Морфофункциональная характеристика органов репродуктивной системы самцов крыс при адаптации к низким температурам и на фоне коррекции (экспериментальное исследование)
На правах рукописи
САЯПИНА ИРИНА ЮРЬЕВНА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОРГАНОВ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ САМЦОВ КРЫС ПРИ АДАПТАЦИИ К НИЗКИМ ТЕМПЕРАТУРАМ И НА ФОНЕ КОРРЕКЦИИ (экспериментальное исследование) 06.02.01 Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Благовещенск – 2013
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Целуйко Сергей Семенович
Официальные оппоненты: Сиразиев Рамазан Закарьянович, доктор биологических наук, профессор ГНУ НИИ ветеринарии Восточной Сибири Россельхозакадемии, заместитель директора по научной работе Максарова Дарима Дамбаевна, доктор биологических наук, доцент ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет» Министерства образования и науки РФ, доцент кафедры зоологии и экологии БГФ Ярцев Владимир Геннадьевич, доктор ветеринарных наук, профессор ГБОУ ВПО Амурская ГМА Минздрава РФ, профессор кафедры патологической физиологии
Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации кандидат биологических наук, ФГОУ ВПО «Дальневосточный
Защита состоится « 20 » декабря 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.027.02 при ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет», 675005 г. Благовещенск, ул.
Политехническая, 86.
тел.: (416-2) 52-32-06, тел./факс: (416-2) 52-62-80,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет»
Автореферат разослан « » 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Самусенко Ольга Леонидовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследований. Репродуктивное здоровье населения является неотъемлемым составляющим демографических процессов, происходящих в обществе, поэтому проблемы, связанные с его нарушением, выходят сегодня за рамки медицинских, и приобретают социальный характер.
На протяжении последних десятилетий во всем мире прослеживается отчетливая тенденция к снижению активности сперматогенеза у мужчин (Быков В.Л., 1999;
Никитин А.И., 2005). Нормативный показатель концентрации сперматозоидов в эякуляте с 60 млн/мл (50–70-е годы XX в.) снизился к настоящему времени до 20 млн/мл. Скорость падения концентрации спермиев в эякуляте согласно расчетам ученых составляет примерно 2% в год (Никитин А.И., 2005). За период с 2005 по 2010гг. прирост абсолютного числа пациентов с заболеваниями предстательной железы только у нас в стране составил 36,2% (Аляев Ю.Г., 2012). Отмечается рост бесплодных браков, в которых, по данным статистики, возрастает доля мужского фактора. Если несколько десятилетий назад доля мужской инфертильности, как причины бесплодного брака, составляла по разным данным от 15 до 25%, то на сегодняшний день она составляет по разным оценкам от 30 до 60% (Никитин А.И., 2005).
Репродуктивные проблемы в браке помимо бесплодия сопровождаются фактами невынашивания беременности, рождением потомства с врожденными аномалиями развития. Как показывают литературные данные, 16% гамет у человека изначально являются неспособными к оплодотворению, а 47% погибают на ранних этапах эмбрионального развития (Никитин А.И., 2005).
Масштабы репродуктивных потерь в значительной степени зависят от того, в каких условиях протекает прогенез. В связи с этим, своевременное выявление факторов риска репродуктивного здоровья и прогнозирование последствий их влияния на организм является одним из актуальных направлений в современной репродуктологии (Никитин А.И., 2005). В настоящее время большое значение придается изучению влияния на прогенез и начальные этапы репродуктивного процесса экологических факторов. На сегодняшний день ученые располагают информацией о многих факторах внешней среды, вызывающих нарушения в органах репродуктивной системы, однако, истинные причины снижения репродуктивной функции у мужчин окончательно не установлены.
Средовые факторы, оказывающие негативное влияние на репродуктивную функцию человека и животных, в подавляющем большинстве являются антропогенными, однако нельзя недооценивать роль климатических факторов.
Известно, что репродуктивная система, сформировавшаяся в процессе эволюции под влиянием факторов внешней среды, сохранила зависимость своей деятельности от изменения этих факторов (Агаджанян Н.А. с соавт., 1998;
Rojansky N. et al., 1992;
Bronson F.H., 1995;
Eriksson A.W., Fellman J., 2001;
Cummings D.R., 2007). Обзор литературы показал, что механизмы и степень влияния на мужскую половую систему экстремальных климатических факторов, к которым относятся и низкие температуры, изучены недостаточно, а морфологические работы, которые бы в полной мере раскрывали сложные взаимоотношения составляющих мужской репродуктивной системы при действии на организм низких температур, отсутствуют.
Все это определяет необходимость разработки экспериментальной модели, позволяющей с морфологических позиций оценить структурно-функциональное состояние органов мужской репродуктивной системы при различных вариантах взаимодействия организма с низкими температурами. Дальнейшие морфологические исследования в этом направлении представляются нам актуальными не только с теоретической точки зрения, но и практически – для разработки критериев риска репродуктивных потерь и способов профилактики нарушений мужской репродуктивной функции в период адаптации организма к низким сезонным температурам.
Настоящая работа выполнена самостоятельно и является составной частью комплексной программы исследований кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии ГБОУ ВПО Амурская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения РФ (№ государственной регистрации 01200809839).
Цель и задачи работы. Цель исследования – изучить особенности структурной и функциональной реорганизации семенников и предстательной железы крыс при адаптации к низким сезонным температурам для прогнозирования риска репродуктивных потерь и разработки способов коррекции.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
На основе комплексного морфологического анализа оценить 1.
генеративную и эндокринную функцию семенников на этапах адаптации к низким температурам.
На основе комплексного морфологического анализа изучить 2.
особенности структурно-функциональной реорганизации эпителиального компартмента и стромального микроокружения предстательной железы на этапах адаптации к низким температурам.
Изучить морфофункциональное состояние семенников и 3.
предстательной железы в отдаленные сроки после адаптации для выяснения временного периода, необходимого для восстановления структурного гомеостаза органов репродукции.
На основе данных морфологического анализа семенников и 4.
предстательной железы на этапах адаптации к низким температурам и в отдаленные сроки после адаптации, определить критические временные периоды, позволяющие прогнозировать репродуктивные потери.
Изучить морфофункциональное состояние органов 5.
репродуктивной системы самцов крыс при адаптации к низким температурам на фоне применения модификаторов биологического ответа растительного и животного происхождения.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное морфологическое исследование структурно-функционального состояния семенников и предстательной железы крыс на этапах адаптации организма к низким сезонным температурам и в отдаленные сроки после адаптации.
Впервые установлено, что при адаптации к низким температурам в семенниках крыс развиваются стойкие нарушения сперматогенеза, которые появляются на ранних сроках, и сохраняются на всех последующих этапах адаптации. Впервые изучена динамика количественных и качественных преобразований популяции клеток Лейдига на этапах адаптации к низким температурам. Показано, что основополагающим фактором, вызывающим нарушения сперматогенеза на ранних этапах адаптации, является дефицит тестостерона, обусловленный угнетением инкреторной активности клеток Лейдига;
на поздних сроках адаптации основной причиной генеративной дисфункции являются нарушения структуры и функции клеток Сертоли, в совокупности с угнетением экспрессии NO-синтетазы в семенниках.
Показано, что основной причиной, вызывающей ускоренную элиминацию клеток Лейдига при адаптации к низким температурам, является окислительный стресс, развивающийся в тканях семенниках с первых недель адаптации. Впервые установлено, что ремоделирование эндокринного аппарата в виде компенсаторной гипертрофии клеток Лейдига, приводит к увеличению концентрации тестостерона в сыворотке крови на поздних сроках адаптации.
Впервые установлены особенности ремоделирования паренхиматозного компартмента и стромального микроокружения предстательной железы крыс, индуцированные адаптацией к низким температурам. Впервые установлено, что к моменту завершения краткосрочной адаптации предстательная железа не возвращается к исходному уровню структурно-функциональной организации.
Впервые установлено, что при адаптации к низким температурам в предстательной железе экспериментальных животных развивается окислительный стресс, ограничивающий компенсаторно-приспособительные возможности органа. Показано, что степень выраженности окислительного стресса коррелирует с длительностью срока адаптации.
Впервые доказана эффективность применения БАД дигидрокверцетин и БАД моллюскам в качестве средств, устраняющих тестикулярную дисфункцию и повышающих адаптационные возможности предстательной железы при действии низких температур.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенного экспериментального исследования имеют фундаментальное значение для морфологической науки, поскольку существенно расширяют имеющиеся представления о влиянии экстремально низких температур на органы репродуктивной системы животных. Полученные данные представляют собой новые знания, раскрывающие особенности тканевых, клеточных и внутриклеточных перестроек структурных компонентов семенников и предстательной железы при холодовой адаптации.
Более полное понимание механизмов повреждающего действия холода на систему репродукции животных создает теоретическую основу для разработки адекватных методов коррекции данного состояния.
Фактические данные и теоретические обобщения диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии Амурской государственной медицинской академии, кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Дальневосточного государственного медицинского университета, в научно-исследовательской работе центральной научно-исследовательской лаборатории Амурской государственной медицинской академии, в научно-исследовательской работе отдела инновационных методов диагностики и терапии, морфологии и патологии ГНУ Дальневосточный зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Россельхозакадемии, в научно-исследовательской работе лабораторий «НИИЭМ имени Г.П. Сомова» СО РАМН.
Основные положения, выносимые на защиту:
При адаптации к низким температурам развивается тестикулярная 1.
дисфункция, индуцированная общим адаптационным синдромом, морфологическим эквивалентом которой являются стойкие нарушения сперматогенеза на всех сроках адаптации, угнетение стероидогенеза в клетках Лейдига и их ускоренная элиминация на ранних сроках адаптации. На момент завершения краткосрочной адаптации происходит адаптивно-компенсаторная перестройка эндокринного аппарата семенника, создающая предпосылки для восстановления генеративной активности органа;
Эпителий предстательной железы на этапах адаптации к низким 2.
