Роль малых g-белков в регуляции эпителиальных натриевых каналов
На правах рукописи
СТАРУЩЕНКО АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ РОЛЬ МАЛЫХ G-БЕЛКОВ В РЕГУЛЯЦИИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Санкт-Петербург 2010
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН, Научном центре здоровья Университета Техаса (США) и Медицинском колледже Висконсина (США)
Научный консультант: доктор биологических наук Негуляев Юрий Алексеевич Институт цитологии РАН
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Крутецкая Зоя Иринарховна Санкт-Петербургский государственный университет доктор биологических наук Казначеева Елена Валентиновна Институт цитологии РАН доктор биологических наук Тихонов Денис Борисович Институт эволюционной физиологии им. И.М.
Сеченова РАН
Ведущая организация: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН
Защита состоится « 19 » февраля 2010 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу:
194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.
Сайт института: www.cytspb.rssi.ru Адрес электронной почты института: [email protected] Факс института +7(812)297-03-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.
Автореферат разослан « » года.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е. В. Каминская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В физиологии почки и в клинической практике вопрос о регуляции реабсорбции натрия остается одним из наиболее актуальных и дискуссионных. В собирательных трубочках почки транспорт Na+ является важнейшим механизмом поддержания электролитического и водного гомеостаза и, следовательно, кровяного давления. Концентрация натрия в плазме определяет объем крови и регулируется путем изменения транспорта Na+ через эпителий почки. Исследование механизмов, опосредующих реабсорбцию натрия, является интенсивно развивающимся направлением современной физиологии, клеточной биологии и медицины. Ведущую роль в поддержании функциональной способности эпителиальных тканей почки и ряда других органов играют различные транспортные процессы с участием ионных каналов клеточных мембран. Согласно современным представлениям, Na+ пассивно входит в клетку по эпителиальным натриевым каналам (ENaC), расположенным в апикальной мембране, и удаляется из клетки при помощи Na+/K+-АТФазы, локализованной в базолатеральной мембране эпителиальных клеток. Нарушение регуляции транспорта Na+ через ENaC приводит к различным патологическим состояниям (1-4). Разработка метода локальной фиксации потенциала (пэтч кламп), позволяющего в реальном масштабе времени наблюдать элементарные события – одиночные открывания ионных каналов в участке плазматической мембраны (5), позволила существенно продвинуться в изучении ионных каналов, и ENaC, в частности. Кроме того, в 1994 году была определена нуклеотидная последовательность ДНК, определяющая образование ENaC (6,7), что позволило использовать различные модельные объекты для исследования механизмов транспорта натрия через ENaC.
Роль малых GTP-связывающих белков (малые G-белки) в различных клеточных процессах таких, как контроль клеточного роста, реорганизация цитоскелета, пролиферация и дифференцировка, не вызывает сомнения (8).
Малые G-белки также вовлечены в различные сигнальные каскады в дифференцированных клетках. Недавно было установлено, что малые G-белки играют существенную роль в регуляции активности ионных каналов. Ионные каналы являются финальными эффекторами для различных малых G-белков (9).
Однако, несмотря на интенсивные исследования, в том числе и с использованием метода пэтч-кламп, до наших работ ничего не было известно о механизмах регуляции эпителиальных натриевых каналов малыми G-белками, а также о вовлечении фосфатидилинозитидов в эту регуляцию.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в установлении функциональных свойств, структуры и механизмов регуляции эпителиальных натриевых каналов. Основное внимание было уделено исследованию механизмов регуляции этих каналов малыми G-белками и вовлечению фосфатидилинозитидов в данный процесс. Отдельная часть работы посвящена исследованию стехиометрии канала и сайтов связывания фосфатидилинозитидов с субъединицами канала.
В связи с этим были поставлены следующие задачи исследования:
1. Зарегистировать и охарактеризовать реконструированные в клетки млекопитающих эпителиальные натриевые каналы и нативные амилорид чувствительные натриевые каналы в клетках собирательной трубочки почки.
2. Разработать новые методические подходы, использующие флуоресцентную микроскопию, с помощью которых будет возможно исследовать как формирование новых каналов в живых клетках, так и транслокацию каналов к плазматической мембраны и от нее.
3. Определить субъединичный состав функционального канала и смоделировать структуру ENaC на базе протон-чувствительного канала, входящего в семейство Deg/ENaC.
4. Идентифицировать малые G-белки, участвующие в регуляции ENaC.
5. Изучить сигнальные пути и механизмы регуляции ENaC малыми G белками.
6. Исследовать возможную роль фосфатидилинозитидов в работе ENaC и в регуляции канала малыми G-белками.
7. Идентифицировать сайты связывания канала с фосфатидилинозитидами.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Разработанные нами новые методические подходы, включая регистрацию ENaC в нативных клетках и экспрессированного в клетки млекопитающих, а также использование современных флуоресцентных методов микроскопии, позволяют исследовать структуру и функции ENaC в условиях приближенных к физиологическим.
2. Определена стехиометрия канала, показывающая, что ENaC является тримером и содержит равное количество -, - и -субъединиц. На основе протон-чувствительного канала cASIC1 смоделирована структура ENaC и идентифицированы потенциально важные для регуляции канала домены и сайты.
3. Функционирование ENaC регулируется малыми G-белками, входящими в семейства Ras, Rho и Rab. При этом малые G-белки вовлечены как в модуляцию воротных свойств канала, так и в изменение количества функционально активных каналов в плазматической мембране. Детально описаны механизмы регуляции ENaC малыми G-белками.
4. Показано, что фосфатидилинозитиды PI(4,5)P2 и PI(3,4,5)P3 вовлечены в регуляцию ENaC малыми G-белками. Эффект опосредован прямым связыванием указанных фосфатидилинозитидов с - и -субъединицами канала. Идентифицированы сайты связывания ENaC с PI(4,5)P2 и PI(3,4,5)P3.
Научная новизна полученных результатов. Работа представляет собой первое комплексное исследование структуры и механизмов регуляции эпителиальных натриевых каналов, выполненное с применением современных электрофизиологических методов и микроскопии. Полученные в процессе выполнения работы результаты обладают несомненной новизной, так как исследование эпителиальных натриевых каналов в плазматической мембране клеток млекопитающих до наших работ практически не проводилось и роль малых G-белков и фосфатидилинозитидов в регуляции ENaC не была изученной.
В настоящей работе разработаны электрофизиологические и микроскопические методы регистрации реконструированного ENaC в клетках млекопитающих и в нативных клетках, позволяющие изучать структуру и функции канала. Приоритетными являются данные по определению стехиометрии канала, которые показали, что ENaC является тримером, и опровергли существующие ранее теории о тетрамерной и нонамерной организации канала. На основе протон-чувствительного канала смоделированы вторичная и третичная структуры ENaC, необходимые для дальнейшего изучения функций канала. Впервые идентифицированы малые G-белки, участвующие в регуляции ENaC, и показаны механизмы их действия.
Установлено, что малые G-белки участвуют как в модуляции воротных свойств канала, так и в сигнальных механизмах, приводящих к изменению количества функциональных каналов в плазматической мембране. Особый интерес представляют результаты, показывающие, что фосфатидилинозитиды принимают участие в регуляции активности канала малыми G-белками. Впервые определены сайты связывания ENaC с PI(4,5)P2 и PI(3,4,5)P3.
Теоретическое и практическое значение работы.
Результаты работы имеют большое теоретическое значение для понимания роли малых G-белков в регуляции ENaC и реабсорбции Na+ в эпителиальных клетках почки, а также роли этих каналов в поддержании необходимого уровня натрия в физиологических условиях и при различных патологиях. Полученные результаты позволяют расширить представление о эпителиальных натриевых каналах и механизмах их активности. Большое практическое значение работы состоит в определении стехиометрии канала, что позволяет более точно определить структуру и, соответственно, функции канала.
В клетках почки абсорбция Na+ приводит к увеличению объема плазмы и повышению кровяного давления. В связи с этим повышенная активность ENaC вызывает гипертонию, а пониженная – гипотонию (2-4). Мутации генов, кодирующих субъединицы ENaC, приводят к ряду тяжелых наследственных заболеваний, таких как синдром Лиддла и псевдогипоальдостеронизм типа I (10 12). Таким образом, исследование сигнальных механизмов регуляции ENaC необходимо для понимания физиологических и патофизиологических процессов, участвующих в регуляции реабсорбции натрия.
Полученные важные данные о регуляции ENaC малыми G-белками и фосфатидилинозитидами могут быть полезны для изучения различных типов ионных каналов, включая другие каналы, входящие в семейство Deg/ENaC.
Полученные результаты способствуют выяснению общих принципов организации ионных каналов плазматических мембран в контексте их участия во внутриклеточной сигнализации.
Разработанная в процессе исследований новейшая технология, включающая в себя совместное использование флуоресцентных методов микроскопии (TIRF, FIR и FRAP), обладает уникальными возможностями для регистрации распределения функциональных каналов в плазматической мембране живых клеток. Данные по действию различных агентов на функциональные характеристики ENaC могут быть применены при разработке и тестировании фармакологических препаратов. Результаты работы могут использоваться в курсах лекций по клеточной биологии, физиологии и биофизике.
Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на Санкт-Петербургской ассамблее молодых ученых и специалистов (Санкт Петербург, 2001), ежегодной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии «Трансляция генома» (Вашингтон, США, и 2007), 37 съезде Американского Нефрологического общества (Сэнт-Луис, США, 2004), совместной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии и 35 международного съезда по Физиологическим наукам (Сан Диего, США, 2005), 49 международном съезде Биофизического общества (Лонг Бич, США, 2005), 5 международном Биофизическом конгрессе (Монпелье, Франция, 2005), 3 ежегодной конференции Центра Биомедицинских Нейронаук (Сан Антонио, США, 2005), 38 и 41 съезде Американского Нефрологического общества (Филадельфия, США, 2005 и 2008), ежегодной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии (Сан Франциско, США, 2006), 51 международном съезде Биофизического общества (Балтимор, США, 2007), национальном съезде Фонда по болезням почек (Орландо, США, 2007), 6 международном симпозиуме «Альдостерон и ENaC: от гена к болезням», 40 съезде Американского Нефрологического общества (Сан Франциско, США, 2007), ежегодной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии (Сан Диего, США, 2008), Пекинской совместной конференции по физиологическим наукам (Пекин, Китай, 2008), 53 международном съезде Биофизического общества (Бостон, США, 2009), научной конференции «Ионные каналы: структура и функции» (Санкт-Петербург, 2009), ежегодной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии (Нью Орлеан, США, 2009), международном конгрессе по Нефрологии (Милан, Италия, 2009) на семинарах кафедр физиологии, фармакологии или медицины (Научного центра здоровья Университета Техаса в Сан Антонио, Университета Калифорнии в Сан Франциско, Университета Флориды в Гэйнсвилле, Научного центра здоровья Государственного университета Луизианы в Новом Орлеане, Медицинского центра университета Рочестера, Аризонского университета, Университета Айовы, Университета Ла Лагуны и Медицинского колледжа Висконсина), а также на научных семинарах Института цитологии РАН.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего публикации. Работа изложена на 218 страницах машинописного текста и иллюстрирована 69 рисунками и 4 таблицами.
Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, Американского национального института здоровья, Американской ассоциации по болезням сердца, Национального фонда по болезням почек и Американского общества нефрологов.
Публикации. По теме диссертации опубликованы 23 статьи в ведущих отечественных и зарубежных изданиях и 45 тезисов докладов.
КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ Клетки. Клетки CHO и Cos-7 (ATCC) культивировали в стандартных условиях (DMEM + 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотики, o C, 5 % CO2) и трансфецировали, используя трансфекционный реагент Polyfect (Qiagen, США) согласно протоколу производителя за 24-72 ч до экспериментов.
Пересев клеток осуществляли через каждые 72 ч.
Для регистрации нативных каналов использовали иммортализованную клеточную линию, выделенную из собирательных трубочек мыши (mpkCCDc14).
Клетки выращивали на проницаемых подложках, в которых имеется доступ к обеим сторонам мембраны (Costar Transwells) в растворе, предложенном авторами, выделившими и предоставившими нам эту клеточную линию (13,14).
Для формирования монослоя, имеющего высокое электрическое сопротивление и обладающего достаточным транспортом Na+, среду меняли каждые 48 ч в течение 7-10 сут. После формирования монослоя и образования межклеточных контактов подложку с клетками разрезали на несколько частей (~ 4x4 мм), которые использовались для проведения электрофизиологических и (или) микроскопических исследований функциональной активности каналов в апикальной плазматической мембране. Для измерения транспорта натрия клетки растили на проницаемых подложках в течение всего эксперимента.
Нами также были исследованы функциональные характеристики нативных каналов, локализованных в апикальной мембране клеток из собирательных трубочек, выделенных из почек крысы. Непосредственно перед экспериментами трубочки были изолированы из почек крыс (3-4 нед, любого пола) линии Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, США). Крыс содержали в течение 7 сут на нормальной диете (0.32 % натрия) или диете с низкой концентрацией натрия (0.01 %). Для обеспечения доступа к апикальной плазматической мембране клеток собирательные трубочки помещали на покровные стекла, покрытые полилизином, а затем последовательно вскрывали их заточенными стеклянными микропипетками, закрепленными на двух микроманипуляторах (Sutter или Narihige).
Электрофизиология. Регистрацию интегральных токов через эпителиальные натриевые каналы, реконструированные в клетках CHO, производили с помощью метода пэтч-кламп (5) в режиме отведения от целой клетки. Использовали усилитель Axopatch 200B (Axon Instruments), соединенный с персональным компьютером через аналого-цифровой преобразователь Digidata 1440 (Axon Instruments). Для регистрации и обработки данных использовали программное обеспечение pClamp 9 или 10.2 (Axon Instruments). Емкости клеток были компенсированы и составляли ~ 8-10 пФ. Для регистрации ионных токов через одиночные каналы плазматической мембраны использовали конфигурации cell-attached, inside-out и outside-out. Для фильтрации сигнала при исследовании одиночных каналов использовали 8-полюсный фильтр Бесселя (Warner Instr).
Пипетки изготавливали из стеклянных капилляров (World Precision Instr) с использованием оборудования для вытягивания микроэлектродов P-97 (Sutter).
Непосредственно перед началом эксперимента пипетки заполняли соответствующим раствором.
Для регистрации реабсорбции Na+ в поляризованных клетках линии mpkCCDc14 использовали систему Millicel с двусторонними Ag/AgCl электродами (Millipore Corp). При определении тока использовали отношение трансэпителиального электрического напряжения к сопротивлению.
TIRF микроскопия. Флуоресцентное излучение от CFP-M, YFP-M и CFP- или YFP-меченых субъединиц ENaC регистрировали с помощью TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) микроскопии, которая позволяет идентифицировать сигналы, поступающие с плазматической мембраны.
Флуоресцентные излучения регистрировали с помощью инвертированного микроскопа TE2000 (Nikon), оборудованного специальными линзами для регистрации TIRF. Образцы исследовали с использованием Apo TIRF масляно иммерсионного 60x объектива с высоким разрешением (апертура 1.45).
Флуоресцентные фотографии были получены с применением охлаждаемой ПЗС камеры (Cascade 512F;
Roper Scientific Inc) и обработаны с помощью программного обеспечения Metamorph (Mol Devices).
FRAP микроскопия. FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching) метод применялся нами в комбинации с TIRF микроскопией. Меченные флуорофорофорами -, - и -субъединицы ENaC и мембранные маркеры были выжжены на плазматической мембране при помощи аргонового лазера (длина волны 514 нм) при полной мощности в течение 2 мин. Флуоресцентные излучения от мембранных флуорофоров регистрировали при помощи TIRF микроскопии до и непосредственно после выжигания. Регистрацию сигнала производили каждую минуту до окончания эксперимента. В отдельных экспериментах для уменьшения выжигания сигнала на плазматической мембране регистрации производили через 15 и 30 мин после выжигания.
Статистический анализ. Результаты представлены как среднее ± средняя ошибка. Парные и непарные эксперименты сравнивали, используя соответствующие t-тесты Стьюдента. Различия с p 0.05 считали достоверными.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Стехиометрия ENaC и моделирование структуры ENaC на основе ASIC каналов. ENaC состоит из трех гомологичных субъединиц –, и. Все три субъединицы участвуют в формировании поры канала и определяют его характеристики – проводимость, селективность и воротные механизмы. Активность ENaC, как и других ионных каналов, регулируется двумя фундаментальными механизмами – изменением вероятности открывания одиночных каналов (Po) и изменением общего количества каналов в плазматической мембране. Ряд эндокринных факторов регулирует с помощью различных внутриклеточных сигнальных каскадов количество и активность ENaC. Наиболее важным гормоном, влияющим на интенсивность натриевой Рис. 1. Модель, демонстрирующая регуляцию реабсорбции Na+ через реабсорбции в дистальном нефроне эпителиальные клетки. Показаны два является минералокортикоид возможных механизма изменения активности ENaC: 1) контроль альдостерон. В клетках вероятности открытого состояния находящихся в плазматической мембране собирательных трубочек коркового каналов – влияние на воротные свойства вещества он вызывает увеличение ENaC и 2) стимулирование встраивания новых функциональных ENaC в синтеза ряда белков, ответственных плазматическую мембрану или замедление интернализации ENaC. за повышение активности ENaC, включая малый G-белок K-Ras. На рис. 1 показана схема регуляции реабсорбции Na+ через эпителиальные клетки. Как отмечено на данной схеме, альдостерон действует посредством: 1) контроля вероятности открытого состояния каналов в плазматической мембране и 2) стимулирования встраивания новых функциональных ENaC или замедления интернализации каналов.
Определение стехиометрии ENaC необходимо для дальнейшего изучения функциональных характеристик, определения сайтов связывания и понимания вторичной и третичной структур канала. Существует несколько теорий, среди которых тетрамерная организация канала, согласно которой ENaC состоит из А. В. eCFP eCFP- 1:3 1:2 1: 3:1 2:1 1: eYFP eYFP 10 8 k1 = 1. FeCFP (A.U.) k2 = 0. FeCFP (A.U.) 6 1:2 2: 4 1:3 3: 2 0 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 FeYFP (A.U.) FeYFP (A.U.) Б. Г.
eCFP eCFP- eYFP eYFP FeCFP / FeYFP FeCFP / FeYFP 1:1 2:1 3: 1:1 2:1 3: cDNA соотношение, -ENaC :
-ENaC cDNA соотношение, -ENaC :
-ENaC Рис. 2. ENaC состоит из одинакового количества - и -субъединиц. График рассеяния флуоресцентных излучений eCFP относительно eYFP, зарегистрированных с помощью TIRF в клетках, трансфецированных eCFP-ENaC + eYFP-ENaC и не меченых флуоресцентной меткой ENaC (А) и eCFP-ENaC + eYFP-ENaC и ENaC субъединицами (В). Красные линии отражают наиболее соответствующие линейные регрессии, полученные при анализе данных и использовании соответствующих коэффициентов к1 и к2. Черные линии предсказывают соотношения субъединиц при указанной стехиометрии. Красные, голубые и зеленые кружки показывают данные, полученные в клетках, трансфецированных равным количеством eCFP- и eYFP-меченых субъединиц, и тех, где соотношение eCFP превышало eYFP в два и три раза, соответственно. (Б, Г) Графики рассеяния значений отношения eCFP/eYFP флуоресцентных излучений, полученные из данных, приведенных на рисунках А и В, и представленные как функции относительного уровня экспрессии eCFP к eYFP.
2:1:1 субъединиц, получила наибольшее распространение (15-17). Описана также нонамерная организация канала с 3:3:3 субъединицами (18-20). Для определения стехиометрии канала мы использовали несколько современных биофизических подходов, включая электрофизиологические измерения и анализ соотношений флуоресцентной интенсивности (FIR) в комбинации с TIRF микроскопией (21).
