авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Дизайн генетических элементов и оптимизация системы гетерологичной экспрессии фактора свертывания крови viii человека в клетках млекопитающих

На правах рукописи

Орлова Надежда Александровна

ДИЗАЙН ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ И ОПТИМИЗАЦИЯ

СИСТЕМЫ ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ ЭКСПРЕССИИ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ

КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2013

Работа выполнена в лаборатории биоинженерии клеток млекопитающих Федерального государственного бюджетного учреждения науки Центра «Биоинженерия»

Российской академии наук и в лаборатории биокатализа Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор химических наук, профессор, член-корр. РАН Габибов Александр Габибович ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Георгиева Софья Георгиевна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, лаборатория факторов транскрипции, заведующая лабораторией.

Судариков Андрей Борисович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Гематологический научный центр»

Минздрава России, лаборатория молекулярной гематологии, заведующий лабораторией.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им.

А.Н. Баха Российской академии наук.

Защита состоится _ октября 2013 г. в _на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу:

1119234, Москва, Ленинские Горы, д.1, стр. 12, МГУ, биологический факультет, ауд.

389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан «» сентября 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Крашенинников И.А кандидат биологических наук Актуальность проблемы Фактор свертывания крови VIII (FVIII) - это неэнзиматический кофактор фактора IXa, который при протеолитической активации образует с фактором IXa плотный нековалентный комплекс, связывающий и активирующий фактор X. Данный комплекс является основным элементом петли положительной обратной связи в каскаде свертывания крови. Дефекты гена FVIII могут приводить к развитию гемофилии А – Х-связанного рецессивного генетического заболевания с частотой встречаемости около 1 случая на 5000 мужчин. Единственной эффективной терапией гемофилии А является регулярно проводимая заместительная терапия лекарственными препаратами FVIII. Традиционный источник FVIII – это донорская плазма крови, количество которой ограничено. Ее использование в качестве сырья для получения терапевтических белков связано с риском передачи пациентам вирусных и прионных инфекций. Рекомбинантный FVIII человека (rhFVIII) для терапии гемофилии A может быть получен при помощи культивируемых клеток млекопитающих. Допущенные к медицинскому применению варианты секретируются трансфицированными rhFVIII клетками яичника китайского хомячка (CHO) или почки новорожденного хомячка (BHK) и полностью эквивалентны FVIII из донорской плазмы при проведении заместительной терапии.

Основным недостатком существующих методов получения rhFVIII является крайне низкий уровень экспрессии, вызванный большим размером целевого белка и сложным набором пост-трансляционных модификаций. При удалении домена B, составляющего значительную часть молекулы FVIII, удельная прокоагулянтная активность FVIII и его период полураспада в плазме крови практически не падают. Замена домена B на короткий линкерный пептид, обозначаемый как SQ, приводит к существенному увеличению уровня продукции FVIII в клетках CHO и почти полному протеолитическому процессингу белка предшественника до зрелой двухцепочечной формы. Медицинский препарат rhFVIII с делецией домена B (FVIII BDD SQ) допущен к медицинскому применению, его показатели эффективности и безопасности аналогичны таковым для препаратов полноразмерного rhFVIII. Типичные опубликованные уровни продуктивности для клеток линии CHO, продуцирующих FVIII BDD SQ, составляли 0,5-2 МЕ/мл, что соответствует концентрации FVIII около 0,2 мкг/мл и на несколько порядков уступает продуктивности промышленных продуцентов других рекомбинантных факторов свертывания крови (VII, IX).

Создание новых генетических конструкций для гетерологичной экспрессии биотехнологически важных белков имеет не только прикладное, но и фундаментальное значение. Современные подходы, связанные с дизайном регуляторных последовательностей гена, кодирующего интересующий белок, позволяют существенно улучшить уровень экспрессии последнего. Получение линий клеток-продуцентов с существенно бльшим уровнем секреции биологически активного rhFVIII является актуальной практической задачей, результаты решения которой будут востребованы современной биофармацевтикой и могут быть использованы для получения промышленно пригодных систем экспрессии других фармацевтически значимых белков.

Цель работы и основные задачи исследования:



Основной целью работы была демонстрация возможности получения клональной клеточной линии-продуцента rhFVIII с высокой продуктивностью и характеризация ее основных свойств.

Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику продуктивности клеточных популяций, экспрессирующих гены полноразмерного rhFVIII и делеционного варианта BDD SQ под контролем промотора CMV.

2. Разработать специализированный плазмидный вектор, позволяющий существенно повысить уровень экспрессии гена rhFVIII.

3. Получить клональные линии-продуценты rhFVIII с продуктивностью более 10 МЕ/мл при помощи разработанного вектора.

4. Исследовать основные свойства линий-продуцентов и разработать варианты лигандов для аффинной очистки rhFVIII.

Научная новизна: В результате проведения настоящей работы обнаружено, что уровень секреции клетками-продуцентами делеционного варианта rhFVIII в безбелковую культуральную среду значительно выше уроня секреции полноразмерного rhFVIII, при этом процесс амплификации трансгена rhFVIII в геноме клеток-продуцентов для генетической конструкции на основе промотора CMV идет с низкой эффективностью даже при объединении открытых рамок считывания целевого гена и селекционного маркера в составе бицистронной РНК. Было продемонстрировано, что использование нетранслируемых и фланкирующих областей гена фактора элонгации трансляции 1A (EEF1A1) китайского хомячка вместо вирусного промотора позволяет существенно увеличить уровень экспрессии в стабильно CMV rhFVIII трансфицированной культуре клеток. Включение в состав экспрессионного вектора конкатемера концевого повтора вируса Эпштейна-Барр (EBV) дает возможность увеличивать уровень экспрессии гена rhFVIII более чем в 10 раз при амплификации генетической кассеты в геноме клеток. Были впервые получены линии-продуценты делеционного варианта rhFVIII с продуктивностью 30-40 МЕ/мл при простом периодическом культивировании клеток в безбелковой среде, не использующие ко-экспрессию шаперона rhFVIII или реинжиниринг сигнальных путей и ферментных систем продуцентов. Было продемонстрировано, что лиганды для аффинной очистки rhFVIII могут быть получены как созданием моноклональных антител, так и докингом in silico библиотек химических соединений.

Теоретическая и практическая ценность: Результаты данной работы способствуют более глубокому пониманию процессов биосинтеза и секреции FVIII гетерологичными клетками.

Полученные результаты могут быть использованы для создания линий-продуцентов различных фармацевтически значимых белков и методов генотерапии гемофилии А.