температурам характеризуется стереотипными морфологическими изменениями, свидетельствующими об усилении его секреторной активности, которые лучше выражены в дорсальных и латеральных долях простаты (ДЛП).
В стромальном микроокружении предстательной железы развиваются неспецифические изменения в виде интерстициального отека и тучноклеточной инфильтрации;
Через 48 дней после завершения адаптации восстанавливается 3.
генеративная активность семенников, восстанавливается численность популяции интерстициальных гландулоцитов при наличии признаков функциональной и морфологической незрелости клеток. Структурные перестройки эпителиального компонента и стромального микроокружения предстательной железы являются следствием гиперсекреторного состояния при адаптации к холоду, намечается тенденция к восстановлению структурного гомеостаза органа;
Структурно-функциональное состояние семенников и предстательной 4.
железы крыс, получавших коррекцию, свидетельствует о том, что дигидрокверцетин и моллюскам уменьшают негативные эффекты экстремально низких температур на репродуктивную систему животных.
Апробация работы. Основные положения исследования и материалы диссертации представлены и обсуждены на научных конференциях и форумах регионального, общероссийского и международного уровня: на международном эмбриологическом симпозиуме «Югра-эмбрио-2006.
Закономерности морфогенезов в онтогенезе и эксперименте у человека и позвоночных животных» (Ханты-Мансийск, 2006), на IV российско-китайском медицинском форуме «Медико-биологические основы лекарственной терапии в традиционной восточной и современной медицине» (Благовещенск, 2007), на 6 ой международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2008), на всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации» (Оренбург, 2008), на втором международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (Санкт Петербург, 2008), на международной гистологической конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте» (Тюмень, 2008), на 5-м китайско-российском форуме биомедицинских и фармакологических наук «Интеграция традиционной и современной медицины» (Харбин, 2008), на научной конференции с международным участием «Системный анализ в медицине» (Благовещенск, 2008, 2010), на общероссийской научной конференции «Однораловские морфологические чтения» (Воронеж, 2010), на межрегиональной научно-практической конференции «Новые технологии в эндокринологии» (Благовещенск, 2010), на второй международной конференции Китая, Японии и Кореи по традиционной восточной медицине и 7-м китайско-российском биомедицинском форуме (Харбин, 2010), на заочной научно-практической конференции научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов «Должановские чтения» (Воронеж, 2010, 2011, 2012), на VIII Российско-Китайском медицинском форуме «Современные проблемы нанофармакологии» (Благовещенск, 2011), на 9-м китайско-российском биомедицинском форуме (Харбин, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 научных работы, из них 15 статей в рецензируемых изданиях, рекомендуемых ВАК России для публикации научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата и доктора наук.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на странице и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов. Список использованной литературы включает источник, в том числе 359 источников иностранных авторов. Работа иллюстрирована 123 рисунками, содержит 15 таблиц.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проведено на 240 нелинейных крысах-самцах Rattus norvegicus с массой тела 200-250 г. Животные содержались в виварии Амурской государственной медицинской академии при соблюдении 12-ти часового светового режима, на стандартном пищевом рационе, при свободном доступе к пище и воде.
В соответствии с целью и задачами настоящего исследования в структуре эксперимента было выделено три направления (табл. 1). Первая серия экспериментов была направлена на изучение органов репродуктивной системы самцов крыс на этапах адаптации организма животных к низким температурам.
Структурно-функциональные изменения в органах репродуктивной системы моделировали путем общего охлаждения животных в климатокамере “ILKA” (Feutron, ГДР) при температуре –15С по 3 часа ежедневно. Температурный режим охлаждения и экспозиция были выбраны с учетом возникновения в таких условиях у животных выраженных биохимических и морфологических изменений (Целуйко С.С. с соавт., 2002). Животные, участвующие в экспериментах первой серии, были рандомизированы на три группы (табл. 1).
Таблица 1 – Краткая характеристика экспериментального материала № Название группы и Характеристика группы количество животных (n) 1. Группа контроля (n 40) Интактные крысы, содержавшиеся в стандартных температурных условиях вивария. Служили контролем для всех экспериментальных групп.
I. Изучение структурно-функционального состояния органов репродуктивной системы на этапах адаптации к низким температурам 2. 1 неделя адаптации (n 40) Общее охлаждение животных при температуре –15С по 3 часа ежедневно в течение 1-й недели.
3. 2 недели адаптации (n 40) Общее охлаждение животных при температуре –15С по 3 часа ежедневно в течение 2-х недель.
4. 4 недели адаптации (n 40) Общее охлаждение животных при температуре –15С по 3 часа ежедневно в течение 4-х недель.
II. Изучение отдаленных последствий адаптации к низким температурам на структурно функциональное состояние органов репродуктивной системы 5. Через 48 дней после Общее охлаждение животных при температуре адаптации –15С по 3 часа ежедневно в течение 4-х недель, следующие 48 дней животные находились в стандартных температурных условиях вивария.
III. Изучение адаптационных возможностей органов репродуктивной системы на фоне БАД растительного и животного происхождения 6. Адаптация к низким Общее охлаждение животных при температуре температурам на фоне –15С по 3 часа ежедневно в течение 4-х недель, БАД дигидрокверцетин (n 40) ежедневно перед охлаждением получали дигидрокверцетин per os в дозе 5 мг/кг массы тела.
7. Адаптация к низким Общее охлаждение животных при температуре температурам на фоне –15С по 3 часа ежедневно в течение 4-х недель, БАД моллюскам (n 40) ежедневно перед охлаждением получали моллюскам per os в дозе 10 мг/кг массы тела.
Сущность второго направления эксперимента заключалась в изучении отдаленных последствий адаптации к низким температурам на систему репродукции крыс-самцов (табл. 1), а именно через 48 дней после завершения краткосрочной адаптации, что обусловлено длительностью сперматогенеза у крыс (Leblond C., Clermont Y., 1952).
В третьей серии экспериментов изучалась возможность коррекции негативных воздействий экстремально низких температур на репродуктивную систему животных. В качестве средств, повышающих адаптационные возможности органов репродуктивной системы, были использованы БАД, выделенные из флоры и фауны Дальневосточного региона, а именно БАД дигидрокверцетин и БАД моллюскам. Соответственно получаемой БАД крысы были рандомизированы на две экспериментальные группы коррекции (табл.
1).
Все животные выводились из эксперимента на следующий день после его окончания. Животных предварительно наркотизировали внутрибрюшинным введением раствора тиопентала натрия, умерщвление проводили путем декапитации. Объектом исследования служили главные (семенники) и добавочные (предстательная железа) половые железы.
Гистологическое исследование Для гистологического исследования фрагменты ткани семенников и простаты фиксировали в 10 нейтральном растворе формалина, после чего заливали в парафин. Для обзорной микроскопии парафиновые срезы семенников и простаты окрашивали гематоксилином Бемера и эозином, для идентификации стадий сперматогенного цикла в соответствии с (Leblond C., Clermont Y., 1952), ставили ШИК-реакцию, волокна соединительной ткани в простате окрашивали по методу Ван Гизона, нейтральные гликопротеины в эпителии простаты выявляли при помощи ШИК-реакции, содержание хелатируемого цинка в эпителии простаты определяли по реакции с дитизоном (Ещенко Ю.В. с соавт., 2010). Фотосъемка гистологических препаратов проводилась на микроскопе “Microphot FXA” (Nikon, Япония).
Иммуногистохимическое исследование На парафиновых срезах семенников и простаты при помощи моноклональных антител определяли локализацию индуцибельной NO синтетазы, на парафиновых срезах простаты определяли локализацию кадгерина Е. Для выявления антигенов использовались готовые антитела (Lab Vision, США): «Cadherin-E/Cadherin» RB-9214-R7 и «Nitric Oxide Постановка иммуно Synthase/inducible(iNOS) AB-1» RB-1605-R7.
гистохимической реакции проводилась в соответствии с прилагающимся протоколом фирмы-производителя.
Методы количественного анализа Для морфометрии семенников и простаты использовали аппаратно программный комплекс, состоящий из программного обеспечения для количественного анализа Морфология 5.0, цифровой окулярной камеры DCM 130, светового микроскопа «Микромед-1» и персонального компьютера.
Для количественной оценки генеративной активности семенников измеряли диаметр извитых семенных канальцев, вычисляли индекс сперматогенеза и цитологический профиль сперматогенеза (Ухов Ю.И., Астраханцев А.Ф., 1983), в 100 просмотренных канальцах подсчитывали число канальцев с отслоившимися клетками в просвете. Инкреторную активность семенников оценивали по относительному количеству клеток Лейдига (КЛ), приходящихся на срез извитого канальца, измеряли диаметр ядра и цитоплазмы КЛ, вычисляли процент количества различных морфофункциональных типов КЛ (Ухов Ю.И., Астраханцев А.Ф., 1983) и индекс активности КЛ (Брюхин Г.В. с соавт., 2010).
В простате измеряли относительную площадь основных гистологических структур [Троценко Б.В., Лугин И.А., 2005, Mukerjee B., Rajan T., 2004], высоту эпителиоцитов и диаметр ядер, проводили подсчет относительного количества эпителиоцитов с двумя ядрами. Измеряли оптическую плотность продуктов гистохимических и иммуногистохимических реакций в исследуемых структурах семенников и простаты, которую выражали в условных единицах.