Соотношение :, : и : cубъединиц ENaC, определенное с помощью FIR/TIRF анализа, составляет 1:1. Для флуоресцентной микроскопии мы использовали флуоресцентные маркеры, прикрепленные ко всем трем субъединицам. Ранее нами были созданы CFP- и YPF-меченые конструкты всех трех субъединиц. После встраивания CFP- и YPF-меток все субъединицы продолжают оставаться функциональными и формируют активный канал. Так как eCFP и eYFP генетически привязаны к субъединицам канала, излучения от соответствующих флуорофоров прямо пропорциональны количеству eCFP- и eYFP-меченых субъединиц ENaC в мембране. На рис. 2 показаны графики рассеяния и построенные по ним линии регрессии (показаны красным цветом) FeCFP относительно FeYFP, измеренные в клетках, экспрессированных eCFP- + eYFP- + ENaC (рис. 2А) и eYFP- + eCFP- + ENaC (рис. 2В). Предсказанные относительные (-ENaC к -ENaC) FIR значения стехиометрии были подсчитаны и показаны как прерывистые черные линии. Для каждой пары меченых субъединиц ENaC мы определили уровень экспрессии eCFP-меченых субъединиц и, таким образом, экспрессировали равное количество eCFP меченых субъединиц, а также в два или в три раза большее количество eYFP меченых субъединиц. Кружки на графике показывают результаты отдельных экспериментов, для клеток, трансфецированных с равным количеством eCFP- и eYFP-меченых субъединиц (показаны красным цветом), с двухкратным (показаны голубым), и трехкратным (показаны зеленым) превышением eCFP кДНК. На рис. 2 Б и Г приведены отношения флуоресцентных интенсивностей сигнала для eCFP- + eYFP- + ENaC и их комплементарной пары, соответственно, как функция от титрации eCFP-меченых субъединиц. k1 и k2 для данных экспериментальных условий были равны 1.19 (r2 = 0.75) и 0.84 (r2 = 0.68), соответственно. На основании этих коэффициентов подсчитано экспериментальное соотношение -ENaC к -ENaC, которое было равно 1.19.
Таким образом мы показали, что ENaC, локализованный на плазматической мембране клеток, состоит из равного количества - и -субъединиц.
Подобные эксперименты с титрацией ENaC субъединиц и FIR/TIRF анализом были проведены с двумя оставшимися комбинациями, когда мы последовательно трансфецировали клетки с различными соотношениями eCFP и eYFP-меченых - и -, а также - и -субъединиц ENaC. Соответствующие немеченные субъединицы были добавлены во всех экспериментах. Для - и субъединиц ENaC k1 и k2 были 0.98 (r2 = 0.86) и 1.02 (r2 = 0.88), соответственно.
Соотношение - относительно -ENaC при данных коэффициентах равняется 0.98. Для - и -ENaC субъединиц, k1 и k2 были 1.02 (r2 = 0.81) и 0.96 (r2 = 0.86), соответственно. Соотношение - относительно -ENaC равняется 1.03. Таким образом, можно предположить, что в плазматической мембране равное количество и, а также и субъединиц ENaC.
Электрофизиологический анализ стехиометрии ENaC подтверждает, что функциональный канал состоит из равного количества субъединиц. Для того, чтобы исследовать соотношение субъединиц и, таким образом, стехиометрию функционального ENaC, A. Б.
* Плотность тока (пA/пФ) мы использовали метод 0.6:0.2:0.2 пэтч-кламп. Для решения поставленной 0.6:0.6:0. задачи нами были n=17 n=9 n=18 n= проведены 2 нА ENaC 0.6 0.2 0.6 0. 200 мс ENaC 0.6 0.2 0.2 0. электрофизиологические ENaC 0.6 0.2 0.2 0. cDNA (мкг/35 мм2) эксперименты в Рис. 3. Относительная стехиометрия ENaC 1:1:1.
(А) Примеры записей токов при подаче тестирующих которых использовали импульсов потенциала от +60 до –100 мВ (при различное количество поддерживаемом потенциале 40 мВ) в клетках CHO, экспрессирующих 0.6, 0.2 и 0.2 мкг и 0.6, 0.6 и 0.6 мкг -,, - и -субъединиц - и -субъединиц ENaC до и после добавления 10 мкг ENaC. Количество амилорида (показано стрелками). (Б) Плотность амилорид-чувствительных токов, измеренная при –80 мВ кДНК для cубъединиц в клетках CHO, трансфецированных с указанным количеством -, - и -ENaC кДНК. * – достоверные ENaC было либо изменения относительно других групп.
одинаковым (0.6 или 0. мкг субъединиц на 35 мм2 чашку), либо - или - и -субъединицы ENaC были экспрессированы при больших концентрациях. Наша гипотеза заключалась в том, что если функциональный канал содержит одинаковое количество субъединиц, и при этом формируются в основном гетеромерные каналы, то увеличение экспрессии одной субъединицы по сравнению с другими, должно либо не иметь, либо иметь небольшое влияние на активность канала. Однако, если канал содержит больше -субъединиц, как было предложено ранее для модели с тетрамерной организацией, то увеличение экспрессии одной этой субъединицы по отношению к другим двум должно быть равносильно простому увеличению экспрессии всех трех субъединиц. Данные приведенные на рис. демонстрируют, что только эквивалентное увеличение кДНК для всех трёх субъединиц приводит к увеличению активности канала.
Таким образом, мы впервые показали, что ENaC состоит из равного количества субъединиц и опровегли устоявшиеся представления о структуре канала. Недавно, с помощью кристаллографии, которая на данный момент является наиболее точным методом, позволяющим определять вторичные и третичные структуры мембранных белков, была показана структура куриного ASIC1a, который относится к тому же семейству, что и ENaC, и обладает гомологией со всеми тремя субъединицами ENaC (22). Авторы показали, что ASIC1a состоит из трех субъединиц. Так как для формирования функционального ENaC требуются все три субъединицы, то, по всей видимости, правильной стехиометрией канала является 1:1:1.
Моделирование структуры ENaC на основе cASIC1. Хотя ENaC и ASIC имеют меньше чем 20 % идентичности на аминокислотном уровне, мы обнаружили, что структура кристалла cASIC1 хорошо подходит для анализа структуры ENaC. Гетеротримерный ENaC и мономерные субъединицы ENaC в составе тримера, по всей видимости, содержат большую часть основных первичных, вторичных, третичных и четвертичных структурных особенностей идентифицированных в ASIC, за исключением небольших различий, которые могут иметь значительные влияния на функционирование канала. Эти различия, по всей видимости, являются ключевыми и приводят к тому, что ENaC А. Б.
90o В. Г.
90o Рис. 4. Предполагаемая структура олигомеризованного ENaC человека. Вид предсказанной нами гетеротримерной структуры ENaC человека перпендикулярно (А, В) и параллельно (Б, Г;
с внеклеточной стороны) молекулярной оси, смоделированный на основе куриного ASIC1a гомотримера (используя 2QTS структурные координаты). Отдельно представлен увеличенный рисунок, показывающий открывание (вид канала сверху) специального туннеля, который приводит через всю длину внеклеточного региона ENaC к поре канала. Широта тунеля варьирует от 4 до 14 при полном открытии.
становится не чувствительным к pH, постоянно активным и не зависящим от временной или каких-либо иных лиганд-зависимых инактиваций.
Структурные координаты (2QTS) для cASIC1, размещенные в банке данных для белков (22), были использованы для того, чтобы описать гомологичную модель для ENaC. Для упрощения моделирования структуры ENaC на основе cASIC1, области с ограниченной аминокислотной однородностью, например регион, непосредственно следующий за ТМ1, были удалены. Небольшое количество дополнительных или отсутствующих остатков были подкорректированы, чтобы более четко соответствовать cASIC последовательности. Для выравнивания и соответствующей подгонки -, - и субъединиц ENaC относительно тримерной структуры cASIC канала было использовано программное обеспечение DeepView/Swiss-PdbViewer v3.7.
На рис. 4 показаны -, - и -субъединицы ENaC человека (красные, желтые и голубые цвета), смоделированные на базе олигомеризованного cASIC1. Оба канала, по всей видимости, состоят из трех субъединиц, что согласуется с нашими данными, показывающими, что олигомеризованный ENaC состоит из равного количества субъединиц и относительной стехиометрией 1:1:1.
Регуляция ENaC малым G-белком K-Ras. Ранее было показано, что в эпителии почечных канальцев шпорцевой лягушки минералокортикоид альдостерон увеличивает экспрессию и повышает уровень активности малого G белка K-Ras (23,24). Для того чтобы исследовать влияние K-Ras и других малых G-белков на активность ENaC, мы реконструировали канал в клетках CHO в отсутствие или в присутствии различных малых G-белков.
K-Ras увеличивает активность канала, не оказывая влияния на ёмкость А клеток. На рис. 5 + RasG12V ENaC амил амил показаны примеры записей тока (А) и 1 нА 100 мс средние значения Б В плотности амилорид * * Плотность тока, пА/пФ чувствительного тока в Ёмкость, пФ клетках, трансфецированных n=67 n=26 n=38 n= только с ENaC или 0 K-Ras K-RasG12V K-RasS17N ENaC K-Ras K-RasG12V K-RasS17N ENaC одновременно Рис. 5. K-Ras активирует ENaC. (A) Примеры записей токов в клетках CHO, трансфецированных всеми тремя экспрессирующих ENaC субъединицами ENaC в отсутствие и в присутствии K-RasG12V.
совместно экспрессированного (Б) и K-Ras дикого типа, Активность ENaC в клетках, экспрессирующих только постоянно активный ENaC или ENaC в сочетании с K-Ras дикого типа, постоянно активного (G12V) и доминантно негативного (G12V) или доминантно (S17N) мутантов. (В) Значения емкостных негативный (S17N) сопротивлений.
А Б * * * Плотность тока, пА/пФ K-Ras * * амил 1 нА 100 мс * *n= + вортманнин n=14 n=12 n=5 n=11 n= n= амил + вортманнин ENaC + Y + PD + C3 экзоензим +K-Ras + U Рис. 6. K-Ras активирует ENaC через PI3-киназу. (А) Типичные примеры записей токов в клетках CHO, трансфецированных ENaC и постоянно активным K-Ras, не обработанных и выдержанных в растворе с вортманнином (200 нМ). (Б) Активность ENaC в клетках, экспрессирующих только ENaC или ENaC в сочетании с K-Ras.
Показана также активность ENaC + K-Ras при обработке различными блокаторами.
мутанты (Б). Постоянно активный K-Ras и малый G-белок дикого типа значительно увеличивают активность канала. Экспрессия K-Ras, как показано на рис. 5В, не влияла на ёмкость клеток.
