Структурно-функциональный анализ днк-узнающих белков с помощью синтетических фрагментов днк
На правах рукописи
КУБАРЕВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДНК-УЗНАЮЩИХ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ СИНТЕТИЧЕСКИХ ФРАГМЕНТОВ ДНК 02.00.10 – биоорганическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук
Москва – 2007
Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в научно-исследовательском институте физико химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова
Официальные оппоненты: доктор химических наук, член-корреспондент РАН профессор Цетлин Виктор Ионович доктор химических наук, профессор Лаврик Ольга Ивановна доктор биологических наук, вед. научн. сотр. Железная Людмила Алексеевна Институт молекулярной биологии
Ведущая организация:
им. В.А. Энгельгардта РАН
Защита состоится 27 ноября 2007 года в 17 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им.
М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан 27 октября 2007 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Смирнова И.Г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Взаимодействие белков с нуклеиновыми кислотами (НК) является основополагающим фактором существования живой материи. Анализ генома человека позволил предположить, что расположенные в нем нуклеотидные последовательности кодируют более 30000 белков. По приблизительным оценкам 6% этих белков являются факторами транскрипции, 13,5% - способны взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами. НК-связывающие белки играют ключевую роль в основных процессах жизнедеятельности клетки, таких как регуляция экспрессии генов, транскрипция, трансляция, репликация и репарация. Исключительно важным для понимания этих процессов является изучение природы и механизмов образования комплексов белков с ДНК.
Первый ДНК-связывающий белок был открыт в 1967 г. (Gilbert et al., 1967). С тех пор методами ЯМР и рентгеноструктурного анализа (РСА) было охарактеризовано более 400 комплексов белков с ДНК. Анализ кристаллографических данных позволил не только выявить основные принципы ДНК-белковых взаимодействий, но и определить, каким образом белки узнают определенные последовательности в ДНК.
Однако даже современные возможности РСА и ЯМР не исключают применения других методов исследования НК-белковых взаимодействий. Это связано с тем, что «взаимоотношения» между белками и нуклеиновыми кислотами носят динамический характер и могут сопровождаться значительными изменениями структуры биополимеров.
В настоящее время наибольший вклад в понимание принципов НК-белкового узнавания вносит изучение сложных функционально зависимых мультибелковых комплексов, формирующихся при различных клеточных процессах. В этих исследованиях незаменимыми оказываются методы направленного изменения структуры НК-лиганда, точечной замены определенной аминокислоты белка и ковалентного присоединения белка к НК, образующие группу так называемых биохимических подходов к исследованию механизмов функционирования НК узнающих белков. Указанные методы позволяют получать сведения об отдельных аспектах и деталях НК-белкового взаимодействия, например, установить белковый компонент, непосредственно связанный с определенным участком НК, выявить механизм передачи «сигналов», обеспечивающих согласованное функционирование биомолекул, зафиксировать контакты, существующие лишь короткое время в процессе ферментативного катализа или структурной перестройки объекта. Таким образом, биохимические подходы сохраняют свою неизменную актуальность. Их применение особенно эффективно в сочетании с анализом данных РСА, сравнением аминокислотных последовательностей белков, моделированием структуры белков и их комплексов с ДНК.
Относительно короткие (10-30-звенные) синтетические фрагменты ДНК используются для изучения природных структур и процессов практически с того момента, как были разработаны эффективные методы их получения. Развитие химии нуклеиновых кислот позволяет создавать новые типы модифицированных олигонуклеотидов, которые являются мощным инструментом в исследованиях различных аспектов взаимодействия с ДНК ключевых ферментов и белков клетки. В свою очередь, полученная с помощью синтетических ДНК информация может найти практическое применение для направленного воздействия на функционирование биологических систем.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в разработке комплексного подхода к исследованию ДНК-белковых взаимодействий в растворе. Этот подход включает в себя: детальный анализ взаимодействия ДНК-узнающего белка с синтетическими ДНК-лигандами различной первичной и вторичной структуры;
зондирование групп атомов ДНК, вовлеченных в узнавание с белком, методами «отпечатков» и на основе данных по взаимодействию белка с модифицированными аналогами ДНК;
выявление фрагментов белка, контактирующих с ДНК, методом ковалентного присоединения к лигандам, содержащим реакционноспособные группировки, и путем изучения свойств мутантных форм белков;
моделирование ДНК-белковых взаимодействий.
В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.
1. Выбрать и охарактеризовать белки – объекты исследования, которые узнают в ДНК последовательности различной длины, относятся к разным классам и участвуют в процессах транскрипции, репарации, метилирования или гидролиза ДНК.
2. Предложить оптимальный набор синтетических немодифицированных и модифицированных одно- и двуцепочечных фрагментов ДНК для изучения особенностей функционирования ДНК-узнающих белков.
3. Сконструировать новые типы ДНК-лигандов с реакционноспособными группировками для региоселективного ковалентного присоединения к белкам с целью зондирования контактов в ДНК-белковых комплексах и определения структурных особенностей последних.
4. Разработать новые методики тестирования активности ферментов рестрикции модификации и репарации, методы контроля за ходом ферментативных реакций.
Оптимизировать стратегию определения функциональных групп белка и ДНК, вовлеченных во взаимодействие.
5. Предложить общую схему зондирования контактов в ДНК-белковых комплексах на различных стадиях их образования.
Научная новизна и практическая значимость работы. Предложена стратегия исследования ДНК-белковых взаимодействий в растворе, применимая к любому ДНК-узнающему белку независимо от размера и структуры узнаваемой им нуклеотидной последовательности. Получены новые данные, позволяющие сделать выводы об особенностях функционирования р50 субъединицы фактора транскрипции NF-B, урацил-ДНК-гликозилазы, ДНК-метилтрансферазы SsoII и эндонуклеаз рестрикции SsoII, PspGI, MboI, EcoRII и MvaI. Перспективность разработанного нами комплексного подхода к изучению ДНК-белковых взаимодействий подтверждена данными РСА.
Впервые для 30 ферментов рестрикции II-го типа, не являющихся изошизомерами, выявлены консервативные ДНК-связывающие мотивы, сделано предположение об эволюционной взаимосвязи между различными эндонуклеазами II-го типа, предложен дивергентный сценарий эволюции. Выявленные закономерности позволяют на базе сравнительного анализа аминокислотных последовательностей эндонуклеаз рестрикции предсказывать структурные и функциональные особенности отдельных представителей этого класса ферментов.
Идентифицированы группы атомов участка метилирования ДНК и инвертированного повтора промоторной области генов системы рестрикции модификации SsoII, существенные для формирования комплексов с С5-цитозиновой метилтрансферазой SsoII. Предложена модель функционирования метилтрансферазы SsoII как белка, сочетающего в себе свойства фермента модификации и фактора транскрипции.
Расширен спектр ДНК-лигандов с направленно модифицированной структурой для исследования механизмов действия ферментов рестрикции, модификации и репарации. Продемонстрирована перспективность применения олигодезокси рибонуклеотидов, содержащих остатки 2'-амино-2'-дезоксиуридина и 1-(3'-дезокси- D-трео-пентафуранозил)урацила, для структурного анализа комплексов урацил-ДНК гликозилазы с ДНК.
Получили развитие химические подходы к исследованию белково-нуклеиновых взаимодействий методом аффинной модификации белка синтетическими аналогами ДНК. Установлено, что ДНК-лиганды, содержащие единичные фосфорил дисульфидные или 2'-йодацетамидные группировки, могут быть использованы для эффективного ковалентного связывания остатков цистеина ДНК-узнающего центра белка. ДНК с 2'-О-2-оксоэтильными группами в участке узнавания белка позволяют фиксировать остатки лизина, сближенные с углеводофосфатным остовом на начальных стадиях узнавания и связывания лиганда. Предложена структура дуплексов с реакционноспособной группировкой в определенном положении В участка для необратимого ингибирования фактора транскрипции NF-B.
Впервые показана возможность выявления АР-эндонуклеазной активности с помощью ДНК, содержащих 1,3-пропандиол. Предложены новые методы анализа степени метилирования каждой из цепей субстрата ферментами модификации, определения специфичности действия цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, непрерывного контроля за расщеплением ДНК-дуплексов эндонуклеазами рестрикции, экспресс-детекции активности ферментов репарации и рестрикции модификации с помощью лигандов, закрепленных на полимерном носителе. Два последних метода могут быть использованы для тестирования примесей неспецифических нуклеаз в препаратах целевых белков.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 2-5-ом рабочих совещаниях фирмы «New England BioLabs» по биологической модификации ДНК (Берлин, Германия, 1990;
Вильнюс, Литва, 1994;
Инсбрук-Иглс, Австрия 1997) и «Рестрикция/Модификация» (Бристоль, Великобритания, 2004), на международном симпозиуме «Синтетические олигонуклеотиды: прогресс и границы практического использования» (Москва, 1991);
на конференциях FASEB «Эндонуклеазы рестрикции и модифицирующие метилтрансферазы: структура и механизм» и «Ферменты, действующие на нуклеиновые кислоты» (Сaкстон-Ривер, Вермонт, США, 1993, 1996), на XVI международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Нью Дели, Индия, 1994), на 3-ей конференции IUBMB «Молекулярное узнавание» (Сингапур, 1995), на VII конгрессе FAOBMB «Достижения в биохимии и молекулярной биологии» (Сидней, Австралия, 1995);
на международном симпозиуме «Биокатализ-2000» (Москва, 2000), на 5-ой международной конференции по изучению узнавания в нуклеиновых кислотах (NACON-V) (Шеффилд, Великобритания, 2001), на V-ом симпозиуме «Химия и биология нуклеиновых кислот» (Кембридж, Великобритания, 2003), на ежегодных рабочих встречах «Биохимия белково-нуклеиновых комплексов» и «Ферменты и мультиферментные комплексы, воздействующие на нуклеиновые кислоты» (Гиссен, Германия, 2002 2004, 2006;
Москва, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 60 статей (5 обзоров).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 479 страницах машинописного текста, содержит 192 рисунка, 64 таблицы, 27 схем. Диссертация состоит из введения, главы «ДНК-узнающие белки – объекты исследования», обзора литературы на тему «Молекулярные аспекты взаимодействия белков с ДНК», обсуждения полученных результатов, заключения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (694 ссылки).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. ДНК-узнающие белки – объекты исследования Эндонуклеазы рестрикции (ЭР) II-го типа SsoII (R.SsoII), PspGI (R.PspGI), MvaI (R.MvaI), EcoRII (R.EcoRII), MboI (R.MboI) узнают специфическую двутяжевую последовательность нуклеотидов и катализируют гидролиз фосфодиэфирных связей в ДНК: R.SsoII - 5'...CCNGG...3', R.PspGI и R.EcoRII - 5'...CCWGG...3', R.MvaI 5'...CCWGG...3', R.MboI - 5'...GATC...3' (N = A, G, C, Т;
W = T, A;
- место гидролиза). Выбор ферментов обусловлен различиями в свойствах и субстратной специфичности, а также их возможным «родством» с эндонуклеазами, для которых имеются данные РСА и/или результаты, полученные биохимическими методами.
