuum Ultraviolet Radiation Physics» (2007, Берлин, Германия);

Международном семинаре «Resonant Inelastic Soft X-Ray Scattering» (2008, Упсала, Швеция);

Российско-Германской школе для молодых ученых "Materials – Synthesis, Characterization and Properties" (2004, Москва), Московской школе по синхротронному излучению (2005, Москва), III Школе-конференции молодых ученых по химической синергетике (2006, Москва) и ряде других мероприятий.

По теме диссертации опубликовано 42 печатные работы, включая 22 статьи в рецензируемых российских и международных журналах из списка изданий ВАК, рекомендованных для публикации результатов докторских диссертаций.

Диссертация является обобщением работ автора в период 2001-2012 гг., выполненных им в качестве научного сотрудника Института элементоорганических соединений имени А.Н. Несмеянова РАН, стажера в Институте прикладной физической химии Гейдельбергского университета (Германия, 2001-2003 гг.) и сотрудника Национального Исследовательского Центра «Курчатовский институт» (начиная с 2006 г.).

Личный вклад автора заключается в формулировке задач, планировании и подготовке экспериментов в синхротронных центрах BESSY II (Берлин, Германия) и ALS (Беркли, США), количественном анализе, обсуждении и систематизации экспериментальных результатов, теоретическом моделировании и написании статей. Автор лично проводил многие измерения по тематике радиационного разложения аминокислот, характеризации вакуумно-напыленных пленок аминокислот и порошковых образцов в синхротронных центрах BESSY II (Берлин, Германия) и ALS (Беркли, США). Часть измерений проводилась без личного участия автора, но автор участвовал в обсуждении и интерпретации полученных экспериментальных результатов и был соавтором соответствующих публикаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, заключения, 5 глав, списка публикаций по теме диссертации и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 302 страницах, включая 23 таблицы и 131 рисунок. Список цитируемой литературы содержит 345 наименований.

Содержание работы Во Введении обоснованы актуальность темы диссертационной работы, выбор объектов исследования и сформулированы цели и задачи работы.

Основной текст диссертации состоит из пяти глав. В первой главе, являющейся Литературным обзором, проводится анализ современных тенденций развития прикладных исследований с использованием синхротронного излучения. В исторической ретроспективе обсуждаются приложения рентгеноспектральных методов мягкого диапазона (до 1000 эВ) к различным классам биоорганических материалов, а также конденсированным системам на основе воды. В заключении литературного обзора описывается состояние области к началу выполнения диссертационной работы, а также дается характеристика степени новизны подходов/результатов, разработанных в ней подходов и полученных результатов.

Обсуждение экспериментальных результатов, полученных в рамках данной работы, проводится в главах 2-4.

Вторая глава посвящена применению методов мягкой рентгеновской синхротронной спектроскопии к исследованию биоорганических материалов в виде порошков. Она включает в себя восемь разделов. Раздел 2.1 посвящен методическим проблемам применения методов мягкой рентгеновской синхротронной спектроскопии для диагностики биоорганических материалов и, в частности, детальному исследованию механизмов радиационных повреждений аминокислот под пучками рентгеновского излучения разной интенсивности. Конечной целью данного исследования является выработка условий проведения синхротронных измерений, гарантирующих минимальную радиационно-индуцированную модификацию образца.

Исследование механизма радиационных повреждений проведено на примере двух серий алифатических (Ala, Ser, Asp, Asn, Cys) и ароматических (Phe и Tyr) аминокислот.

Сравнительный анализ радиационной стабильности и механизмов радиационного разложения данных аминокислот проводился в два этапа. На первом этапе образцы порошкообразных аминокислот облучались в течение длительного времени рентгеновским излучением трубки с Mg-анодом (Mg K, E=1253.6 эВ) в сверхвысоковакуумной (СВВ) камере лабораторного фотоэлектронного спектрометра.

При этом постоянно измерялись фотоэлектронные спектры остовных линий всех входящих в состав молекул элементов. Анализировались как спектральные профили отдельных линий, так и их интегральные интенсивности (количественный анализ).

Параллельно с XPS-спектрами регистрировалось общее давление в вакуумной камере (в условиях динамического вакуума, т.е. при включенном магнито-разрядном наносе, работающем в режиме постоянной скорости откачки – при этом давление в вакуумной камере для большинства исследованных аминокислот с течением времени увеличивалось).

С помощью анализатора остаточного газа определялся состав газовой атмосферы в СВВ камере для идентификации газообразных продуктов радиационного распада, ответственных за ухудшение вакуума в камере.

На втором этапе анализировались изменения во времени спектров NEXAFS на К краях углерода, азота, кислорода и L2,3-крае серы в условиях значительно более интенсивного облучения на микрофокусном ондуляторном источнике СИ третьего поколения (ALS, Беркли, США).

Использованные нами методы XPS, масс-спектрометрии и NEXAFS дают комплементарную информацию о химических процессах, протекающих в аминокислотах при рентгеновском облучении. Полученные экспериментальные данные указывают на то, что реализуется несколько конкурирующих путей радиационного разложения. Наиболее важными из них представляются следующие:

• Дегидрирование вследствие разрыва химических связей C-H, N-H, O-H и S-H.

Ключевыми проявлениями этого процесса в эксперименте являются рост концентрации молекулярного H2 в остаточном газе вакуумной камеры, а также формирование двойных и тройных связей C-C и C-N. На основе полученных данных можно предположить, что наиболее восприимчивой к данному процессу является протонированная амино группа цвиттер-ионной аминокислоты. Скорее всего, ее депротонирование не останавливается на стадии образования –NH2, а идет дальше, приводя к формированию имино- (C=NH) и далее циано- (CN) производных.

• Дегидратация, т.е. отщепление молекулы воды в результате разрыва химической связи C-OH с последующим отрывом протона от органического субстрата образующимся гидроксил-анионом. Ключевыми экспериментальными проявлениям данного процесса являются рост концентрации воды в остаточном газе, а также быстрое уменьшение брутто-содержания кислорода в облучаемом образце (данные XPS и NEXAFS). Этот процесс затрагивает как гидроксильные группы в боковых цепях аминокислотных остатков (как в случае серина), так и карбоксильные группы. Можно предположить, что протекание данного процесса сопровождается образованием кратных связей, циклизации и конденсации, что, в частности, приводит к таким продуктам радиолиза как дикетопиперазины и олигопептиды.

• Декарбоксилирование, т.е. отрыв молекул CO2 при разрыве связей Calk-Ccarb. С экспериментальной точки зрения этот процесс проявляется в росте концентрации диоксида углерода в остаточном газе, а также понижении соотношения Ccarb/Calk.

• Декарбонилирование, т.е. отрыв молекул монооксида углерода СO. Это проявляется в росте концентрации СО в остаточном газе и понижении доли карбоксильных атомов углерода Ccarb, как и при декарбоксилировании. Имеющиеся результаты дают основания считать, что данный процесс становится особенно значимым на поздних этапах радиолиза, когда значительная часть исходных карбоксильных групп уже трансформировалась в кето- или карбамидные производные.

• Деаминирование, т.е. отрыв молекул аммиака в результате разрыва связей C-N.

Деаминирование приводит к росту концентрации частиц NH2+ в остаточном газе, а также к понижению брутто-содержания азота или, точнее, соотношения N/C в образцах.

• Десульфуризация (для цистеина), т.е. отщепление молекулярного сероводорода H2S при разрыве связей C-S. Экспериментальным проявлением этого процесса служит появление частиц H2S+, HS+, and S+ в остаточном газе.

Доминирующий маршрут радиационного разложения зависит от молекулярной структуры аминокислоты и, в некоторой степени, от условий рентгеновского облучения.

На первом этапе исследования (характеристическое излучение рентгеновской трубки Mg K) были идентифицированы следующие доминирующие маршруты разложения для различных аминокислот: деаминирование для аланина, дегидратация (разрыв связей Calk OH) для серина, деаминирование и декарбоксилирование для цистеина, декарбоксилирование для аспарагиновой кислоты и дегидратация (разрыв связей Ccarb-OH) для аспарагина. Средние эффективные скорости разложения также существенно различаются в ряду исследованных аминокислот. Это позволяет на качественном уровне сопоставить константы радиационной стабильности исследованных аминокислот, поскольку все измерения проводились в максимально близких условиях. Исследованные аминокислоты можно расположить в следующий ряд по повышению радиационной стабильности серин аланин аспарагиновая кислота цистеин аспарагин. Поскольку эти аминокислоты можно формально рассматривать как производные аланина с различными заместителями в -положении, то можно те же экспериментальные наблюдения сформулировать в виде ряда эффективного повышения радиационной стабильности этих функциональных заместителей в составе результирующих молекул аминокислот:

-OH -COOH -NH2 -SH -CONH2.