Апробация работы: Основные научные результаты диссертационной работы были представлены на I Российском симпозиуме с международным участием «Биофарма-2009»

(Турция, Анталия, 25-27 мая 2009), Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 20-22 марта 2012), 16й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 16-21 апреля 2012), Международной конференции «Биология–наука XXI века» (Москва, 24 мая 2012), на 38-м Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (FEBS) «Биологические механизмы» (Санкт-Петербург, 6-11 июля 2013).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, материалов российских и международных конференций - 6. Оформлено 2 патента.

Структура и объем работы: Диссертация содержит следующие основные разделы:

введение, обзор литературы, описание материалов и методов, главы результатов собственных исследований и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы, включающий _ ссылок. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и содержит _ таблицы и _ рисунка.

Содержание работы Результаты исследования и их обсуждение 1.Создание линии продуцента фактора VIII c делецией B-домена на базе стандартной экспрессионной системы 1.1 Создание экспрессионных конструкций делеционного мутанта FVIII Экспрессионная конструкция pOptivec/F8, кодирующая полноразмерный FVIII, была создана на основе вектора pOptivec-TOPO. При клонировании варианта FVIII BDD SQ минимизировали использование ПЦР для снижения вероятности возникновения мутаций (рис. 1). Для получения стабильных линий-продуцентов использовали линеаризованные плазмиды с разрушенным геном -лактамазы.

Рисунок 1. Карта экспрессионной плазмиды pOptivec/F8BDD и общая схема клонирования CMV-prom – цитомегаловирусный промотор, F8 Kozak – природная последовательность Козак гена FVIII, F8 signal peptide – последовательность, кодирующая природный сигнальный пептид FVIII, F8BDD – ОРС FVIII BDD SQ, EMCV IRES – внутренний участок связывания рибосом EMCV, DHFR– ОРС дигидрофолатредуктазы, polyA – сигнал полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота, pUC ori – бактериальная область начала репликации, bla – ОРС -лактамазы, bla prom – промотор гена -лактамазы. Направление транскрипции генов указано стрелками. Б. Прямоугольники - линейные фрагменты ДНК, круги – плазмиды. Стадии ПЦР показаны пунктирной линией, рестрикции-лигирования – сплошной.

1.2 Получение и характеризация линии-продуцента BDD-FVIII Дефектные по dhfr клетки CHO DG-44 трансфицировали линеаризованными плазмидами в бессывороточной среде с использованием реагента, свободного от продуктов животного происхождения. Популяции стабильно трансфицированных клеток получены во всех случаях после культивирования трансфицированных клеток в селективной среде в течение 15–20 дней.

Концентрацию секретированного FVIII определяли методом ИФА. Для полноразмерного FVIII все три популяции секретировали менее 10 МЕ/л FVIII. Для делеционного варианта была обнаружена популяция с уровнем секреции BDD-FVIII 71 ± 10 МЕ/л, которая использовалась для амплификации трансгена.

Клетки выбранного пула подвергали воздействию селекционного агента метотрексата (MTX), начиная с концентрации 25 нМ. После стабилизации культуры концентрацию MTX удваивали и продолжали амплификацию (рис. 2). Не обнаружено плавного подъема уровня секреции BDD-FVIII в течение всего курса амплификации, максимальный уровень BDD-FVIII в кондиционированной среде получен после пяти последовательных шагов амплификации (0.5 мкМ MTX). Дальнейшее увеличение концентрации MTX привело к немедленному падению уровня секреции продукта в 10 раз с последующим возвращением к величинам, примерно соответствующим исходной культуре стабильно трансфицированных клеток (74 ± 6 МЕ/л для 16 мкМ MTX). Это явление предположительно обусловлено увеличением в популяции доли непродуцирующих клеток, содержащих измененную бицистронную мРНК (Fann, 2000) или амплифицированные «посторонние» гены, например ген множественной лекарственной устойчивости, кодирующий гликопротеин P (Assaraf, 1989).

Рисунок 2. Уровень секреции BDD-FVIII в конфлюентных клеточных популяциях по данным ИФА. Измерения проводили в двух повторностях, погрешности указаны для доверительных интервалов 95%.

Популяцию клеток с максимальным уровнем продукции BDD-FVIII, полученную в присутствии 0,5 мкM MTX, использовали для клонирования клеток-продуцентов методом предельного разведения (табл. 1).

Таблица 1. Секреция BDD-FVIII 10 наиболее продуктивными клональными клеточными линиями Клональная линия, номер 18 22 17 9 1 2 15 3 4 * Секретируемый BDD-FVIII, МЕ/л 502 475 434 416 410 399 395 379 378 Концентрацию секретированного продукта измеряли для прикрепленных культур в момент * достижения конфлюентности.

Не было зафиксировано существенного падения уровня BDD-FVIII в двух клональных линиях, #18 и #22, при продолжительном культивировании. Более продуктивную линию # выбрали для дальнейшего использования. Секретируемый BDD-FVIII из кондиционированной среды и клеточных лизатов отобранной клональной линии, названной DG-BDDFVIII-18, был охарактеризован методом иммуноблоттинга (рис. 3).





Рисунок 3. Иммуноблотинг секретированного и внутриклеточного BDD-FVIII «тяжелая цепь» и «легкая цепь» – гибридизация с моноклональными антителами к тяжелой и легкой цепи FVIII соответственно;

«BDD-FVIII-»

и «BDD-FVIII+» – образцы, соответствующие нетрансфицированным клеткам CHO DG-44 и клеткам линии DG-BDDFVIII-18, соответственно. Приведенные для каждого из антител дорожки соответствуют одной мембране, разделение в 7.5% ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях, молекулярные массы указаны в кДа.

Основная часть секретированного BDD-FVIII и его внутриклеточного белка предшественника была процессирована до двухцепочечной формы. Подвижность полос тяжелой и легкой цепи при ДСН-ПААГ соответствовала подвижности цепей BDD-FVIII, определенной ранее Келли и соавторами (Kelley, Jankowski et al.).

Прокоагулянтная активность BDD-FVIII в кондиционированной среде составила 0,47 МЕ/мл, а уровень антигена FVIII в этом образце, измеренный при помощи ИФА, составил 0,52 МЕ/мл. Секретируемый клональной клеточной линией DG-BDDFVIII-18 FVIII обладает полной удельной прокоагулянтной активностью.

2 Дизайн генетических элементов для оригинальной системы экспрессии p.1. В качестве элемента, обеспечивающего транскрипционную активность целевого гена, был выбран конститутивный аутологичный промотор CHO, и области, фланкирующие ген EEF1A1 клеток CHO. Ограничением векторов, включающих ОРС и протяженные регуляторные области, может являться низкая эффективность трансфекции и низкая частота амплификации целевого гена в геноме, вызванная большим размером генетической кассеты и возможностью независимой амплификации гена селекционного маркера. Для уменьшения размера генетической кассеты – создана минимальная плазмида (бэкбон), на основе которой собирался экспрессионный вектор. Для увеличения вероятности интеграции и частоты амплификации в вектор ввели фрагмент конкатемера терминальных повторов EBV.