Особый интерес представляло сравнительное изучение особенностей функционирования R.MvaI, R.SsoII, R.PspGI, R.MboI и R.EcoRII, выявление гомологичных участков в их первичной структуре и поиск эволюционной взаимосвязи между ними.
ДНК-метилтрансфераза (МТаза) SsoII (М.SsoII) узнает в двутяжевой ДНК ту же последовательность, что и R.SsoII, и метилирует внутренний остаток dC этого участка (5'...CCNGG...3') с образованием 5-метил-2'-дезоксицитидина (Никольская и др., 1983). Уникальной особенностью М.SsoII является наличие протяженной N концевой области (1-71 аминокислотные остатки), предшествующей первому консервативному участку белка. Показано, что N-концевая область определяет способность М.SsoII выступать в роли фактора транскрипции: стимулировать экспрессию собственного гена и ингибировать экспрессию гена, кодирующего R.SsoII (Karyagina et al., 1997). Таким образом, М.SsoII представляет собой уникальный бифункциональный белок: с одной стороны это фактор транскрипции, а с другой - фермент, катализирующий реакцию метилирования. Бифункциональные белки такого типа практически не изучены.
В большинстве случаев химические механизмы действия ДНК-гликозилаз неизвестны или предложены на основании статических кристаллических структур.
Изучаемая нами урацил-ДНК-гликозилаза (УДГ) из плаценты человека является простейшей монофункциональной гликозилазой, лишенной эндонуклеазной активности по отношению к апиримидиновому (АР) участку. Фермент катализирует гидролиз N-гликозидной связи между урацилом и углеводофосфатным остовом. В ряде случаев в сравнительных экспериментах использовалась УДГ из Е. coli.
Ядерный фактор транскрипции NF-B является основным элементом в системе регуляции экспрессии большого числа генов. Одним из аспектов, необходимых для понимания принципов функционирования NF-B и для создания новых подходов к направленному регулированию его активности, является изучение молекулярных основ взаимодействия этого белка с ДНК. В качестве модели фактора транскрипции NF-B использовали р50 субъединицу NF-B человека, соединенную с глутатион-S трансферазой (р50-GST). Известно, что такой белок в виде гомодимера эффективно взаимодействует с B-участком, представляющим собой двутяжевую 10-звенную последовательность нуклеотидов: 5'-GGGRNNYYCC-3' (R = A, G;
Y = T, C;
N = A, G, T, C) (Kieran et al., 1990;
Smith et al., 1988).
2. Разработка новых методик анализа взаимодействия ферментов рестрикции модификации и репарации с ДНК Оценка степени метилирования отдельных цепей дуплекса метилтрансферазами Метод слежения за метилированием каждой из цепей ДНК основан на введении в лиганд двух радиоактивных меток 3Н и 32Р. В качестве субстратов следует использовать ДНК-дуплексы с цепями разной длины для их эффективного разделения в полиакриламидном геле (ПААГ). Такой субстрат инкубируют с МТазой в присутствии S-аденозил-L-метионина (AdoMet), содержащего 3Н в составе метильной группы. Затем в реакционную смесь добавляют 32Р-меченные олигонуклеотиды с точно измеренной радиоактивностью и с той же электрофоретической подвижностью, что и олигонуклеотиды, формирующие ДНК-субстрат. 32Р-метка служит как маркер при авторадиографии и как внутренний стандарт для корректного определения счета по 3Н. После электрофоретического разделения и извлечения олигонуклеотидных фракций из геля определяют значения 3Н- и 32Р-радиоактивности. Полученные величины радиоактивности цепей дуплекса по тритиевой метке пересчитывают с учетом изменения 32Р-радиоактивности образцов.
Спектрофотометрический метод контроля за ходом расщепления дуплексов эндонуклеазами рестрикции Суть метода заключается в регистрации гиперхромного эффекта, обусловленного фрагментацией субстрата под действием ЭР и последующей его диссоциацией на одноцепочечные олигонуклеотиды. Для того, чтобы в ходе кинетического эксперимента наблюдалось увеличение оптической плотности при 260 нм, необходимо выбрать субстрат такой длины и такую температуру реакции, чтобы обеспечить существование субстрата в двутяжевой форме в начальный период времени и частичную или полную диссоциацию продуктов расщепления. На * М.SsoII, M.SsoII(C142A), M.NlaX с шестью остатками His на N-конце предоставлены Карягиной А.С.
(НИИЭиМ РАМН), Лавровой Н.В. и Тихоновой Т.В. (ВНИИСБ РАСХН);
УДГ из плаценты человека Невинским Г.А. (ИХБиФМ СО РАН), УДГ из Е. coli нативной или модифицированной структуры Ворониной О.Л. (ВНИИСБ РАСХН) и Гончаром Д.А. (ООО «СибЭнзим»). Мутантные формы субъединицы р50 с глютатион-S-трансферазой на N-конце получены Колесниковым И.В., Молочковым Н.В. и Тимченко М.А. (Институт белка РАН). Фрагменты ДНК, в том числе модифицированные, синтезированы сотрудниками химического факультета и НИИФХБ МГУ Романовой Е.А., Метелевым В.Г., Волковым E.М, Зацепиным Т.С., Зубиным Е.М под руководством проф. Орецкой Т.С.
спектрофотометре регистрируют зависимость прироста А260 (А260) от времени;
значение А260 в момент добавления фермента принимают за ноль (рис. 1).
Спектрофотометрический метод позволяет получить непрерывную кинетическую кривую гидролиза субстрата ферментом. Он может быть рекомендован для тестирования препаратов на присутствие определенной ЭР или, напротив, неспецифических эндо- или экзонуклеаз, быстрого определения кинетических параметров реакции.
Рис. 1. Расщепление субстрата I:
5' ACCTACCTGGTGGT 3' 3' TGGATGGACCACCA 5' эндонуклеазой рестрикции MvaI (участок узнавания выделен, стрелками указаны места гидролиза фосфодиэфирных связей). (1) и (2) Зависимости прироста оптической плотности реакционной смеси при 260 нм (А260) от времени в интегральной и дифференциальной формах соответственно.
Экспресс-метод тестирования активности ферментов Оригинальный подход, пригодный для быстрой проверки активности ферментов рестрикции, модификации и репарации, разработан с помощью ДНК-субстратов, иммобилизованных на полимерном носителе. К олигонуклеотиду, закрепленному на полимере на основе силикагеля CPG-500 и содержащему на 5'-конце 32Р-метку, добавляют комплементарную матрицу, формируют дуплекс и инкубируют с ЭР. При гидролизе фосфодиэфирной связи в участке узнавания фермента меченые продукты с полимерного носителя переходят в раствор, что позволяет судить об активности эндонуклеазы на качественном уровне.
Для тестирования активности ДНК-метилтрансфераз иммобилизованный субстрат первоначально инкубируют с ферментом модификации. Затем в реакционную смесь добавляют ЭР, действие которой блокируется в случае метилирования ДНК. Об активности МТазы свидетельствует отсутствие 32Р-метки в растворе.
Для оценки активности УДГ использовали dU-cодержащий 5'-32Р-меченный олигодезоксирибонуклеотид, иммобилизованный на носителе Tenta Gel S-NH2. Для расщепления углеводофосфатного остова в AP-участке, образующемся после удаления урацила, применяли концентрированный раствор аммиака, что позволило значительно ускорить процедуру гидролиза. В отличие от CPG-500 носитель Tenta Gel S-NH2 в этих условиях не подвергается деструкции, поэтому появление 32Р-метки в растворе обусловлено только расщеплением АР-участка в иммобилизованном субстрате.
Метод универсален и может быть использован для тестирования активности широкого набора ферментов нуклеинового обмена при синтезе соответствующего субстрата, а также для выявления примесей неспецифических нуклеаз в препаратах белков. Кроме радиоактивной метки на 5'-конец иммобилизованного ДНК-фрагмента можно вводить флуоресцентные маркеры.
Определение неметилируемого dC в участке узнавания цитозиновых МТаз Предлагаемый подход основан на применении бисульфитной реакции в сочетании с УДГ. При разработке метода была использована M.SsoII. На схеме 1 рассмотрены два возможных варианта метилирования МТазой участка узнавания в ДНК (А, Б). На стадии 1 субстрат инкубируют с M.SsoII в присутствии AdoMet, добиваясь исчерпывающего метилирования. Затем реакционную смесь обрабатывают эндонуклеазой рестрикции SsoII для удаления неметилированных молекул ДНК (стадия 2). R.SsoII гидролизует участок узнавания, если внутренний или внешний остаток dC неметилирован (Упорова и др., 1985;
Громова и др., 1991). Методом гель электрофореза в денатурирующих условиях разделяют цепи ДНК-дуплекса (стадия 3).
Для удобства разделения одна цепь должна быть на несколько нуклеотидных звеньев длиннее другой. Метилированные олигонуклеотиды выделяют из геля, обрабатывают бисульфитом натрия (стадия 4) и обессоливают. Бисульфит натрия обратимо присоединяется по двойной связи С5-С6 цитозина. Образующийся аддукт при обработке щелочью (стадия 5) быстро дезаминируется с последующим отщеплением бисульфита. Полученный dU-содержащий олигонуклеотид инкубируют с УДГ (стадия 6). После расщепления ДНК по АР-участку реакционную смесь разделяют методом электрофореза в ПААГ, содержащем 7 М мочевину (стадия 7). По длине образовавшегося олигонуклеотида опре деляют, какой остаток dC неметилирован. Един ственным ограничением этого подхода является необходимость констру ирования субстратов, у которых отсутствуют остатки dC в последова тельности, примыкаю щей к участку узнавания МТазы с 5'-конца.
Разработанный метод был применен для р* – 32Р определения специфич- m5C – 5-метил-2'-дезоксицитидин Схема 1.
ности действия МТазы U - 2'-дезоксиуридин NlaX.
3. Характеристика синтетических ДНК-лигандов Исследование свойств ДНК-узнающих белков целесообразно начинать с изучения их взаимодействия с немодифицированными ДНК-дуплексами. Такие лиганды позволяют определить оптимальные условия функционирования ДНК-узнающих белков и охарактеризовать термодинамические и кинетические параметры ДНК белкового взаимодействия, стехиометрию процесса комплексообразования.