Сопоставление данных для пары ароматических аминокислот фенилаланина и тирозина выявило неожиданно сильное различие в радиационной стабильности этих родственных органических молекул: именно, тирозин характеризуется значительно более высокой радиационной стабильностью по сравнению с фенилаланином. То есть замещение одного атома водорода в бензольном кольце молекулы фенилаланина на гидроксильную группу приводит к ярко выраженной стабилизации. Следует отметить, что в ряду исследованных алифатических аминокислот наблюдалась противоположная тенденция: серин (OH-замещенный аланин) отличался меньшей радиационной стабильностью, чем аланин. Более того, было показано, что именно OH-группа является "слабым звеном" серина, поскольку основным каналом радиационного распада является дегидратация за счет разрыва связи C-OH. Это означает, что эффект от введения определенных функциональных групп (в данном случае, гидрокисльной OH-группы) на радиационную стабильность результирующей молекулы зависит от положения функционализации (алифатическая боковая цепь или ароматическое кольцо).

Мы считаем, что исключительная стабильность тирозина объясняется образованием в качестве ключевого интермедиата радиолиза долгоживущих тирозильных радикалов, в которых неспаренный электрон делокализован между атомом кислорода и шестью атомами углерода бензольного кольца. Генерация тирозильного радикала не приводит к мгновенной дефрагментации молекулы - исходная молекула тирозина легко регенирируется присоединением атома водорода, хотя и наблюдается некоторая потеря массы и модификация функциональных групп в ходе продолжительного облучения, указывающие, что имеют место альтернативные маршруты радиационно индуцированного разложения (в частности, дегидратация карбоксильных групп), эти альтернативные маршруты оказываются в значительной степени подавленными.

В случае фенилаланина доминируют два маршрута радиационно-индуцированного распада: декарбоксилирование и деаминирование (т.е. разрыв связей C-C и C-N, приводящий к десорбции газообразных продуктов, диоксида углерода и аммиака).

Генерируемые в этих процессах радикалы могут вступать в реакции, аналогичные радикальной полимеризации, с соседними молекулами. Кроме того, они могут трансформироваться в более стабильные частицы, в частности, бензильные или стирильные радикалы, с отрывом соответствующих низкомолекулярных фрагментов.

Помимо академического аспекта полученных новых экспериментальных данных о механизмах радиационного повреждения аминокислот мягким рентгеновским излучением, большой объем накопленной информации о разнообразных проявлениях радиационного разложения послужил методической основой поиска и оптимизации условий проведения пучковых экспериментов, позволяющих в значительной степени подавить или полностью избежать проявления эффектов радиационных повреждений. В частности, были сформулированы следующие рекомендации по сбору экспериментальных данных, нацеленные на подавление или снижение негативного влияния радиационных повреждений:

• Источник СИ: проблемы радиационного разложения стоят намного острее для наиболее ярких (ондуляторных) станций на источниках СИ третьего поколения, чем для менее ярких источников (станций на поворотных магнитах).

• Использование фокусировки рентгеновского пучка на образец (с помощью сферически или тороидально изогнутой дифракционной решетки) приводит к увеличению плотности фотонного потока и, соответственно, ускорению радиационно-индуцированных процессов деградации. По возможности, следует избегать использования фокусирующей оптики или работать в режиме дефокусировки.

• Необходима полная оптимизация времени сбора экспериментальных данных. Шаг сканирования по энергии должен выбираться в соответствии с энергетическим разрешением установки и особенностями измеряемого спектра (NEXAFS): целесообразно использовать минимальный шаг (0.05-0.1 эВ) в области узких *-резонансов и более грубый шаг (0.2-0.5 эВ) в области широких *-резонансов.

• Исследуемый образец должен находиться в пучке СИ только в ходе измерения;

недопустимо держать пучок открытым в другие моменты времени.

• Каждая новая серия измерений должна начинаться на «свежей» точке образца, ранее не попадавшей под пучок СИ.

• Всегда необходим тщательный контроль радиационного разложения, например, путем измерения серий повторных измерений на одной и той же точке образца с анализом изменений между последовательными спектрами.

• Необходимо эффективное охлаждение образца, по крайней мере, для недопущения локального разогрева. При этом само по себе глубокое охлаждение образца не позволяет ослабить эффекты радиационных повреждений. Понижение температуры съемки изменяет характер протекающих процессов (прежде всего, замедляется массоперенос и затрудняется вывод газообразных продуктов радиолиза из зоны облучения), но существенного подавления первичных актов фотохимически индуцируемого разрыва связей нами обнаружено не было.

Далее в разделе 2 приводятся результаты измерения спектров NEXAFS в оптимизированных условиях, исключающих проявление эффектов радиационного разложения для аминокислот и их ионных солей, олигопептидов, гомополипетидов, нескольких функциональных белков, а также пуриновых и пиримидиновых азотистых оснований – компонентов ДНК и РНК.

Раздел 2.2 посвящен обсуждению рентгеновских спектров простых аминокислот NH3+–CHR–COO–, (обычно кристаллизующихся в цвиттер-ионных формах стабилизированных Н-связями), а также их ионных солей. Простейшей аминокислотой является глицин Gly (R=H). В рамках работы были сопоставлены экспериментальные спектры цвиттер-ионного глицина, хлорида глициния и глицината натрия. Для интерпретации экспериментальных спектров проводились теоретические расчеты в рамках подхода полного учета многократного рассеяния (full multiple scattering, FMS), реализованного в программе FEFF.

С точки зрения теории спектр NEXAFS на К-крае C, N или O, по сути, визуализирует парциальный вклад 2p-электронов соответствующего элемента - углерода, азота или кислорода - в общую плотность незанятых электронных состояний фотоионизируемого атома (Е) с учетом динамически экранированной «дырки» на 1s уровне. Говоря более строго, все особенности соответствующей кривой парциальной плотности 2р-состояний должны быть дополнительно размыты из-за естественного уширения остовного уровня, вызванного конечным временем жизни «дырки», а сама кривая - наложена на ступенчатую функцию фотоионизации атома (переходов остовного электрона в континуум). Задача моделирования спектров состояла в выявлении эффектов вариации зарядового состояния глицина (в результате переноса протона), а также межмолекулярных взаимодействий. Последний фактор редко включается в теоретические схемы, хотя именно для систем на основе глицина им пренебрегать ни в коем случае нельзя. Зарядовые формы глицина (цвиттер-ион, катион, анион) стабилизируются именно специфическими конфигурациями межмолекулярных взаимодействий, и оба фактора проявляются согласованно, так что их практически невозможно разделить.

В рамках подхода полного учета многократного рассеяния (FMS) в ходе расчета получается весь спектр целиком, включающий особенности, связанные с * и * резонансами и ступенькой атомного поглощения, но энергии одноэлектронных уровней молекулы не рассчитываются. Чтобы выполнить традиционное отнесение особенностей спектров NEXAFS конкретным электронным переходам, таким как C 1s *C-N или *C=O, к теоретическим спектрам, рассчитанным в рамках формализма FMS, была применена следующая процедура. Парциальные спектры поглощения, рассчитанные для каждого неводородного атома в молекуле глицина, были приведены к единой энергетической шкале путем вычитания потенциалов ионизации соответствующих остовных уровней (в программе FEFF эти значения определяются нулевой точкой muffin tin-потенциала) из вычисленных энергий фотонов. Спектральная особенность, проявившаяся в парциальных вкладах разных атомов на одинаковой энергии, может быть отнесена к парному вкладу этих атомов, т.е. к разрыхляющей орбитали, локализованной между ними. Чтобы различить переходы, связанные с *- и *-орбиталями, мы провели расчеты спектров для разных формальных направлений поляризации возбуждающего пучка во внутренней системе координат молекулы глицина. Интенсивности спектральных компонент, связанных с переходами *-типа, должны достигать максимума, когда вектор поляризации направлен параллельно соответствующей химической связи, т.е. линии, соединяющей центры ядер. И наоборот, в случае *-резонансов максимальная интенсивность должна наблюдаться для вектора поляризации, перпендикулярного плоскости -системы.