2.1 Получение минимального базового вектора pBL Были сформулированы требования к плазмиде, которую можно использовать как основу для создания экспрессионного вектора, среди которых: 1) минимальный размер, 2) высокая копийность в бактериях, 3) пригодность для клонирования сложных последовательностей.

Для создания минимального базового вектора был применен метод инвертированной ПЦР с использованием длинных адапторных праймеров. Был получен базовый вектор – транскрипционо-неактивный и содержащий удобный для дальнейшей сборки фрагментов полилинкер.

2.2 Получение фланкирующих областей гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка Ген китайского хомячка EEF1A1 и фланкирующие его области были клонированы и депонированы в публичную базу данных GenBank под номером AY188393 авторами работы (Running Deer and Allison 2004), показавшими также, что два фрагмента AY188393, соответствующие позициям 8532–12603 и 14545–18794, содержат все необходимые элементы для стабильной экспрессии гетерологичных белков в клетках млекопитающих. Для получения данных районов нами была применена стратегия модульной сборки (рис. 4). При помощи разработанной нами программы BIOF фланкирующие районы гена EEF1A1 были поделены на 5 и 6 модулей. Небольшая длина модулей (0,8 т.п.о.) позволяла определять нуклеотидную последовательность фрагментов до их сборки, то есть быстро и экономично получить полностью корректную последовательность целевых геномных участков.

Разработанная в ходе решения этой задачи программа BIOF для разбиения геномных последовательностей на модули, содержащие гибридные рестриктные сайты, распространяется на условиях лицензии GNU GPL, программа и ее исходный код доступен по адресу http://sourceforge.net/projects/biof/. Данная стратегия клонирования (MAC, рис. 4) может применяться для других приложений, например, для получения ОРС редких транскриптов в ходе in vitro сплайсинга.

Рисунок 4. Схема принципа метода модульной сборки Мутации или неизвестные нуклеотиды обозначены звездочками, «OK» верифицированные последовательности ДНК.

Праймеры для секвенирования обозначены стрелками.

Все 11 модулей были получены при ПЦР с геномной ДНК CHO DG-44 без оптимизации условий, клонированы в T-вектор, и собраны в ходе последовательных шагов рестрикции-лигирования.

Когда были опубликованы первые данные «черновой» сборки генома CHO (Hammond, Kaplarevic et al. 2011), в них были обнаружены те же отличия от AY188393, что и у нас, за исключением двух замен. Следует отметить, что фрагменты сборки генома CHO, примыкающие к гену EEF1A1 - AFTD01093962 и AFTD01093963.1, не полностью перекрываются с последовательностью AY188393, то есть в опубликованной сборке отсутствует фрагмент длиной 810 п.о., соответствующий нуклеотидам 11387 - AY188393 (Рис. 5). Полученная нами последовательность, предположительно, лучше отражает истинную последовательность этих районов, так как была достигнута большая избыточность при секвенировании клонов, содержащих короткие субфрагменты. Одна однонуклеотидная замена и инсерция двух нуклеотидов, не совпадающие со сборкой генома CHO и AY188393, встречались во всех проанализированных клонах, и могут быть обусловлены ошибками ПЦР или мутациями генома сублинии CHO DG-44.

Рисунок 5. Известные данные о геномной последовательности областей, фланкирующих ген EEF1A1 китайского хомячка Схематически изображены имеющиеся на данный момент в данные о последовательности областей генома, окружающих ген EEF1A1. UFRи DFR - upstream, downstream flanking regions– районы, фланкирующие ген EEF1A1, использованные при создании вектора p1.1.

2.3 Получение экспрессионного вектора p.1. Экспрессионный вектор p1.1 (рис. 6) был собран на основе разработанного нами нетранскрибируемого вектора pBL-2, в который были последовательно добавлены собранные из модулей геномные области, фланкирующие ген EEF1A1 CHO, фрагмент конкатемера терминальных повторов EBV, EMCV IRES и ОРС DHFR мыши.

Рисунок 6. Карта экспрессионного вектора p 1.1 и общая схема клонирования А. pUC ori – область начала репликации;

bla – ОРС -лактамазы, bla prom – промотор гена лактамазы;

EBVTR - участок терминального повтора EBV;

EMCV IRES – внутренний сайт связывания рибосом EMCV;

DHFR – ОРС дигидрофолатредуктазы мыши для селективного отбора и амплификации в эукариотических клетках;

CHO EEF1A1 UFR и DFR - районы, фланкирующие ген EEF1A1 CHO, pA - сигнал полиаденилирования гена EEF1A1 CHO;

TATA, transcription start – ТАТА бокс и точка начала транскрипции;

CHO EEF1A1 intron 1 – первый интрон гена EEF1A1 CHO.

Стрелками указаны направления транскрипции генов. Б. Прямоугольники - линейные фрагменты ДНК, круги – плазмиды. Стадии ПЦР показаны пунктирной линией, рестрикции-лигирования – сплошной.

Был также создан контрольный вектор p1.1 (EBVTR-) без повторов EBV. На основе этих векторов получены экспрессионные конструкции p1.1-eGFP и p1.1(EBVTR-)-eGFP с геном зеленого флуоресцентного белка для проверки их функциональных свойств.

2.4 Проверка свойств вектора p1.1 и определение условий получения стабильно трансфицированных линий клеток и амплификации трансгена для модельного белка eGFP Клетки CHO DG-44 трансфицировали сверхскрученными плазмидами и через 48 часов определяли интенсивность флуоресценции eGFP в лизате клеток и долю флуоресцирующих клеток. Установлено, что доля транзиентно трансфицированных клеток и общий уровень продукции eGFP не различались для случаев трансфекции клеток CHO DG-44 плазмидами сходной длины, содержащими или не содержащими участок EBVTR. Эффективность транзиентной трансфекции для плазмид на основе вектора p1.1 была значительно ниже, чем для контрольной плазмиды pEGFP-N2 с минимальным вирусным промотором, что объясняется большей длиной вектора p1.1.

Линеаризованные плазмиды p1.1-EGFP и p1.1(EBVTR-)-EGFP использовали для трансфекции клеток и последующей селекции стабильно трансфицированной популяции.

Культура, трансфицированная плазмидой p1.1-EGFP, содержащей участок EBVTR, проходила минимум клеточной плотности на 11-й день культивации в селективной среде, при этом плотность составила 147,5 тыс. клеток/мл при доле жизнеспособных клеток 27,7%.