Немодифицированные ДНК-дуплексы с вариациями нуклеотидной последо вательности, использованные для изучения свойств ДНК-узнающих белков – объектов исследования, представляют собой короткие 11-20-звенные субстраты с одним участком узнавания и более протяженные 30-47-звенные ДНК-дуплексы. В отдельных экспериментах использовали субстраты конкатемерного типа и ПЦР фрагменты, содержащие один или два участка узнавания изучаемых ЭР.
Модифицированные ДНК-дуплексы дают возможность идентифицировать фрагменты ДНК, вовлеченные во взаимодействие с белком, прояснить детали механизма функционирования белка. По способу введения модификации применяемые нами ДНК-лиганды могут быть разделены на две группы. К первой группе относятся олигонуклеотиды, модификацию которых проводили после завершения химического синтеза (постсинтетическая модификация). Так, для получения ДНК-лигандов, содержащих апуриновые/апиримидиновые участки, N7 метил-2'-дезоксигуанозин или этоксифосфатную группу, немодифицированный дуплекс обрабатывали в условиях статистической модификации муравьиной кислотой, гидразином, диметилсульфатом или N-этил-N-нитрозомочевиной соответственно. Такой прием использовался нами в методе «отпечатков».
Во вторую группу входят модифицированные ДНК, полученные в процессе олигонуклеотидного синтеза. В данной работе расширен спектр ДНК-лигандов с направленно модифицированной структурой. В качестве аналогов субстратов ферментов рестрикции, модификации и УДГ предложено использовать олигонуклеотиды, в которых одно или несколько нуклеозидных звеньев заменено на остаток (2R,2S)-2-оксиметилтетрагидрофуранола-3 (ddR) или на остаток 1,3 пропандиола (Prd). Для подтверждения участия оснований в дискриминационных взаимодействиях белка с ДНК использовали ациклический аналог нуклеозида – 9-[1' гидрокси-2'-(гидроксиметил)этокси]метилгуанин (glG).
Gua O O O O Prd: O (CH2)3 O glG:
ddR:
O O Введение таких модификаций в состав 14-звенного ДНК-дуплекса приводит к понижению его температуры плавления (Tпл) на 14-190С, однако данные КД свидетельствуют об отсутствии существенных конформационных изменений двойной спирали.
Ura (Thy) Сконструированы лиганды, которые содержат нуклеозид- O O ные остатки с модификацией в 2'-положении рибозного O кольца, моделирующие структурную гетерогенность ДНК: xU (xT) 2'-дезокси-2'-фторуридин (fU), 2'-амино-2'-дезоксиуридин (nU), и нуклеозидные остатки с инвертированной Ura O гидроксильной группой при С3'- или С2'-атоме: 1-(2'- O O дезокси--D-трео-пентафуранозил)урацил (тимин) xU (xT), tU 1-(3'-дезокси--D-трео-пентафуранозил)урацил (tU).
Замена атома Н в 2'-положении фуранозного кольца на атом F не влияет на стабильность 14-звенного дуплекса, в то время как замена атома Н на NH2-группу или инверсия ОН-группы у С2'- или С3'-атомов понижает его Тпл на 5-80С. Спектры КД дуплексов, содержащих остатки xT или tU, существенно отличаются от спектра немодифицированного дуплекса положением точки нулевого перехода и максимума полосы положительного Коттон-эффекта, но при этом практически совпадают друг с другом. Совокупность полученных данных свидетельствует о наличии в xT(xU)- и tU содержащих дуплексах структурно-модифицированного фрагмента с частично нарушенными «стэкингом» оснований и системой водородных связей. В случае tU модификации в составе ДНК-дуплекса, кроме того, появляется неприродная 2'-5' межнуклеотидная связь.
Для идентификации роли отдельных атомов и групп атомов гетероциклических оснований ДНК во взаимодействии с белком незаменимой оказывается точечная модификация гетероциклов. В табл. 1 приведены аналоги гетероциклических оснований, использованные в настоящей работе. Все они не оказывают существенного влияния на вторичную структуру двутяжевого ДНК-лиганда.
Таблица 1. Аналоги гетероциклических оснований, используемые для конструирования ДНК-лигандов с точечными модификациями в участке узнавания белков.
Гетероциклическое Аналог Условное Зондируемая группа атомов основание гетероциклического обозначение основания нуклеозида урацил dU 5-СН3, большая бороздка fl5dU тимин 5-фторурацил 5-СН3, большая бороздка br5dU 5-бромурацил 5-СН3, большая бороздка i5dU 5-йодурацил 5-СН3, большая бороздка m5dC 5-метилцитозин 5-Н, большая бороздка цитозин m4dC 4-метилцитозин 4-NH2, большая бороздка m6dA аденин 6-метиладенин 6-NH2, большая бороздка гуанин гипоксантин dI 2-NH2, малая бороздка Уникальными инструментами исследования механизма действия ДНК-узнающих белков оказались дуплексы с неканонической вторичной структурой. Мы использовали три типа таких структур, синтезированных в нашей лаборатории: ДНК дуплекс гантелеобразного типа (ДНК-«дамбл»), дуплекс, концы которого соединены остатками полимиксина M и дуплексы с химической «сшивкой» между цепями.
Подтверждением структуры всех «сшитых» дуплексов является повышение их термической стабильности по сравнению с исходными ДНК, а также устойчивость к нуклеазному гидролизу.
Полимиксин М GCCAACCdUGG CTCTppGT O (A)3 (A) CGGTTGG-ACCGAGA--CA O P NH 5' AGAGGGGACTTTCCGAG O O 5' CGGTcNGAGGGGACTTTCCGAcNTGGC 3' O P NH 3' TCTCCCCTGAAAGGCTCGCA O 3' GCCAnUCTCCCCTGAAAGGCTnUACCG 5' cN – ненуклеозидная вставка с Выделены участки узнавания R.SsoII, R.MvaI, карбоксильной группой R.EcoRII, R.PspGI, M.SsoII и фактора транскрипции NF-B nU - 2'-амино-2'-дезоксиуридин Основное внимание в данной работе было уделено развитию химических подходов к исследованию белково-нуклеиновых взаимодействий методом аффинной модификации белка реакционноспособными аналогами ДНК. Мы применяли три типа реагентов: 1) фотоактивируемые ДНК-дуплексы, содержащие остатки 5-бром- или 5 йод-2'-дезоксиуридина;
2) ДНК-дуплексы с реакционноспособной межнуклеотидной группировкой (замещенной пирофосфатной, фосфорилдисульфидной);
3) ДНК дуплексы, несущие активную группировку (альдегидную, йодацетамидную) в 2' положении углеводного фрагмента. Важной особенностью этих ДНК-лигандов является то, что предложенные модификации могут быть введены в любое заранее заданное положение олигонуклеотидной цепи. Фотоактивируемые НК широко используются для зондирования аминокислотного окружения гетероциклических оснований ДНК в предварительно сформированных белково-нуклеиновых комплексах. Остальные реагенты позволяют анализировать контакты белков с углеводофосфатным остовом ДНК. Такие модификации не должны нарушать комплементационные взаимодействия и специфические контакты в белково нуклеиновом комплексе. Мы показали, что реагенты второго и третьего типа способны взаимодействовать с определенной аминокислотой белка с образованием устойчивого конъюгата без дополнительной активации при значениях рН 6,0-8,0 и сохранять стабильность в нейтральных водных растворах в течение длительного времени без потери реакционной способности.
ДНК-лиганды с межнуклеотидной замещенной пирофосфатной группировкой Для введения межнуклеотидной замещенной пирофосфатной группировки (ЗПГ) в заданную позицию цепи ДНК использовали метод химического лигирования олигонуклеотидов, содержащих моно- и дизамещенные концевые фосфатные группы, на комплементарной матрице под действием 1-этил-3-(3-диметиламино пропил)карбодиимида. В зависимости от того, какой из концевых фосфатных остатков, 3'- или 5'-, в исходном олигонуклеотиде этерифицирован, возможно образование двух изомерных ЗПГ-содержащих дуплексов (схема 2). Соединения с ЗПГ Б-типа получены впервые.
Все модифицированные олигонуклеотиды расщеплялись под действием 0,5 М раствора пропилендиамина (ПДА) с рН 8,0 в течение 12 ч при 370С с эффективностью около 95%. Нуклеофильная атака и присоединение ПДА происходит по неэтерифицированной фосфатной группе в межнуклеотидной замещенной пирофосфатной группировке (схема 2), что согласуется с данными о свойствах ЗПГ содержащих дуплексов А-типа, описанных ранее (Кузнецова и др., 1990).
3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' O O O O PO O O P OCH O PO O P OCH3 NH (CH2)3 NH OH NH2 (CH2)3 NH NH2 (CH2)3 NH O O OH NH (CH2)3 NH P OCH O O PO P OCH O O PO O O O O Б A 5' 3' 3' 5' 3' 5' 5' 3' Схема 2.
Для оценки реакционной способности ЗПГ-содержащих ДНК-дуплексов по отношению к различным нуклеофилам использовали низкомолекулярные соединения, имитирующие функциональные группы боковых цепей ряда аминокислот: ПДА (Lys), имидазол (His), этилгуанидин (Arg), дитиотреит (Cys), n-крезол (Tyr), этанол (Ser и Thr), ацетамид (Asn и Gln) и уксусную кислоту (Asp и Glu). Эти соединения инкубировали с реакционноспособным дуплексом при 200С в 7,5 мM HEPES-буфере (pH 8,0), содержащем 34 мM NaCl, 1 мМ MgCl2, 0,05 мМ ЭДТА, 0,5 мМ дитиотреит (условия формирования комплекса p50 субъединицы фактора NF-B c лигандом) в течение 12 ч. Только ПДА и имидазол взаимодействуют с ЗПГ в модифицированном дуплексе (рис. 2). Можно полагать, что в ходе аффинной модификации с ЗПГ содержащими фрагментами ДНК будут реагировать остатки Lys и His белка.
Рис. 2. Авторадиограмма электрофоретического разделения в 20% ном ПААГ с 7 М мочевиной реакционных смесей, содержащих дуплекс с ЗПГ A-типа и одно из модельных соединений: дорожка - этанол, 3 - пропилендиамин, 4 - имидазол, 5 - этилгуанидин, 6 - п крезол, 7 - дитиотреит, 8 - уксусная кислота, 9 - ацетамид. Дорожка 1 - исходный модифицированный дуплекс.
ДНК-лиганды, содержащие фосфорилдисульфидную группировку Межнуклеотидную фосфорилдисульфидную группировку (ФДСГ) вводили в ДНК аутолигированием 3'-тиофосфорилированного олигонуклеотида с 2-пиридилдисуль фидным аддуктом 5'-дезокси-5'-меркаптопроизводного олигонуклеотида в 15 мМ натрий-цитратном буфере (рН 4,5), содержащем 150 мМ NaCl и 20 мМ MgCl2, в отсутствие комплементарной матрицы (схема 3). При проведении реакции в течение 30 мин при 250С выходы продуктов составили 95-98%.