Электронная микроскопия Для электронной микроскопии образцы тканей семенников и простаты фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида с постфиксацией в 1 растворе осмиевой кислоты. После обезвоживания в спиртах восходящей концентрации, образцы заливали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме «Ultratome III 8800» (LKB, Швеция), контрастировали раствором уранилацетата и цитратом свинца. Исследование и фотографирование ультратонких срезов проводили на трансмиссионном электронном микроскопе «Tecnai G2 Spirit TWIN» (FEI Company, Нидерланды).
Иммуноферментный анализ Для установления корреляции между морфологическими и функциональными критериями активности КЛ в сыворотке крови определяли концентрацию тестостерона методом иммуноферментного анализа с использованием стандартного набора для иимуноферментного анализа (Вектор Бест, Россия) согласно протоколу фирмы-производителя.
Биохимическое исследование Интенсивность процессов перекисного окисления липидов оценивали по содержанию диеновых конъюгатов (ДК), малонового диальдегида (МДА) и гидроперекисей липидов (ГЛ) в сыворотке крови и тканях семенника, состояние антиокислительной системы оценивали по уровню витамина Е в сыворотке крови и тканях семенника.
Статистическая обработка Для статистической обработки цифровых данных использовалось программное обеспечение Statistica 6.0 (StatSoft, США), все данные представлены в виде M±m. Гипотезу нормальности распределения значений в выборках проверяли при помощи теста Колмогорова-Смирнова, после чего выборки сравнивались с использованием t-критерия Стьюдента. Различия между выборками считались статистически значимыми при р 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Морфофункциональная характеристика семенников на этапах адаптации к низким сезонным температурам Результаты проведенного исследования показали, что изменения генеративной активности семенника после 1-й недели адаптации имеют выраженный депрессивный характер. В части извитых семенных канальцев отмечается истощение генерации круглых сперматид, резкое уменьшение генерации удлиненных сперматид вплоть до полного их отсутствия. В канальцах на VII-VIII стадиях сперматогенного цикла в популяции пахитенных сперматоцитов и круглых сперматид появляются единичные клетки с признаками дегенерации, в просветах канальцев часто встречаются конгломераты из отслоившихся сперматогенных клеток. При электронной микроскопии в бухтообразных углублениях клеток Сертоли встречаются дегенеративно измененные головки удлиненных сперматид, в цитоплазме клеток Сертоли обнаруживаются крупные фагоцитарные вакуоли, содержащие фрагменты сперматогенных клеток.
По результатам количественного анализа (табл. 2) число канальцев с клеточными «пробками» увеличено по сравнению с группой контроля на 64%, диаметр извитых канальцев уменьшается на 13,5% (р 0,05), снижается индекс сперматогенеза (р 0,05). Изучение цитологического профиля сперматогенеза показало (табл. 2), что после 1-й недели адаптации относительное количество прелептотенных сперматоцитов уменьшается на 11,6%, пахитенных сперматоцитов на 16,8% (р 0,05), но самые значительные изменения происходят в популяции круглых и удлиненных сперматид – их количество уменьшается на 29,4% и 32,08% соответственно (р 0,05).
Таблица 2 – Количественные показатели генеративной активности семенника на этапах адаптации к низким температурам (M±m) Показатель Контроль 1 неделя 2 недели 4 недели адаптации адаптации адаптации Диаметр канальцев 277,86±1,27 240,29±1,18* 231,08±1,18* 255,76±1,08* (мкм) Индекс сперматогенеза 3,3±0,45 3,21±0,4* 3,25±0,43* 3,28±0, (число) Число канальцев с 0,528±0,09 0,867±0,14* 0,792±0,09* 0,670±0, «пробками» Прелептотенные 66,03±1,29 58,33±1,57* 61,6±1,28* 56,83±1,15* сперматоциты (число) Пахитенные 81,13±1,78 67,46±2,1* 68,83±1,3* 65,83±1,28* сперматоциты (число) Круглые 199,13±3,68 140,5±4,36* 166,16±4,18* 162,93±3,31* сперматиды (число) Удлиненные 219,23±4,47 148,9±3,64* 157,63±4,13* 163,8±3,65* сперматиды (число) Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с контролем при р 0,05.
Таким образом, обнаруженные цитопатологические изменения пахитенных сперматоцитов и круглых сперматид в канальцах на VII-VIII стадиях цикла, уменьшение практически всех генераций герминативных клеток в совокупности с уменьшением диаметра извитых семенных канальцев и снижением индекса сперматогенеза указывают на серьезные нарушения сперматогенеза, индуцированные адаптацией животных к низким температурам, и косвенно свидетельствуют о снижении уровня тестостерона в семенниках (Creasy D.M., 2001;
Odum J. et al., 2009).
Основные характеристики инкреторной активности семенника после 1-й недели адаптации также имеют депрессивную направленность, о чем свидетельствуют изменения морфологических и количественных показателей КЛ (табл. 3). В ядрах КЛ отмечается умеренная конденсация хроматина, уменьшается диаметр ядра и цитоплазмы КЛ (р 0,05), что указывает на снижение синтетических процессов в клетках. При электронной микроскопии в цитоплазме КЛ обнаруживаются скопления липидных капель, что косвенно свидетельствует об угнетении синтеза стероидов (Васильев Г.А. с соавт., 1974).
Анализ популяционного состава КЛ показал (рис. 1), что по сравнению с контролем на 28% увеличивается представительство малых КЛ, которые являются малоактивными в отношении стероидогенеза формами (Брюхин Г.В. с соавт., 2010;
Шевлюк Н.Н. с соавт., 2010;
Davidoff M.S. et al., 2009). В то же время КЛ среднего и большого размера, активно участвующих в синтезе стероидных гормонов, становится меньше, что приводит к снижению индекса активности КЛ, относительное количество КЛ после 1-й недели адаптации не изменяется (табл. 3). Концентрация тестостерона в сыворотке крови крыс после 1-й недели адаптации снижается на 16, 7% (р 0,05).
Таблица 3 – Количественные показатели инкреторной активности семенника на этапах адаптации к низким температурам (M±m) Группа Диаметр Диаметр Относительное Индекс Тестостерон ядра КЛ цитоплазмы КЛ количество КЛ активности (нмоль/л) (мкм) (мкм) (число) КЛ (число) Контроль 6,23±0,02 8,31±0,03 10,9±0,28 32,32±2, 1, 1 неделя 6,13±0,02* 7,76±0,05* 11,13±0,18 28,06±1,8* 0, 75% 2 недели 6,19±0,01 70%8,06±0,03* 10,14±0,12* 28,76±2,15* 0, 4 недели 6,57±0,03* 9,04±0,04* 8,84±0,27* 32,17±0, 4, 55% 52% 60 Примечание: * – различия статистически 47% значимы с контролем при р 0,05.
42% 50 Малые КЛ Средние КЛ 29% Большие КЛ 30 18% 7% 3% 1% 1% Контроль 1 неделя 2 недели 4 недели Рисунок 1. Распределение КЛ на три основных морфофункциональных типа (по результатам количественного анализа).
Результаты морфологического исследования семенников после 2-х недель адаптации свидетельствуют о выраженных нарушениях генеративной активности органа. В извитых семенных канальцах наблюдается активная десквамация герминативных клеток, отмечается истощение популяций пахитенных сперматоцитов, круглых и удлиненных сперматид, в эпителиосперматогенном слое присутствуют дегенеративно измененные клетки, из которых формируются сферические структуры.
Результаты количественного исследования семенников объективизируют обнаруженные морфологические изменения (табл. 2). Индекс сперматогенеза остается по-прежнему сниженным, диаметр извитых семенных канальцев достигает минимальных значений, число канальцев с клеточными конгломератами в просвете увеличено на 50% (р 0,05). Изменения цитологического профиля сперматогенеза сохраняют депрессивный характер:
количество прелептотенных сперматоцитов уменьшено на 6,7%, пахитенных сперматоцитов становится меньше на 15,1%, популяция круглых сперматид уменьшается на 16,5%, а популяция удлиненных сперматид на 28% (р 0,05).
При ультраструктурном исследовании клеток мейотической и постмейотической популяций выявляется вакуолизация митохондрий. Начиная с популяции пахитенных сперматоцитов, в цитоплазме генеративных клеток появляются ультраструктурные признаки деградации в виде вакуолей, содержащих миелиноподобные структуры. В ядрах удлиненных сперматид отмечается неравномерная конденсация хроматина, часто встречаются сперматиды с ультраструктурными признаками деградации ядра и цитоплазмы.
В бухтообразных углублениях клеток Сертоли можно наблюдать деформированные фрагменты погибших сперматид, цитоплазма сустентоцитов умеренно вакуолизирована. Таким образом, как и в предыдущей группе сильнее всего пострадали популяции пахитенных сперматоцитов, круглых сперматид и удлиненных сперматид, являющиеся зависимыми от концентрации тестостерона в семенниках (Creasy D.M. et al., 2002;
Mc Lachlan R.I. et al., 2002, Odum J. et al., 2009;
Walker W.H., 2011).
После 2-х недель адаптации отмечается обеднение интерстиция семенников КЛ. Количественный анализ показал, что относительное количество КЛ уменьшается на 17 % (р 0,05), диаметр цитоплазмы КЛ меньше, чем у интактных крыс (табл. 3). В популяции КЛ преобладающим морфофункциональным типом являются малые эндокриноциты, не участвующие в синтезе стероидов, количество КЛ среднего и большого размера уменьшено (рис. 1), индекс активности КЛ снижен, концентрация тестостерона в сыворотке крови на 11 % ниже показателей группы контроля (р 0,05). В ядрах КЛ сохраняется умеренная конденсация хроматина, прогрессивно нарастает число инволюционирующих КЛ, в цитоплазме которых наблюдается тотальное расширение везикул агранулярной эндоплазматической сети, накапливаются лизосомы.