С помощью описанной процедуры в спектрах цвиттер-ионного глицина на всех краях поглощения объективно идентифицированы четыре главные компоненты, а именно *COO, *COO, *C-C и *C-N. Слабые предкраевые пики, наблюдаемые для цвиттер-ионного глицина, были проинтерпретированы как результат частичного вовлечения орбиталей атома углерода C2 и атома азота в -систему карбоксильной группы, в том числе за счет межмолекулярных взаимодействий. В соответствии с полученными результатами, переход от цвиттер-ионного глицина к катиону глициния сопровождается лишь незначительными изменениями экспериментальных спектров на К-краях C и N. Более заметные изменения в спектрах на К-крае кислорода трудно поддаются анализу из-за возможного влияния паразитного вклада таких кислород-содержащих примесей, как вода. Напротив, при переходе от цвиттер-иона к глицинат-аниону наблюдаются очень значительные изменения и в углеродных, и в азотных спектрах, выражающиеся в появлении дополнительного узкого резонанса. Следуя формальному алгоритму, использованному для теоретического анализа спектров -глицина, можно предположить, что эти новые пики имеют общее происхождение, поскольку они характеризуются близкими энергиями в совмещенной шкале для атомов C1 и N. Иными словами, образование глицинат-аниона сопряжено с появлением дополнительного слаборазрыхляющего состояния, включающего вклады атомных орбиталей C1, N и, возможно, Na.

В рамках диссертационной работы впервые были измерены эталонные спектры протениогенных аминокислот (20 генетически кодируемых аминокислот плюс гидроксипролин и цистин). Качественный анализ этого массива данных с учетом базового отнесения особенностей в спектре NEXAFS для глицина на основе теоретических расчетов позволил составить классификацию спектральных вкладов функциональных групп, входящих в состав аминокислот.

Ключевые функциональные группы, входящие в состав аминокислот и однозначно проявляющиеся в спектрах NEXAFS, перечислены в Табл. 1-3.

Табл. 1. Характерные положения особенностей в спектрах NEXAFS на К-крае углерода аминокислот и их предполагаемое отнесение Отнесение Энергетическое Примеры положение, эВ *(COO) 288.6 Все/Asp, Glu *(CONH2) 288.3 Asn, Gln *(C-замещенный бензол) 285.1, 285.4 Phe, Tyr *(OH-замещенный бензол) 287.0 Tyr *(C- замещенный имидазол) 286.8, 288.6 His *(C- замещенный индол) 285.1, 285.4, 285.9, 285.5, Trp 287. *(гуанидин) 289.2 Arg *(C-C) 293.0-297.0 Все *(C-N) C-NH3+ 290.3-291 Все 289.9 Lys C-NH *(COO)/(COOH)/(CONH2) 298-305 Все/Asp, Glu/Asn,Gln *(C-OH) 289.6-290.6 Asp, Glu, Ser, Thr, (протонированная карбоксильная / Tyr спиртовая группа) *(C-S) 287.3 Cys, CysCys, Met Табл. 2. Характерные положения особенностей в спектрах NEXAFS на К-крае азота аминокислот и их предполагаемое отнесение Отнесение Энергетическое Примеры положение, эВ *(CONH2) 400.7 Asn, Gln *(имидазол) 399.8, 401.3 His *(индол) 401.7 Trp *(гуанидин) 401.4 Arg *(C-N) 406.2-406.6 Все Табл. 3. Характерные положения особенностей в спектрах NEXAFS на К-крае кислорода аминокислот и их предполагаемое отнесение Отнесение Энергетическое Примеры положение, эВ *(COO)/(COOH)/(CONH2) 532.3-532.5 Все *(C-OH) 534.0 Asp, Glu *(COO)/(COOH)/(CONH2) 542-549 Все *(C-OH) 538-539.4 Ser, Thr, Hyp, Tyr Аминокислоты – серия родственных органических молекул, содержащих ограниченный набор функциональных групп. Тем не менее, несмотря на близость молекулярных структур, все аминокислоты обладают характерными спектрами NEXAFS.

Различие всего в одной функциональной группе может привести к вполне значимым спектральным различиям. В качестве примера можно привести спектры аспарагиновой кислоты и ее амидного производного, аспарагина (Рис. 1). В спектре NEXAFS на К-крае углерода наблюдается небольшой, но статистически значимый сдвиг положения доминирующего резонанса *(COO) в случае Asp и *(CONH2) в случае Asn. В азотном спектре аспарагина появляется новый *-резонанс, связанный с частично двойным характером связи N-C амидной группы (вовлечение неподеленной электронной пары атома азота в делокализованную -систему карбамидной группы). Оба упомянутых спектральных изменения носят фундаментальный характер, поскольку проявляются и при переходе от простых аминокислот к пептидам: ведь пептиды образуются за счет амидных мостиков между аминокислотными остатками. Они будут обсуждаться ниже в контексте МРСС-исследований пептидов.

C K-edge N K-edge Asp O H2N C OH CH CH C O OH Asn O, a.u.

H2 N CH C OH CH C O NH 410 420 285 290 295 300 E, eV Рис. 1. Сопоставление экспериментальных спектров NEXAFS на K-краях углерода (слева) и азота (справа) для аспарагиновой кислоты (Asp) и аспарагина (Asn).

Химически идентичные функциональные группы в структурно родственных молекулах дают идентичные спектральные сигналы. В качестве примера можно упомянуть азотные спектры NEXAFS для серии алифатических аминокислот с одной первичной аминогруппой и одной карбоксильной группой в молекуле, включая глицин, аланин, изолейцин, лейцин и валин. Эти спектры, обладающие очень схожей тонкой структурой, можно рассматривать как спектральный вклад протонированной амино группы C-N*H3+ (звездочкой обозначен остовно-возбужденный атом при измерении спектра).

Phe N Phe Эксперимент FEFF N FEFF N Tyr, a.u.

Tyr Эксперимент Phe N FEFF 395 400 405 410 415 420 425 430 E, eV Рис. 2. Сопоставление экспериментальных спектров NEXAFS на K-крае азота для фенилаланина и тирозина с теоретическими, рассчитанными по кристаллической структуре в программе FEFF. Также приведены фрагменты кристаллических структур тирозина и фенилаланина с обозначением конфигурации H-связей.

С другой стороны, для пары ароматических аминокислот фенилаланин-тирозин в спектрах NEXAFS на К-крае азота наблюдается значимое различие (Рис. 2), которое сложно объяснить их молекулярными формулами: тирозин отличается от фенилаланина наличием гидроксильной группы, но эта дополнительная группа находится слишком далеко от амино-группы, чтобы вызвать какие-либо сильные электронные эффекты и изменения в азотном спектре. Нестандартным образцом в этой паре следует признать именно фенилаланин: спектр тирозина достаточно близок к спектрам алифатических аминокислот, а вот в спектре фенилаланина наблюдается эффективное расщепление основного максимума поглощения на две компоненты. Мы считаем, что такая аномалия может объясняться спецификой молекулярной конформации и межмолекулярных связей в его кристаллической структуре. Согласно результатам рентгеноструктурного исследования, его элементарная ячейка включает две кристаллографически независимые молекулы, различающиеся конформацией и мотивами образуемых водородных связей. Мы провели теоретический расчет спектральных вкладов протонированных амино-групп (N1 и N2) из этих двух независимых молекул в программе FEFF, результаты которого представлены на Рис. 2. Оказалось, что данные спектральные вклады значимо различаются, причем за низкоэнергетическое плечо в спектре отвечает вклад атома N1.

Структурной особенностью молекулы фенилаланина, которой принадлежит атом N1, является наличие относительно слабой внутримолекулярной водородной связи между протоном амино-группы и атомом кислорода карбоксильной группы (соответствующее межатомное расстояние равно 2.29 ). Этот контакт образуется, несмотря на то, что амино-группа вовлечена в образование трех обычных межмолекулярных водородных связей N-H…O. Конфигурации водородных связей, в которых участвуют атомы N1 и N2 в структуре фенилаланина и атом азота в структуре тирозина, также приведены на Рис. 2.