K-Ras активирует ENaC через PI3-киназу. Ранее было показано, что Raf, RalGDS и PI3-киназа являются наиболее вероятными первичными эффекторами белков Ras, инициирующими MAPK 1/2, Ral/Rac/Rho/Rho-киназный и PI3 киназный сигнальные каскады, соответственно (8). Для исследования сигнальных механизмов активации ENaC мы использовали блокаторы различных потенциальных эффекторов малого G-белка K-Ras. На рис. приведены примеры записей токов и суммарные данные, полученные при использовании различных блокаторов. Предварительная обработка клеток CHO, трансфецированных ENaC и K-Ras, блокаторами MAPK (10 мкМ PD98059, 1-2 ч;
500 нМ U0126, 1-3 ч), Ral/Rac/Rho/Rho-киназы (500 нМ Y27632, 30-60 мин;
мкг/мл C3-экзоэнзима, включенного в пипеточный раствор) не влияла на уровень активности канала. Обработка клеток вортманнином (200 нМ), который при данной концентрации является селективным ингибитором PI3-киназы, вызывала значительное уменьшение активности ENaC.
Данные, показанные на рис. 7, также подтверждают наше предположение о том, что PI3-киназа вовлечена в активацию ENaC малым G-белком K-Ras и что в данном сигнальном каскаде эта киназа находится между малым G-белком и А C40 + вортманнин G12:G37 G12:C G12:E амил 1 нА 100 мс Б В ** * Плотность тока, пА/пФ Плотность тока, пА/пФ 300 ** 200 100 n= n=10 n= n=3 n=8 n=10 n= n= 0 ENaC C вортманнин C40 + + G12V:G + G12V:C + G12V:E + G12V ENaC Рис. 7. Постоянно активный мутант K-Ras (G12:C40), работающий исключительно через PI3-киназу, активирует ENaC. (А) Записи токов в клетках CHO, трансфецированных -, - и -ENaC и различными постоянно активными мутантами K-Ras, осуществляющими запуск специфических сигнальных каскадов.
Показана также запись тока в клетках, трансфецированных ENaC и мутантом G12:C40 K-Ras, обработанных блокатором PI3-киназы вортманнином. (Б) Графики для плотностей амилорид-чувствительных токов в клетках, трансфецированных отдельно ENaC, или вместе с постоянно активным K-Ras (G12V) или различными мутантами. (В) Графики для опытов с мутантом G12V:C40 до и после обработки вортманнином.
каналом. Нами были протестированы эффектор-специфические мутанты K-Ras (25), которые способны взаимодействовать исключительно с единственным первичным эффектором K-Ras и, таким образом, инициировать запуск только одного сигнального механизма. Специфический мутант K-Ras G12:E активирует только c-Raf киназу и, таким образом, запускает MAPK сигнальный механизм. Мутант G12:G37 активирует RalGDS и запускает Ral/Rac/Rho сигнальный каскад. Мутант G12:C40, в свою очередь, вовлечен только в PI3 киназный сигнальный путь. Как видно из рис. 7, только мутант G12:C активировал ENaC. Кроме того, эффект, вызванный одновременной экспрессией канала и мутанта G12:C40 блокировался при обработке клеток вортманнином.
Регуляция ENaC PI3-киназой в нативных клетках. Как показано в наших экспериментах в гетерологичной экспрессионной системе, существует прямая пространственно-временная связь между K-Ras, PI3-киназой и фосфолипидным продуктом этой киназы. PI(3,4,5)P3, по всей видимости, непосредственно связывается с каналом и увеличивает вероятность открытого состояния ENaC.
Для проверки этого предположения, влияние ингибирования PI3-киназы на нативный ENaC было протестировано в клетках из постоянных клеточных линий и в свежевыделенных клетках собирательных канальцев кортекса почки крысы.
Первоначально использовали мышиные поляризованные дифференцированные клетки mpkCCDc14, в которых ENaC обуславливает реабсорбцию Na+.
При ингибировании PI3-киназы с помощью LY294002 (50 мкМ) мы наблюдали значительное уменьшение PI(3,4,5)P3 в апикальной мембране.
Типичные фотографии флуоресцентных излучений от GFP-AktPH PI(3,4,5)P3 в апикальной плазматической мембране клетки mpkCCDc14 до (1) и после 5 (2) или 15 (3) мин обработки с LY294002 показаны на рис. 8А. Излучения были получены с помощью TIRF, что позволило нам регистрировать сигналы только с апикальной плазматической мембраны. Таким образом, эти значения отражают А Б В 1. Относ. уровень PI(3,4,5)P3 в апикальной мембране 1. 1. нормал 0.8 Контроль 0.8 Контроль LY LY303511 0. LY 0. scc 0. Ток 0.4 0. 0. 0. 0 1 2 3 0 2 4 6 8 10 12 Время, ч Время, мин Рис. 8. Изменения Na+-транспорта и активности параллельны изменениям уровня PI(3,4,5)P3 в апикальной плазматической мембране клеток mpkCCDc14.
(А) Фотографии показывающие флуоресцентные излучения от GFP-AktPH PI(3,4,5)P в апикальной плазматической мембране клетки mpkCCDc14, находящейся в пределах конфлюэнтного монослоя до (1) и после 5 (2) или 15 (3) мин обработки LY294002 ( мкМ). Данные значения отражают уровень PI(3,4,5)P3 в апикальной мембране. (Б) Уменьшения относительного уровня PI(3,4,5)P3 в апикальной плазматической мембране клеток mpkCCDc14 при обработке LY294002 (). Показаны также значения при использовании неактивного аналога LY303511 () и негативный контроль, в котором исследовали влияние LY294002 на уровень PI(4,5)P2 в таких же условиях (). (В) Изменения во времени относительного Na+-транспорта в ответ на ингибирование PI3-киназы с помощью LY294002.
уровень PI(3,4,5)P3 в апикальной мембране. На рис. 8Б показаны средние значения относительного уровня PI(3,4,5)P3 в апикальной плазматической мембране клеток mpkCCDc14 при обработке LY294002 (n=9). Значения откорректированы на незначительное уменьшение интенсивности свечения, вызванное выжиганием люминофора. На рис. 8В показаны результаты экспериментов, в которых измеряли трансэпителиальный ток через монослой клеток mpkCCDc14, выращенных на проницаемых подложках. Относительная реабсорбция натрия значительно уменьшилась (приблизительно на 60 %) в течение 15 мин после добавления LY294002 (50 мкМ) и достигла максимального уменьшения (~ 80 %) к 45 мин. В конце эксперимента к апикальной стороне был добавлен амилорид (10 мкМ) для того,чтобы убедиться в том, что ионный ток через монослой опосредован ENaC. Через 1-2 мин после добавления амилорида ток полностью ингибировался (не показано на рисунке). Таким образом, уменьшение натриевого транспорта через монослой клеток mpkCCDc14, вызванное блокированием PI3-киназы, происходит параллельно снижению уровня PI(3,4,5)P3 в апикальной мембране.
Для того, чтобы провести эксперименты на нативных клетках, мы изолировали собирательные трубочки почки крысы. После изолирования трубочки вскрывали с помощью микропипеток и, таким образом, имели доступ к апикальной плазматической мембране. Для регистрирации изменений в активности канала в реальном времени использовали метод пэтч-кламп. В условиях отведения токов от фрагмента плазматической мембраны неповрежденной клетки (конфигурация cell-attached) зарегистрировали активность ионных каналов в нормальных условиях при различных уровнях поддерживаемого потенциала в диапазоне от 0 до -60 мВ. Собирательные трубочки были изолированы из почек крыс, которые находились в течение семи суток на диете с низкой концентрацией натрия (0.01 %). Нами также были проведены опыты, в которых трубочки были изолированы из почек крыс, которые содержались на нормальной диете (0.32 % натрия). Вероятность открытого состояния (Po) в данной группе была значительно ниже. Кроме того, мы наблюдали меньшее количество активных каналов в экспериментах, сделанных на апикальной плазматической мембране в клетках, выделенных из А 0. контроль Po c 0. * 0. + вортманнин c 0. контроль + вортм 1 пА Б контроль 2 сек 0. Po c 0. 0. + LY * c 0. контроль В + LY контроль c Po 0. 0. + LY 0. c 0. контроль + iLY Рис. 9. Вероятность открытого состояния ENaC в апикальной мембране вскрытых изолированных собирательных канальцев кортекса крысы зависит от PI3-киназы. Записи токов в конфигурации cell-attached в контрольных условиях и после добавления LY294002 (А), вортманнина (Б) и LY303511 (В). Графики изменения вероятности открытого состояния и средние значения указаны справа от каждой группы экспериментов. Поддерживаемый на мембране потенциал –40 мВ.
крыс содержащихся на нормальной диете. При использовании крыс, содержащихся на недостаточной по Na+ диете, количество активных каналов и Po значительно возрастало.
На рис. 9 показаны типичные записи токов и графики уменьшения вероятности нахождения канала в открытом состоянии в нативных собирательных канальцах кортекса почек крыс до и после (5-10 мин) добавления 0.2 мкМ вортманнина, 50 мкМ LY294002 и 50 мкМ LY303511. Токи зарегистрированы с использованием конфигурации cell-attached в апикальной мембране клеток, изолированных из почек крыс, содержащихся на низкой натриевой диете. В этих экспериментах поддерживался мембранный потенциал 40 мВ и Po каналов регистрировали в течение всего эксперимента. Как видно из записей токов и средних значений Po, ингибирование PI3-киназы двумя химически разнородными блокаторами, вортманнином и LY294002, уменьшало значения Po нативного ENaC. Напротив, неактивный аналог LY294002, LY303511, давал незначительный эффект в этих условиях. Сходные результаты были получены в клетках mpkCCDc14. Полученные результаты демонстрируют, что ингибирование PI3-киназы в нативных клетках приводит к уменьшению Po активных каналов в апикальной мембране. Таким образом, исследование механизма регуляции ENaC PI3-киназой и PI(3,4,5)P3 продемонстрировало, что изменения вероятности открытого состояния опосредуют данное взаимодействие. Кроме того, нами показано, что этот сигнальный механизм играет значительную роль в регуляции канала в нативных клетках.
Регуляция ENaC малыми G-белками семейства Rho. Малые G-белки, входящие в семейство Rho, регулируют различные клеточные процессы, включая организацию цитоскелета, дифференцировку и пролиферацию клеток, а также участие в разнообразных сигнальных механизмах в дифференцированных клетках. Недавно было также показано, что малые G-белки, входящие в семейство Rho, модулируют активность нескольких классов ионных каналов.