После 4-х недель адаптации усиливается обедненность интерстиция семенников КЛ. Существенные изменения происходят в популяционном составе КЛ: преобладающим морфофункциональным типом становятся средние и большие КЛ округлой или овальной формы со светло-оксифильной вакуолизированной цитоплазмой и светлыми ядрами, практически лишенными конденсированного хроматина, что указывает на их активное участие в синтезе стероидов. В цитоплазме КЛ отмечается расширение везикул гладкой эндоплазматической сети, большинство митохондрий имеют нечеткие, размытые кристы, цитоплазматический матрикс сильно просветлен, что указывает на истощение компенсаторно-приспособительных реакций клеток.
После 4-х недель адаптации в интерстиции семенников часто встречаются активированные макрофаги, находящиеся в тесном контакте с КЛ. В цитоплазме тестикулярных макрофагов обнаруживаются гигантские фагосомы, содержащие фрагменты КЛ. Инволюционирующие формы КЛ встречаются реже, чем на ранних сроках адаптации к низким температурам.
По результатам количественного анализа (табл. 3) после 4-х недель адаптации относительное количество КЛ уменьшается на 19% (р 0,05), диаметр ядра и цитоплазмы КЛ увеличивается (р 0,05). Доля средних и больших КЛ в популяции увеличивается на 20% и на 4% соответственно, доля малых КЛ уменьшается на 24% (рис. 1). В результате этого доля активных КЛ в популяции составляет 82%, а индекс активности эндокриноцитов повышается в 3,2 раза.
Концентрация сывороточного тестостерона после 4-х недель адаптации поднимается до уровня интактных животных (табл. 3). Структурной основой данного феномена, на наш взгляд, является компенсаторная гипертрофия клеток Лейдига, подтвержденная результатами морфологического, количественного и ультраструктурного анализа.
На фоне повышения концентрации сывороточного тестостерона в семенниках крыс после 4-х недель адаптации повышается индекс сперматогенеза, намечается тенденция к увеличению диаметра извитых семенных канальцев (табл. 2). Однако анализ цитологического профиля показывает, что восстановления сперматогенеза после 4-х недель адаптации не происходит: по сравнению с группой контроля количество прелептотенных сперматоцитов меньше на 13,9%, пахитенных сперматоцитов на 18,8%, круглых сперматид меньше на 18,2% (р 0,05). Наиболее чувствительной популяцией герминативных клеток являются удлиненные сперматиды, их меньше, чем в контроле на 25,3% (р 0,05).
По данным электронной микроскопии в цитоплазме пахитенных сперматоцитов, круглых и удлиненных сперматид сохраняется вакуолизация митохондрий, в цитоплазме круглых сперматид отмечается модификация пластинчатого комплекса. Для сравнения, в круглых сперматидах интактных крыс комплекс Гольджи имеет сферическую конфигурацию, в нем хорошо выражено корковое и мозговое вещество, представленное крупными вакуолями, что согласуется с имеющимися литературными данными (Сlermont Y. Et al., 1994;
Russinova A.I. et al., 1998;
Ishibashi K., Yuasa S., 1999;
Tanii I., Yashinaga K., 2002). После 4-х недель адаптации комплекс Гольджи представлен разрозненными диктиосомами, секреторные вакуоли в мозговом веществе отсутствуют. В ядрах удлиненных сперматид отмечаются нарушения конденсации ядерного хроматина, что морфологически проявляется появлением в ядрах клеток светлых вакуолей.
Электронная микроскопия показала, что после 4-х недель адаптации усиливается вакуолизация цитоплазмы клеток Сертоли, размер вакуолей, представляющих собой расширенные элементы гладкой эндоплазматической сети, увеличивается;
резко снижается электронная плотность цитоплазматического матрикса. Состояние повышенного функционального напряжения, в котором находятся клетки Сертоли, сопровождается ускоренным изнашиванием внутриклеточных структур, в результате чего в цитоплазме сустентоцитов уменьшается количество митохондрий, появляются продукты деградации мембранных органелл в виде миелиноподобных структур. В цитоплазме некоторых клеток Сертоли клеточный матрикс сохраняет электронную плотность, однако отмечается активное накопление липидных включений, что может быть связано либо с усилением стероидогенеза, либо, напротив, свидетельствовать о замедленной утилизации липидов.
Ультраструктурные изменения сустентоцитов, обнаруженные после 4-х недель адаптации, имеют неспецифический характер, и выявляются при различного рода экстремальных воздействиях (Creasy D.M., 2001;
Kassim N.M.
et al., 1997;
Odum J. et al., 2009). Регенераторно-пластическая недостаточность клеток Сертоли, развивающаяся при холодовой адаптации, по нашему мнению, является основополагающим фактором элиминации половых клеток.
После 4-х недель адаптации в структурах эпителиосперматогенного слоя отмечается резкое угнетение экспрессии индуцибельной NO-синтетазы. Оксид азота, синтез которого обеспечивает фермент NO-синтетаза, принимает активное участие в регуляции сперматогенеза, обеспечивая поддержание целостности специализированных межклеточных контактов, таких как плотные контакты Сертоли-Сертоли, а также контакты между сустентоцитами и сперматидами (Lee N.P., Cheng C.Y., 2008). Следовательно, угнетение экспрессии NO-синтетазы может вызвать нарушения сперматогенеза, обнаруженные при адаптации к холоду.
Одной из причин тестикулярной дисфункции различного генеза является окислительный стресс (Nechifor M.T. et al., 2006, Aitken R.J., Roman S.D., 2008).
Биохимическое исследование показало (табл. 4), что уже на ранних сроках адаптации в семенниках развивается окислительный стресс: содержание ГЛ увеличивается на 81%, содержание витамина Е снижается на 28% (р 0,05), в сыворотке крови на 61% увеличивается содержание ДК, МДА на 25% (р 0,05), намечается тенденция к росту ГЛ и снижению концентрации витамина Е.
После 2-х недель адаптации в тканях семенника отмечается эскалация окислительного стресса (табл. 4). Содержание ГЛ превышает показатели контрольной группы на 48%, ДК больше на 16%, содержание витамина Е уменьшается на 31% (р 0,05). В сыворотке крови содержание ДК повышено на 86%, МДА на 15% (р 0,05), продолжается снижение уровня витамина Е.
После 4-х недель адаптации в тканях семенника сохраняются биохимические проявления окислительного стресса (табл. 4). Содержание ГЛ остается повышенным на 68%, содержание ДК повышено на 13%, содержание витамина Е снижено на 18% (р 0,05). В сыворотке крови содержание ДК повышается на 76%, ГЛ и МДА на 25%, в то время как содержание витамина Е снижается на 34% (р 0,05).
Таблица 4 – Содержание основных продуктов перекисного окисления липидов и витамина Е в сыворотке крови и ткани семенников (M±m) Группа ДК (нмоль/г) ГЛ (нмоль/г) МДА (нмоль/л) Витамин Е (мкг/г) Сыворотка крови Контроль 27,23±3,07 26,06±1,46 4,84±0,27 51,12±4, 1 неделя 43,96±4,64* 28,08±2,60 6,02±0,53* 47,01±4, 2 недели 50,74±3,39* 28,03±3,02 5,60±0,29* 45,04±2, 4 недели 48,90±3,84* 32,76±1,81* 6,06±0,34* 32,48±2,29* Семенник Контроль — 66,18±4,77 25,80±0,97 52,63±3, 1 неделя — 71,42±4,29 46,74±3,47* 37,70±1,21* 2 недели — 80,90±6,28* 38,21±2,97* 36,28±1,75* 4 недели — 78,90±5,03* 43,36±2,81* 38,85±1,61* Примечание: * – различия статистически значимы с группой контроля при р 0,05.
2. Морфофункциональная характеристика семенников через 48 дней после завершения адаптации Через 48 дней после завершения адаптации складывается визуальная морфологическая картина полного восстановления структурного гомеостаза в семенниках. В извитых семенных канальцах на IX-XIV стадиях сперматогенного цикла восстанавливается ярус удлиненных сперматид, уменьшается число канальцев, содержащих отслоившиеся герминативные клетки, дегенеративно измененные клетки в канальцах не встречаются.
Для воспроизведения более полной и максимально объективной картины состояния генеративной функции семенников обратимся к результатам количественных исследований. Визуальная картина восстановления генерации удлиненных сперматид находит количественное подтверждение (табл. 5).
Относительное количество удлиненных сперматид на 23,5% больше, чем у интактных крыс (р 0,05), восстанавливается численность прелептотенных и пахитенных сперматоцитов (табл. 5), однако количество круглых сперматид меньше, чем в контроле (р 0,05). Индекс сперматогенеза ниже, чем у интактных животных (р 0,05), что указывает на уменьшение числа канальцев на VIII стадии сперматогенного цикла. Несмотря на то, что тенденция к увеличению диаметра канальцев наметилась уже после 4-х недель адаптации, диаметр извитых семенных канальцев меньше, чем в группе контроля (р 0,05).
Количественные показатели генеративной активности семенника свидетельствуют о нестабильности сперматогенеза через 48 дней после завершения адаптации. Таким образом, восстановление сперматогенной функции семенников у крыс занимает длительный срок, превышающий продолжительность сперматогенеза, что согласуется с данными других авторов (Потемина Т.Е., 2008;
Tash J.S. et al., 2002;
Motabagani M.A., 2007).
В то же время результаты электронной микроскопии показывают полное восстановление ультраструктурной организации половых и соматических клеток: в клетках мейотической и постмейотической популяций нормализуется структура митохондрий, комплекс Гольджи приобретает полусферическую конфигурацию, в ядрах удлиненных сперматид отмечается равномерная конденсация хроматина, нормализуется внутренняя архитектура поддерживающих эпителиоцитов.