Этот результат демонстрирует, что помимо химической природы функциональной группы (прежде всего, графа образуемых ею химических связей), в спектрах NEXAFS могут проявляться особенности межмолекулярного взаимодействия, особенно в случае сильных специфических взаимодействий, таких как водородные связи.

Раздел 2.3 посвящен анализу спектральных проявлений образования пептидной связи при переходе от простых аминокислот к пептидам. Сопоставление спектров NEXAFS простейшей аминокислоты глицина с его линейными ди- и трипептидами (глицилглицином и глицилглицилглицином) показывает, что наиболее значительные изменения наблюдаются в азотном спектре: возникает новый относительно интенсивный предкраевой *-резонанс, отражающий вовлечение неподеленной электронной пары атома азота в делокализованную -систему карбамидной группы (альтернативная интерпретация появления данного резонанса может быть дана в рамках концепции амидо-иминольной таутомерии). В углеродном спектре наблюдается небольшой сдвиг доминирующего * резонанса в сторону меньших энергий.

С другой стороны, на примере сравнительного анализа спектров олигопептидов из разных аминокислотных остатков (HisPhe, LeuTyr и LeuLeuTyr, а также GlyGlyTyrArg) было показано, что уникальные спектральные характеристики сохраняются для соответствующих аминокислотных остатков в составе более крупных пептидов.

Следующим логическим шагом после составления базы данных спектров наиболее важных протеногенных аминокислот и тестовых измерений на простых олигопептидах стало исследование гомополипептидов, описанное в разделе 2.4.

Гомополипептид, содержащий пептидную последовательность из аминокислотных остатков одного типа, по уровню химической сложности не отличается от своей базовой аминокислоты (и при этом намного проще физиологически значимых белков, включающих широкое разнообразие аминокислот), но его строительные блоки – аминокислотные остатки – уже соединены друг с другом в макромолекулу. В данном разделе анализируются экспериментальные спектры NEXAFS на К-краях C, N и O для трех гомополипетидов: полиизолейцина, политирозина и полигистидина (использовались порошки оптически чистых L-форм с молекулярной массой 10 кДа). В обсуждении также используется спектр циклического дипептида глицина - 2,5-дикетопиперазина, поскольку он благодаря циклической структуре близок к бесконечным линейным полипептидам.

O K-edge * N K-edge *O=C *N-CH2 N-CO *O=C DKP FEFF DKP *N-CO model FEFF model PEY, a.u.

DKP DKP Polyhis Polytyr Polyile Polyile 400 410 420 430 530 540 550 E, eV Рис. 3. Сопоставление спектральных вкладов «пептидных» атомов азота (слева) и кислорода (справа) для 2,5-дикетопиперазина (DKP) и гомополипептидов.

Спектры NEXAFS на К-краях азота и кислорода для молекул, включающих только «пептидные» атомы азота и кислорода (полиизолейцин, политирозин и 2,5 дикетопиперазин для N K-края и полиизолейцин, полигистидин и 2,5-дикетопиперазин для O K-края), приведены на Рис. 3. Формально, эти спектры должны быть идентичными, поскольку они соответствуют химически эквивалентным атомам азота и кислорода, составляющим пептидную связь. Экспериментальные спектры действительно очень похожи, но не идентичны. Во-первых, пики в спектрах 2,5-дикетопиперазина существенно уже и более интенсивны, чем для гомополипептидов. Предположительно, эта разница может быть вызвана «энтропийным» фактором: возможностью сосуществования большого количества химически эквивалентных атомов, находящихся, тем не менее, в различающихся внутримолекулярных (в соответствии с реальной конформацией молекулы) и межмолекулярных (сетка Н-связей и др.) конфигурациях. Этот фактор приводит к неэквивалентности атомов азота и углерода в макромолекулах и, соответственно, понижению интенсивности и уширению пиков в спектрах. Помимо экспериментальных, на Рис. 3 приведены также теоретические спектры для 2,5 дикетопиперазина, рассчитанные в приближении FMS с помощью программы FEFF с отнесением основных спектральных особенностей.

Наиболее существенное различие между азотными спектрами NEXAFS гомополипетидов (полиизолейцина и политирозина) и 2,5-дикетопиперазина состоит в появлении дополнительного узкого -подобного резонанса на энергии 402.7 эВ (выделен прямоугольником на Рис. 3). Его происхождение не до конца понятно. Можно -спиральной предположить, что так проявляется отличие конформации гомополипептидов (характерной для большинства белков), возникающей за счет внутримолекулярных водородных связей N-H…O между аминокислотными остатками, и идеально плоской геометрии циклической молекулы 2,5-дикетопиперазина, образующей только межмолекулярные водородные связи. Точная геометрия карбамидной группы, в частности, небольшие отклонения от плоской конфигурации, могут сильно сказаться на эффективности -делокализации.

В случае спектров на К-крае углерода наблюдается сдвиг доминирующего резонанса карбоксильной группы на 0.4 эВ в сторону меньших энергий и общее понижение интенсивности спектральных компонент на 20-30%. Изменения однозначно регистрируются, несмотря на то, что, как правило, в химических изменениях участвует всего один атом углерода аминокислотного остатка. Наиболее существенно изменяются спектры на К-крае азота. Кислородные спектры изменяются аналогично углеродным (т.е.

сдвиг на 0.3 эВ и уменьшение интенсивности), а результирующий спектр по характеру тонкой структуры начинает напоминать азотный спектр. Таким образом, нами обнаружено, что образование пептидной связи при переходе от мономерной аминокислоты к производному гомополипептиду дает несколько хорошо воспроизводимых изменений в спектрах NEXAFS.

В разделе 2.5 обсуждаются экспериментальные спектры NEXAFS функциональных белков: лизоцима, овальбумина (оба из белка куриного яйца), бычьего сывороточного альбумина (BSA) и коллагена типа I из крысиного хвоста. Показано, что функциональные белки характеризуются очень близкими, но все же различимыми спектрами NEXAFS, и некоторые из характерных различий могут быть надежно связаны с особенностями их аминокислотного состава в рамках подхода строительных блоков, возможности и ограничения которого обсуждаются в разделе 2.6.

Раздел 2.7 посвящен обсуждению спектров NEXAFS азотистых оснований, являющихся субъединицами еще одного важного класса биоорганических макромолекул:

нуклеиновых кислот. Последние представляют собой полимеры нуклеотидов – трехкомпонентных фрагментов, состоящих из нуклеинового (нуклеотидного, азотистого) основания, остатка фосфорной кислоты и сахара (рибозы в случае РНК и дезоксирибозы в случае ДНК). В рамках диссертационной работы были измерены и проанализированы спектры пяти нуклеиновых оснований: цитозина, урацила, тимина (пиримидиновые основания) а также аденина и гуанина (пуриновые основания) в широком энергетическом диапазоне, включающем как *-, так и *-резонансы. В экспериментальных спектрах наблюдается богатая тонкая структура, позволяющая идентифицировать соответствующие молекулярные фрагменты в составе более сложных биоорганических макромолекул.

Схема качественного анализа спектров NEXAFS и идентификации электронных эффектов заместителей продемонстрирована ниже на примерах урацила (U) и Тимина (T), различающихся всего одним метильным заместителем у атома углерода C6 (Рис. 4).

Для отнесения спектральных компонент и интерпретации наблюдаемых сдвигов спектральных линий необходимо учесть следующие соображения. С формальной точки зрения положение полосы поглощения в спектре NEXAFS однозначно определяется сочетанием двух факторов: эффектов начального и конечного состояния с учетом динамической релаксации электронной системы в присутствии остовной дырки, созданной в акте фотопоглощения. К эффектам начального состояния относятся вариации энергий остовных уровней C 1s (наблюдаемые в XPS), а под эффектами конечного состояния понимаются энергии вакантных разрыхляющих молекулярных орбиталей, ассоциированных с данным переходом. В соответствии с недавним исследованием вакуумно-напыленных пленок пиримидиновых оснований на золотой подложке методом высокоразрешающей XPS-спектроскопии,5 в спектрах остовного уровня C1s наблюдается 4 компоненты. С другой стороны, по результатам расчета электронной структуры азотистых оснований в рамках теории функционала плотности,6 абсолютные энергии низших свободных молекулярных орбиталей (НСМО) в электронно-основном состоянии для урацила и тимина практически идентичны. Они располагаются у самого потолка запрещенной зоны, полная ширина которой составляет ~4.5 эВ. Было отмечено, что НСМО характеризуются выраженным *-характером, эффективно делокализованным по всем неводородным атомам молекул с близкими коэффициентами вкладов соответствующих атомных орбиталей (исключая лишь метильный атом C7 в молекуле тимина). Следующие по энергии орбитали НСМО+1 и НСМО+2 располагаются выше НСМО на ~1.5 и 3 эВ соответственно.