Олигонуклеотиды и ДНК-дуплексы с ФДСГ инкубировали с дитиотреитом (ДТТ), N -ацетил-L-лизином, N-ацетил-L-цистеином и глутатионом (-L-глутамил-L цистеинилглицином). ФДСГ в составе ДНК количественно расщеплялась под действием 50 мМ раствора ДТТ в 10 мМ Трис-HCl буфере (рН 7,5, 1ч, 200С) и 0,3 мМ раствора N-ацетил-L-цистеина (рН 7,5, 1-5 ч, 200С), но практически не реагировала с производным лизина (8 мМ, 5 ч). Весьма вероятно, что в ДНК-белковом комплексе эта реакционноспособная группировка будет преимущественно взаимодействовать с остатками Cys, в то время как -аминогруппы Lys останутся незатронутыми.
B 5'... O O O B SS B1 OPO N O 5'... O O S + + B S O N S O H O O PO OPO O O S...3' OPO Схема 3.
O...3' Глутатион также эффективно взаимодействует с ФДСГ-содержащими ДНК. В результате реакции тиол-дисульфидного обмена образуется конъюгат между пептидом и олигонуклеотидом. Атака 3' 3' 5' 5' тиольной группы Cys O глутатиона направлена на OPO O Glu Cys Gly атом серы ФДСГ, связанный S OPO с 5'-метиленовой группой S Glu Cys Gly S (схема 4). Структура обра S зующегося олигонуклеотидо- S S CH пептида была подтверждена CH Схема 4.
методом масс-спектрометрии 3' 5' 3' 5' и встречным синтезом.
ДНК-лиганды, содержащие 2'-йодацетамидную группировку Для синтеза 2'-йодацетамидсодержащих ДНК-лигандов использовали олигонуклеотиды с единичными 2'-амино-2'-дезоксиуридиновыми звеньями (схема 5), которые ацилировали избытком ангидрида йодуксусной кислоты в среде ацетонитрил/1 М натрий-боратный буфер (рН 8,3) в темноте при 370С в течение 2 ч.
Реакционные смеси анализировали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном варианте. Выход продуктов ацилирования составил 70-95%.
5' 3' 5' 3' 5' O O O белок Ura Ura Ura H2C H2C H2C O O O 1. (ICH2CO)2O белок S A A 2. комплементарная NH O O HN O HN I S матрица OPO OPO O PO O O O O O 3' 3' 3' 5' 5' Схема 5.
Совокупность данных, полученых с использованием модельных соединений (глутатиона, ДТТ, N-ацетил-L-лизина и гексаметилендиамина), позволяет предположить, что за короткий промежуток времени (15-30 мин) при pH 7,5-8, йодацетамидная группировка в составе ДНК-белкового комплекса будет преимущественно взаимодействовать с остатками Cys, в то же время аминогруппа Lys должна подвергаться алкилированию со значительно меньшей эффективностью.
Для подтверждения тиоэфирной природы связи между олигонуклеотидом с 2' йодацетамидной группировкой и остатком Сys белка можно использовать реакцию селективного расщепления C-S-C-связи нитратом серебра (Sinha and Striepeke, 1991).
ДНК-лиганды, содержащие 2'-альдегидную группировку Добиться селективного связывания -аминогрупп остатков лизина можно, применяя для аффинной модификации белков НК-лиганды, содержащие в составе углеводного фрагмента альдегидные группы (Brevnov et al., 1997;
Tunitskaya et al., 1999). В развитие этого подхода мы предложили использовать ДНК, содержащие единичные 2'-О-(2 оксоэтил)уридиновые (цитидиновые) звенья (Zatsepin et al., 2002).
Исходными соединениями для синтеза служили олигонуклеотиды с единичными 2' О-(2,3-дигидроксипропил)уридиновыми (цитидиновыми) звеньями, 1,2-диольную группировку которых окисляли периодатом натрия при комнатной температуре в ацетатном буфере (рН 4,5) и формировали ДНК-дуплексы (схема 6). После реакции аминогруппы остатка лизина белка с 2'-альдегидной группой в ДНК образующееся основание Шиффа восстанавливали до вторичного амина NaBH3CN.
5' 3' 5' 3' 5' белок O O O Ura(Cyt) H 2C Ura(Cyt) Ura(Cyt) H 2C Lys O H2C O O H2N 1. NaIO белок OH A(G) A(G) O 2. комплементарная O NaBH3CN O O O O O Lys матрица OH H N O PO OPO O PO H O O O 3' 3' 3' 5' 5' Схема 6.
4. Структурно-функциональный анализ ДНК-узнающих белков 4.1. Субъединица р50 фактора транскрипции NF-B Использование гомодимера р50 фактора транскрипции NF-B, как объекта исследования, обусловлено возможностью сравнения результатов его взаимодействия с ДНК, полученных с помощью биохимических подходов, с данными РСА. Нами проанализированы трехмерные структуры комплексов фактора NF-B с ДНК, определены консервативные и вариабельные ДНК-белковые контакты в зависимости от субъединичного состава белка и нуклеотидной последовательности участка узнавания, построены модели взаимодействия р50 субъединицы с «идеальным» B-участком B палиндромным (Id-B: 5'-GGGAATTCCC-3') и последовательностью из энхансера генов легких цепей иммуноглобулинов (Ig-B:
5'-GGGACTTTCC-3'). Эти B-участки различаются нуклеотидной последова тельностью и числом нуклеотидных пар между GG-корами (рис. 3). В ходе работы были сконструированы наборы реакционноспособных ДНК-лигандов для аффинной модификации гомодимера p50-GST. В качестве базовых соединений использовали ДНК-дуплексы II-V. Каждый модифицированный ДНК-дуплекс в одном из положений B-участка содержал межнуклеотидную замещенную пирофосфатную или фосфорилдисульфидную группировку, остаток 2'-дезокси-2' йодацетамидоуридина, 2'-О-(2-оксоэтил)уридина или 2'-О-(2-оксоэтил)цитидина.
Места модификации выбраны в соответствии со схемами контактов димера субъединицы р50 NF-B с соответствующими участками узнавания (рис. 3) и представлены в табл. 2 - 4.
а б Рис. 3. Схемы взаимодействия гомодимера р50 субъединицы фактора транскрипции NF-B с: а – Id-B-участком, б – Ig-B-участком.
Двойными синими стрелками () показаны ван-дер-ваальсовы взаимодействия между неполярными атомами, черными стрелками () – водородные связи, фиолетовыми стрелками () – контакты, допускающие образование водородной связи (3,5-4,0 );
аминокислоты, относящиеся к одной субъединице, выделены, ко второй – ;
GG-коры выделены.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 5' ACCTCGGGAATTCCCCTCT 5' ACCTCGGAAAGTCCCCTCT III II 3' GAGCCCTTAAGGGGAGA 3' GAGCCTTTCAGGGGAGA Ig-B Id-B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 TC GGAAAGTCCCCTC 5' 5' TGGGAATTCCCCTC IV V AG CCTTTCAGGGGAG A CCCTTAAGGGGAG 3' 3' Ig-B Id-B Методом «торможения в геле» было установлено, что все модифицированные дуплексы связываются с гомодимером р50-GST так же эффективно, как и немодифицированные дуплексы II-V. То есть введение единичной реакционноспособной группировки в различные положения B-участка не препятствовало образованию специфических ДНК-белковых комплексов.
5'-Фосфатную группу 3го-8го нуклеотида дуплекса II и 4го, 5го или 8го нуклеотида дуплекса III заменяли на ЗПГ А- или Б-типа. Дуплексы с ЗПГ, примыкающей с 5' конца к нуклеозиду 9, использовались в качестве негативных контролей. Выходы конъюгатов, образующихся при взаимодействии дуплексов, содержащих ЗПГ в различных положениях Ig-B- и Id-B-участков с р50-GST, приведены в табл. 2.
Таблица 2. Результаты аффинной модификации р50 субъединицы фактора NF-B ДНК лигандами, содержащими межнуклеотидную замещенную пирофосфатную группировку.
Выход конъюгата*, % Нуклеозид-5'-фосфат, Аминокислота, сближенная Дуплекс с В-участком подвергнутый (В-участок) модификации ЗПГ А-типа ЗПГ Б-типа по данным РСА — A3 1 II A4 Lys272, Gln274, Gln306 1 (Ig-В) A5 Lys144 50 G6 Tyr57, Lys144 30 T7 Cys59, Lys241 15 C8 Lys145, Cys59 35 — C9 2 A4 Arg305 3 н/о III A5 Gln274, Gln306 11 н/о (Id-В) C8 Lys145, Cys59 10 н/о — C9 2 н/о * Реакцию ковалентного связывания p50-GST с ДНК-лигандами, содержащими 32Р-метку в неэтерифицированной фосфатной группе ЗПГ, проводили в НЕPES-буфере (рН 8,0) при 200С в течение 12 ч. Далее реакционные смеси анализировали методом электрофореза в 12%-ном ПААГ, содержащем додецилсульфат натрия (ДСН). Выход ДНК-белковых конъюгатов определяли как среднее арифметическое трех независимых экспериментов. Ошибка измерений не превышала 10%;
«н/о» – не определяли.
Для дуплексов, содержащих ЗПГ А-типа, эффективность ковалентного связывания с белком зависит от положения реакционноспособной группы в углеводофосфатном остове ДНК. Полученные нами данные иллюстрируют достаточно фиксированную локализацию ДНК-белковых контактов в центре связывания. Так, выход ДНК белковых конъюгатов различается в 50 раз для дуплексов с ЗПГ А-типа в 4ом и 5ом положениях Ig-B-участка. Выходы конъюгатов р50-GST с лигандами, содержащими ЗПГ Б-типа, не превышают 10% независимо от места введения модификации.
Схемы распределения контактов между остатками лизинов и фосфатными группами Ig-B- и Id-B-участков различаются (рис. 3). Этим может быть обусловлена низкая эффективность аффинной модификации р50-GST производными дуплекса III, содержащими ЗПГ А-типа в 4ом и 5ом положениях. Остаток Lys145 p субъединицы NF-B сближен с 5'-фосфатом dC в 8ом положении обоих B-участков.
Однако выход конъюгата в случае модифицированного в этой позиции дуплекса II в раза выше по сравнению с модифицированным дуплексом III, что, возможно, связано с большим сродством гомодимера р50 к Ig-B-участку (Kunsch et al., 1992). Все полученные конъюгаты разрушаются под действием 5 М водного NH2OH (pH 5,0).