Попытаемся разобраться в причинах, лежащих в основе нестабильного осуществления сперматогенной функции, обратившись к рассмотрению интерстициального компартмента семенников. Через 48 дней после адаптации обращает внимание обилие в интерстиции семенников КЛ небольших размеров.
Количественный анализ показал, что относительное количество КЛ возвращается к показателям интактных крыс (табл. 5). КЛ новообразованной популяции характеризуются небольшими размерами: по данным морфометрии (табл. 5) средний диаметр цитоплазмы КЛ меньше, чем у крыс из группы контроля (р 0,05), в то время как диаметр ядра КЛ больше контрольных значений (р 0,05), что характерно для гландулоцитов с низкой функциональной активностью (Арав В.И. с соавт., 2004, Шевлюк Н.Н. с соавт., 2010).
Таблица 5 – Количественные характеристики функциональной активности семенника в норме и через 48 дней после завершения адаптации к низким температурам (M±m) Количественные характеристики Контроль Через 48 дней Генеративная активность семенника Диаметр канальцев (мкм) 277,9±1,27 261,3±1,18* Индекс сперматогенеза (число) 3,3±0,45 3,2±0,39* Число канальцев с «пробками» 0,528±0,09 0,541±0, Прелептотенные сперматоциты (число) 66,0±1,29 67,1±1, Пахитенные сперматоциты (число) 81,1±1,78 78,2±1, Круглые сперматиды (число) 199,1±3,68 180,1±4,66* Удлиненные сперматиды (число) 219,2±4,47 270,8±5,6* Инкреторная активность семенника Диаметр ядра КЛ (мкм) 6,2±0,02 6,4±0,03* Диаметр цитоплазмы КЛ (мкм) 8,3±0,03 7,9±0,04* Относительное количество КЛ (число) 10,9±0,28 11,0±0, Индекс активности КЛ (число) 1,38 0,63* Тестостерон (нмоль/л) 33,7±1,71 31,5±1, Примечание: * – различия статистически значимы с контролем при р 0,05.
Изменяется популяционный состав КЛ: количество малых КЛ, являющихся малоактивными в отношении стероидогенеза формами (Брюхин Г.В. с соавт., 2010;
Шевлюк Н.Н. с соавт., 2010;
Davidoff M.S. et al., 2009), увеличено в популяции на 19%. Количество КЛ среднего и большого размера уменьшается на 17% и 2% соответственно, в результате чего индекс активности КЛ относительно контроля снижается в 2,2 раза. При электронной микроскопии доминируют КЛ с небольшим объемом цитоплазмы, в которой присутствуют единичные липидные капли, митохондрии и агранулярная эндоплазматическая сеть развиты слабо. Уровень сывороточного тестостерона, отражающий функциональную активность КЛ, незначительно ниже, чем в группе контроля (р 0,05). Таким образом, структурная и функциональная незрелость КЛ новообразованной популяции может быть одной из причин нестабильного осуществления сперматогенной функции семенниками в отдаленные сроки после адаптации.
Как ни парадоксально, но даже через 48 дней после завершения адаптации в организме животных сохраняется дисбаланс между процессами перекисного окисления липидов и состоянием антиокислительной системы (табл. 6). Биохимическое исследование показало, что в сыворотке крови животных повышено содержание ГЛ, ДК и МДА, уровень витамина Е ниже, чем у интактных крыс (р 0,05). В тканях семенников повышено содержание ГЛ, а уровень витамина Е ниже контрольных значений (р 0,05).
Следовательно, пролонгированный во времени окислительный стресс может являться одной из причин нарушений генеративной активности семенника через 48 дней после завершения адаптации организма к низким температурам.
Таблица 6 – Содержание основных продуктов ПОЛ и витамина Е в сыворотке крови и ткани семенников (M±m) ДК (нмоль/г) ГЛ (нмоль/г) МДА (нмоль/л) Витамин Е (мкг/г) Сыворотка крови Контроль 27,23±3,07 26,06±1,46 4,84±0,27 51,12±4, Через 48 дней 51,40±2,30* 32,96±2,11* 5,57±0,32* 41,38±3,52* Семенник Контроль — 66,18±4,77 25,80±0,97 52,63±3, Через 48 дней — 62,37±7,54 37,15±2,14* 35,81±0,88* Примечание: * – различия статистически значимы с группой контроля при р 0,05.
3. Морфофункциональная характеристика предстательной железы на этапах адаптации к низким сезонным температурам Результаты проведенного исследования показали, что по сравнению с вентральными долями простаты более выраженный структурный след адаптации отмечается в ДЛП. Структурно-функциональные изменения ДЛП, обусловленные развитием общего адаптационного синдрома, обнаруживаются как в эпителиальном компартменте железы, так и в стромальном микроокружении, что позволяет рассматривать ДЛП крыс как наиболее адекватную модель для изучения влияния экстремальных факторов среды.
Уже после 1-й недели адаптации усиливается секреторная активность железистого эпителия ДЛП, на что указывают гипертрофия зоны Гольджи, вакуолизация цитоплазмы люминальных эпителиоцитов, смена мерокринового типа секреции на макроапокриновый. Как показывает электронная микроскопия, структурной основой гипертрофии зоны Гольджи в люминальных эпителиоцитах является гиперплазия элементов пластинчатого комплекса. Морфологические эквиваленты гиперсекреторного состояния люминальных эпителиоцитов достигают максимального развития ко 2-й неделе, и сохраняются после 4-х недель адаптации.
Адаптация к низким температурам стимулирует процессы соматической полиплоидии: после 4-х недель адаптации численность люминальных эпителиоцитов с двумя ядрами увеличивается на 113% (р 0,05). Клетки, способные к полиплоидизации, отвечают на любой стресс быстрым накоплением геномов (Анацкая О.В., Виноградов А.Е., 2008;
Gorla G.R. et al., 2001;
Mc Crann D.J. et al., 2008). Следовательно, увеличение численности люминальных эпителиоцитов с двумя ядрами можно позиционировать как компенсаторный резерв железистого эпителия ДЛП, повышающий метаболическую пластичность клеток, и являющийся структурной основой, обеспечивающей повышенную секреторную активность гландулоцитов.
Состояние функционального напряжения, в котором находятся люминальные эпителиоциты при холодовой адаптации, приводит к дегенеративным изменениям биологических мембран очагового характера и усилению процессов аутофагии в клетках. Обнаруженные ультраструктурные изменения свидетельствуют о развитии регенераторно-пластической недостаточности люминальных эпителиоцитов.
На фоне гиперсекреторного состояния эпителия после 2-х недель адаптации в ДЛП появляются конгестивные феномены в виде расширения и переполнения секретом ацинусов и выводных протоков, имеющие очаговый характер. Отмечается десквамация эпителиоцитов в просветы ацинусов, которая усиливается после 4-х недель адаптации, появляются люминальные эпителиоциты с вакуольной дегенерацией цитоплазмы.
После 4-х недель адаптации в эпителии ДЛП угнетается экспрессия NO синтетазы, оптическая плотность продуктов реакции статистически значимо ниже, чем в группе контроля (р 0,05). Оксид азота играет важную роль в холодовой адаптации тканей и органов, являясь дополнительной системой антиоксидантной защиты местного уровня (Vasilijevic A. et al., 2007;
Korac A. et al., 2008;
Petrovic V. et al., 2008), следовательно, угнетение экспрессии NO синтетазы, обеспечивающей синтез оксида азота, создает условия для развития окислительного стресса в тканях простаты.
Результаты гистохимической реакции с дитизоном показали, что после 4-х недель адаптации в эпителии ДЛП снижается содержание катионов цинка (р 0,05). Значительная часть хелатируемого цинка входит в состав цинк-зависимой супероксиддисмутазы (Zn-СОД), являющейся важным фактором защиты эпителиальных клеток простаты от активных метаболитов кислорода (Ещенко Ю.В. с соавт., 2010;
Song Y. et al., 2010;
Iguchi K. et al., 2011), следовательно, выявленный дефицит цинка может способствовать развитию окислительного стресса в предстательной железе.
Цинк, обладая мощным антипролиферативным и противовоспалительным действием, играет важную биологическую роль в гистофизиологии простаты, а цитрат цинка является неотъемлемым компонентом секрета железы. Снижение концентрации хелатируемого цинка может привести к нарушениям структурного и функционального гомеостаза железы.
Важнейшей компонентой структурного гомеостаза простаты, предупреждающей пролиферацию и опухолевый рост железистого эпителия, является экспрессия гландулоцитами Е-кадгерина (Day M.L. et al., 1999;
Haberman H. et al., 2001). Как показывает иммуногистохимическая реакция на Е-кадгерин, после 4-х недель адаптации иммунопозитивные свойства железистого эпителия ДЛП резко снижены (р 0,05), что негативно отражается на межклеточных взаимодействиях эпителиоцитов.
После 4-х недель адаптации в эпителии ДЛП резко снижается активность ШИК-реакции, оптическая плотность продуктов реакции ниже, чем в группе контроля (р 0,05). По литературным данным гликоген в простатическом эпителии не выявляется (Бадлуев Э.Б., 2000;
Батуева А.Б., 2000), следовательно, уменьшение содержания ШИК-позитивных веществ указывает на снижение содержания нейтральных гликопротеинов в цитоплазме люминальных эпителиоцитов.
Угнетение экспрессии NO-синтетазы и Е-кадгерина, снижение ШИК позитивных свойств эпителия и уменьшение концентрации хелатируемого цинка указывают на нарушения синтетической активности люминальных эпителиоцитов при холодовой адаптации.