В случае плазмиды p1.1(EBVTR-)-EGFP, без EBVTR, минимум был достигнут на 13-ый день культивации в селективной среде, при этом плотность составила 42,5 тыс. клеток/мл при доле жизнеспособных клеток 3,6%. Средний уровень экспрессии целевого гена eGFP для обеих полученных популяций не имел существенных различий – 62, тыс. ОЕФ/50 тыс. клеток и 63,8 тыс. ОЕФ/50 тыс. клеток, соответственно. Таким образом, участок EBVTR не влияет на средний уровень экспрессии трансгена для стабильно трансфицированных линий клеток.

Для количественной оценки уровня интеграции плазмид в геном продуцентов через 48 ч после трансфекции клетки перемещали в селекционную среду и высевали в лунки микропланшетов по 5 тыс. клеток на лунку. Через 2 недели после посева подсчитывали общее число выросших колоний, число флуоресцирующих колоний и уровень флуоресценции для нескольких колоний с максимальной интенсивностью флуоресценции (табл. 2). При высевании в лунки планшетов клеток, обработанных трансфекционным реагентом без добавления плазмид, колониеобразования не происходило.

Таблица 2. Эффективность колониеобразования при стабильной трансфекции клеток CHO плазмидами с участком EBVTR и без него При получении олигоклональных линий-продуцентов eGFP трансфекция плазмидой, содержащей участок EBVTR, позволила увеличить количество позитивных колоний в 40 раз, при этом уровень экспрессии целевого гена для самой продуктивной олигоклональной линии был выше в 4,6 раза. При получении олигоклональных популяций стабильно трансфицированных плазмидой p1.1-EGFP клеток в присутствии 50 нМ MTX было установлено, что удельный уровень флуоресценции для 10 наиболее продуктивных олигоклональных популяций приблизительно в два раза выше, чем в случае селекции олигоклонов в среде без MTX (Рис. 7А). Для получения более продуктивных линий, экспрессирующих ген eGFP, проводили амплификацию целевого гена в геноме клеток под действием MTX. Популяции клеток, стабильно трансфицированные плазмидами p1.1-EGFP и p1.1(EBVTR-)-EGFP высевали в лунки микропланшетов в присутствии различных концентраций MTX. В случае плазмиды p1.1(EBVTR-)-EGFP не наблюдали значимого увеличения уровня флуоресценции при использовании МТХ в концентрациях до 200 нМ, также не наблюдали образования колоний при концентрациях МТХ 400 и 800 нМ (данные не приводятся). Для олигоклональной линии, полученной при трансфекции клеток плазмидой p1.1-EGFP, были получены колонии для всех концентраций MTX, результаты измерения удельной интенсивности флуоресценции лизатов клеток для 8 колоний с максимальным уровнем экспрессии eGFP (для каждого уровня MTX) приведены на рис. 7Б.

Таким образом, наличие участка EBVTR в плазмиде p1.1 существенно увеличивает скорость амплификации целевого гена и позволяет получать высокопродуктивные линии в короткие сроки (15 дней) под действием высоких концентраций МТХ. Возможный механизм действия участка EBVTR при амплификации целевого гена – образование шпильки на одноцепочечной ДНК при транспозиции области целевого гена, ускорение амплификации трансгенов по механизму транспозиции описано в работе (Tanaka, Tapscott, 2002). Наиболее вероятно образование шпильки между участками GGGGGCCGCGGG (нуклеотиды 161-172) и или образующими CCCGCAGCCCCC (84-95) CCCGCGGACCCC (100-111), инвертированные повторы с одной некомплементарной парой нуклеотидов.

Рисунок 7. Удельная интенсивность флуоресценции для наиболее продуктивных олигоклональных линий, экспрессирующих eGFP.

A Уровень экспрессии еGFP для 10 наиболее продуктивных олигоклональных лунок, при культивации в среде, содержащей 0 и 50 нМ МТХ;

Б. Уровень экспрессии еGFP для 8 наиболее продуктивных олигоклонов, полученных при амплификации трансгена под действием различных концентраций MTX;

исходная олигоклональная популяция получена без МТХ. Для всех серий панели Б – 1 шаг амплификации трансгена под действием MTX, для каждого уровня MTX анализировали по 2x96 лунок. В. Постоянство экспрессии eGFP линиями-продуцентами при суспензионном культивировании (пассирование 1 раз в 4 дня). ОЕФ – относительные единицы флуоресценции.

Показано, что продуктивность нескольких наилучших олигоклональных линий может быть увеличена приблизительно в 5 раз при выполнении однократной процедуры амплификации.

Для 10 олигоклональных линий были получены моноклональные линии -продуценты eGFP, из них для 6 линий с различными уровнями продуктивности измеряли динамику удельной флуоресценции при продолжительном культивировании. Значимого изменения уровня продуктивности не наблюдалось ни в одной из линий (рис. 7В), что позволяет заключить, что линии-продуценты, полученные при трансфекции клеток CHO DG- плазмидой на основе вектора p1.1 и последующей одностадийной амплификации целевого гена, сохраняют стабильный уровень экспрессии целевого гена в течение 60 дней. Такой срок сохранения неизменного уровня продукции целевого белка обычно считается достаточным для промышленного использования линий-продуцентов в биофармацевтике.

3.Получение и характеризация линий-продуцентов BDD-FVIII на основе разработанной системы экспрессии Генетическая конструкция p1.1-F8BDD была получена лигированием ОРС FVIII BDD SQ и консенсусной последовательности Козак с вектором p1.1, обе НТО из кДНК FVIII были полностью удалены, и ОРС FVIII была полностью перемещена в контекст гена EEF1A1. Трансфекцию и получение первичной популяции клеток-продуцентов проводили в тех же условиях, что и для плазмиды pOptivec/F8BDD. Обнаружено, что уровень секреции FVIII для транзиентно трансфицированной культуры составляет 9 мМЕ/мл, а для стабильно трансфицированной популяции – 0,134 МЕ/мл по данным ИФА. Полученную популяцию использовали для проведения амплификации целевого гена в адгезионной культуре при концентрациях MTX 50, 100, 200, 400 нМ;

одновременно с этим повторно провели трансфекцию клеток CHO DG-44 плазмидой p1.1-FVIII-BDD и провели первичную селекцию продуцентов в присутствии 50 нМ MTX в условиях адгезионной культуры. Наиболее продуктивные олигоклональные линии реадаптировали к культивации в суспензионных условиях. Результаты анализа продуцентов для различных уровней селекционного давления приведены на рис 8.

Рисунок 8. Уровень секреции FVIII при амплификации трансгена при помощи MTX или первичной селекции в адгезионной культуре.