Спектры NEXAFS на К-крае С пиримидиновых оснований обладают очень схожей тонкой структурой. В них наблюдается четыре хорошо разрешенных *-резонанса, условно обозначенных a-d, и, по крайней мере, два *-резонанса вблизи 296 и 304 эВ. С учетом приведенных выше соображений, мы относим узкие пики, наблюдаемые в углеродных спектрах NEXAFS U и T (рис. 4), к электронным переходам с неэквивалентных остовных уровней C1s различных атомов углерода в молекулах на делокализованные *-НСМО.

Урацил (U) Тимин (T) O O 2 6 NH NH 5 4N O 4N 9O H H b a d O K-edge C K-edge U T c b c U INorm, a.u.

T a' N K-edge a U T 398 400 402 404 406 408 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 530 535 540 545 550 555 E, eV Рис. 4. Спектры NEXAFS урацила и тимина на К-краях поглощения углерода, азота и кислорода.

При детальном анализе области *-резонансов, показанной в увеличенном масштабе на Рис. 4, обнаруживается ряд систематических вариаций в положении основных четырех *-пиков a-d. При переходе от урацила к тимину заметно сдвигается вправо только пик a, в то время как изменения положений остальных трех резонансов минимальны. Такое поведение легко объяснимо: пик a соответствует вкладу углеродного атома C6, к которому в молекуле тимина присоединен метильный заместитель. В случае T пики a-d характеризуются меньшей интенсивностью, поскольку экспериментальный спектр T нормируется на пять углеродных атомов, один из которых (C7) не вносит вклад в ароматическую систему, в то время как силы осцилляторов соответствующих переходов C1s* остаются практически постоянными.

Спектры NEXAFS на К-крае азота урацила и тимина так же очень схожи. Они различаются лишь незначительными вариациями в положении и относительных интенсивностях главных *-резонансов, обозначенных символами b и c.

В спектрах NEXAFS на К-крае кислорода доминирующий узкий *-резонанс наблюдается для U на энергии 532 эВ. Весьма неожиданно, в спектре тимина наблюдается явное расщепление данного резонанса на две компоненты 531.2 и 532.8 эВ. Этот эффект не может быть объяснен, исходя из молекулярной формулы тимина. Метильный заместитель в тимине не может вызвать столь сильные электронные эффекты на кислородном атоме. Возможно, в данном случае имеет смысл, как и в случае аминокислот, привлечь для объяснения твердотельные эффекты (эффекты межмолекулярного соавт. взаимодействия в молекулярном кристалле). Оцеки и провели рентгеноструктурное исследование безводного тимина. Согласно полученным результатам, в кристалле молекулы тимина образуют бесконечные водородно-связанные цепочки. Авторы отметили, что для объяснения некоторых особенностей конфигурации Н-связей необходимо предположить, что часть молекул тимина находится не в стандартной амидной, а в иминольной таутомерной форме (т.е. протон переходит с атома N2 на атом O9 с соответствующим перераспределением формальных двойных связей). В такой иминольной форме тимина атомы кислорода O8 и O9 оказываются неэквивалентными, что выражается в расщепленной форме *-резонанса. Следует отметить, что таутомерия азотистых оснований (иногда используется термин RAHB, resonance-assisted H-bond) очень широко обсуждается в молекулярно-биологической литературе в контексте мутагенеза и множественного распознавания. В третьей главе диссертации обсуждаются результаты исследования тонкопленочных биоорганических структур. Раздел 3.1 посвящен обсуждению дополнительных возможностей рентгеноспектральных методов в приложении к тонким пленкам аминокислот, получаемым вакуумным напылением, и самоорганизованным монослоям органических молекул по сравнению с порошковыми образцами. Эти дополнительные возможности связаны, в первую очередь, с исключительно высокой информативностью рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии в диагностике тонких пленок, а также важностью применения эффектов линейного дихроизма в NEXAFS для анализа ориентационной упорядоченности органических молекул в пленке.

В разделе 3.2 приводятся результаты по исследованию вакуумно-напыленных пленок аминокислоты гистидина на Au(111). Систематически сопоставлены рентгеноспектральные данные для моно- и полимолекулярной пленок. Их эффективные толщины, оцененные по ослаблению фотоэлектронной линии подложки, равны ~5 и 20.

Помимо оценки толщины гистидиновых пленок, детальный анализ спектральных профилей остовного уровня Au 4f позволяет извлечь важную информацию о силе взаимодействия адсорбат-подложка. В случае чистой подложки (поверхность золота, подвергнутая очистке ионным травлением с последующим отжигом) обе компоненты спин-орбитального дублета остовной линии Au 4f демонстрируют асимметричную форму (Рис. 5), вследствие наложения объемного (83.98 эВ для Au 4f7/2) и поверхностного (83. эВ) вкладов.

Au 4f N 1s C 1s B BC O 1s D D C Поли A AB A C INorm, a.u.

Поли Поли Поли Моно Моно Моно Моно Au Моно Поли Iabs, cps 90 88 86 84 82 290 288 286 284 534 532 530 528 404 402 400 EB, эВ Рис. 5. Спектры XPS остовных уровней Au 4f, O1s, N1s и C1s для мономолекулярной (моно) и полимолекулярной (поли) пленок гистидина на золоте. Вверху: кривые, нормированные на максимальную интенсивность (сплошные линии) с результатами разложения на спектральные компоненты (пунктирные линии). Внизу: кривые в абсолютной шкале интенсивностей, нормированные только на интенсивность падающего пучка.

В случае мономолекулярной пленки вместо полностью подавленной поверхностной компоненты появляется новая, которая характеризуется энергией связи 84.66 эВ, более чем на 1 эВ превышающей характерное значение для объемного металла.

Наблюдаемый “поверхностный сдвиг” явно указывает, что атомы золота, находящиеся на границе раздела, приобретают частичный положительный заряд при адсорбции гистидинового монослоя. Это можно объяснить, если предположить, что гистидин адсорбируется в форме анионов, образуя с золотом достаточно прочные ионно ковалентные связи. Отсутствие в детектируемом количестве исходной поверхностной компоненты чистого золота указывает на то, что эффективное покрытие поверхности гистидином близко к полному.

Рис. 6. Схематическое изображение адсорбционных структур гистидина на золоте в мономолекулярном и полимолекулярном режимах.

В случае полимолекулярной пленки энергия связи интерфейсной компоненты золота всего на 0.35 эВ превышает значение поверхностной компоненты чистого золота, что приводит к полному перекрыванию с пиком объемной компоненты. Это указывает на то, что формирование второго, третьего и последующих слоев гистидина изменяет и состояние интерфейсного слоя. Экспериментальные данные позволяют предположить, что взаимодействие адсорбат-подложка в полимолекулярной пленки существенно слабее, чем в мономолекулярной. Скорее всего, это связано с развитием электростатических и других сильных межмолекулярных взаимодействий (в частности, Н-связей) внутри самого органического слоя.

Дополнительная информация о химической форме адсорбированных молекул гистидина и о природе взаимодействий адсорбат-подложка была получена из анализа спектральных профилей остовных линий C 1s, N 1s и O 1s (см. Рис. 5), а также спектров NEXAFS на всех доступных краях поглощения.