RhoA увеличивает активность ENaC. Первоначально нами была поставлена задача определить роль RhoA в регуляции эндогенного ENaC в поляризованных эпителиальных клетках. Для экспериментов мы использовали эпителиальные клетки амфибий A6. Ранее было показано, что Na+ ток через монослой клеток A6 в основном определяется активностью ENaC. Для исследования роли RhoA в этих клетках мы использовали проницаемый через клеточную мембрану химерный энзим C3 (C2IN-C3), прикрепленный к токсину C2 из C. botulinum, который помогает энзиму проникать через плазматическую мембрану (26). Блокирование эндогенного RhoA в клетках A6 значительно уменьшает реабсорбцию Na+.
Как видно на примере исследования механизмов регуляции ENaC малым G-белком K-Ras, нами налажены и успешно используются электрофизиологические измерения активности канала, экспрессированного в клетки CHO в присутствии других белков. Для исследования регуляции ENaC белками, входящими в семейство Rho, мы продолжили использовать эту методику. На рис. 10 показаны примеры записей тока и средние значения плотности амилорид-чувствительного тока в клетках CHO, трансфецированных только с ENaC или одновременно экспрессирующих ENaC и RhoA дикого типа, постоянно активный (G14V) или доминантно негативный (T19N) мутанты. Для оценки активности каналов регистрировали макроскопические токи, вызываемые короткими (500 мс) тестирующими импульсами потенциала от поддерживаемого потенциала в 30 мВ до 100 мВ в сторону положительных потенциалов и до -120 мВ – в сторону отрицательных, с шагом в 20 мВ.
Активность ENaC измеряли как отношение величины амилорид- А. hENaC + амил чувствительного интегрального тока при -80 мВ к ёмкости клетки (плотность + RhoA + амил G14V тока). Постоянно активный RhoA и малый G-белок дикого типа значительно увеличивают активность + RhoA G14V канала. Доминантно негативный мутант + амил T19N RhoA, в свою очередь, значительно уменьшал амилорид-чувствительный ток через ENaC. Нами были также + RhoA T19N + амил протестированы эффекты двух других 200 мс 2 нА белков, входящих в семейство Rho.
Б.
Дикий тип и постоянно активный (QL) * Плотность тока (пА/пФ) Rac1, также как и RhoA, значительно * увеличивает активность ENaC, когда совместно экспрессирован в клетках CHO. Однако ни дикий тип Cdc42, ни постоянно активный мутант (G12V) не * n=11 n=8 n= n= оказывали влияния на активность hENaC +RhoA +G14V +T19N канала. Таким образом, эффект малых Рис. 10. RhoA активирует ENaC. (А) G-белков в семействе Rho является Типичные записи макроскопических токов в клетках CHO до и после подачи специфическим.
амилорида. (Б) Плотность амилорид RhoA активирует ENaC чувствительных токов при -80 мВ в клетках CHO, экспрессирующих либо последовательно через Rho-киназу и только ENaC, либо ENaC совместно с PI(4)P 5-киназу. Для тестирования RhoA дикого типа или соответствующим мутантом.
возможных сигнальных путей, * Рис. 11. Влияние * экспрессии Rho- или * PI(4)P 5-киназ на Плотность тока (пА/пФ) * * активность ENaC.
Плотность амилорид чувствительного тока, измеренная в клетках CHO отдельно для ENaC и для ENaC, экспрессированного в сочетании с постоянно активным (G14V) или доминантно негативным n=9 n=13 n=11 n=12 n=12 n=15 n=12 n= (T19N) RhoA и их эффекторами в различных комбинациях.
ENaC + Rho-K DN + PI(4)P5-K + Rho-K DN + Rho-K DN + RhoAT19N + RhoAG14V + PI(4)P5-K + PI(4)P 5-K + RhoAT19N + Rho-K CA + Rho-K CA участвующих в активации ENaC малым G-белком RhoA, были проведены серии экспериментов с использованием ингибиторов MAPK, PI3-киназы и Rho-киназы. Только блокатор Rho-киназы (Y27632;
1 мкМ) значительно уменьшил влияние RhoA на активность ENaC. Предварительная обработка клеток CHO, трансфецированных ENaC и RhoA, блокаторами MAPK PD98059 (10 мкМ) или PI3-киназы (LY294002, 50 мкМ;
вортманнин, 200 нМ) не влияла на увеличение уровня активности ENaC, вызванного RhoA.
Одновременная экспрессия ENaC и постоянно активной Rho-киназы также приводит к значительной активации ENaC (рис. 11). Доминантно негативная Rho-киназа (Rho-K DN) не оказывает влияния на активность ENaC.
Эксперименты с одновременной экспрессией ENaC и постоянно активными (G14V) или доминантно негативными (T19N) мутантами RhoA совместно с Rho K DN и Rho-K CA указывают на то, что RhoA является эффектором Rho-киназы и что Rho-киназа требуется для активации ENaC малым G-белком RhoA. Из литературных данных известно, что Rho-белки и Rho-киназа являются активаторами PI(4)P 5-киназы, которая необходима для синтеза PI(4,5)P2.
Поэтому наряду с Rho-киназой мы протестировали PI(4)P 5-киназу. PI(4)P 5 киназа также значительно активировала ENaC (рис. 11). Сходные эксперименты были проведены с одновременной экспрессией канала в присутствии PI(4)P 5 киназы и доминантно негативных RhoA и Rho-киназы. Таким образом, RhoA, по A Рис. 12. RhoA увеличивает ENaC ENaC ENaC контр ENaC +RhoA +T19N +G14V уровень ENaC на плазматической мембране.
(А) Иммуноблоттинг фракции, плазматической мембраны (М) и общего клеточного лизата (О) клеток CHO, экспрессирующих GFP O (контр) и myc-меченые M O M O M O M M O субъединицы ENaC отдельно Б * * или в присутствии RhoA дикого типа, или доминантно % в мембране негативного (T19N), или постоянно активного (G14V) мутантов. (Б) Выраженная в процентах доля мембранной n=6 фракции относительно n=7 n= n= 0 общего клеточного лизата для ENaC ENaC ENaC ENaC клеток CHO, +Rho A +T19N G14V экспрессирующих ENaC всей видимости, активирует ENaC отдельно и с RhoA дикого типа или мутантами.
последовательно через Rho- и PI(4)P 5-киназы.
RhoA увеличивает количество ENaC в плазматической мембране.
Следующая серия экспериментов была посвящена выяснению механизмов действия RhoA на ENaC. На рис. 12А представлены данные типичного эксперимента, показывающие распределение ENaC в мембранной фракции относительно количества ENaC в общем клеточном лизате в клетках, трансфецированных только GFP (контроль), а также в клетках, экспрессирующих ENaC (ENaC) и ENaC совместно с RhoA дикого типа (+RhoA) или доминантно негативным (+T19N) или постоянно активным (+G14V) мутантами. Выявление ENaC производили моноклональными анти-myc антителами. Как показано на рис. 12Б, одновременная экспрессия канала с RhoA дикого типа или постоянно активным мутантном привела к значительному увеличению уровня ENaC в плазматической мембране. В том случае, когда мы использовали K-Ras вместо RhoA, увеличения мембранной фракции канала не наблюдали. Полученные данные позволяют предположить, что RhoA увеличивает активность ENaC за счет увеличения количества функционально активных каналов в плазматической мембране.
Увеличение количества каналов на плазматической мембране может быть как результатом увеличения транслокации каналов к мембране, так и снижением А. Б. ENaC + RhoAG14V ENaC eCFP-m + RhoAG14V контроль отмывка Y eCFP-m Относит. уровень ENaC на мембране 2. 2.2 отмывка eYFP-ENaC Y + RhoAG14V 2. 1. 1. eCFP-m 1. + RhoAG14V 1. 1. 0. 0 10 20 30 Время (мин) Рис 13. Активация Rho сигнального пути приводит к быстрому увеличению транслокации и встраивания ENaC в плазматическую мембрану. (А) Микрофотографии клеток Cos-7, трансфецированных RhoA и либо eYFP-ENaC, либо мембранным маркером eCFP-m. Показана флуоресценция YFP (514 нм;
верхние фотографии) и CFP (442 нм;
нижние фотографии) на плазматической мембране до и после отмывки блокатора Rho-киназы Y-27632 (1 мкМ). Для регистрации сигнала с плазматической мембраны использовали TIRF. (Б) Графики, иллюстрирующие изменение во времени интенсивности флуоресценции для клеток Cos-7, трансфецированных либо отдельно YFP-ENaC, либо с постоянно активным RhoA. Показаны также значения для eCFP как в присутствии, так и в отсутствие RhoA.
скорости интернализации ENaC с плазматической мембраны, опосредованной эндоцитозом (27,28). Первоначально были проведены исследования некоторых белков, вовлеченных в эндоцитоз. Были протестированы влияния эпсина, доминантно негативного динамина (K44A) и Nedd4-2 на активность ENaC, экспрессированного в клетки CHO. Эпсин и Nedd4-2 значительно уменьшают активность ENaC посредством эндоцитоза. В отличие от эпсина и Nedd4-2, доминантно негативный динамин значительно увеличивает активность канала.
При одновременной экспрессии RhoA и доминантно негативного динамина (K44A) мы наблюдали совокупный эффект. Плотность амилорид чувствительного тока в клетках, экспрессирующих одновременно ENaC, RhoA и K44A, была значительно выше, чем при экспрессии ENaC отдельно с RhoA или K44A. Таким образом, мы можем предположить, что RhoA увеличивает активность ENaC через механизм, не зависящий от динамина, возможно посредством ускорения трафика к плазматической мембране.
Активация RhoA способствует быстрой транслокации и встраиванию ENaC в плазматическую мембрану. Для того чтобы оценить процесс транслокации ENaC на плазматическую мембрану клеток в реальном времени, использовали TIRF микроскопию. Для экспериментов по изучению транслокации субъединиц ENaC на мембрану, клетки Cos-7 были трансфецированы YFP-связанными субъединицами ENaC и мембранным маркером CFP-m в в отсутствие или присутствии постоянно активного RhoA.
Клетки были предварительно обработаны в течение 30-40 мин ингибитором Rho киназы Y27632 (1 мкМ), который в данной концентрации блокирует активацию ENaC малым G-белком RhoA. Транслокацию и встраивание ENaC в плазматическую мембрану регистрировали с момента начала отмывки блокатора. На рис. 13А приведены изображения клеток Cos-7, трансфецированных YFP-мечеными субъединицами ENaC и мембранным RhoAG14V.