А – уровень секреции для лучших 10 олигоклональных линий, отобранных среди 182 лунок для каждой использованной концентрации MTX, измерение в момент достижения конфлюентности в первых 10% лунок. Б – уровень секреции FVIII для олигоклональных линий после реадаптации к суспензионному культивированию. Концентрация FVIII измерена ИФА для культуральной среды, взятой по достижении клетками концентрации 1,2 млн клт/мл. Планки погрешностей соответствуют стандартным отклонениям, n=2. Линии 2-F6, 3-B8, 4-H6 получены первичной селекцией в адгезионной культуре, остальные линии получены при концентрации MTX 200 нМ.

Установлено, что одностадийная амплификация трансгена для первичной популяции клеток под действием 200 нМ MTX и первичная селекция олигоклональных линий в присутствии 50 нМ MTX приводят к получению линий со сходной продуктивностью, не уступающей продуктивности большинства описанных в литературе моноклональных линий продуцентов делеционных вариантов FVIII. Для дальнейшей амплификации трансгена была выбрана олигоклональная линия 3-B8, полученная первичной селекцией при концентрации MTX 50 нМ и секретирующая только интактный FVIII по данным иммуноблоттинга (рис. 9).

Рисунок 9. Иммуноблотинг секретированного и внутриклеточного BDD-FVIII для различных продуцентов «heavy chain» и «light chain» – гибридизация с моноклональными антителами к тяжелой и легкой цепи FVIII соответственно;

«CMV» и «CHEF1» – образцы, соответствующие клеткам линии DG-BDDFVIII 18 (промотор CMV) и 3-B8 (промотор CHEF1), соответственно. Приведенные для каждого из антител дорожки соответствуют одной мембране, разделение в 7.5% ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях, молекулярные массы указаны в кДа.

При постепенном повышении концентрации MTX в суспензионной культуре линии 3 B8 было обнаружено, что существенное падение жизнеспособности клеток наблюдается при концентрации MTX 1 мкМ. Наиболее продуктивная поликлональная популяция клеток была получена при культивации в присутствии 4 мкМ MTX (табл. 3) и использована для генерации клональных линий-продуцентов методом конечных разведений.

Была получена 361 изолированная колония, среди которых была выбрана наиболее продуктивная моноклональная линия-продуцент 11A4H, обладающая удельной продуктивностью 7,7 мкМЕ/клт/д по данным коагулометрии и временем деления 30 ч.

При культивировании линии 11A4H в перемешиваемой колбе в течение пяти суток в стандартной безбелковой культуральной среде ProCHO 4 был достигнут уровень FVIII:С 39±3 МЕ/мл при конечной концентрации клеток 3,5 млн/мл и жизнеспособности более 85%.

Для выбранной линии 11A4H постоянство уровня секреции FVIII было подтверждено для 60 дней последовательного культивирования в отсутствие MTX (данные не приводятся).

Таблица 3. Схема получения и продуктивность основных линий и популяций продуцентов FVIII * - измерение концентрации FVIII по ИФА, стандарт – полноразмерный рекомбинантный FVIII.

** - измерение активности FVIII одностадийным коагулометрическим методом.

*** - измерение активности FVIII двухстадийным коагулометрическим методом.

Методом ПЦР-РВ подтверждена амплификация экспрессионной кассеты в геноме CHO (рис. 10).

Рисунок 10. Копийность экспрессионной кассеты в геноме по данным ПЦР-РВ.

А. Изменение средней копийности экспрессионной кассеты в ходе амплификации. ID- данные, полученные при помощи праймеров к области IRES-DHFR, F8B - к области ОРС SQ FVIII BDD.

Приведена схема амплификации, где указаны использованные концентрации MTX.

Б. Данные для праймеров к области гена пептидил-пролил изомеразы B (PPIB), предположительно уникальной для генома CHO. В. Копийность кассеты для трех клонов-продуценты FVIII - 13B4F, 11A4H, 21A7B. SPCD - удельная продуктивность клонов, мкМЕ/клт./день. Приведено число копий на гаплоидный геном CHO. Данные представлены в виде «среднее значение ± стандартное отклонение от среднего».

Сравнение данных, полученных с использованием праймеров к области IRES и гена дигидрофолатредуктазы мыши и праймеров к ОРС FVIII-BDD (области SQ делеции В домена) показало сохранение сцепления гена селекционного маркера и целевого гена, то есть интактности экспрессионной кассеты при амплификации. Установлено, что линия-продуцент 11A4H содержит 29±1 копий трансгена на гаплоидный геном.

При анализе кДНК методом ПЦР-РВ не выявлено значимых отличий в уровне транскрипции трансгена между тремя клонами с максимальной продуктивностью (рис.11 A), одновременно с этим уровень секреции продукта был максимален для клона с повышенным уровнем экспрессии шаперона BiP (рис.11 Б).

Рисунок 11. Анализ кДНК клонов–продуцентов FVIII методом ПЦР-PB. А Экспрессия трансгена, % от -актина. Б. Изменение уровня экспрессии генов по сравнению с DG44. Нормирование данных вели по уровню - актина. EiF1a1- фактор инициации трансляции 1A эукариот, EiF3- фактор инициации трансляции 3 эукариот, PPIB- пептидил-пролил изомераза B (циклофилин B), BIP – иммуноглобулин-связывающий белок субъединица комплекса (Grp78);

OSTC олигосахарилтрансферазы;

St3gal –бетагалактозид-2,3-сиалил трансфераза III;

B4gal - -1,4 галактозилтрансфераза I. 13B4F, 11A4H, 21A7B – клоны-продуценты FVIII, FIXp – контрольная популяция продуцентов фактора IX. Данные представлены в виде «среднее значение ± стандартное отклонение от среднего».

Методом гибридизации по Саузерну для клонов 11A4H и 21A7B было установлено, что копии интегрированного в геном клеток-продуцентов экспрессионного вектора в основном присутствуют в неизменном виде (рис. 12).

Для области ОРС FVIII не обнаруживается рестриктных фрагментов измененной длины, а для областей DHFR, EMCV IRES, bla наблюдается присутствие одного укороченного рестриктного фрагмента, что может указывать на наличие преобладающего разрыва последовательности ДНК экспрессионной конструкции в одной из этих областей, то есть предположительного нахождения преобладающей точки рекомбинации ДНК экспрессионной конструкции и геномной ДНК клетки-хозяина в одной из них.

Рисунок 12. Анализ геномной ДНК клонов – продуцентов FVIII методом гибридизации по Саузерну c меченными биотином зондами.

FVIII probe - гибриизация с зондом к области ОРС FVIII, IRES-DHFR-bla – с зондом к вспомогательным областям экспрессионной кассеты (ОРС DHFR, EMCV IRES, bla, pUC18 ori). Разделение в 0,8% TBE-агарозе, геномная ДНК рестрицирована EcoRI.