Этот результат свидетельствует об образовании фосфоамидной связи и подтверждает предположение о том, что с ЗПГ в составе ДНК-дуплексов реагируют функциональные группы боковых цепей остатков Lys или His. Соответствие результатов ковалентного связывания ДНК-белок для производных дуплекса II, содержащих ЗПГ в положениях 3, 5, 6, 8 или 9 Ig-B-участка, данным РСА позитивно характеризует возможности развиваемого нами метода аффинной модификации по определению контактов нуклеофильных групп аминокислотных остатков белка с межнуклеотидными фосфатными группами в ДНК.
Для зондирования остатков цистеина р50 субъединицы NF-B, сближенных с углеводофосфатным остовом в составе белково-нуклеинового комплекса, использовали ФДСГ- и 2'-йодацетамидсодержащие ДНК-лиганды. ФДСГ вводили вместо 3' фосфатной группы 6го или 7го нуклеотидов Ig-B-участка. Остатки 2'-амино-2' йодацетамидоуридина находились в одной из цепей дуплексов IV и V в 5, 6 или 7ом положении B-участка. Из табл. 3 видно, что аффинная модификация р50-GST ДНК лигандами с 2'-йодацетамидной или фосфорилдисульфидной группировкой в 7ом положении B-участка, протекает с высокой эффективностью (выходы ДНК-белковых конъюгатов составляли 18-33%). При использовании дуплексов, содержащих модификацию в других положениях B-участка, или без него, выходы ковалентно связанных комплексов с р50 субъединицей NF-B не превышали 6%. Для доказательства тиоэфирной (в случае 2'-йодацетамидсодержащих лигандов) или дисульфидной (в случае ФДСГ-содержащих лигандов) природы связи в ДНК-белковых конъюгатах использовали водный раствор AgNO3 или восстанавливающие агенты (ДТТ, трис(2-карбоксиэтил)фосфин) соответственно.
Только Cys59 входит в состав ДНК-узнающего центра р50 субъединицы NF-B (рис.
3). Нами получена мутантная форма р50-GST, в которой остаток Суs59 заменен на Ala.
Белок р50(С59А)-GST образует специфические комплексы со всеми реакционноспособными ДНК-лигандами так же эффективно, как и с немодифицированными дуплексами. Замена остатка Cys59 на остаток Ala существенно не влияет на сродство р50 субъединицы фактора транскрипции NF-B к ДНК.
Аффинная модификация р50(С59А)-GST модифицированными ДНК-лигандами не приводила к образованию ДНК-белковых конъюгатов. Очевидно, именно остаток Cys59 белка ответственен за образование ковалентной связи с ДНК-лигандами обоих типов. Полученные результаты согласуются с данными РСА и схемой ДНК-белковых контактов (рис. 3), согласно которым остаток Cys59 p50 субъединицы фактора транскрипции NF-B сближен с 3'-фосфатной группой 7-го нуклеотида Id-B- и Ig-B участка.
Таблица 3. Результаты аффинной модификации р50 субъединицы фактора NF-B ДНК лигандами, содержащими фосфорилдисульфидную или 2'-йодацетамидную группировку.
Аминокислота, Нуклеозид Выход ДНК-белкового конъюгата*, % сближенная с В Дуплекс 3'-фосфат, (В-участок) подвергнутый 2'-йодацетамид- ФДСГ-содержащий участком модификации содержащий дуплекс дуплекс по данным РСА — A5 1 н/о II, IV G6 4 Cys (Ig-В) T7 33 — A5 4 н/о V — T6 6 н/о (Id-В) T7 Cys59 26 н/о Модифицированный ДНК-дуплекс без В-участка 2 * Реакцию ковалентного связывания радиоактивно меченных ДНК-лигандов c р50-GST проводили в НЕPES-буфере (рН 7,5), не содержащем ДТТ, в течение 30 мин при 250С. В случае 2'-йодацетамидсодержащих дуплексов 32Р-метка находилась на 5'-конце модифицированной цепи, в случае ФДСГ-содержащих - на 3'-конце. Далее реакционные смеси анализировали методом электрофореза в 8%-ном ПААГ, содержащем ДСН. Выход конъюгатов определяли как среднее арифметическое трех независимых экспериментов.
Ошибка измерений не превышала 10%;
«н/о» – не определяли.
Для выяснения особенностей комплексообразования и ковалентного связывания гомодимера р50 субъединицы NF-B с 2'-альдегидсодержащими ДНК-лигандами использовали ДНК-дуплексы IV и V. Модифицированный остаток уридина или цитидина вводили в указанные в табл. 4 положения одной из цепей Ig-B- или Id-B участка. Аффинную модификацию р50-GST 5'-32Р-меченными ДНК-лигандами проводили в условиях специфического связывания в течение 30 мин в HEPES-буфере (рН 7,5) при 250С. Образующееся в результате реакции основание Шиффа восстанавливали до вторичного амина 25 мМ раствором NaBH3CN в течение 40 мин при 250С (схема 6, с. 15) и анализировали реакционные смеси методом электрофореза в 8%-ном ДСН-ПААГ.
Из табл. 4 видно, что ДНК-лиганды с 2'-О-2-оксоэтильной группировкой в 3, 4 или ом положениях Ig-B-участка или в 5ом положении Id-B-участка образуют конъюгаты с р50-GST с более высокой эффективностью, чем другие модифицированные дуплексы. Остатки Lys144, Lys145, Lys241, Lys272 или Lys275, предположительно сближенные с В-участками (рис. 3), были заменены на остаток Ala. Значения констант диссоциации комплексов мутантных белков и исходного р50 GST с дуплексами IV или V лежат в пределах одного порядка.
Таблица 4. Результаты аффинной модификации исходной и мутантных форм р субъединицы фактора NF-B ДНК-лигандами, содержащими 2'-альдегидную группу.
Выход ДНК-белкового конъюгата*, % Аминокислота, Нуклеозидное сближенная с В ДНК-дуплекс звено, Мутантные формы р50-GST р50 (В-участок) подвергнутое участком GST К144А К145А К241А К272А К275А модификации по данным РСА A3 Lys272 25 23 20 21 13 A4 22 24 24 19 19 Lys A5 23 18 22 18 20 IV — G6 7 9 10 8 11 (Ig-В) T7 Lys145 9 6 7 5 8 — С8 4 4 5 3 5 — С9 4 4 4 3 3 A5 Lys144 14 10 12 12 11 V — T6 8 8 7 8 8 (Id-В) T7 Lys145 6 6 5 5 6 Модифицированный ДНК-дуплекс без В-участка 6 5 6 5 5 * Указанные значения выходов конъюгатов определяли как среднее арифметическое трех независимых экспериментов. Ошибка измерений не превышала 10%.
Все мутантные формы р50 субъединицы фактора транскрипции NF-B ковалентно связывались с 2'-альдегидсодержащими дуплексами практически с той же эффективностью, что и исходный белок. Исключение составляли белки с заменами К272А и К275А, для которых наблюдалось примерно двукратное падение эффективности образования ковалентно связанного комплекса с модифицированным по 3ему положению дуплексом IV (табл. 4). Подобные результаты, однако, не являются доказательством участия каждого из этих остатков лизина в образовании конъюгата с реакционноспособным олигонуклеотидом, входящим в состав этого дуплекса.
Для определения остатков Lys р50 субъединицы NF-B, образующих ковалентные связи с ДНК-лигандами, модифицированными по 3, 4 или 5ому положениям Ig-B участка или по 5ому положению Id-B-участка, было проведено протеолитическое расщепление соответствующих ДНК-белковых конъюгатов трипсином и последующий анализ полученных олигонуклеотидопептидов методом масс-спектрометрии в варианте MALDI-TOF. Установлено, что в образовании ковалентных связей со всеми рассматриваемыми лигандами принимает участие остаток Lys360 белка. Дуплексы, модифицированные по 3ему или 4/5ому положениям Ig-B-участка, также взаимодействуют с остатками Lys275 или Lys77. Выявленные остатки входят в состав С-концевых участков Rel-гомологичной области (Lys275, Lys360) и в состав основной ДНК-узнающей петли L1 (Lys77) р50 субъединицы NF-B. Полученные результаты свидетельствуют о том, что 2'-альдегидсодержащие ДНК могут быть использованы только для зондирования остатков Lys белка, сближенных с углеводофосфатным остовом на начальных стадиях узнавания и связывания лиганда.
Основываясь на накопленных данных, можно предложить оптимальную на настоящий момент конструкцию ДНК-дуплекса для эффективного ингибирования фактора транскрипции NF-B. Такой дуплекс должен содержать реакционноспособную группировку (2'-йодацетамидную или замещенную пирофосфатную) в определенном положении углеводофосфатного остова B-участка, обеспечивающую эффективное необратимое связывание белка. Для повышения термической стабильности и устойчивости к нуклеазному гидролизу комплементарные цепи в дуплексе должны быть соединены ненуклеотидными фрагментами. Желательно введение в состав ДНК-лиганда соединений, способных улучшить его транспорт через клеточную мембрану и внутриклеточное распределение.
4.2. Урацил-ДНК-гликозилаза C помощью синтетических аналогов ДНК были изучены особенности связывания УДГ с нуклеиновой кислотой, узнавания урацила и его удаления, катализируемого ферментом. Элиминирование урацила или его модифицированных аналогов тестировали по расщеплению углеводофосфатного остова в образующемся апиримидиновом участке. Сродство олигонуклеотидов к УДГ оценивали как концентрацию лигандов, при которой достигается ингибирование реакции элиминирования урацила из ДНК, содержащей остатки [3H]dU, на 50% (I50) (Василенко и др., 1994). В условиях этого эксперимента выщеплением урацила из синтетических dU-содержащих олигонуклеотидов можно пренебречь.
Для выяснения роли фосфатных групп и гетероциклических оснований неспецифической ДНК в связывании с УДГ был синтезирован олигомер (TpEt)14T, в котором все межнуклеотидные фосфатные группы этилированы, олигомер (pddR)9pT с ненуклеозидными вставками, имитирующими апиримидиновые участки, и гомоолигодезоксирибонуклеотиды d(pA)10, (pT)10, d(pC)10. Обнаружено, что сродство УДГ к олигомеру (pddR)9pT (I50 = 930 ± 186 мкМ) сопоставимо со сродством УДГ к d(pC)10 (I50 = 560 ± 112 мкМ), характеризующимся наименьшей гидрофобностью по сравнению с другими гомоолигонуклеотидами. Cродство УДГ к гомоd(pN) возрастает в том же порядке, что и относительная гидрофобность оснований:
СytТhyАde. Возможно, УДГ вовлечена в слабые гидрофобные взаимодействия с гетероциклическими основаниями ДНК, но они не вносят существенного вклада в стабилизацию комплекса фермента с нуклеиновой кислотой. По-видимому, важную роль в обеспечении высокого сродства УДГ к неспецифической ДНК играют контакты фермента с углеводофосфатным остовом олигонуклеотида. Действительно, олигомер (TpEt)14T, в котором все межнуклеотидные фосфатные группы этилированы, в 4 раза менее эффективно связывается с УДГ по сравнению с немодифицированным олигомером (pТ)15. Обнаружено также низкое сродство фермента к 21-звенному олигонуклеотидопептиду, содержащему остатки урацила.