маркером CFP-m в присутствии На фотографиях показана флуоресценция сигнала YFP и CFP, зарегистрированная на плазматической мембране клетки Cos-7 до и после активации Rho-зависимого сигнального механизма, вызванного отмывкой Y27632. На рис. 13Б приведены графики, суммирующие изменение во времени относительной интенсивности флуоресценции для клеток Cos-7, трансфецированных либо отдельно YFP субъединицами ENaC, либо в сочетании с постоянно активным RhoA в течение 40 мин после отмывки Y27632. Показаны также контрольные значения для мембранного маркера CFP-m в отсутствие или в присутствии постоянно активного RhoA. Таким образом, активация Rho-каскада значительно ускоряет транслокацию и встраивание ENaC в плазматическую мембрану клеток (рис.
13). Брефельдин А, который является ингибитором трафика белков, устраняет транслокацию ENaC к плазматической мембране в ответ на активацию Rho каскада, вызванного отмывкой Y27632.
Для того, чтобы непосредственно исследовать эффект RhoA в живых клетках, мы использовали комбинацию TIRF и FRAP. FRAP применяется для исследования подвижности биоорганических молекул посредством инициации фотохимического разложения флуорохрома в зоне облучения и последующего его рассоединения с молекулами. После выжигания молекулы с флуорохромом из необлученной зоны движутся вследствие диффузии в облученную зону образца. По времени нарастания в ней флуоресценции можно судить о подвижности молекул. Так как этот метод впервые применялся для анализа интегральных мембранных белков, нами были проведены несколько серий контрольных экспериментов.
Если предположить, что мембранный маркер eYFP-M имеет равномерное распределение и свободно перемещается, тогда восстановление репортера после выжигания с иллюминацией TIRF должно в основном отражать латеральную диффузию не выжженных маркеров от регионов, расположенных рядом с плазматической мембраной. Напротив, если движение субъединиц ENaC ограничено, тогда восстановление свечения флуорофора в области плазматической мембраны должно отражать передвижение и встраивание канала в плазматическую мембрану. На рис. 14А показаны флуоресцентные до 10 сек после 30 мин после A.
eYFP-M eYFP-ENaC Б.
Относительная интенсивность eYFP-M флуоресценции 0. eYFP-ENaC 0. до 10 сек 1 мин 2 мин 5 мин 30 мин Рис. 14. Измерение трафика ENaC к плазматической мембране с помощью TIRF/FRAP микроскопии. (А) Флуоресцентные микрофотографии клеток Cos-7, экспрессирующих мембранный маркер eYFP-M и eYFP-меченые субъединицы ENaC до выжигания YFP с помощью TIRF иллюминации, 10 с и 30 мин после выжигания. Шкала – 8 мкМ. (Б) Флуоресцентные излучения через участки клеток (показаны пунктирными линиями на рисунке А) до выжигания и через 10 с, 1, 2, 5 и 30 мин после выжигания.
A. Б. В.
eYFP-ENaC * 0. Относит. FRAPt = 30 мин + RhoA 0. 2. Относит. FRAP 0. Tau (минут) 0. 2. 0. 0.4 1. eYFP-ENaC n = 19 n = 0. 0.2 1. ENaC + RhoA ENaC + RhoA 0 5 10 15 20 25 Время, мин Рис. 15. RhoA усиливает движение ENaC к плазматической мембране. (А) Средние значения изменения во времени восстановления после выжигания в клетках, экспрессирующих только eYFP-ENaC и eYFP-ENaC совместно с постоянно активным RhoA. Излучения были зарегистрированы с помощью TIRF. (Б) Средние значения восстановления через 30 мин после выжигания для ENaC и ENaC + RhoA.(В) Средние значения времени необходимого для увеличения флуоресценции в клетках, экспрессированных ENaC отдельно и в присутствии RhoA.
фотографии клеток Cos-7, экспрессирующих мембранный маркер eYFP-M или YFP-меченые субъединицы ENaC. Наблюдения велись с помощью метода TIRF.
Изображения получены непосредственно до выжигания с иллюминацией TIRF и спустя 10 с или 30 мин после него. Восстановление свечения после выжигания присутствует в обоих случаях. Однако, в случае с мембранным маркером сначала происходит восстановление по краям клетки. В отличие от eYFP-M, ENaC равномерно распределяется по всей клетке. Разница в распределении eYFP-M и ENaC более четко прослеживается на рис. 14Б, на котором показаны относительные значения флуоресцентной интенсивности сигнала через определенные участки клеток (показаны пунктирными линиями на рис. 14А).
Таким образом, как видно из данных экспериментов, восстановление свечения мембранного маркера после выжигания вызвано его латеральной диффузией, а ENaC – встраиванием новых каналов.
Для исследования механизма действия RhoA на канал клетки Cos-7 были экспрессированы только с субъединицами ENaC или совместно с постоянно активным RhoAG14V. На рис. 15А показаны средние значения изменения во времени восстановления свечения после выжигания в клетках, экспрессирующих с RhoAG14V. Значения только eYFP-ENaC, или eYFP-ENaC совместно интенсивности флуоресценции были нормированы по отношению к интенсивностям излучения до выжигания. На рис. 15Б и В показаны средние значения восстановления свечения после выжигания для ENaC и ENaC + RhoA (через 30 мин) и времени необходимого для увеличения флуоресценции в клетках, экспрессированных ENaC отдельно и в присутствии RhoA. Как видно из рисунка, восстановление ENaC в присутствии RhoAG14V было значительно больше и быстрее, чем в отсутствие малого G-белка.
RhoA и K-Ras независимо влияют на активность ENaC, действуя через параллельные сигнальные пути. На рис. 16 показаны типичные записи интегральных токов до и после добавления амилорида в клетках CHO, трансфецированных -, - и -ENaC отдельно или в присутствии постоянно активных RhoAG14V или K-RasG12V по отдельности или вместе. Для этих экспериментов плазмиды, кодирующие малые G-белки, были трансфецированы насыщающими количествами (1 мкг) ДНК (рис. 16 Г и Д). На рис. 16Б показано как оба малых G-белка значительно увеличивали активность ENaC. Кроме того, ** А. Б. В.
1000 K-Ras ENaC Конт RhoA RhoA Плотность тока * RhoA K-RasG12V + * (пА/пФ) K-Ras 400 Конт K-Ras RhoA 200 K-Ras + RhoAG14V n = 11 n = 12 n = 11 n = ENaC +K-RasG12V +RhoAG14V +RhoAG14V +K-RasG12V Г. Д.
+ K-RasG12V - 0.1 0.3 0.5 1.0 2. + RhoAG14V Плотоность тока Плотность тока RhoA 400 400 - 0.1 0.3 0.5 1.0 2. 2 нА K-Ras 100 мс 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2. RhoAG14V (мкг) K-RasG12V (мкг) Рис. 16. RhoA и K-Ras независимо влияют на активность ENaC. (А) Типичные записи макроскопических токов до и после амилорида в клетках CHO, трансфецированных -, - и -ENaC отдельно или в присутствии постоянно активных RhoAG14V или K-RasG12V (1 мкг кДНК) по отдельности или вместе. (Б) Плотность амилорид-чувствительных токов в клетках, трансфецированных только ENaC или совместно с малыми G-белками. (В) Вестерн-блоты, содержащие лизаты контрольных клеток и клеток, трансфецированных HA-мечеными K-RasG12V и myc мечеными RhoAG14V отдельно или вместе. (Г) Средние значения плотности амилорид-чувствительного тока в клетках CHO, трансфецированных ENaC и различным количеством K-RasG12V и RhoAG14V кДНК. (Д) Соответствующие Вестерн-блоты клеток, трансфецированных различными количествами HA-меченых K-RasG12V и myc-меченых RhoAG14V.
** ENaC Плотность тока (пА/пФ) ENaC + Rab n=34 n=31 n=14 n=38 n=11 n=10 n=10 n= ENaC +Arf- +Rab +Rab11a +Rab5Q79L +Rab3a +Rab +Rab27a 1 нА 100 мс Рис. 17. Rab11a и Rab3a увеличивают активность ENaC. (A) Примеры записей токов в клетках, экспрессирующих -, - и -ENaC отдельно и совместно с Rab11a.
(B) Плотность амилорид-чувствительных токов в клетках, трансфецированных ENaC отдельно и совместно с соответствующими малыми G-белками.
когда RhoA и K-Ras были экспрессированы вместе, наблюдался кумулятивный эффект. На рис. 16В показаны типичные Вестерн-блоты демонстрирующие уровень экспрессии экзогенного K-RasG12V и RhoAG14V. Таким образом, RhoA и K-Ras независимо влияют на активность ENaC, действуя через параллельные сигнальные пути.
Регуляция ENaC малыми G-белками семейства Rab. Наши недавние исследования показали, что различные изоформы малых G-белков, входящих в семейство Rab, физически взаимодействуют и (или) модулируют активность некоторых эпителиальных ионных каналов. Нами была поставлена задача идентифицировать малые G-белки в семействе Rab, вовлеченные в регуляцию ENaC, и охарактеризовать механизмы их действия. Исследование было сфокусировано на нескольких типичных малых G-белках, входящих в семейство Rab, которые представляют потенциальный интерес как регуляторы активности каналов в эпителиальных клетках почки. Так, Rab11a известен как участник регуляции трафика различных белков. Rab3 вовлечен в Ca2+-зависимый экзоцитоз. Rab5 присутствует на ранних эндосомах и регулирует ранние стадии эндоцитоза. Rab38 – это новый член данного семейства, который регулирует внутриклеточный транспорт и может быть вовлечен в развитие различных болезней почек. Rab27a и их эффекторы играют роль в экзоцитозе. Белки Arf Рис. 18. Различные влияния Брефельдина А на отдельно Плотность тока (пА/пФ) 600 ENaC и в сочетании с Rab11a.
Плотность амилорид чувствительного тока в клетках * CHO, трансфецированных ENaC отдельно и совместно с 300 Rab11a, не обработанных и обработанных БФА.
* 150 принадлежат к подсемейству * Sar1/Arf малых G-белков и n=21 n=16 n=7 n=12 n=10 n= регулируют почкование ENaC +БФА (24 ч) +БФА (24 ч) +БФА (2 ч) +БФА (2 ч) +Rab11a везикул.
Нами были идентифицированы два белка, влияющих на активность ENaC. Rab11a и Rab3a значительно увеличивали плотность амилорид-чувствительного тока в том случае, когда были экспрессированы совместно с ENaC в клетках CHO. На рис.