Изображения ДНК в геле инвертированы, контраст сканограмм окрашенных мембран увеличен для улучшения видимости полос гибридизации.

4.Разработка подходов к очистке рекомбинантного белка BDD-FVIII 4.1 Очистка и характеризация BDD-FVIII Выделение и очистку FVIII из культуральной среды проводили при помощи пяти последовательных стадий хроматографии, ультрафильтрацию и сходные методы разделения не использовали из-за необратимого связывания FVIII с материалом ультрафильтрационных мембран. Данные гель-электрофореза белковых фракций, полученных на трех первых стадиях очистки, приведены на Рис. 13, таблица очистки приведена в Таб. 4. Было установлено, что гомогенный по данным электрофореза препарат FVIII может быть получен при помощи стадий очистки на сорбентах Capto MMC, SP Sepharose, VIII Select, однако удельная прокоагулянтная активность, соответствующая фармакопейным требованиям для лекарственного препарата делеционного варианта FVIII «ReFacto», достигается только после проведения пяти стадий очистки. Общий выход целевого белка (по прокоагулянтной активности) составил более 20%, что позволяет считать использованный процесс выделения и очистки пригодным для промышленного использования.

Рисунок 13.

Электрофореграмма белковых фракций препарата FVIII в процессе хроматографической очистки.

Обозначения: M – маркер;

MMC wash – фракции промывки, стадия 1;

SP el – фракции элюции, стадия 2;

VIII ff – фракция проскока, стадия 3;

VIII el – фракция элюции, стадия 3. HC – тяжелая цепь, LC – легкая цепь. Молекулярные массы указаны в кДа.

Восстанавливающие условия, окраска коллоидным Кумасси синим. Дорожки A, B, C приведены из Sandberg H. et al//Semin Hematol, V.38, N.2, (2001), 41-42.

Таблица 4. Таблица очистки FVIII Активность, активность, FVIII, тыс.

Объем, мл № стадии Удельная МЕ/мл** Сорбент Кол-во мг/мл* стадии Выход Выход общий МЕ/мг Белок, МЕ Тип хроматографии Культуральная среда 0 - 320 -- 36,3 - 11,6 - Мультимодальная катионообменная 1 Capto MMC 17 0,233 496,9 2133 8,45 73% 73% Катионообменная 2 SP Sepharose 10 0,271 538,1 1986 5,38 64% 46% Аффинная 3 VIII Select 11 0,046 382,0 8304 4,2 78% 36% Анионообменная + гель- Capto Q + фильтрация 4+5 Superdex 75 10 0,026 284,1 10925 2,84 68% 24% Примечания: *- на стадиях 0-3 измерение по методу Брэдфорд, на стадии 4+5 УФ-спектрометрией;

**- измерение прокоагулянтной активности методом АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время).

Идентификацию триптических пептидов очищенного BDD-FVIII проводили методом масс-спектрометрии. В масс-спектрах триптических гидролизатов цепей BDD-FVIII и одноцепочечной формы белка были обнаружены пики, суммарно соответствующие пептидам, составляющим 44% общей длины BDD-FVIII. В стандартном режиме работы масс-спектрометра (positive mode) не был выявлен пик пептида, потенциально содержащего три остатка сульфотирозина, а также не выявлены пики пептидов, содержащих три полностью занятых сайта N-гликозилирования, одновременно с этим присутствовали пики пептидов, содержащих частично заполненные сайты О-гликозилирования T1651, T1652, пики пептидов, потенциально содержащих одиночные остатки сульфотирозинов и пик пептида 37-47, содержащего частично заполненный сайт N-гликозилирования N41.

Присутствие в спектрах пиков пептидов с немодифицированными остатками тирозина может быть объяснено как их неполным сульфатированием, так и фрагментацией пептидов при ионизации.

4.2 Компьютерное моделирование, поиск синтетического лиганда для очистки При получении фармацевтических препаратов FVIII с помощью иммуноаффинных сорбентов у пациентов выявлены аллергические реакции на остаточный иммуноглобулин мыши (Larson, Альтернативой иммунсорбентам являются сорбенты с 2004).

иммобилизованными малыми молекулами (Morrill, 2002). Компьютерное моделирование таких лигандов было проведено в две последовательные стадии: докинга виртуальной библиотеки химических соединений Asinex против пространственных рецепторных решёток доменов C1 и C2 FVIII, и докинга виртуальной библиотеки ChemBridge против тех же пространственных рецепторных решеток. Для проверки релевантности выбранных сайтов связывания использовались известные лиганды FVIII - L3 и L4. Для поиска сайтов связывания были выбраны поверхности доменов C1 и C2 FVIII, содержащие большое количество как ионизированных, так и гидрофобных боковых цепей аминокислот (согласно анализу распределения заряда и гидрофобных областей по поверхности FVIII при помощи утилиты SiteMар), и образующие область контакта FVIII c мембраной (Shen, 2008;

Ngo, 2008).

Над поверхностями потенциальных сайтов связывания были расположены границы рецепторных решёток кубической формы со стороной 34 ангстрема. Докинг лигандов L3 и L4 в рецепторные решётки предполагаемых сайтов связывания доменов C1 и C2 дал величины композитного индекса Glidescore в диапазоне -7 -9. Докинг библиотек химических соединений производился по схеме последовательного обогащения более энергетически выгодными лигандами, связывающимися с рецепторными сайтами. Докинг библиотеки Asinex позволил отобрать 40 наиболее энергетически выгодных молекул кандидатов, величина Glidеscorе для которых соответствовала диапазону Glidеscorе конформеров L3 и L4. Соединения с наилучшими (наиболее отрицательными) значениями Glidеscorе показаны на рис.12. Значительная часть (24) этих соединений имели в составе карбоксильную группу (16 из 24 содержали 2 и более карбоксильных групп).

Рисунок 14. Кандидатные лиганды, отобранные из библиотеки химических соединений Asinex Gold L3 (справа вверху) и L (справа внизу) – структурные формулы соответствующих лигандов.

Поскольку проведение докинга по исходной схеме для большей по размеру виртуальной библиотеки химических соединений ChemBridge потребовало бы около недель вычислений одной рабочей станции, для второго этапа докинга использовали только соединения, пригодные для иммобилизации на подложке, а также 3 рабочие станции. После фильтрации библиотеки ChemBridge было обнаружено около 120 тыс. молекул, содержащих первичную аминогруппу или карбоксильную группу. Данные молекулы были пакетно модифицированы путем включения в их состав концевого участка соответствующей линкерной группы. Был проведён докинг полученной библиотеки в решётки докинга вершин доменов C1 иC2. Величины Glidеscorе для кандидатных лигандов (рис. 13) соответствовали области значений Glidеscorе для конформеров L3 и L4 и для выбранных на первом этапе докинга кандидатов из библиотеки Asinex.