В стромальном микроокружении ДЛП после 1-й недели адаптации отмечаются очаговые изменения в виде интерстициального отека и плазматического пропитывания межклеточного вещества, намечается тенденция к увеличению площади стромы (рис. 2). После 2-х недель адаптации очаговые изменения стромы виде плазматического пропитывания сохраняются, развивается диффузный интерстициальный отек, что приводит к статистически значимому увеличению площади стромы на 101% (рис. 2). На этом же сроке увеличивается численность тучных клеток, многие из которых имеют признаки дегрануляции.
Вены и венулы ДЛП полнокровны, в мелких венулах отмечается стаз форменных элементов крови. После 4-х недель адаптации мастоцитарная инфильтрация стромы и венозное полнокровие уменьшаются, однако прослойки межацинозной соединительной ткани остаются расширенными, а площадь стромы на 77% больше контрольных значений (р 0,05).
По данным электронной микроскопии уже после 1-й недели адаптации в стромальном микроокружении ДЛП увеличивается представительство клеток с секреторным фенотипом, вблизи которых располагаются волокнистые структуры. Однако на светооптическом уровне в расширенных прослойках межацинозной соединительной ткани выявляется умеренное количество коллагеновых и эластических волокон, что свидетельствует о низком уровне десмопластических реакций.
Одним из факторов, ограничивающих адаптационные возможности предстательной железы, является окислительный стресс. Биохимические проявления окислительного стресса в сыворотке крови появляются уже на 1-й неделе адаптации, нарастают ко 2-й неделе, но манифестация окислительного стресса наступает после 4-х недель (см. табл. 4), когда отмечается статистически значимое снижение уровня витамина Е и окислительный стресс в предстательной железе верифицируется гистохимически и иммуногистохимически.
У некоторых животных после 4-х недель адаптации в ДЛП мкм обнаруживаются морфологические признаки воспаления, степень выраженности которых варьирует от лимфоцитарной инфильтрации стромы до накопления клеток воспалительного экссудата в просветах ацинусов.
* 3500 * контроль 1 неделя 2 недели 4 недели Рисунок 2. Динамика площади стромальных компонентов ДЛП на этапах адаптации к низким температурам.
* – различия статистически значимы с контролем при р 0,05.
Таким образом, после 4-х недель адаптации простата, как биологическая система, не возвращается к исходному уровню структурно-функциональной организации. Обнаруженные изменения свидетельствуют о том, что предстательная железа перешла на новый уровень функционирования, адекватный изменившимся условиям среды.
4. Морфофункциональная характеристика предстательной железы через 48 дней после завершения адаптации Как и на этапах адаптации к низким температурам, через 48 дней после завершения адаптации более значительные структурные перестройки были обнаружены в ДЛП. В эпителии секреторных отделов ДЛП обнаруживаются участки гиперплазии, локализующиеся в области пальцевидных выпячиваний.
Анализ данных морфометрии показал (рис. 3, а, б), что по сравнению с мкм мкм группой контроля на 11% увеличивается высота люминальных эпителиоцитов 35 31,34* (р 0,05), что свидетельствует о гипертрофии клеток. На 63% увеличивается 29,08 30 * относительная площадь24,48* эпителия (р 0,05), что объективизирует наличие гипертрофии и гиперплазии эпителия ДЛП.
25 21, 15 10 * 4000 * Контроль через 48 дней Контроль через 48 дней эпителий строма просветы ДЛП ВП а). б).
Рисунок 3. а). Высота люминальных эпителиоцитов простаты интактных крыс и через 48 дней после завершения адаптации. б). Площадные характеристики гистологических компонентов ДЛП интактных крыс и через 48 дней после завершения адаптации. Примечание: * – различия статистически значимы с контролем при р 0,05.
Очаговая гиперплазия эпителия, обнаруженная в ДЛП через 48 дней после адаптации, имеет компенсаторную направленность (Bossland M.C. et al., 1998;
Odum J. et al., 2009). Начиная со 2-й недели адаптации к низким температурам отмечается усиление десквамации железистого эпителия, которая приобретает после 4-х недель адаптации массовый характер, и обусловлена, по нашему мнению, гиперсекреторным состоянием клеток. Таким образом, обнаруженную гиперплазию эпителия можно позиционировать как физиологическую регенерацию с увеличением числа клеток сверх исходного уровня в силу инерции компенсации физиологических потерь клеток (Казанин В.И., 2004).
Предвестники гиперплазии эпителия ДЛП в виде усиления процессов соматической полиплоидии появились уже после 4-х недель адаптации, но пролиферативная активность клеток на данном этапе не достигла уровня морфологической и количественной визуализации процесса. Поэтому очаговую гиперплазию эпителия мы наблюдаем в ДЛП спустя 48 дней после адаптации.
Феномен гипертрофии люминальных эпителиоцитов, обнаруженный в ДЛП через 48 дней после адаптации, в большинстве случаев имеет адаптивное значение (Казанин В.И., 2004). Можно предположить, что гипертрофия эпителия ДЛП, как и его гиперплазия, является отсроченной во времени компенсаторно-приспособительной реакцией, обусловленной повышенной секреторной активностью. Таким образом, гиперплазия и гипертрофия эпителия, представляют собой компенсаторно-приспособительные реакции железистого эпителия ДЛП, обусловленные развитием общего адаптационного синдрома, и, следовательно, являются обратимым состоянием.
Через 48 дней после завершения адаптации пролиферативный потенциал железистого эпителия ДЛП угнетается, что проявляется уменьшением численности полиплоидных гландулоцитов относительно контроля на 44% (р 0,05). Это подтверждает обратимый характер гиперплазии эпителия ДЛП, и может являться необходимым условием для поддержания пролиферативного гомеостаза эпителия.
Активная десквамация секреторных эпителиоцитов, имеющая место в ДЛП через 48 дней после завершения адаптации, также указывает на обратимость явлений гипертрофии и гиперплазии эпителия. На этапах адаптации к низким температурам наблюдалась десквамация практически интактных эпителиоцитов (так называемая, донекротическая десквамация), но через 48 дней после адаптации в просветах ацинусов в большом количестве обнаруживаются деформированные эпителиоциты с гиперхромными и сморщенными ядрами, либо фрагменты клеток. В железистом эпителии ДЛП отмечаются дегенеративные изменения люминальных эпителиоцитов в виде средне- или крупновакуольной дистрофии.
Через 48 дней после адаптации (рис. 3) в ДЛП по сравнению с контролем увеличивается площадь поверхности фиброзно-мышечной стромы на 176% (р 0,05), отмечаются умеренный диффузный фиброз и эластоз стромы. Однако волокнистые структуры имеют признаки деградации, что свидетельствует об обратимом характере изменений стромального микроокружения. Длительное гиперсекреторное состояние эпителия приводит к увеличению площади просветов ацинусов ДЛП (рис. 3).
Таким образом, структурные преобразования эпителиального и стромального компонентов простаты, индуцированные адаптацией к низким температурам, обнаруживаются через 48 дней. Простата, как любая биологическая система, обладает сложными механизмами поддержания структурного гомеостаза, обеспечивающими выполнение ее физиологических функций. Вероятно, необратимые дистрофические изменения люминальных эпителиоцитов с их последующей десквамацией, являются обязательным этапом в поддержании тканевого гомеостаза простаты, необходимым для возврата системы к исходному уровню после воздействия экстремальных факторов среды.
5. Морфофункциональная характеристика семенников и простаты после 4-х недель адаптации на фоне БАД дигидрокверцетин ДКВ, как биофлавоноид, является антиоксидантом, способным связывать свободные радикалы, при этом уровень антиоксидантной активности позволяет занимать ДКВ первые позиции среди веществ со схожим спектром действия (Конкина И.Г. с соавт., 2011). По результатам биохимического исследования можно констатировать, что при адаптации к низким температурам ДКВ проявляет антиоксидантный эффект, приводя к статистически значимому снижению в сыворотке крови ДК на 28,2% и МДА на 18% (р 0,05), уровень витамина Е увеличивается на 11,3% (р 0,05), поэтому данный показатель у крыс из группы коррекции не имеет статистически значимых различий с группой контроля (рис. 4, а).
В тканях семенника на 11,2% уменьшается содержание ДК (р 0,05), что свидетельствует о коррекции биохимических проявлений окислительного стресса.
Однако уровень ГЛ в семенниках крыс, получавших ДКВ, остается повышенным, а содержание витамина Е ниже, чем в семенниках крыс из группы контроля (рис.
4, б), что может быть связано с особенностями метаболического состояния гонады в условиях адаптации к низким температурам.
60 7 * * ** 6 ** 40 * 4 * * 30 20 10 0 0 Группа Группа Группа Группа Группа Группа контроля сравнения коррекции контроля сравнения коррекции а). ДК (нмоль/г) ГЛ (нмоль/г) ДК (нмоль/г) ГЛ (нмоль/г) б).
МДА (нмоль/мл) Витамин Е (мкг/г) Рисунок 4. а). Содержание продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови.
б). Содержание продуктов перекисного окисления липидов и витамина Е в тканях семенника.
Примечание: здесь и ниже * – различия статистически значимы с группой контроля при р 0,05;
** – различия статистически значимы с группой сравнения при р 0,05.
Результаты исследования эндокринного аппарата семенников показали (табл. 7), что коррекция окислительного стресса предотвращает гибель КЛ.
Относительное количество КЛ на фоне приема ДКВ больше, чем в группе сравнения на 26,8% (р 0,05), линейные размеры ядра и цитоплазмы КЛ больше, чем в группе контроля (р 0,05). Анализ популяционного состава показал, что в семенниках крыс, получавших ДКВ, преобладающим морфофункциональным типом являются средние и большие КЛ, принимающие активное участие в синтезе стероидных гормонов. Уровень сывороточного тестостерона у крыс, получавших ДКВ, находится на уровне значений интактных животных.