17 показаны записи токов и средние значения активности канала в клетках, трансфецированных ENaC отдельно и совместно с соответствующими малыми G-белками. В отличие от Rab11a и Rab3a, другие исследованные Rab белки не оказывали влияния на активность канала.
Механизм регуляции ENaC малым G-белком Rab11a. При использовании различных ингибиторов нами не были установлены сигнальные пути регуляции ENaC малым G-белком Rab11a. При одновременной экспрессии Rab11a и доминантно негативного мутанта динамина K44A мы наблюдали кумулятивный эффект. Таким образом, мы можем предположить, что Rab11a увеличивает активность ENaC через механизм, не зависящий от динамина, возможно посредством ускорения трафика к плазматической мембране. Активность ENaC не увеличивалась при одновременной экспресси Rab11a и SGK1 (Serum and glucocorticoid regulated kinase 1). Основываясь на этих результатах мы можем предположить, что SGK1 может быть вовлечена в Rab11a-зависимую регуляцию ENaC.
Для того, чтобы исследовать, опосредуется ли стимулирующее влияние Rab11a на активность ENaC через пути, регулирующие внутриклеточную транслокацию белков, мы обработали клетки, экспрессирующие либо отдельно канал, либо ENaC совместно с Rab11a, брефельдином А (БФА). БФА (5 мкг/мл) значительно снижал активность ENaC через 24 ч после обработки как в клетках, экспрессирующих только ENaC, так и в клетках, трансфецированных также Rab11a (рис. 18). Напротив, при разрушении эндомембраных систем при помощи БФА за 2 ч, плотность тока уменьшалась только в клетках, одновременно экспрессирующих ENaC и Rab11a. Таким образом, БФА, который блокирует трафик, уменьшает Rab11a-зависимое движение ENaC к плазматической мембране. Нами также показано, что ENaC колокализуется с Rab11a как в цитозольной, так и в мембранной фракциях.
Молекулярные механизмы PI(3,4,5)P3 и PI(4,5)P2 регуляции ENaC.
Фосфатидилинозитиды вовлечены в различные внутриклеточные каскады, включая сигнальные пути, приводящие к изменению активности ионных каналов. Во многих случаях фосфатидилинозитиды непосредственно связываются с ионными каналами, влияя на воротные свойства и, таким образом, на активность каналов. Нами было показано, что как PI(3,4,5)P3, так и PI(4,5)P вовлечены в регуляцию ENaC малыми G-белками. Связывание и прямая активация ионных каналов фосфатидилинозитидами имеет высокое физиологическое и патофизиологическое значение, так как разрушение связывания может приводить к различным болезням, таким как синдром Андерсена-Тэвила, Бартера, QT-синдром или врожденный гиперинсулинизм (29 31). Чтобы лучше понять молекулярные механизмы регуляции ENaC фосфатидилинозитидами, нами были произведены серии экспериментов по исследованию влияния PI(3,4,5)P3 и PI(4,5)P2 как на нормальный ENaC, так и на канал, в котором были проведены замены/делеции некоторых регионов, которые могут быть потенциально ответственны за данную регуляцию.
Механизмы PI(3,4,5)P3 регуляции ENaC. Каждая из трёх субъединиц ENaC содержит трансмембранные домены TM1 и TM2, которые имеют в своем составе кластеры повторяющихся у разных видов субъединиц положительно заряженных аминокислотных остатков. Кроме того, - и -субъединицы ENaC имеют консервативные кластеры в составе цитозольных N- и C-концов. Мы начали исследование молекулярных механизмов регуляции ENaC фосфоинозитидами с того, что охарактеризовали мутантные каналы, содержащие либо замены, либо удаления консервативных аминокислотных последовательностей. Для этого были созданы и протестированы 12 мутантов мышиного ENaC: (1) три -ENaC, включая R98-K108 (1D) и R614-R630 (2D) делеции и R98A + K103A (1S) замещения;
(2) четыре -ENaC, включая K4-K (ND), K39-K49 (1D) и K552-R563 (2D) делеции и K39A + R40A (1S) замещения;
и (3) пять -ENaC, включая R42-R53 (1D) и Q573-R583 (2D) делеции и K6A + K8A + K10A + K12A + K13A (NS), R42A + R43A (1S) и R569A + R570A + K574A + K576A + R581A + R582A + R583A (2S) замещения.
Семь из двенадцати мутантов формировали активный канал (рис. 19).
Ранее нами было показано, что регуляция ENaC малым G-белком K-Ras опосредована действием PI3-киназы и что продукт этой киназы, PI(3,4,5)P3, увеличивает вероятность открытого состояния канала. Чтобы протестировать, как мутантные ENaC субъединицы отвечают на стимуляцию PI3-киназы, мы экспрессировали в клетках CHO мутантные субъединицы одновременно с комплементарными субъединицами дикого типа в отсутствие и в присутствии постоянно активной PI3-киназы. Для лучшего понимания механизмов регуляции PI3-киназой и А. Б. Плотность тока (пА/пФ) PI(3,4,5)P3 были 0 100 200 TM1 TM проведены измерения ENaC активности каналов на но, 1D но, 1S уровне регистрации 2D * унитарных токов. На ND 1D но, рис. 20А-Г показаны 1S но, 2D влияния экзогенного NS PI(3,4,5)P3 на 1D но, 1S вероятность открытого 2D * 2S состояния (Po) ENaC для Рис. 19. Мутанты ENaC, использованные для тестирования регуляции канала фосфоинозитидами. (А) Схема, демонстрирующая ENaC дикого типа (ENaC) и мутанты -, - и -субъединиц ENaC. Относительное распределение позиций, в которых были проведены удаления (показано черными квадратами) или замещения аминокислот (черные линии), показаны для всех мутаций. (Б) Средние значения плотности тока для ENaC дикого типа и соответствующих мутантов, зарегистрированные при экспрессии соответствующих субъединиц в клетках CHO;
но – значения не определены.
А. Б. В. Г.
2D 2S 2D wt 1.0 1.0 1. 1. 0.8 0.8 0. * 0. * Po Po Po Po 0. 0.6 0. 0. 0. 0.4 0. 0. 0. 0.2 0. 0. 0. 0.0 0. 0. контроль +PIP контроль +PIP3 контроль +PIP контроль +PIP Д. Е. Ж. З.
1.0 1. 1. 1. * 0.8 0. 0. * 0. Po Po Po Po 0. 0.6 0. 0. 0. 0.4 0. 0. 0.2 0. 0.2 0. 17 8 15 9 6 11 0. 0.0 0.0 0. 2S 2D 2D + PI3-K + PI3-K ENaC + PI3-K + PI3-K Рис. 20. Положительно заряженные аминокислотные последовательности непосредственно после TM1 и TM2 в - и -ENaC необходимы для регуляции канала PI3-киназой и PI(3,4,5)P3. Средние значения влияния PI(3,4,5)P3 на Po для ENaC, экспрессированного в клетках CHO и содержащего все три субъединицы дикого типа (А) или мутантные субъединицы в присутствии комплементарных двух других субъединиц ENaC (Б-Г). Д-З Средние значения Po для ENaC, экспрессированного в клетки CHO в отсутствие или в присутствии постоянно активной PI3-киназы.
дикого типа (ENaC) и каналов, содержащих либо 2D, либо 2D или 2S мутации. Изменения Po после добавления PI(3,4,5)P3 были подсчитаны в парных экспериментах. Каналы, состоящие из субъединиц только дикого типа и каналы содержащие мутант 2D, значительно активировались при добавлении PI(3,4,5)P3. Напротив, когда каналы содержали мутанты 2D или 2S, влияния PI(3,4,5)P3 на Po не наблюдали. Полученные результаты полностью согласуются с измерениями интегральных токов в клетках, экспрессирующих ENaC (дикого типа и мутанты) и PI3-киназу и значениями Po для ENaC (дикого типа и мутантов) в отсутствие и в присутствии PI3-киназы, приведенными на рис. 20Д З. На этих графиках показаны средние значения, подсчитанные в непарных outside-out экспериментах. Таким образом, полученные нами данные демонстрируют важность консервативных положительно заряженных последовательностей непосредственно после TM2 в - и -ENaC в регуляции PI3-киназой, и, соответственно PI(3,4,5)P3.
Механизмы PI(4,5)P2 регуляции ENaC. Нами также было показано, что увеличение активности ENaC RhoA вызвано влиянием PI(4,5)P2 на канал. После А. Б.
ENaC PI(4,5)P2 PI(4,5)P 1пА 1пА 40с 40с 2с 2с В. Г.
до до до +PI(4,5)P +PI(4,5)P Рис. 21. Положительно заряженные аминокислоты в N-конце - и -субъединиц необходимы для PI(4,5)P2 регуляции ENaC. (А, Б) Типичные записи токов в конфигурации inside-out в клетках CHO, экспрессирующих ENaC дикого типа (А) или NS + ND мутанты (Б) до и после добавления PI(4,5)P2 (20 мкМ). Потенциал на мембране -60 мВ. Показаны также примеры записей токов в увеличенном масштабе до затухания активности (1), непосредственно до (2) и после (3) добавления PI(4,5)P2. (В, Г) Средние значения Po до и после добавления PI(4,5)P для ENaC дикого типа и мутантов NS + ND.
того как были идентифицированы участки, необходимые для регуляции ENaC PI3-киназой и PI(3,4,5)P3, роль консервативных участков в PI(4,5)P2 регуляции канала была также исследована.
Прямое влияние экзогенного PI(4,5)P2 на вероятность нахождения ENaC в открытом состоянии были исследованы в парных экспериментах при использовании конфигурации inside-out метода пэтч-кламп. Результаты, полученные в этой серии экспериментов, показаны на рис. 21. Как и ожидалось, активность канала быстро уменьшалась при отрыве фрагмента мембраны от клетки. Известно, что такое уменьшение активности при измерениях в конфигурации inside-out характерно как для каналов ENaC, так и для некоторых других каналов (32-34). В наших экспериментах, добавление PI(4,5)P2 (20 мкМ) к внутриклеточной стороне плазматической мембраны быстро восстанавливало активность ENaC дикого типа (рис. 21 А, В). Напротив, каналы, содержащие мутанты NS и ND, не реагировали на добавление экзогенного PI(4,5)P2. На рис. 21Б и Г показаны типичный Рис. 22. Схема регуляции ENaC малыми G пример такого эксперимента и белками K-Ras, Rab11 и RhoA.