Определяющим фактором связывания УДГ с субстратом является конформация углеводного фрагмента. 2'-Фторсодержащий олигонуклеотид 14fU связывается с УДГ в 100-200 раз хуже, чем субстрат 14U1, а удаления урацила не происходит (табл. 5).
Следовательно, 3'-эндо-конформация рибозы не узнается ферментом. Таким образом, «отбор» субстратов УДГ происходит уже на стадии комплексообразования.
Таблица 5. Взаимодействие УДГ из плаценты человека с модифицированными олигонуклеотидами.
Условное Олигодезоксирибонуклеотид Отн. сродство УДГ Отн. начальная а (5' 3') обозначение скорость удаления к ДНК-лиганду урацила (v0)б соединения 14U1 GCCAACCdUGGCTCT 1,00 14fU GCCAACCfUGGCTCT 0,01 14xU GCCAACCxUGGCTCT 1,67 14tU GCCAACCtUGGCTCT 0,83 14nU GCCAACCnUGGCTCT 2,50 14ddR GCCAACCddRGGCTCT 5,00 14U2 ACCTACCdUGGTGGT 1,00 14fl5U ACCTACCfl5dUGGTGGT 2,00 14br5U ACCTACCbr5dUGGTGGT 0,40 14T1 ACCTACCTGGTGGT 1,14 а. Относительное сродство УДГ к ДНК-лиганду оценивалось как отношение I50 для соединения 14U1 или 14U2 к I50 соответствующего модифицированного аналога субстрата. Все измерения проводили не менее 3 раз. Ошибка в определении значений I не превышала 20%.
б. Отношение v0 ДНК-лигандов к v0 олигонуклеотида 14U1 или 14U2, умноженное на 100.
Все измерения проводили не менее 3 раз. Ошибка измерений не превышала 20%.
Можно полагать, что начальной стадией функционирования УДГ является локальное расплетание ДНК. УДГ в два раза быстрее элиминирует урацил из одноцепочечного олигонуклеотида, по сравнению с дуплексом, и в 1,5-2,5 раза быстрее из дуплекса, чем из «шпилечной» структуры, температура плавления которой на 300С выше. Удаления урацила из наиболее стабильной гантелеобразной ДНК практически не происходит. То есть функционирование УДГ тем более эффективно, чем менее стабильна двойная спираль ДНК. По-видимому, «плавление» двутяжевой ДНК под действием фермента облегчает последующее выведение остатка урацила из двойной спирали, зафиксированное методом РСА (Parikh et al., 2000;
Werner et al., 2000).
Изучение взаимодействия модифицированных олигонуклеотидов с УДГ позволило установить, что стадия катализа является существенно более «чувствительной» к структуре ДНК, чем стадия комплексообразования. Модификация основания или углеводного фрагмента dU в составе олигонуклеотидов приводит к значительному замедлению скорости удаления урацила из ДНК или даже к отсутствию гидролиза.
При этом сродство модифицированных лигандов сопоставимо со сродством контрольных олигонуклеотидов (табл. 5). Следовательно, специфичность действия УДГ проявляется не на стадии комплексообразования, а на последующих стадиях – адаптации структуры лиганда до оптимальной и непосредственно на стадии катализа.
Способность УДГ выщеплять аналоги урацила резко падает в следующем порядке HFBrCH3. Эти результаты коррелируют с размером и гидрофобностью заместителя и свидетельствуют о том, что атом водорода в С5-положении урацила вовлечен во взаимодействие с УДГ на стадии катализа.
Освобождение ДНК, содержащей АР-участок, из фермент-субстратного комплекса, по-видимому, является лимитирующей стадией реакции, катализируемой УДГ.
Установлено, что олигонуклеотид 14ddR, содержащий единственный остаток (2R, 3S)-2-оксометилтетрагидрофуранола-3 и представляющий собой, по существу, стабильный аналог продукта реакции, связывается с УДГ в 5 раз эффективнее, чем немодифицированный субстрат 14U1 (табл. 5).
Полученные нами результаты в целом коррелируют с данными РСА, а в ряде случаев дополняют и конкретизируют их.
4.3. Эндонуклеазы рестрикции R.SsoII, R.PspGI и R.MboI:
определение каталитического и ДНК-связывающих мотивов Отличительной особенностью ЭР II-го типа от других групп ферментов является практически полное отсутствие гомологии в их первичной структуре. В результате систематического анализа доступных аминокислотных последовательностей ЭР II-го типа нами было выявлено 30 ферментов, в первичной структуре которых был найден консервативный блок из ~ 70 аминокислотных остатков (рис. 4). Наиболее вероятная организация найденного блока соответствует обнаруженному ранее структурному модулю ()(+) (Bujnicki, 2001). В этом участке можно выделить 3 мотива. Один из них гомологичен встречающемуся во многих эндонуклеазах рестрикции мотиву (PD)…(D/E)XK и отвечает за катализ (мотив К) (Stahl et al., 1998). Два других выделенных нами гомологичных мотива С1 и С2 не были ранее охарактеризованы.
Мы предположили, что они вовлечены в узнавание ДНК-субстрата.
В табл. 6 перечислены достаточно консервативные аминокислотные остатки ЭР подтипа IIP SsoII, PspGI и MboI, входящие в состав мотивов K, С1 и С2. Нами изучена роль ряда из них (подчеркнуты) в функционировании перечисленных ферментов. Как правило, консервативный аминокислотный остаток заменяли на остаток Ala. Анализировали способность мутантных форм белков связывать и гидролизовать 32Р-меченные субстраты.
Проведенные эксперименты подтверждают выдвинутую нами гипотезу о том, что в состав каталитического центра R.SsoII/R.PspGI входят аминокислотные остатки E125/E105, D160/D138, K182/K160, E195/E173. Остаток E191/E169, возможно, также участвует в катализе, играя вспомогательную роль. Каталитический центр R.MboI, по-видимому, формируют остатки D186, E199, N201 и E212.
мотив К мотив С1 мотив С Рис. 4. Сравнительный анализ фрагментов аминокислотных последовательностей 30 ЭР II-го типа. Слева приведены названия ЭР и указаны их последовательности узнавания в ДНК (5' 3'). Элементы вторичной структуры изображены над соответствующими остатками в последовательностях указанных ЭР. -Спирали обозначены в виде цилиндров, -тяжи – в виде стрелок. Наиболее консервативные аминокислотные остатки R.SsoII и R.PspGI, входящие в состав мотивов К, С1 и С2, приведены над «выравниванием». Фоновым окрашиванием отмечены аминокислотные остатки, степень консервативности которых более 50%.
Таблица 6. Параметры взаимодействия исходной и мутантных форм эндонуклеаз рестрикции SsoII, PspGI и MboI с ДНК-субстратами а.
Мотив C1 Мотив C Мотив K б S180 S118 Q R.SsoII wt D160A K182A E191A E195A R116A R117A R119A K122A R186A E187A R188A E125A в Kd, нМ 80 140 300 - 60 90 60 н.с. - н.с. 160 800 400 500 н.с.
отн. акт., % 100 0 0 - 0 100 2 0 0 - 0 10 0 0 0 T158 F97 S98 Е165 R R.PspGI wt Е105A D138A K160A E169A E173A R96A R99A K102A R164A R166A Kd, нМ 90 40 230 - 130 20 45 н.с. - - н.с. 25 1000 - 1000 отн. акт., % 100 40 0 - 8 44 12 0,1 - - 0 70 0,1 - 0 A216 K141 S R.MboI wt S149E D186A E199A N201A E212Q R140А N142A R143A D146K S208A K209A N211A Kd, нМ 7 6 6,5 7 10 6,2 - н.с. - 1000 н.с. 7 - 1000 330 7, отн. акт., % 100 0,8 0,01 0,01 3 0,3 - 0 - 0 0 88 - 0 0,2 а. Исследования выполнялись в Институте биохимии Университета им. Ю. Либиха (Гиссен, Германия) совместно с д-ром В. Пингоуд.
Специфические комплексы в экспериментах по связыванию исходной (wt) и мутантных форм R.SsoII, R.PspGI c 20-звенным ДНК-субстратом и R.MboI c 188-звенным ДНК-субстратом формировали в присутствии 5 мМ CaCl2 и 10 мкг/мл поли(dIdC). Гидролиз субстратов проводили при 370С (R.SsoII, R.MboI) и при 500С (R.PspGI), определение Kd - при 200С. Отн. акт. – относительная активность. Для мутантных форм ферментов отн.
акт. определялась как [kapp(мутант)/kapp(wt)]100%. Указанные значения Kd и относительной каталитической активности определяли как среднее арифметическое трех независимых экспериментов. Ошибка измерений не превышала 10%.
б. Красным отмечены аминокислотные остатки, вовлеченные во взаимодействие, зеленым – не участвующие во взаимодействии, фиолетовым аминокислотные остатки, выяснение роли которых в катализе и связывании субстрата требует дальнейших исследований.
в. н.с. – нет связывания Замена консервативных аминокислотных остатков из блока R(R/K)XR мотива С приводит к потере способности R.SsoII, R.PspGI и R.MboI образовывать комплекс с ДНК. В связывании с ДНК также принимают участие остатки Arg186, Glu187, Arg R.SsoII, Arg164 и Arg166 R.PspGI из мотива С2. Методом аффинной модификации белков ФДСГ-содержащими ДНК было установлено, что консервативные остатки мотивов С1 и С2 R.SsoII и R.PspGI сближены с ДНК уже на стадии образования неспецифического фермент-субстратного комплекса. Были получены моноцистеин содержащие формы эндонуклеаз, в которых один из консервативных остатков заменяли на Сys. Эти белки вводили в реакцию тиол-дисульфидного обмена с модифицированными неспецифическим и специфическим ДНК-дуплексами VI и VII (рис. 5). Выход конъюгатов в случае обоих дуплексов был одинаков и достигал 50%.
pss - фосфорилдисульфидная группа VI 5' TCGGAAAGTpssTGACTGCACGGT 3' 3' GCCTTTCA---ACTGACGT 5' Участок узнавания R.SsoII и R.PspGI VII 5' TCGGTTCpssCTGGCTCT 3' выделен жирным шрифтом.