Электронная микроскопия показала ультраструктурные признаки функционального напряжения КЛ в виде исчезновения полоски маргинального хроматина в ядрах, умеренного расширения везикул агранулярной эндоплазматической сети, гиперплазии элементов комплекса Гольджи, появления везикулярных расширений между кристами митохондрий.
Структурно-функциональное ремоделирование эндокринного аппарата семенников крыс, получавших ДКВ, положительно сказалось на показателях генеративной активности органа. Изучение цитологического профиля сперматогенеза показало (табл. 7), что в семенниках крыс из группы коррекции количество прелептотенных сперматоцитов относительно группы сравнения увеличилось на 23,5%, пахитенных сперматоцитов на 20,6%, круглых сперматид на 23,4% и удлиненных сперматид на 37,5%. Сперматогенные клетки с дегенеративными изменениями в извитых канальцах не встречаются.
Диаметр извитых семенных канальцев у крыс, получавших ДКВ, на 10,5% больше, чем у крыс из группы сравнения (табл. 7). Индекс сперматогенеза у крыс, получавших ДКВ, не отличается от крыс из группы сравнения и группы контроля. Исходя из результатов сравнительного анализа количественных показателей генеративной активности семенников, можно констатировать, что ДКВ предупреждает нарушения сперматогенеза, индуцированные адаптацией организма животных к низким температурам.
Таблица 7 – Количественные характеристики функциональной активности семенников интактных крыс, после 4-х недель адаптации к низким температурам и после 4-х недель адаптации на фоне приема БАД дигидрокверцетин (M±m) Показатель Группа Группа Группа контроля сравнения коррекции Генеративная активность семенника Диаметр канальцев (мкм) 277,86±1,27 255,76±1,08* 281,98±1,65** Индекс сперматогенеза 3,30±0,45 3,28±0,44 3,28±0, Число канальцев с «пробками» 0,67±0, 0,53±0,09 0,54±0, Прелептотенные сперматоциты (число) 66,03±1,29 56,83±1,15* 70,20±1,18** Пахитенные сперматоциты (число) 81,13±1,78 65,83±1,28* 79,41±0,99** Круглые сперматиды (число) 199,13±3,68 162,93±3,31* 201,03±3,46** Удлиненные сперматиды (число) 219,23±4,47 163,80±3,65* 225,62±3,27** Инкреторная активность семенника Диаметр ядра КЛ (мкм) 6,23±0,02 6,57±0,03* 6,67±0,02** Диаметр цитоплазмы КЛ (мкм) 8,31±0,03 9,04±0,04* 8,77±0,04** Относительное количество КЛ (число) 10,90±0,28 8,84±0,27* 11,21±0,32** Индекс активности КЛ 1,38 4,55 2, Тестостерон (нмоль/л) 32,36±2,03 32,17±0,83 31,25±1, Примечание: * – различия статистически значимы с группой контроля при р 0,05;
** – различия статистически значимы с группой сравнения при р 0,05.
Электронная микроскопия показала, что комплекс Гольджи в цитоплазме круглых сперматид крыс, получавших ДКВ, имеет полусферическую конфигурацию с хорошо выраженным корковым и мозговым веществом. На фоне приема ДКВ ядерный хроматин в удлиненных сперматидах имеет одинаковую электронную плотность, светлые вакуоли в ядрах отсутствуют.
Однако прием ДКВ не повлиял на восстановление структуры митохондрий в цитоплазме сперматоцитов, ранних и поздних сперматид.
Коррекция окислительного стресса оказала положительное влияние на структурно-функциональное состояние клеток Сертоли. На фоне приема ДКВ в цитоплазме клеток Сертоли отсутствует вакуолизация, имеются многочисленные митохондрии с электронноплотным матриксом, цитоплазматический матрикс имеет среднюю электронную плотность, характерную для сустентоцитов интактных крыс. Восстановление тонкой структуры клеток Сертоли, в свою очередь, обеспечивает необходимые условия для сперматогенеза.
В железистом эпителии простаты крыс, получавших ДКВ, отмечается экспрессия индуцибельной NO-синтетазы. Оптическая плотность продуктов реакции в ДЛП крыс из группы коррекции больше (р 0,05), чем у крыс из группы сравнения (табл. 8).
В эпителии ДЛП крыс, получавших ДКВ, выявляются продукты реакции с дитизоном (табл. 8), оптическая плотность которых по данным количественного анализа больше, чем у крыс из группы сравнения (р 0,05).
Таким образом, восстановление на фоне приема ДКВ экспрессии индуцибельной NO-синтетазы и концентрации хелатируемого цинка, свидетельствует о коррекции окислительного стресса в тканях простаты.
Однако прием ДКВ не повлиял на активность ШИК-реакции и на экспрессию Е-кадгерина в эпителии ДЛП. Как и у крыс, которым не проводилась коррекция, содержание ШИК-позитивных веществ в цитоплазме люминальных эпителиоцитов снижено, экспрессия Е-кадгерина отсутствует.
Таблица 8 – Оптическая плотность (усл. ед.) продуктов гистохимических и иммуногистохимических реакций (M±m) Группа коррекции Группа контроля Группа сравнения Название реакции (4 недели адаптации на (интактные крысы) (4 недели адаптации) фоне ДКВ) Дитизон 0,438±0,022 0,154±0,010* 0,386±0,032** 0,299±0,009 0,198± 0,009* NO-синтетаза 0,249±0,004** Примечание: * – различия статистически значимы с группой контроля при р 0,05;
** – различия статистически значимы с группой сравнения при р 0,05.
По результатам морфометрии площадь стромы ДЛП крыс, получавших ДКВ, не имеет статистически значимых различий с ДЛП крыс контрольной группы (рис. 5, а), что указывает на уменьшение интерстициального отека, и может быть обусловлено ангиопротекторными свойствами ДКВ (Колхир В.К. с соавт., 1995;
Тюкавкина Н.А. с соавт., 1996). По сравнению с крысами, которым не проводилась коррекция, на фоне приема ДКВ в соединительнотканной строме ДЛП уменьшается степень лимфоцитарной инфильтрации, практически отсутствует экссудация клеток воспаления в просветы ацинусов и протоков.
Результаты морфологического исследования ДЛП крыс, получавших ДКВ, показали, что для эпителиального компартмента характерны изменения, обусловленные развитием общего адаптационного синдрома. Люминальные эпителиоциты проявляют признаки повышенной функциональной активности:
зона Гольджи в цитоплазме секреторных клеток гипертрофирована, цитоплазма вакуолизирована, имеются морфологические признаки макроапокриновой Число мкм мкм секреции.В популяции люминальных эпителиоцитов (рис. 5, б), увеличивается 4000 35000 1, численность клеток с двумя ядрами (р 0,05), отмечается активная 1, 3500 десквамация клеток. * * 1, 1, 20000 0, 0, 0, 500 0, 0 0 Группа Группа Группа Группа Группа Группа контроля сравнения коррекции контроля сравнения коррекции Площадь просветов Площадь стромы Двуядерные эпителиоциты а). б).
Рисунок 5. Сравнительная характеристика некоторых количественных показателей ДЛП.
* – различия статистически значимы с группой контроля при р 0,05.
Таким образом, структурно-функциональное состояние семенников и предстательной железы крыс, получавших во время адаптации к низким температурам дигидрокверцетин, позволяет рассматривать данную БАД в качестве средства, уменьшающего негативные эффекты экстремальных климатических факторов среды на репродуктивную систему животных.
6. Морфофункциональная характеристика семенников и простаты после 4-х недель адаптации на фоне БАД моллюскам Рассмотрим БАД моллюскам в качестве средства, повышающего адаптационные возможности семенников и предстательной железы крыс, при действии на организм животных низких температур.
Изучение цитологического профиля сперматогенеза показало (табл. 9), что в семенниках крыс, получавших БАД моллюскам, относительное количество прелептотенных сперматоцитов, пахитенных сперматоцитов, круглых и удлиненных сперматид статистически значимо выше, чем в группе сравнения.
Диаметр извитых семенных канальцев у крыс, получавших моллюскам, статистически значимо больше, чем у крыс из группы сравнения (табл. 9).
Индекс сперматогенеза, характеризующий генеративную активность семенников, у крыс, получавших моллюскам, не отличается от крыс из группы контроля. Таким образом, результаты сравнительного анализа количественных данных показали, что БАД моллюскам предупреждает нарушения сперматогенеза, индуцированные адаптацией организма животных к низким сезонным температурам.
В извитых семенных канальцах фоне приема БАД моллюскам отмечается полная сохранность клеток эпителиосперматогенного пласта, количественное и качественное восстановление популяции клеток адлюминального пространства.
Митохондрии в цитоплазме пахитенных сперматоцитов и круглых сперматид имеют структуру, характерную для интактных крыс, вакуолизированные органеллы не встречаются. Комплекс Гольджи в круглых сперматидах имеет полусферическую организацию, в нем хорошо выражены корковое и мозговое вещество. Удлиненные сперматиды имеют тонкое строение, идентичное сперматидам интактных крыс. Ядерный хроматин в удлиненных сперматидах на фоне приема моллюскама имеет одинаковую электронную плотность, хорошо выражены структуры тубулобульбарного комплекса.