средние значения для проведенной нами серии опытов. Таким образом, полученные результаты ENaC согласуются с идеей, что участки в N-конце - и -ENaC играют роль в регуляции канала PIP PI(4,5)P2.
N Po N PI(4)P5-киназа PI3-киназа ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате Rho-киназа выполненной работы достигнуты значительные успехи в понимании механизмов регуляции эпителиальных натриевых каналов малыми G-белками и фосфатидилинозитидами. ENaC, наряду с другими ионными каналами, является конечной мишенью для малых G-белков и ассоциированных с ними сигнальных каскадов. Малые G-белки воздействуют как на воротные свойства ENaC, так и на количество активных каналов в плазматической мембране. При этом, как минимум в нескольких случаях фосфатидилинозитиды вовлечены в регуляцию канала опосредованную малыми G-белками. На рис. 22 показана предполагаемая модель регуляции ENaC малыми G-белками K-Ras, RhoА и Rab11. K-Ras, через PI3-киназу и PI(3,4,5)P3, влияет на вероятность открытого состояния канала.
RhoA и Rab11 участвуют в транслокации канала к плазматической мембране.
Показано, что и другие малые G-белки вовлечены в изменение активности ENaC, и их влияние на канал специфично. Таким образом, накоплен достаточный экспериментальный материал показывающий, что регуляция эпителиального Na+ канала малыми G-белками и фосфатидилинозитидами широко распространена и играет физиологическую роль в поддержании ENaC опосредованного Na+-гомеостаза.
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что ENaC состоит из равного количества субъединиц с относительной стехиометрией 1:1:1. На основе протон-чувстительного канала, принадлежащего к тому же семейству, смоделирована структура ENaC как гетеротримера и показаны потенциально важные для физиологической регуляции домены в субъединицах ENaC.
2. Количество функциональных каналов в плазматической мембране и активность ENaC регулируются малыми G-белками, входящими в семейства Ras, Rho и Rab. Механизмы активации и сигнальные каскады, вовлеченные в модулирование канала малыми G-белками, различны.
3. Активность ENaC регулируется малым G-белком K-Ras через PI3-киназу и соответствующее увеличение уровня PI(3,4,5)P3. Вероятность открытого состояния канала зависит от уровня фосфатидилинозитида.
4. Встраивание новых каналов в плазматическую мембрану осуществляется при участии малых G-белков RhoA и Rab11a. При этом RhoA влияет на ENaC последовательно через Rho-киназу, PI(4)P 5-киназу и фосфатидилинозитид PI(4,5)P2. Rab11a колокализуется с субъединицами ENaC и, по всей видимости, участвует в транслокации канала к плазматической мембране через механизм, опосредованный SGK1.
5. Положительно заряженные аминокислоты непосредственно после TM2 в - и -ENaC вовлечены в регуляцию PI3-киназой и, соответственно, PI(3,4,5)P3.
Увеличение активности канала, вызванное одновременной экспрессией PI3 киназы или добавлением PI(3,4,5)P3, зависит от консервативных регионов в и -субъединицах ENaC. Консервативный регион в N-конце - и -ENaC вовлечен, в свою очередь, в регуляцию канала PI(4,5)P2.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Staruschenko A., Patel P., Tong Q., Medina J.L., Stockand J.D. 2004. Ras activates the epithelial Na+ channel (ENaC) through phosphoinositide 3-OH kinase (PI3-K) signaling.
Journal of Biological Chemistry. 279(36): 37771-37778.
2. Staruschenko A., Nichols A., Medina J.L., Camacho P., Zheleznova N.N., Stockand J.D.
2004. Rho small GTPases activate the epithelial Na+ channel. Journal of Biological Chemistry. 279(48): 49989-49994.
3. Staruschenko A., Medina J.L., Patel P., Shapiro M.S., Booth R.E., Stockand J.D. 2004.
Fluorescence resonance energy transfer analysis of subunit stoichiometry of the epithelial Na+ channel. Journal of Biological Chemistry. 279(26): 27729-27734.
4. Staruschenko A., Pochynyuk O.M., Tong Q., Stockand J.D. 2005. Ras couples phosphoinositide 3-OH kinase to the epithelial Na+ channel. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1669(2): 108-115.
5. Staruschenko A., Adams E., Both R.E., Stockand J.D. 2005. Epithelial Na+ channel subunit stoichiometry. Biophysical Journal. 88(6): 3966-3975.
6. Pochynyuk O., Staruschenko A., Tong Q., Medina J., Stockand J.D. 2005. Identification of a functional phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate binding site in the epithelial Na+ channel. Journal of Biological Chemistry. 280(45): 37565-37571.
7. Staruschenko A., Pochynyuk O., Stockand J.D. 2005. Regulation of epithelial Na+ channel activity by conserved serine/threonine switches within sorting signals. Journal of Biological Chemistry. 280(47): 39161-39167.
8. Staruschenko A., Booth R.E., Pochynyuk O., Stockand J.D. Tong Q. 2006. Functional reconstitution of the human epithelial Na+ channel (ENaC) in a mammalian expression system. From: Methods in Molecular Biology, Ion Channels: Methods and Protocols.
Humana Press Inc., Totowa, NJ. 337: 3-13.
9. Pochynyuk O., Tong Q., Staruschenko A., Ma H.P., Stockand J.D. 2006. Regulation of the epithelial Na+ channel (ENaC) by phosphatidylinositides. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 290(5): F949-F957.
10. Починюк О.M., Железнова Н.Н., Медина Дж.Л., Стокканд Дж.Д., Старущенко А.В. 2006. Регуляция эпителиальных натриевых каналов (ENaC) малыми G белками. Биологические Мембраны. 23: 327-338.
11. Pochynyuk O., Medina J.L., Gamper N., Genth H., Stockand J.D., Staruschenko A. 2006.
Rapid translocation and insertion of the epithelial Na+ channel in response to RhoA signaling. Journal of Biological Chemistry. 281(36): 26520-26527.
12. Pochynyuk O., Tong Q., Staruschenko A., Stockand J.D. 2007. Binding and direct activation of the epithelial Na+ channel (ENaC) by phosphatidylinositides. Journal of Physiology. 580(2): 365-372.
13. Staruschenko A., Dorofeeva N.A., Bolshakov K.V., Stockand J.D. 2007. Differential effects of Cd2+ and Ni2+ on distinct acid-sensing ion channel (ASIC) isoforms.
Developmental Neurobiology. 67(1): 97-107.
14. Pochynyuk* O., Staruschenko* A., Bugay V., LaGrange L., Stockand J.D. 2007.
Quantifying RhoA facilitated trafficking of ENaC to the plasma membrane with TIRF FRAP. Journal of Biological Chemistry. 282(19): 14576-14585. *-equal contribution.
15. Staruschenko A., Pochynyuk O., Bugay V., Vandewalle A., Stockand J.D. 2007. Acute regulation of Epithelial Na+ Channel induced by inhibition of phosphatidylinositol 3 kinase in the cortical collecting duct. Journal of American Society of Nephrology. 18(6):
1652-1661.
16. Pochynyuk O., Tong Q., Medina J., Vandewalle A., Staruschenko A., Bugay V., Stockand J.D. 2007. Molecular determinants of PI(4,5)P2 and PI(3,4,5)P3 regulation of the epithelial Na+ channel. Journal of General Physiology. 130(4): 399-413.
17. Pochynyuk O., Stockand J.D. Staruschenko A. 2007. Ion channel regulation by Ras, Rho and Rab GTPases. Experimental Biology and Medicine. 232(10): 1258-1265.
18. Dorofeeva N.A., Barygin O.I., Staruschenko A., Bolshakov K.V., Magazanik L.G. 2008.
Mechanisms of non-steroid anti-inflammatory drugs action on ASICs expressed in hippocampal interneurons. Journal of Neurochemistry. 106 (1): 429-441.
19. Stockand J.D., Staruschenko A., Pochynyuk O., Booth R.E., Silverthorn D.U. 2008.
Insight toward epithelial Na+ channel (ENaC) mechanism revealed by the acid-sensing ion channel 1 (ASIC1) structure. International Union of Biochemistry and Molecular Biology Life. 60(9): 620-628.
20. Karpushev A.V., Levchenko V., Pavlov T.S., Lam V., Vinnakota K.C., Vandewalle A., Wakatsuki T., Staruschenko A. 2008. Regulation of ENaC expression at the cell surface by Rab11. Biochemical and Biophysical Research Communications. 377(2): 521-525.
21. Pochynyuk O., Kucher V., Boiko N., Mironova E., Staruschenko A., Karpushev A.V., Tong Q., Hendron E., Stockand J. 2009. Intrinsic voltage dependence of the epithelial Na+ channel is masked by a conserved transmembrane domain tryptophan. Journal of Biological Chemistry. 284(38): 25512-25521.
22. Dorofeeva N.A., Karpushev A.V., Nikolaev M.V., Bolshakov K.V., Stockand J.D., Staruschenko A. 2009. Muscarinic M1 modulation of acid-sensing ion channels.
Neuroreport. 20(15): 1386-1391.
23. Карпушев А.В., Павлов Т.С., Старущенко А. 2009. Регуляция эпителиальных натриевых каналов малыми G-белками и фосфатидилинозитидами. Биологические мембраны. 26(4): 265-279.
Karpushev A.V., Pavlov T.S., Staruschenko A. 2009. Regulation of the epithelial sodium channel (ENaC) by small G proteins and phosphatidylinositides. Biochemistry (Moscow), Series A: Membrane and Cell Biology. 3(3): 261-274.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Alvarez de la Rosa D., Canessa, C. M., Fyfe, G. K., and Zhang, P. (2000) Annu. Rev.
Physiol 62, 573-594. 2. Rossier, B. C., Pradervand, S., Schild, L., and Hummler, E. (2002) Annu. Rev. Physiol 64, 877-897. 3. Rossier, B. C. and Schild, L. (2008) Hypertension 52, 595-600. 4. Schild, L. (2004) Rev. Physiol Biochem. Pharmacol 151, 93-107. 5. Hamill, O.
P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., and Sigworth, F. J. (1981) Pflugers Arch. 391, 85-100.
6. Canessa, C. M., Horisberger, J. D., and Rossier, B. C. (1993) Nature 361, 467-470. 7.