3' GAGCCAAG---GACCGAGACT 5' Рис. 5. Анализ продуктов аффинной модификации R.PspGI ФДСГ-содержащими ДНК дуплексами VI (Н, неспецифическим) и VII (С, содержащим участок узнавания фермента) методом электрофореза в 15%-ном ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием геля раствором солей серебра. Концентрация дуплексов составляла 2 мкМ, концентрация R.PspGI – 2 мкМ (в расчете на димер). М – маркеры молекулярной массы (кДа).
Замена внутреннего dG участка узнавания R.SsoII (5'-CCNGG-3') на 5-йод-2' дезоксиуридин и последующая аффинная модификация белка под действием УФ света приводила к образованию конъюгата с выходом ~ 8%. Мы установили, что модифицированный нуклеозид ковалентно связывается с Trp189 эндонуклеазы. Этот аминокислотный остаток расположен рядом с Arg186 и Arg188, которые входят в мотив С2. Полученный результат подтверждает предположение, что этот район белка отвечает за связывание с ДНК и образование специфических контактов с динуклеотидом d(GрG) участка узнавания. В случае R.MboI во взаимодействие с ДНК, вероятно, вовлечены остатки Ser208 и Lys209 мотива С2. Сближенность Lys с аденином участка узнавания была показана нами методом фотоаффинной модификации R.MboI 5-йод-2'-дезоксиуридинсодержащим лигандом.
Таким образом, наличие консервативных аминокислотных остатков характерно не только для каталитического центра ферментов рестрикции II-го типа, но и для районов, отвечающих за связывание ДНК-субстрата.
На основании полученных нами результатов и гомологии R.SsoII и R.PspGI с R.NgoMIV, R.EcoRII и R.Cfr10I, для которых известны данные РСА, выполнено моделирование пространственной структуры активных центров R.SsoII и R.PspGI (рис. 6).* Видно, что консервативные остатки мотива С1 занимают идеальное положение для формирования контактов с углеводофосфатным остовом ДНК-субстрата. В тоже время остатки аргининов мотива С2 участвуют в узнавании гетероциклических оснований.
С помощью ДНК-дуплексов, содержащих ненуклеозидные аналоги в участке узнавания, выявлены необычные свойства R.SsoII. Замена любого из остатков центральной пары участка узнавания на ddR или Prd, имитирующие «АР-сайт», приводит к 1,5-2-кратному повышению скорости расщепления ДНК ферментом. Аналогичный эффект наблюдался нами также при введении в центральную Рис. 6. Моделирование позицию участка узнавания R.SsoII некомпле пространственной струк ментарной ТТ-пары или тиминдингликоля. Можно туры активного центра полагать, что в первую очередь субстратами R.SsoII в мономера R.PspGI.
клетке являются ДНК с модификациями, нарушающими комплементационные взаимодействия и индуцирующими повышенную конформационную «гибкость» участка узнавания фермента в центральной вырожденной позиции. Снижение эффективности действия R.SsoII при использовании в качестве субстрата конформационно ограниченного ДНК-«дамбла» подтверждает это предположение.
Доказательство правомерности разрабатываемого нами комплексного подхода к изучению ДНК-белковых взаимодействий в растворе было получено в работе (Bochtler et al., 2006), в которой сделан РСА комплекса эндонуклеазы рестрикции Ecl18kI с субстратом, содержащим участок узнавания 5'-CCWGG-3'. R.Ecl18kI является изошизомером и ближайшим гомологом R.SsoII. Степень идентичности аминокислотных последовательностей этих эндонуклеаз составляет 99% (Деньмyхаметов и др., 1997). Данные РСА подтвердили состав каталитического центра R.Ecl18kI (R.SsoII) и нашу гипотезу о том, что остатки Arg116, Arg117 и Arg119 мотива C1 вовлечены во взаимодействие с углеводофосфатным остовом, а аминокислотные остатки мотива С2 Arg186, Arg188 и Glu187 формируют контакты с гетероциклическими основаниями участка узнавания. Более того, из данных РСА следует, что при взаимодействии R.Ecl18kI с субстратом происходит значительное изменение конформации ДНК, нарушение комплементационных взаимодействий в центральной А·Т паре участка узнавания и выведение аденозина и тимидина из состава двойной спирали.
Эндонуклеаза рестрикции MvaI R.MvaI выделена из мезофильного штамма Micrococcus varians RFL19, характеризуется высокой термостабильностью и проявляет свойства, аналогичные * Моделирование трехмерных структур комплексов эндонуклеаз рестрикции с ДНК выполнялось совместно с д-ром Буйницким Я. и д-ром Косинским Я. (Международный институт молекулярной и клеточной биологии, Польша).
ферменту-изошизомеру BstNI из термофильного штамма Bacillus stearothermophilus N. С помощью немодифицированных субстратов мы установили, что R.MvaI относится к IIP-подтипу ЭР и занимает промежуточное место между мезофильными и термофильными ферментами. Температурный оптимум расщепления R.MvaI 14 звенного субстрата за 10-30 мин составляет 46-480С.
На основании результатов расщепления модифицированных ДНК-дуплексов сделано заключение, что фермент преимущественно взаимодействует с группами атомов гетероциклических оснований, расположенных по центру большой бороздки двойной спирали ДНК. Характер расщепления субстратов Iа и Iб, Iв и Iг R.MvaI одинаков, независимо от того в dА- или Т-cодержащей цепи участка узнавания находится модификация (табл. 7). Эти данные свидетельствуют в пользу симметричной локализации контактов R.MvaI в асимметричном участке узнавания.
Вместе с тем, R.MvaI отличает остаток dA от остатка T в узнаваемой последовательности ДНК. Это следует из результатов расщепления ферментом квазипалиндромного субстрата: 5'-AATGCCTGGCATT-3'/3'-TTACGGACCGTAA-5'.
Скорость гидролиза фосфодиэфирной связи между остатками dC и dA в 3 раза выше, чем между остатками dC и T.
Таблица 7. Расщепление модифицированных ДНК-дуплексов эндонуклеазой MvaI.
Отн. начальная ДНК-дуплекс а КМ, 10-7 М Vмакс, 10-8 М/мин № б скорость гидролиза 5' ACCTACCTGGTGGT 3' 100 2,1 ± 0,2 1,17 ± 0, I 3' TGGATGGACCACCA 5' 100 2,0 ± 0,2 1,03 ± 0, -...m4C-С-T-G-G... Iа...G-G-A–C-C... -...C-C-T-G--G... Iб...G-G-A-C–m4C......C-m5C-T-G-G... 91 1,5 ± 0,1 1,07 ± 0, Iв...G---G-A–C-C... 53 1,8 ± 0,1 0,55 ± 0,...C-C-T---G-G... 51 1,7 ± 0,3 0,6 ± 0, Iг...G-G-A-m5C–C... 153 2,0 ± 0,6 1,58 ± 0, -...C-C---T-G-G... Iд...G-G-m6A-C–C......C-C-T–I-G... 90 - Iе...G-G-A-C-C......C-C-rU-G-G... Iж...G-G--A–C-C......C-C-xT-G-G... Iз...G-G--A–C-C... a. В дуплексах Iа-Iз представлены только модифицированные фрагменты молекул, остальные их части идентичны исходному соединению I;
rU - рибоуридин б. Отношение начальной скорости гидролиза отдельных цепей модифицированных дуплексов к степени гидролиза соответствующей цепи исходного субстрата, умноженное на 100.
Данные верхней и нижней строк соответствуют расщеплению «верхней» и «нижней» цепи ДНК-дуплекса. Ошибка измерений не превышала 15%.
Возможность отдельно изучать расщепление каждой из цепей модифицированных ДНК-дуплексов позволила установить детали функционирования R.MvaI. Главная особенность этого фермента состоит в избирательном влиянии многих модификаций на гидролиз только одной цепи субстрата. Так, метилирование экзоциклических аминогрупп остатка dA и внешних остатков dC участка узнавания приводит к блокированию гидролиза только модифицированной цепи ДНК-дуплекса (субстраты Iа, Iб, Iд), при этом R.MvaI эффективно расщепляет немодифицированную цепь участка узнавания (табл. 7). Эффективный гидролиз R.MvaI немодифицированной цепи субстратов при отсутствии продуктивного взаимодействия с модифицированной цепью свидетельствует о том, что мономер фермента формирует специфические контакты преимущественно с одной цепью ДНК и гидролизует одну фосфодиэфирную связь, находящуюся именно в этой цепи субстрата. По-видимому, две субъединицы R.MvaI функционируют достаточно независимо. С другой стороны, модификации, введенные только в одну цепь участка узнавания, но кардинально нарушающие белково-нуклеиновые взаимодействия в фермент-субстратном комплексе в целом (например, удаление или замена гетероциклических оснований), ингибируют гидролиз R.MvaI как модифицированной, так и немодифицированной цепи, что свидетельствует о взаимодействии каждой субъединицы R.MvaI с обеими цепями ДНК-дуплекса.
Необычный характер расщепления обнаружен нами при гидролизе R.MvaI ДНК дуплексов Iв, Iг, Iе-Iз (табл. 7). Введение остатков m5dC, dI, rU, xT в одну из цепей участка узнавания не снижает скорости расщепления модифицированной цепи, но ингибирует гидролиз немодифицированной цепи. Мы полагаем, что этот эффект наблюдается только в случае тех модификаций, которые не затрагивают критичных для узнавания ферментом групп атомов в ДНК. Вероятно, мономер R.MvaI, формируя основные контакты с гидролизуемой цепью, осуществляет ряд дополнительных взаимодействий с противоположной цепью ДНК-дуплекса. Вместе с тем, метилирование экзоциклической аминогруппы внутреннего остатка C, по-видимому, препятствует формированию таких дополнительных контактов и вызывает тем самым блокирование гидролиза не только модифицированной, но и немодифицированной цепи (Butkus et al, 1985).