Таблица 9 – Количественные характеристики функциональной активности семенников интактных крыс, после 4-х недель адаптации к низким температурам и после 4-х недель адаптации на фоне приема БАД моллюскам (M±m) Показатель Группа Группа Группа контроля сравнения коррекции Генеративная активность семенника Диаметр канальцев (мкм) 277,86±1,27 255,76±1,08* 267,98±1,26** Индекс сперматогенеза 3,30±0,45 3,28±0,44 3,38±0, Число канальцев с «пробками» 0,67±0, 0,53±0,09 0,54±0, Прелептотенные сперматоциты (число) 66,03±1,29 56,83±1,15* 70,65±2,25** Пахитенные сперматоциты (число) 81,13±1,78 65,83±1,28* 76,75±2,54** Круглые сперматиды (число) 199,13±3,68 162,93±3,31* 202,75±5,7** Удлиненные сперматиды (число) 219,23±4,47 163,80±3,65* 246,75±7,45** Инкреторная активность семенника Диаметр ядра КЛ (мкм) 6,23±0,02 6,57±0,03* 6,40±0, Диаметр цитоплазмы КЛ (мкм) 8,31±0,03 9,04±0,04* 8,29±0,09** Относительное количество КЛ (число) 10,90±0,28 8,84±0,27* 12,50±0,37** Индекс активности КЛ 1,38 4,55 1, Тестостерон (нмоль/л) 32,36±2,03 32,17±0,83 30,57±2, Примечание: * – различия статистически значимы с группой контроля при р 0,05;
** – различия статистически значимы с группой сравнения при р 0,05.
На фоне приема БАД моллюскам в цитоплазме клеток Сертоли отмечается полное отсутствие вакуолизации, восстанавливается энергетический компартмент клеток и электронная плотность цитоплазматического матрикса.
Дополнительное поступление в организм животных заменимых, частично заменимых и незаменимых аминокислот, входящих в состав моллюскама (Беседнова Н.Н. с соавт., 2007), предупреждает развитие «пластической недостаточности» клеток Сертоли. Таким образом, прием БАД моллюскам способствует полноценному протеканию процессов внутриклеточной регенерации сустентоцитов, создавая структурную и функциональную основу для нормально протекающего сперматогенеза.
В семенниках крыс, получавших во время холодовой адаптации моллюскам, отмечается хорошо выраженная реакция на NO-синтетазу.
Оптическая плотность продуктов реакции, представленная в таблице 11, у крыс, получавших моллюскам, выше, чем в группе сравнения (р 0,05).
Восстановление экспрессии NO-синтетазы в клетках эпителиосперматогенного слоя, опосредованно, через синтез оксида азота, способствует полноценному осуществлению сперматогенной функции (Lee N.P., Cheng C.Y., 2008).
У крыс из группы коррекции, равно как и у крыс из группы сравнения, уровень сывороточного тестостерона находится на уровне контрольных значений.
Однако структурное обеспечение функциональной активности эндокринного аппарата семенников у крыс из группы коррекции коренным образом отличается от структурных преобразований КЛ в семенниках из группы сравнения.
На фоне приема моллюскама относительное количество КЛ в интерстиции семенников больше (р 0,05), чем в группе сравнения (табл. 9).
Популяционный состав интерстициальных гландулоцитов, а также линейные размеры цитоплазмы КЛ существенно не различаются с показателями интактных крыс (табл. 9). При электронной микроскопии КЛ ультраструктурные признаки функционального напряжения не выявляются.
Таким образом, на фоне приема БАД моллюскам эндокринный аппарат семенников функционирует в обычном режиме, обеспечивая организм животных достаточным количеством половых стероидов.
Результаты биохимического исследования показали, что в сыворотке крови крыс, получавших моллюскам, содержание МДА достоверно ниже, чем у животных из группы сравнения, и не имеет различий с группой контроля, статистически значимо увеличивается концентрация витамина Е (табл. 10).
Свободные аминокислоты в комплексе с дипептидами, входящие в состав моллюскама, представляют собой комплекс антиокислителей, выполняющих роль скэвенджеров свободных радикалов (Беседнова Н.Н. с соавт., 2007).
Следовательно, дополнительное введение молекул с антиоксидантной активностью уменьшает расход витамина Е, приводя к увеличению его концентрации в сыворотке крови. В то же время, концентрация ДК и ГЛ в сыворотке крови крыс из группы коррекции выше одноименных показателей у крыс группы контроля (табл. 10).
Таблица 10 – Содержание основных продуктов перекисного окисления липидов и витамина Е в сыворотке крови и ткани семенников (M±m) Группа ДК (нмоль/г) ГЛ (нмоль/г) МДА Витамин Е (мкг/г) (нмоль/л) Сыворотка крови Контроль 27,23±3,07 26,06±1,46 4,84±0,27 51,12±4, Группа сравнения 48,90±3,84* 32,76±1,81* 6,06±0,34* 32,48±2,29* Группа коррекции 44,96±2,31* 31,05±2,79* 4,97±0,24** 39,77±2,58** Семенник Контроль — 66,18±4,77 25,80±0,97 52,63±3, Группа сравнения — 78,90±5,03* 43,36±2,81* 38,85±1,61* Группа коррекции — 74,50±3,40 43,85±2,58* 41,40±2,19* Примечание: * – различия статистически значимы с группой контроля при р 0,05;
** – различия статистически значимы с группой сравнения при р 0,05.
В тканях семенника на фоне приема БАД моллюскам снижается содержание ДК (табл. 10), однако содержание ГЛ по сравнению с группой контроля остается повышенным, а содержание витамина Е меньше контрольных значений (р 0,05), что может быть обусловлено высокой интенсивностью стероидогенеза в условиях холодовой адаптации.
Таким образом, при окислительном стрессе, индуцированном адаптацией организма к низким сезонным температурам, моллюскам проявляет умеренную антиоксидантную активность, что обусловлено низкой атиоксидантной емкостью моллюскама. Тем не менее, коррекция моллюскамом окислительного стресса предотвращает элиминацию КЛ.
В ДЛП на фоне приема моллюскама обнаруживаются продукты реакции на NO-синтетазу, оптическая плотность продуктов реакции в цитоплазме люминальных эпителиоцитов выше (табл. 11), чем в группе сравнения (р 0,05), исходя из чего, можно констатировать, что антиоксидантный эффект моллюскама проявляется на уровне эпителиального компартмента простаты.
Восстановление реакции на NO-синтетазу может быть обусловлено не только антиоксидантными свойствами моллюскама, но и дополнительным поступлением в составе моллюскама аминокислоты аргинина, являющейся субстратом для синтеза оксида азота.
В эпителии ДЛП крыс, получавших моллюскам, отмечается высокая активность реакции с дитизоном. По данным количественного анализа (табл. 11) оптическая плотность продуктов реакции в ДЛП крыс из группы коррекции выше, чем у крыс из группы сравнения (р 0,05). Таким образом, восстановление на фоне приема моллюскама экспрессии индуцибельной NO-синтетазы и концентрации хелатируемого цинка, свидетельствует об успешной коррекции окислительного стресса в тканях простаты.
Результаты реакции на Е-кадгерин показали, что у крыс, получавших моллюскам, в железистом эпителии простаты обнаруживаются продукты реакции на Е-кадгерин в виде преципитатов светло-коричневого цвета, а оптическая плотность продуктов реакции (табл. 11) превышает одноименный показатель в группе сравнения (р 0,05). Экспрессия Е-кадгерина является важнейшей компонентой структурного гомеостаза простаты, предупреждающей пролиферацию и опухолевый рост железистого эпителия, следовательно, восстановление экспрессии Е-кадгерина положительно отражается на межклеточных взаимодействиях эпителиоцитов.
Несомненным преимуществом использования БАД моллюскам является восстановление активности ШИК-реакции в цитоплазме люминальных эпителиоцитов, подтвержденное повышением оптической плотности продуктов реакции (табл. 11). Так как гликоген в цитоплазме люминальных эпителиоцитов простаты крыс гистохимическими методами не выявляется, накопление продуктов ШИК-реакции указывает на восстановление баланса гликопротеинов в цитоплазме эпителиоцитов. Комплекс незаменимых, частично заменимых и заменимых аминокислот, а также дипептидов, входящих в состав БАД моллюскам, способствует полноценному протеканию реакций белкового синтеза в организме человека и животных (Беседнова Н.Н. с соавт, 2007).
Дополнительное поступление в организм животных эссенциальных аминокислот, по-видимому, оказывает модулирующий эффект на процессы белкового синтеза в люминальных эпителиоцитах.
Таблица 11 – Оптическая плотность (усл. ед.) продуктов гистохимических и иммуногистохимических реакций (M±m) Название реакции Группа контроля Группа сравнения Группа коррекции Семенник 0,299±0,009 0,198± 0,009* 0,268±0,012** NO-синтетаза Предстательная железа Дитизон 0,438±0,022 0,154±0,010* 0,302±0,022** ШИК-реакция 0,345±0,009 0,263±0,016* 0,417±0,016** 0,299±0,009 0,198± 0,009* 0,268±0,012** NO-синтетаза 0,302±0,013 0,226±0,018* 0,291±0,015** E-кадгерин Примечание: * – различия статистически значимы с группой контроля при р 0,05;
** – различия статистически значимы с группой сравнения при р 0,05.
Таким образом, восстановление экспрессии NO-синтетазы и Е-кадгерина, а также накопление гликопротеинов, свидетельствуют о восстановлении секреторной активности гландулоцитов простаты.
При обзорной микроскопии ДЛП крыс, получавших моллюскам, отмечается очаговая гиперплазия железистого эпителия. Анализ данных морфометрии показал (рис. 6, а), что по сравнению с группой контроля на 11,7% увеличивается высота люминальных эпителиоцитов (р 0,05), что свидетельствует о гипертрофии железистых клеток. Очаговая гиперплазия и гипертрофия эпителия повлияли на увеличение такого количественного показателя, как площадь железистого эпителия ДЛП (рис. 6, б), который превысил одноименный показатель группы контроля на 159% (р 0,05).
Статистически значимое увеличение высоты секреторных эпителиоцитов и площади, занимаемой железистым эпителием, объективно подтверждают наличие феномена компенсаторной гипертрофии и гиперплазии эпителия ДЛП.