Рисунок 15. Структурные формулы модифицированных кандидатных лигандов, отобранных из библиотеки химических соединений «ChemBridge».

4.3 Получение моноклональных антител для иммуноаффинной очистки Промышленная очистка белка BDD-FVIII включает в себя четыре стадии обычной хроматографии и одну стадию аффинной хроматографии. Таким образом, ключевым компонентом всего процесса может быть мкАт, способное связывать BDD-FVIII из культуральной среды или из промежуточного концентрата и диссоциировать в мягких условиях элюции. Моноклональные антитела, пригодные для аффинной очистки BDD-FVIII, получены путем скрининга гибридомных клонов (продуцирующих антитела к FVIII) при помощи ИФА. Были отобраны четыре клона с высоким титром специфических антител и максимальной чувствительностью к промывке лунок раствором этиленгликоля (табл. 4).

Таблица 5. Свойства моноклональных антител, чувствительных к этиленгликолю Все четыре отобранных мкАт избирательно связывались с тяжелой цепью BDD-FVIII при иммуноблотинге (данные не приведены). Очищенные мкАт, полученные из асцитной жидкости, были иммобилизованы на хроматографическом сорбенте в соотношении 1 мг мкАт на 1 мл осажденного сорбента. Полученные иммуносорбенты использовали для выделения BDD-FVIII непосредственно из кондиционированной среды методом адсорбции в объеме. В таких условиях наблюдалась неполная адсорбция BDD-FVIII (около 20–30%), но практически весь адсорбированный целевой белок удерживался на сорбенте при промывке PBS и элюировался 50% раствором этиленгликоля. Уровень FVIII во фракции несвязавшихся белков и во фракциях элюатов измеряли при помощи коагулометрического теста.

Присутствие активного FVIII во фракциях элюата указывало на то, что в использованных условиях элюции не происходит существенного повреждения продукта.

Таким образом, получены мкАт, потенциально пригодные для препаративной иммуноаффинной очистки рекомбинантного FVIII.

Заключение В настоящей работе рассмотрены способы получения высокопродуктивной линии продуцента фактора свертывания крови VIII с делецией области B-домена и описаны возможные варианты лигандов для проведения аффинной очистки FVIII.

При генерации линий-продуцентов FVIII с помощью общепринятых плазмидных векторов с промотором цитомегаловируса нами было установлено, что уровень секреции полноразмерного FVIII в безбелковую культуральную среду значительно ниже, чем уровень секреции В-домен делетированного варианта. При амплификации трансгена в геноме клеток продуцентов под действием метотрексата уровень секреции функционально активного делеционного варианта FVIII был доведен до 0,5 МЕ/мл, при этом было обнаружено, что общая эффективность процесса амплификации для генетической конструкции с областью ОРС FVIII невысока, несмотря на использование бицистронной матрицы, кодирующей целевой белок и селекционный маркер. Продуктивность полученной системы экспрессии соответствовала имеющимся литературным данным, полученным ранее для векторов, кодирующих раздельные мРНК FVIII и селекционного маркера. Было предположено, что относительно низкий уровень экспрессии гена FVIII в клетках CHO может быть существенно увеличен при переносе открытой рамки считывания FVIII в специально сконструированный плазмидный вектор, включающий протяженные регуляторные области гена домашнего хозяйства китайского хомячка, фрагмент концевого повтора вируса, увеличивающий частоту интеграции кассеты в геном и как можно более короткий участок ДНК, необходимый для наработки плазмиды в бактериях. Согласно литературным данным, высокий и постоянный уровень экспрессии целевых генов наблюдался при переносе их ОРС в контекст гена фактора элонгации трансляции 1 альфа (EEF1A1), однако векторы на основе данного гена были практически непригодны для амплификации трансгена в геноме продуцентов и обладали довольно низкой частотой интеграции в геном.

Нами были последовательно решены вспомогательные задачи по получению «нетранскрибируемого» плазмидного вектора минимального размера и молекулярному клонированию протяженных фрагментов гена EEF1A1. При помощи полученных фрагментов был сконструирован плазмидный вектор p1.1 для трансфекции клеток млекопитающих. На примере ОРС модельного флуоресцентного белка eGFP, клонированной в вектор p1.1, были найдены условия проведения трансфекций клеток линии CHO и амплификации трансгена в геноме продуцентов, позволяющие за короткое время создавать продуктивные и стабильные линии-продуценты.

Генетическая конструкция p1.1-F8BDD, кодирующая делеционный вариант FVIII, была трансфицирована в клетки CHO по разработанной методике, что позволило получить олигоклональные линии-продуценты FVIII с продуктивностью 5-10 МЕ/мл при помощи одной-двух стадий селекции и амплификации. Обнаруженный уровень продуктивности не уступал мировым результатам, достигнутым для клональных линий-продуцентов, полученных многостадийным отбором. При дальнейшей амплификации трансгена возрастающими концентрациями метотрексата и последующей генерации клональных линий были получены линии с продуктивностью до 39 МЕ/мл и проведен их молекулярный анализ, продемонстрировавший высокую копийность трансгена и высокий уровень мРНК целевого гена при отсутствии значимого числа аберрантных копий целевого гена. Таким образом, повышение уровня мРНК FVIII в клетках-продуцентах является достаточным условием для многократного увеличения уровня секреции функционально активного FVIII в безбелковую культуральную среду, позволяющего вести его экономически обоснованный промышленный выпуск.

Поскольку медицинское применение препаратов FVIII предполагает его полную очистку от белков продуцента, нами была исследована возможность обнаружения низкомолекулярных лигандов, специфически связывающих FVIII, методами скрининга библиотек химических соединений in silico, а также получена панель моноклональных антител, узнающих эпитопы в составе тяжелой цепи FVIII и пригодных для адсорбции FVIII из культуральной среды и практически полной десорбции функционально активного FVIII.

Созданный в ходе настоящей работы плазмидный вектор p1.1 и исследованные методы его применения могут быть использованы для получения высокопродуктивных клеточных линий, секретирующих фармацевтически значимые белки.

Выводы Создана генетическая конструкция для экспрессии полипептида структурного 1.

варианта фактора VIII с делетированным B-доменом, соответствующего разрешенному к применению в клинической практике белку. Установлено, что при использовании стандартного плазмидного вектора на основе промотора цитомегаловируса (CMV) и кДНК дигидрофолатредуктазы могут быть получены линии-продуценты фактора VIII с уровнем секреции 0,5 МЕ/мл. Амплификация созданной трансгенной конструкции в геноме клеток CHO-DG44 под действием метотрексата позволяет увеличивать продуктивность в 2,3 раза по целевому белку.