Полимолекулярные слои построены из трехмерных агрегатов случайно ориентированных молекул гистидина (с некоторой тенденцией к горизонтальной ориентации имидазольных колец), сильно взаимодействующих друг с другом за счет кулоновских взаимодействий (между заряженными центрами цвиттер-ионов) и Н-связей, но при этом относительно слабо связанных с золотой подложкой за счет ван-дер ваальсовских взаимодействий. В пленке сосуществуют приблизительно в равных пропорциях две формы цвиттер-ионных молекул гистидина с протонированной амино группой и протонированным имидазольным кольцом. Наряду с цвиттер-ионными молекулами гистидина в полимолекулярной пленке содержится небольшая доля нейтральных молекул (предположительно на границе раздела с вакуумом, а также на дефектных центрах).

Напротив, в мономолекулярном режиме гистидин адсорбируется преимущественно в виде анионов, образующих прочные связи с подложкой. По всей видимости, наибольший энергетический вклад в связывание с подложкой обеспечивает координация атома N3 имидазольного кольца, что требует ориентации сорбированной молекулы с перпендикулярным расположением имидазольного кольца относительно плоскости подложки. Кроме того, в связывании участвуют карбоксилатные группы и амино-группы.

Это подразумевает либо тридентатную геометрию координации, либо сосуществование нескольких бидентатных адсорбционных структур, что схематично изображено на Рис. (нижняя панель). Из-за сосуществования нескольких неэквивалентных адсорбционных структур мономолекулярная пленка не проявляет ярко выраженного ориентационного упорядочения.

Помимо исследования состояния молекул гистидина в вакумно-напыленных пленках, исследовались возможности их модификации облучением (радиационные повреждения) и напылением воды. Облучение образца полимолекулярной пленки гистидина высокоинтенсивным ондуляторным пучком приводит к переходу цвиттер ионов в нейтральные молекулы, а также к частичной потере массы вследствие декарбоксилирования. Вода сорбируется на гистидиновую полимолекулярную пленку частично диссоциативно, генерируя гидроксильные анионы и повышая степень протонирования гистидиновых молекул.

Раздел 3.4 посвящен исследованию самоорганизованных монослоев (СОМ) органических молекул и их взаимодействию с молекулами воды в условиях сверхвысокого вакуума. Самоорганизованные монослои (COM, ангийский термин self assembled monolayer, SAM) – высокоупорядоченные двумерные массивы органических молекул, технологически легко и воспроизводимо получаемые на определенных субстратах9 – являются исключительно удобным модельным объектом для исследования поверхностных свойств (био)органических материалов. Самоорганизованные монослои в определенном смысле близки к пленкам Лэнгмюра-Блоджетт, но принципиальным отличием является то, что при синтезе СОМ упорядоченный монослой органических молекул формируется сразу на твердой подложке (металлической, полупроводникой и др.) за счет сильного специфического взаимодействия связывающих головных групп с подложкой, а в случае ЛБ-пленок всегда необходимы две стадии: формирование лэнгмюровской пленки на границе раздела жидкость-воздух, и ее перенос на твердую подложку. Наиболее распространены СОМ на основе длинноцепочечных алкантиолов на золоте, серебре и некоторых других металлах (Cu, Pt, Pd, Hg), в которых за связывание органических молекул с металлической подложкой отвечает атом серы. Стандартным методом получения таких СОМ является сорбция алкантиолов из разбавленных спиртовых растворов (0.1 – 10 мМ). Нормальное падение (90o ) Скользящее падение (20o) Partial Electron Yield [a.u.] C K-edge N K-edge H десорбция воды адсорбция воды O N 285 290 295 300 305 400 405 410 C Partial Electron Yield [a.u.] S Au 285 290 295 300 305 400 405 410 Энергия фотонов, эВ Рис. 7. Спектры NEXAFS на К-краях углерода и азота для самоорганизованных монослоев меркаптофенилпиридина на золоте в геометрии нормального и скользящего падения. Справа схематично изображена модель адсорбции воды с образованием сильных H-связей с пиридиновыми центрами.

Нами были исследованы несколько тиолятных СОМ с различными терминальными функциональными группами, определяющими их интерфейсные свойства. В работе приводятся экспериментальные данные для исходных пленок, а также обсуждаются эффекты их структурной реорганизации при взаимодействии с молекулами воды в условиях сверхвысокого вакуума при низкой температуре (начальные этапы формирования пленок льда). Наиболее детально рассматривается СОМ на основе меркаптофенилпиридина, в котором в качестве терминальной группы выступает атом азота пиридинового фрагмента (относительно редкий случай гидрофильной пленки, не содержащей атомов кислорода, что методически удобно для анализа состояния адсорбируемых молекул воды).

Анализ данных фотоэлектронной спектроскопии и NEXAFS для СОМ меркаптофенилпиридина позволил сделать следующие выводы:

• На поверхности самоорганизованного монослоя из молекул 4-(4 меркаптофенил)пиридина на золоте при его хранении на воздухе в стандартных условиях спонтанно образуется субмонослой адсорбированной воды (адсорбционная доза приблизительно соответствует 0.1 L, а атомное соотношение N:O 3.3:1).

Адсорбированная вода не удаляется в условиях сверхвысокого вакуума при температуре около 330 K (дальнейшее повышение температуры может привести к разрушению самого органического СОМ). Более половины адсорбированных молекул воды депротонированы до гидроксильных анионов, в то время как химическое состояние практически половины терминальных атомов азота СОМ модифицировано взаимодействием с адсорбированной водой (а доля пиридиниевых катионов составляет около 7%). Таким образом, каждая сорбированная молекула воды должна взаимодействовать в среднем с двумя терминальными атомами азота посредством образования мостиковых водородных связей.

• При целенаправленной адсорбции воды на СОМ при температуре 90 K, формирование трехмерных кластеров льда начинается приблизительно в момент полного монослоевого покрытия поверхности СОМ молекулами воды. После образования кластеров льда доля протонированных пиридиновых центров слегка превышает одну треть всех поверхностных атомов азота СОМ.

• Адсорбция воды на поверхность СОМ приводит к резкому возрастанию ориентационной разупорядоченности в исходно двумерно-кристаллическом молекулярном массиве, что выражается в существенном ослаблении линейного дихроизма в спектрах NEXAFS на К-краях углерода и азота (Рис. 7).

• Наблюдаемые изменения практически полностью обратимы: при мягкой термической обработке наблюдается десорбция воды и возврат системы в исходное состояние.

Следует подчеркнуть, что структурный переход, связанный с потерей ориентационной упорядоченности в слое при адсорбции воды, происходит на границе раздела поверхность-вакуум при температуре 90 К в системе с сильно ограниченной диффузионной подвижностью молекулярных фрагментов. Это с необходимость означает, что энергетический выигрыш за счет образования H-связей с избытком компенсирует неизбежные энергетические потери структурной перегруппировки, по сути, означающей "плавление" 2D-кристаллического СОМ. Этот вывод наряду с непосредственным наблюдением в значительной степени ионного характера взаимодействия вода-СОМ может иметь важные последствия для построения теоретических моделей описания механизмов смачиваемости органических поверхностей на молекулярном уровне. Более того, сам факт спонтанного формирования и высокой стабильности субмонослоя адсорбированной воды на поверхности СОМ с терминальным пиридиновым атомом азота должен учитываться при анализе и оптимизации интерфейсных свойств аналогичных по химической природе СОМ для функциональных приложений (поверхности с градиентной гидрофильностью, поверхности, устойчивые к неспецифической сорбции белков и др.).

Особенности начальных этапов формирования покрытия органических пленок с разными интерфейсными свойствами водой/льдом удобно проанализировать для двух СОМ, номинально не содержащих в своем составе кислорода меркаптофенилпиридинового (гидрофильный ионогенный субстрат) и додецилтиолятного (гидрофобный, неионогенный субстрат) (Рис. 8). В спектре NEXAFS исходного СОМ меркаптофенилпиридина при комнатной температуре (содержащего, как было упомянуто выше, около 0.1 L спонтанно хемисорбированной воды) наблюдается широкий интенсивный предкраевой резонанс на 531.4 эВ, который можно связать с гидроксильными анионами и протон-донирующими молекулами воды, преимущественно присутствующими в исходном СОМ. Интенсивность этого предкраевого резонанса по мере увеличения адсорбционной дозы уменьшается. При этом у широкого основного максимума поглощения формируется все более выраженная тонкая структура, приближающаяся к спектру чистого льда. Такая эволюция спектров NEXAFS соответствует картине послойного формирования полимолекулярной пленки льда поверх самоорганизованного монослоя меркаптофенилпиридина с очень сильными специфическими связями между интерфейсными атомами органической пленки и воды вплоть до полной ионизации с переносом протона на пиридиновый фрагмент.