Полученные экспериментальные данные легли в основу модели комплекса R.MvaI с ДНК. В качестве матриц при моделировании комплекса фермента с 12-звенным дуплексом использовали структуры комплексов MutH из Haemophilus influenzae (PDB-код 2aoq) и мутантной формы R.PvuII(D34G) (PDB-код 3pvi) с ДНК субстратами. На рис. 7 представлены аминокислотные остатки мономера R.MvaI, предположительно вовлеченные во взаимодействие с группами атомов участка узнавания. Согласно модели остатки Asn45, Leu67, Lys159 R.MvaI взаимодействуют с углеводофосфатным остовом гидролизуемой цепи (А-цепь). Рядом с расщепляемой фосфодиэфирной связью локализован остаток Asp50. Остатки Glu36 и Glu взаимодействуют с фосфатной группой в гидролизуемом межнуклеотидном узле опосредованно через молекулы воды. Эти аминокислоты, а также Lys57, по видимому, составляют основу активного центра R.MvaI. Фермент не контактирует с фосфодиэфирной связью, которая может подвергаться гидролизу в комплементарной Т-цепи. Вместе с тем, R.MvaI посредством Lys26 образует водородную связь с фосфатной группой в Т-цепи, расположенной напротив расщепляемой связи в А цепи, как и предполагалось в нашем исследовании. Остатки Arg209 и Phe70 играют важную роль в дискриминации центральной dАТ-пары участка узнавания. Остаток Arg230 образует водородные связи c остатками dG гидролизуемой цепи. С комплементарными им остатками dС взаимодействуют Ile208 и Asp207. Введение метильной группы в 5-ое положение внутреннего dC Т-цепи препятствует реализации гидрофобного взаимодействия с Ile208, а метилирование экзоциклической аминогруппы этого цитидина создает стерические препятстствия для взаимодействия Arg209 с центральной нуклеотидной парой и нарушает контакты фермента с углеводофосфатным остовом. Эти обстоятельства, вероятно, обуславливают наблюдаемое ингибирование гидролиза ДНК в первом случае и его блокирование во втором. Недостаточная достоверность моделирования R.MvaI в районе 208- остатков не позволяет точно предсказать аминокислоты, контактирующие с внешним и внутренним цитидинами гидролизуемой цепи. В целом предложенная нами модель R.MvaI и комплекса R.MvaI с субстратом находится в хорошем соответствии с опубликованными в 2007 г. данными РСА (Kaus-Drobek et al., 2007).
Рис. 7. Схематическое изображение возможных контактов мономера R.MvaI с участком узнавания в ДНК.
Пунктирными линиями обозначены контакты, опосредованные молеку лами воды. Обведены фосфатные группы, подвергнутые модификации.
Аминокислотные остатки, участие которых во взаимодействии с ДНК подтверждено данными РСА, выделены желтым.
Эндонуклеаза рестрикции EcoRII Согласно существующей классификации R.EcoRII относится к IIE-подтипу ЭР (Roberts et al., 2003). Эффективность расщепления ферментом синтетических субстратов с одним участком узнавания понижается с увеличением длины фланкирующих его последовательностей. Мы показали, что «эффект изолированного сайта» проявляется уже на 30-звенном дуплексе VIII. Скорость его гидролиза увеличивается при добавлении в реакционную смесь коротких субстратов (активаторов) длиной от 11 до 14 нуклеотидных пар (рис. 8). Дуплекс, состоящий из комплементарных 14- и 17-звенных олигонуклеотидов, уже не является активатором.
В процессе активации гидролиза 30-звенного субстрата короткие дуплексы сами расщепляются ферментом. Это означает, что при транс-активации любой из ДНК дуплексов, имеющих близкое сродство к ферменту, может быть как активатором, т.е.
связываться в N-концевой области R.EcoRII (Zhou et al., 2004), так и выступать в качестве субстрата, т.е. попадать в каталитический центр фермента.
Предпочтительность образования того или иного каталитически активного комплекса, по-видимому, определяется также вероятностью нахождения ферментом своего участка узнавания. Увеличение концентрации активатора приводит к увеличению скорости гидролиза протяженного субстата (рис. 8).
Дуплекс VIII 5' GATGCTGCCAACCTGGCTCTAGCTTCATAC 3' 3' CTACGACGGTTGGACCGAGATCGAAGTATG 5' Дуплекс I 5' ACCTACCTGGTGGT 3' 3' TGGATGGACCACCA 5' Рис. 8. Расщепление 32Р-меченного ДНК дуплекса VIII (CD 3,5·10-7 М) R.EcoRII (0,04 ед.
акт.) в присутствии 14-звенного субстрата I: CD 3,5·10-7 М (2) и CD 1·10-5 М (3). 1 - Собственный гидролиз ДНК-дуплекса VIII, - 32Р-метка в Т-цепи дуплекса VIII, ----- - в А-цепи.
Какая из функций – связывание или расщепление активатора является определяющей для стимулирования действия R.EcoRII? Для ответа на этот вопрос мы исследовали гидролиз этим ферментом 47-звенного ДНК-дуплекса с «изолированным» участком узнавания в присутствии дуплексов IX и X. В дуплексе X в местах гидролиза пентануклеотидной последовательности R.EcoRII расщепляемая фосфодиэфирная связь заменена на негидролизуемую пирофосфатную.
IX X 5' CACTCCTGGATCCG 3' 5' CACTppCCTGG--ATCCG 3' 3' CAGTGAGGACCTAGGCA 5' 3' CAGTGA--GGACCppTAGGCA 5' Известно, что значения констант связывания ДНК-дуплексов IX и X близки (Gromova et al., 1990). Дуплекс X ингибирует гидролиз 47-звенного субстрата, в то время как дуплекс IX в тех же условиях активирует его расщепление. Таким образом, только дуплексы, которые в определенных условиях сами могут формировать продуктивный комплекс с R.EcoRII, могут выступать в роли активатора действия фермента.
Нами было изучено комплексообразование R.EcoRII с синтетическими 32Р меченными дуплексами I и VIII. Независимо от длины субстрата его связывание с ферментом приводит к образованию двух типов комплексов, соотношение между которыми в растворе меняется в зависимости от молярных концентраций эндонуклеазы, ДНК и ионов магния. На основании оценки подвижности комплексов в геле было сделано предположение, что в образовании комплекса 1 участвуют две субъединицы R.EcoRII, а в образовании комплекса 2 – одна субъединица (рис. 9). При соотношении концентраций мономера фермента и субстрата 1:1 и концентрации ионов Mg2+ меньше (или равно) 1 мМ наблюдается образование обоих типов комплексов. Расщепление ДНК в таких условиях практически отсутствует. При концентрации ионов Mg2+ больше 1 мМ наблюдается эффективный гидролиз субстрата и присутствие в реакционной смеси только комплекса 1. Возможно, первоначально происходит связывание одной молекулы дуплекса с димером R.EcoRII, что соответствует образованию комплекса 1 – E2S. Такой комплекс является неактивным. Затем с димером R.EcoRII связывается вторая молекула дуплекса, что приводит к образованию комплекса 1' – E2S2. Можно предположить, что комплекс E2S2 в отсутствие ионов Mg2+ является неустойчивым и распадается. В результате образуются два комплекса 2, в которых мономер R.EcoRII взаимодействует с одной молекулой субстрата. Комплекс E2S2 в присутствии ионов Mg2+ является каталитически активным.
Рис. 9. Анализ связывания R.EcoRII с дуплексом I методом гель-электрофореза в неденатурирующих условиях.
а – Авторадиограмма геля: 1 – исходный Р-меченный дуплекс I, 2 – дуплекс I (CD 5·10-6 М) в присутствии R.EcoRII (СЕ в расчете на мономер 2,5·10-6 М). б – Гель, окрашенный расвором кумасси R250: 1 дуплекс I (CD 5·10-6 М) в присутствии R.EcoRII (СЕ 2,5·10-6 М), 2 – R.EcoRII, 3 – овальбумин. Справа указаны молекулярные массы димера и мономера овальбумина.
Результаты проведенного нами прецизионного выравнивания аминокислотных последовательностей 30 ЭР II-го типа (рис. 4, с. 24) и анализа данных РСА позволяют предположить, что каталитический центр R.EcoRII сформирован остатками Asp299, Lys324 и Glu337. Остатки Lys328 и Arg330 могут быть вовлечены в формирование контактов с гетероциклическими основаниями участка узнавания в субстрате, тогда как остаток Lys263, возможно, сближен с углеводофосфатным остовом ДНК.
Эволюционная взаимосвязь между различными эндонуклеазами рестрикции Выбранные нами для исследования ферменты оказались перспективными с точки зрения изучения эволюционного процесса среди эндонуклеаз рестрикции II-го типа.
Первоначально мы показали, что для R.SsoII и R.PspGI характерна существенная гомология аминокислотной последовательности с R.EcoRII, R.NgoMIV, R.Cfr10I и R.Bse634I. Было доказано, что эти ферменты, узнающие сходные последовательности, имеют аналогичную организацию каталитического центра и ДНК-связывающих мотивов и родственны эволюционно, несмотря на принадлежность к разным подтипам. Затем исследование было перенесено на R.MboI, которая узнает совсем другую нуклеотидную последовательность, но имеет в своем составе те же структурные элементы для узнавания и расщепления ДНК, что и перечисленные выше ферменты. Подтвердив функциональную значимость аминокислотной гомологии между R.MboI, R.SsoII, R.PspGI, R.EcoRII, R.NgoMIV, R.Cfr10I и R.Bse634I, мы сделали вывод об эволюционном родстве этих ферментов. Это первый пример тесной эволюционной взаимосвязи между ферментами рестрикции, узнающими совершенно разные нуклеотидные последовательности.
Во вторичной структуре R.SsoII, Bse643I R.PspGI, R.EcoRII и R.MboI можно NgoMIV MboI Cfr10I выделить консервативный структурный PspGI фрагмент ()(+), аналогичный активному центру EcoRI-подобных ЭР SsoII (-семейство). Поскольку каталитичес- EcoRII EcoRI.
......
кий мотив R.MboI имеет лишь......
незначительное отклонение от клас....
...
сического PD…(D/E)XK мотива (К EcoRV заменен на N), мы полагаем, что R.MboI расположена ближе к общему Sau3AI предшественнику, чем R.SsoII, R.PspGI PvuII MvaI MutH и R.EcoRII, имеющие более существен ные вариации в каталитическом мотиве Рис. 10. Фрагмент схематичного (рис. 10). изображения эволюционного дерева, В аминокислотных последователь- построенного для ферментов супер ностях R.SsoII, R.EcoRII и R.PspGI семейства PD…(D/E)XK на основе сравнительного анализа их вторичных обнаружен мотив (K/R)Xn(D/E)(K/R), структур (Bujnicki, 2004) и результатов охарактеризованный в структуре данной работы. Эндонуклеазы подтипа IIP R.NgoMIV (5'-GCCGGC-3'). Можно представлены на белом фоне, IIF – на полагать, что все эти ферменты светло-сером, IIE – на темно-сером.
реализуют сходный механизм узнавания GрG-динуклеотида в ДНК. Филогенетическое дерево, построенное на основании полученных нами результатов и сравнительного анализа аминокислотных последовательностей R.MboI, R.SsoII, R.PspGI, R.EcoRII, R.NgoMIV, R.Cfr10I и R.Bse634I, показало, что для выделенной группы ферментов характерна дивергентная эволюция. Из нашей работы следует, что структурный модуль ()(+), который охватывает участок примерно из 70 подобных аминокислотных остатков, может быть использован для выявления новых ферментов -семейства ЭР.