Для стабильной экспрессии гетерологичных белков с высоким уровнем на основе 2.

нетранслируемых областей гена фактора элонгации трансляции 1 альфа китайского хомячка и фрагмента конкатемера концевого повтора вируса Эпштейна-Барр создан специализированный вектор p1.1. На модельном белке (eGFP) показано, что конструкции на основе созданного вектора интегрируются в геном клеток CHO-DG44 с высокой эффективностью. Использование данной системы позволяет многократно увеличивать уровень экспрессии целевого гена при амплификации под действием метотрексата и обеспечивает постоянный уровень экспрессии целевого гена в течение длительного времени.

При трансфекции клеток линии CHO-DG44 генетической конструкцией состоящей из 3.

вектора p1.1 и кДНК фактора VIII с делетированным B-доменом при одностадийной селекции получены клональные линии-продуценты фактора VIII с продуктивностью 5 10 МЕ/мл, что не уступает известным мировым аналогам. После многостадийной амплификации трансгенной конструкции под действием метотрексата получена стабильная клональная линия-продуцент делеционного варианта фактора VIII 11A4H, секретирующая фактор VIII в концентрации 39 МЕ/мл, что существенно превосходит известные показатели для промышленных продуцентов данного белка. Таким образом, установлено, что увеличение уровня мРНК фактора VIII является достаточным для многократного повышения уровня его секреции трансфицированными клетками CHO.

Разработаны подходы к очистке и характеризации рекомбинантного фактора VIII 4.

человека. Методом скрининга библиотек химических соединений in silico отобраны кандидатные молекулы, потенциально пригодные для аффинной очистки фактора VIII.

Получены и охарактеризованы моноклональные антитела, позволяющие проводить аффинную очистку активного фактора VIII. Разработана пятистадийная схема очистки фактора VIII, секретируемого линией 1A4H. Получаемый этим методом гомогенный препарат обладает удельной активностью 11 тыс. МЕ/мг, что соответствует данным для известных лекарственных препаратов на основе рекомбинантного фактора VIII.

Список публикаций по теме диссертации Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Orlova N.A., Kovnir S.V., Vorobiev I.I., Yuriev A.S., Gabibov A.G., Vorobiev A.I. Stable Expression of Recombinant Factor VIII in CHO Cells Using Methotrexate-Driven Transgene Amplification // Acta Naturae. 2012. V.4. № 1. P. 93-101.

2. Мацкевич В.А., Орлова Н.А., Воробьев И.И., Юрьев А.С., Воробьев А.И. Поиск низкомолеклярного лиганда для аффинной хроматографической очистки фактора свертывания крови VIII человека молекулярным докингом in silico // Математическая биология и биоинформатика. 2011. Т. 6. № 1. С. 14-22.

3. Орлова Н.А., Ковнир С.В., Воробьев И.И., Габибов А.Г., Воробьев А.И. Фактор свертывания крови VIII – от эволюции к терапии //Acta Naturae. 2013. Т. 5. № 2. C. 19-39 (Обзор) 4. Orlova N.A., Kovnir S.V., Vorobiev I.I., Gabibov A.G. Coagulation Factor IX for Hemophilia B Therapy // Acta Naturae. 2012. V4. № 2. P. 62-75 (Обзор) Статьи в рецензируемых журналах:

1. Orlova N.A., Orlov A.V., Vorobiev I.I. A modular assembly cloning technique (aided by the BIOF software tool) for seamless and error-free assembly of long DNA fragments // BMC Research Notes.

2012. 5:303.

Тезисы:

1. Orlova N.A., Kovnir S.V., Vorobiev I.I., Vorobiev A.I., Gabibov A.G. Design of genetic elements and expression system optimization for high-level coagulation factor VIII production in mammalian cells // Federation of European Biochemical Societies Congress 2013 «Mechanisms in Biology». FEBS Journal 280 (Suppl. 1). 2013. P. 2. Воробьев И.И., Орлова Н.А., Ковнир С.В. Методы получения рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII // Тезисы научно-практической конференции «Достижения в гематологии и трансфузиологии». Гематология и трансфузиология. 2009. Т.54, N1. С. 28-29.

3. Орлова Н.А., Ковнир С.В., Усакин Л.А., Воробьев И.И. Плазмидный вектор р1.1 для высокоэффективной стабильной экспрессии гетерологичных белков в культивируемых клетках китайского хомячка // Биология – наука ХХI века: 16-я Международная Пущинская школа конференция молодых ученых. Сборник тезисов. Пущино. 2012. С. 137.

4. Orlova N.A., Kovnir S.V., Vorobiev I.I., Gabibov A.G., Vorobiev A.I. Generation of a high-level factor VIII producer cell line using expression system bearing untranslated regions of the elongation factor alpha gene of Chinese hamster // Proceedings of the International Scientific Conference «Pharmaceutical and Medical Biotechnology». Moscow. 2012. P. 114-115.

5. Орлова Н.А., Ковнир С.В., Воробьев И.И. Оптимизация системы гетерологичной экспрессии фактора свертывания крови VIII человека // Актуальные проблемы биохимии и биотехнологии.

Сборник трудов. Казань. 2012. С. 210-213.

6. Орлова Н.А., Ковнир С.В., Воробьев И.И., Габибов А.Г., Воробьев А.И. Высокопродуктивная линия-продуцент фактора свертывания крови VIII человека на основе вектора с нетранслируемыми областями гена фактора элонгации трансляции 1 альфа китайского хомячка // Материалы Международной конференции «Биология–наука XXI века». Москва. 2012. C. 655-656.

Патенты:

1. Орлова Н.А., Ковнир С.В., Воробьев И.И., Юрьев А.С., Воробьев А.И. Экспрессионная генетическая конструкция рOptivec/F8BDD, кодирующая рекомбинантный фактор свертываемости крови VIII человека с делецией В домена и клеточная линия DG OV F8BDD 18, продуцирующая рекомбинантный фактор свертываемости крови VIII человека с делецией В домена. Патент РФ № 2429294. Приоритет от 23.10.2009 // Бюл. «Изобретения. Полезные модели», № 26, 2. Орлова Н.А., Ковнир С.В., Воробьев И.И. Экспрессионный плазмидный вектор для гетерологичной экспрессии рекомбинантных белков, высокочастотной интеграции и усиленной амплификации экспрессионной кассеты в клетках млекопитающих, бицистронная мРНК, способ получения стабильных линий продуцентов рекомбинантных белков с использованием указанного вектора, способ получения рекомбинантных белков. Патент РФ № 2488633. Приоритет от 16.11.2011 // Бюл. «Изобретения. Полезные модели», № 21,

 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.