В то же время для гидрофобного СОМ додецилтиола хорошо видно, что уже при минимальной адсорбционной дозе воды спектр (с поправкой на достаточно высокий уровень шума) полностью воспроизводит все спектральные особенности, характерные для относительно толстой пленки льда (2-3 нм). Это означает, что в случае гидрофобного СОМ с терминальной СH3-группой формирование трехмерных кластеров льда начинается с самых ранних этапов адсорбции, в то время как спектральных проявлений специфического взаимодействия с подложкой не наблюдается (режим островкового роста).

N N O K-edge O1s NEXAFS XPS Интенсивность фотоэмиссии, усл. ед S S Au Au Au-S-Ph-Py субстрат при КТ (спонтанная доза ~0.1 L), a.u.

7L CH3 CH3CH3 CH SS S S Au Au-S-(CH2)11-CH 0.2 L 7L 536 535 534 533 532 531 530 535 540 545 Энергия связи, эВ E, eV Рис. 8. Характерные изменения спектров NEXAFS на К-крае кислорода (слева) и спектральных профилей остовной линии O1s (справа)для двух пленок СОМ/лед (при 90 К), соответствующих различным адсорбционным дозам воды.

Изменение спектральных профилей остовной линии O1s в спектрах XPS для СОМ с терминальной СH3-группой очень незначительно (сдвиг в сторону больших EB не превышает 0.3 эВ). В то же время компонента молекулярно сорбированной воды (для максимальной адсорбционной дозы ~7 L) в случае СОМ меркаптофенилпиридина характеризуется EB приблизительно на 0.8 эВ больше, чем в случае СОМ додецилтиола.

Эта разница, по всей видимости, связана преимущественно с изменением эффективной работы выхода фотоэлектронов с поверхности образца из-за значительной поляризации интерфейса СОМ-вода и появления высокого поверхностного дипольного момента в случае меркаптофенилпиридина.

Адсорбционные исследования воды на СОМ, как правило, заканчивались выращиванием толстой пленки льда в качестве реперной системы. В ходе систематических измерений мы неожиданно обнаружили, что спектры NEXAFS на К-крае кислорода для макроскопически толстых пленок льда (адсорбционная доза 2000- Лэнгмюр, толщина около 1 мкм), выращенных на различных подложках при температуре 90 К, оказываются неидентичными (в качестве примера можно сравнить спектры полимолекулярных пленок льда для адсорбционной дозы 7 L, что соответствует толщине 2-3 нм, приведенные на Рис. 8 – такая разница сохраняется и при дальнейшем росте пленок льда). Поскольку на таких больших толщинах подложка вряд ли может оказывать заметное прямое электронное или структурообразующее влияние (по типу эпитаксии/псевдоэпитаксии), логичнее предположить, что наблюдаемые изменения отражают морфологию пленок, формирующихся в различных режимах роста, определяемых интерфейсными свойствами органического субстрата: послойный рост, послойно-островковый или островковый. Это послужило мотивацией для проведения более детального исследования таких систем.

В разделе 3.5 проводится анализ морфологии макроскопически толстых пленок льда, формирующихся на органических пленках с разными интерфейсными свойствами.

Было обнаружено, что для пленок, выращенных при температуре 90 К на различных подложках (СОМ с терминальными группами –Py, –CH3 и –OH, а также чистое золото), вид спектра NEXAFS на К-крае кислорода остается субстрат-зависимым для весьма значительных толщин (вплоть до ~1 мкм). Эта зависимость пропадает для пленок, подвергнутых «отжигу» или выращенных при температурах 145-155 К.

Рост в условиях кинетического контроля по островковому (или послойно островковому) механизму приводит к высокопористым структурам с развитой (фрактальной) внутренней поверхностью и высокой эффективной долей структурно дефектных поверхностных или приповерхностных молекул. Для пленок, полученных в режиме, более близком к термодинамическому контролю, структура пленок становится слабо зависящей от природы субстрата, при этом также сглаживаются различия между объемом и поверхностью льда.

Для более глубокого понимания особенностей локальной структуры и специфической дефектности пленок льда была использована спектроскопия EXAFS на К крае кислорода (раздел 3.6).

Несмотря на тот факт, что спектроскопия EXAFS является без преувеличения основным рентгеноспектральным методом в жесткой рентгеновской области (так что под термином «рентгеновская спектроскопия» часто понимается именно EXAFS), в мягкой рентгеновской области этот метод развит достаточно слабо. Если количество публикаций по EXAFS в жесткой рентгеновской области насчитывает более десяти тысяч, то аналогичное количество для EXAFS в мягкой рентгеновской области (до 1000 эВ) вряд ли превышает несколько десятков. Это связано с целым рядом факторов.

, a.u.

|FT(k3(k))| k3(k) 525 550 575 600 625 650 E, eV 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 R, - k, Рис. 9. Осциллирующая часть спектра EXAFS на К-крае кислорода для 2,5 дикетопиперазина (справа) и ее Фурье-трансформанта (слева): экспериментальные данные изображены сплошными линиями, а теоретические кривые после оптимизации структурной модели – точками. На врезке к левой панели приведен фрагмент исходного спектра EXAFS.

Прежде всего, в большинстве случаев химический состав образца не позволяет измерить спектр в достаточно широком для традиционного анализа EXAFS энергетическом интервале из-за присутствия посторонних краев поглощения. Во-вторых, измерение спектра поглощения в широком интервале энергий фотонов, сложно реализуется технически. Например, на наиболее современных ондуляторных каналах источников СИ третьего поколения варьирование энергии пучка СИ, падающего на образец, осуществляется одновременным сканированием угла поворота монохроматора (дифракционной решетки) и магнитного зазора ондулятора, так чтобы требуемая энергия не сильно уходила с максимума фундаментальной (или более высокой) гармоники ондулятора. В таком режиме ширина доступного интервала сканирования фотонной энергии без существенной переюстировки параметров оказывается ограниченной. Еще одним фактором является относительно быстрое затухание структурных EXAFS осцилляций на краях поглощения легких элементов.

Для проверки технической возможности использования спектроскопии EXAFS на К-крае кислорода для анализа локальной структуры пленок льда мы провели измерение спектров EXAFS для двух модельных систем – оксида цинка и 2,5-дикетопиперазина и проанализировали их с использованием стандартных алгоритмов и программных средств, принятых в спектроскопии жесткого диапазона.

Достоинствами 2,5-дикетопиперазина как репера являются простота молекулярной структуры: в молекуле присутствует два полностью эквивалентных атома кислорода, образующие единственную химическую связь с атомом углерода. Кроме того, 2,5 дикетопиперазин характеризовался высокой радиационной стабильностью. Полученные результаты представлены на Рис. 9. Стандартные алгоритмы обработки спектров позволяют надежно восстановить параметры локального окружения атома кислорода: в данном случае координационное число для сферы O-C 1 с межатомным расстоянием 1. в полном соответствии с известной кристаллической структурой.12 Наблюдаемые в Фурье-трансформанте дальние пики могут соответствовать внутри- и межмолекулярным расстояниям в кристаллической структуре 2,5-дикетопиперазина.

Насколько нам известно, данное измерение является первым в мире EXAFS исследованием молекулы пептидной природы на К-крае кислорода.

Фурье-трансформанты экспериментальных спектров EXAFS на К-крае кислорода для двух пленок льда на поверхности золота, выращенные при 100 К (1) и 153 К (2), представлены на Рис. 10. В области очень коротких расстояний в диапазоне 0.5-1.8 в Фурье-трансформантах наблюдается сложная картина пиков, которую логично отнести к O-H-вкладам. Локальная конфигурация молекулы воды в структуре льда описывается так называемым правилом Полинга:13 2 ковалентно связанных атома H на расстоянии около 1.00 (выступающих в качестве доноров для соседних водородно-связанных молекул) и дополнительных атома Н на расстоянии 1.75, водородно-связанных по акцепторному типу. Попытки описать наблюдаемую картину в рамках стандартного алгоритма EXAFS анализа, считая водород «обычным» атомом, привели к существенно отличающимся от требований правила Полинга результатам. В частности, для одной из исследованных пленок совпадение экспериментального спектра и модельного было достигнуто для формальной комбинации из трех контактов O-H R,(N): 1.01(0.6), 1.41(1.6) и 1.89(1.8) с наложенным ограничением, что координационные числа (значения, приведенные в скобках) должны в сумме давать 4. В таком наборе расстояний не очень понятным выглядит присутствие средней компоненты на расстоянии 1.41. Один из факторов, возможно, влияющих на интерпретацию пиков малых расстояний, наблюдаемых в Фурье трансформанте, связан с протеканием ультрабыстрой диссоциации связи O-H, инициируемой фотоионизацией (более подробно о данном явлении см. ниже).

Для обсуждаемых образцов пленок льда в Фурье-трансформантах кислородных спектров EXAFS доминирует пик, максимум которого наблюдается на координате 2.40.

Стандартная процедура моделирования-оптимизации структурной модели с использованием пути однократного рассеяния O…O дает значение расстояний в интервале 2.72-2.74. Следует отметить, что для улучшения критерия сходимости требуется включить в оптимизируемую структурную модель пути многократного рассеяния в линейных цепочках O-H…O или O…H-O.

Расчет FEFF 2 Лед Ic |FT(k (k))|, a.u.

Лед II Эксперимент 1 0 1 2 3 4 5 R, 530 540 550 560 E, eV Рис. 10. Слева: Фурье-трансформанты экспериментальных спектров EXAFS на К-крае кислорода для пленок льда, выращенных на Au(111) при 90 К (1) и 153 К (2). Справа соответствующие спектры NEXAFS в сравнении с результатами моделирования спектров для кристаллических фаз льда Ic и II.

Очень интересным является четкое проявление в Фурье-трансформантах относительно слабых, но статистически значимо превышающих уровень фона пиков в области расстояний 3. Вторая координационная сфера O…O в структуре кристаллического кубического льда I (которая согласно литературным данным,14 должна преобладать в пленках, нанесенных на подложку из вакуума при температуре выше 150 K, то есть для образца 2) находится на расстоянии 4.5,15 что должно давать максимум на Фурье-трансформанте в районе 4.2 из-за фазового сдвига. Это расстояние характерно для расположения H-связанных молекул воды по вершинам идеального тетраэдра в алмазоподобной структуре. Координационное число для второй координационной сферы равно 12, так что для упорядоченной кристаллической структуры льда пик второй координационной сферы должен быть достаточно интенсивным, по крайней мере, сопоставимым по интенсивности с пиком первой координационной сферы. Однако максимумы второй координационной сферы O...O в ФТ наблюдаются на 3.45 (1) и 3. (2). Это подразумевает, что в пленках льда, полученных вакуумным напылением, цепочки связей O…O…O существенно искажены по сравнению с ожидаемой строго тетраэдрической структурой кристаллического льда Iс. Именно такая ситуация сильных геометрических искажений сетки водородных связей наблюдается в некоторых кристаллических модификациях льда высокой плотности.

Для образца 1 пик второй координационной сферы O…O неплохо воспроизводится суперпозицией двух вкладов на расстояниях 3.5-3.6 и 3.9 с суммарным координационным числом около 3 (1 – для первого вклада и 2 для последнего. В случае образца 2 пик второй координационной сферы моделируется суперпозицией вкладов O…O на расстояниях 3.9 и 4.4 с суммарным координационным числом 4 (2 + 2). Оба наблюдаемых фактора, а именно низкие эффективные координационные числа и необходимость включения в структурную модель неэквивалентных близко расположенных вкладов, указывает на достаточно нерегулярное, низкосимметричное локальное окружение атомов кислорода, по всей видимости, характеризующееся широким распределением межатомных расстояний за пределами первой координационной сферы.

Таким образом, данные спектроскопии EXAFS на К-крае кислорода для вакуумно напыленных пленок льда указывают на то, что их локальные структуры существенным образом отличаются от структуры, характерной для фаз льда низкой плотности (включая кубическую и гексагональную модификации льда I и аморфный лед низкой плотности), а находятся ближе к формам льда высокой плотности (кристаллические модификации льда II, V, IX, а также аморфный лед высокой плотности).

Детальный анализ различий между пленками 1 и 2 показал, что в высокотемпературной пленке 2 действительно проявляются начальные стадии формирования локальной структуры, характерной для кристаллической структуры кубического льда I, но ее доля в общей структуре остается невысокой.

На базе локально-структурной информации, полученной из EXAFS, было проведено теоретическое моделирование спектров NEXAFS, которое дополнительно показало, что наблюдаемые в эксперименте спектры NEXAFS на К-крае кислорода для пленок 1 и 2 несовместимы со структурой кубического льда I. Левое плечо основного максимума поглощение воспроизводится в теоретических расчетах только для моделей, характеризующихся укороченными расстояниями O…O во второй координационной сфере центральной молекулы воды в интервале 3.6-3.9, что соответствует сильным искажениям тетраэдрической пространственной сетки водородных связей (в частности, встречающимся в кристаллических фазах льда высокой плотности, таких как лед II).

Однако часть спектральных особенностей (а именно рост основного спектрального максимума, а также формирование специфической волнообразной тонкой структуры в интервале энергий 550-575 эВ) соответствует росту вклада кристаллической структуры кубического льда I в высокотемпературной пленке 2.

Четвертая глава посвящена исследованию методами мягкой рентгеновской спектроскопии жидкой воды и водных растворов с использованием техники проточной жидкостной ячейки с мембраной. В рамках диссертационной работы были измерены спектры NEXAFS и XES для ряда жидкостей, включая обычную и тяжелую воду, растворы NaOH, NaCl, а также аминокислот гистидина и глицина и дипептида глицилглицина (что позволяет считать измерения рентгеновских спектров для водных растворов биоорганических молекул технически реализуемыми).

Спектры NEXAFS на К-крае азота для водных растворов аминокислоты глицина и дипептида глицилглицина приведены на Рис. 11. Для раствора глицина спектры были измерены для двух значений pH: близкого к нейтральному, характерному для раствора чистого глицина, и сильнощелочного, полученного добавлением к раствору глицина капли раствора NaOH. Для сравнения на левой панели Рис. 11 также приведены спектры аналогичных порошковых систем: цвиттер-ионного поликристаллического глицина, глицилглицина и глицината натрия.

Спектры цвиттер-ионного глицина в твердом теле и водном растворе при нейтральном pH практически идентичны. При повышении pH раствора, смещающем равновесие зарядовых форм от цвиттер-иона к аниону, спектр кардинально изменяется.

Основной спектральный максимум смещается приблизительно на 1 эВ в сторону меньших энергий, и появляется два новых низкоэнергетических резонанса на 402.0 и 403.3 эВ.

Переход от цвиттер-ионной формы глицина к анионной связан с депротонированием амино-группы, т.е. переходом заряженного фрагмента –NH3+ в незаряженный –NH2.

Аналогичная зарядовая форма глицина существует в поликристаллической ионной соли – глицинате натрия (Na+gly-). И действительно, в твердотельных азотных спектрах наблюдаются очень похожие изменения при переходе от Gly к Na+gly-. Только в случае Na+gly- низкоэнергетический резонанс на 402.0 эВ выражен очень слабо в виде перегиба по сравнению с растворным спектром. По всей видимости, такое различие отражает неэквивалентность межмолекулярного окружения глицинат-аниона в твердой ионной соли и водном растворе или, другими словами, влияние гидратной оболочки глицинат аниона в растворе.

Таким образом, данный результат является наглядной демонстрацией способности спектроскопии NEXAFS различать зарядовые формы, связанные с переносом протона, для биоорганической молекулы, находящейся в водном растворе. В случае дипептида глицилглицина (диглицина, digly) переход из поликристаллического состояния в водный раствор не приводит к сильным изменениям в спектре NEXAFS. В нем по-прежнему наблюдаются узкий интенсивный *-резонанс амидной группы около 401.4 эВ и широкий *-пик с преимущественным N-C характером на 406 эВ. Различия заключаются в перераспределении интенсивностей этих двух доминирующих компонент, а также в появлении диффузной послекраевой компоненты в области 408-420 эВ.

Порошок Водный раствор Digly pH Partial Electron Yield, a.u.

Digly + Na Gly FlY a.u.