авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Регуляция 24-эпибрассинолидом метаболизма цитокининов в растениях пшеницы

На правах рукописи

ЮЛДАШЕВ РУСЛАН АДИКОВИЧ

РЕГУЛЯЦИЯ 24-ЭПИБРАССИНОЛИДОМ МЕТАБОЛИЗМА

ЦИТОКИНИНОВ В РАСТЕНИЯХ ПШЕНИЦЫ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

УФА 2009

2

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Шакирова Фарида Миннихановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Клячко Нелла Леопольдовна Институт физиологии растений РАН доктор биологических наук, профессор Веселов Станислав Юрьевич Башкирский государственный университет

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный университет

Защита состоится «» 2009 г. в «_» ч на заседании диссертационного совета ДМ002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН по адресу: 450054, Уфа, пр. Октября,

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71 и на сайте ИБГ УНЦ РАН: http://www.anrb.ru/molgen/dissov.html

Автореферат разослан «» 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. С.М.Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Гормональной системе отводят лидирующую роль в регуляции метаболизма растений, лежащего в основе роста и развития в ходе онтогенеза, а также адаптации к изменяющимся условиям произрастания. Каждый из фитогормонов участвует в регуляции таких интегральных физиологических процессов как рост, развитие и дифференцировка растений в нормальных условиях произрастания и при их изменении, что указывает на активное взаимодействие их друг с другом в единой системе регуляции жизнедеятельности (Chow, McCourt, 2004;

Reski, 2006;

Goda et al., 2008;

Fukaki, Tanaka, 2008;

Kuppusamy et al., 2008;

Bari, Jones, 2009). Нужно отметить, что изучение молекулярных механизмов действия брассиностероидов (БС) имеет общебиологическое значение. В связи с тем, что они являются структурными аналогами стероидных гормонов животных, это может способствовать пониманию общих закономерностей функционирования систем регуляции метаболизма не только растений, но и других организмов (Geldner et al., 2007).

К настоящему времени накопилось много сведений об участии БС в регуляции протекания разнообразных метаболических процессов в растениях, причем благодаря отличительной особенности БС проявлять свой эффект на разные культуры в исключительно низких в сравнении с действием других гормонов концентрациях их относят к уникальному классу фитогормонов (Haubrick, Assmann, 2006;

Howell et al., 2007;

Jager et al., 2008), более того, высказывают мнение об их лидирующей роли среди фитогормонов (Khripach et al., 2000). С начала открытия у БС было продемонстрировано сочетание ярко выраженного ростстимулирующего и защитного в отношении разных по природе неблагоприятных факторов действия на растения, обусловленного их тесным взаимодействием с другими фитогормонами (Kuperin et al., 2008;

Arteca, Arteca, 2008;

Vert et al., 2008;

Bari, Jones, 2009).

Ранее в нашей лаборатории было выявлено, что обработка проростков пшеницы 24-эпибрассинолидом (ЭБ) в оптимальных в стимуляции ростовых процессов концентрациях вызывает в них стойкое двукратное накопление цитокининов (ЦК) на фоне отсутствия изменений в уровне индолилуксусной (ИУК) и абсцизовой (АБК) кислот (Шакирова и др., 2002;

Авальбаев и др., 2003). Это позволило предположить, что эндогенные цитокинины могут играть важную регуляторную роль в проявлении физиологического действия ЭБ на растения, как в нормальных условиях произрастания, так и при стрессовых воздействиях. В пользу возможности вовлечения цитокининов в реализацию физиологического действия ЭБ могут служить сведения об участии гормонов цитокининовой природы в активации ростовых процессов и формировании защитных реакций, обусловленных индукцией под их влиянием чувствительных к ним генов (Hare et al., 1997;

Liu, Huang, 2002;

Boonman et al., 2007;

Werner et al., 2008;

Potters et al., 2009). Однако встает вопрос, что лежит в основе ЭБ-индуцированной стимуляции накопления цитокининов и поддержания их повышенного вдвое содержания в растениях пшеницы при обработке ЭБ.

Цель и задачи исследований. Цель работы заключалась в выявлении механизмов регуляции 24-эпибрассинолидом метаболизма гормонов цитокининовой природы в растениях пшеницы. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) Исследовать характер влияния ЭБ на новообразование цитокининов в растениях пшеницы посредством оценки количественного уровня нуклеотида зеатина и изопентиниладенозина, являющихся первыми соединениями на пути биосинтеза зеатина.

2) Провести анализ динамики содержания О-глюкозидов как наиболее распространенной запасной формы активных цитокининов в проростках пшеницы при обработке 24-эпибрассинолидом.

3) Для принципиальной оценки участия 24-эпибрассинолида в катаболизме цитокининов исследовать его влияние на активность ключевого фермента деградации цитокининов цитокининоксидазы и уровень экспрессии кодирующего этот фермент гена в растениях пшеницы.



4) В сравнительном аспекте исследовать пути гормональной регуляции транскрипции гена дегидрина и концентрации пролина, как важнейших осмопротектантов растений под влиянием 24-эпибрассинолида и синтетического аналога зеатина 6-бензиламинопурина.

Научная новизна. Раскрыты механизмы регуляции индуцированного 24-эпибрассинолидом стойкого двукратного увеличения концентрации цитокининов в растениях пшеницы. Выявлено, что они связаны как с усилением новообразования цитокининов, о чем судили по увеличению уровня нуклеотида зеатина и суммарного содержания производных изопентиниладенина и резкому возрастанию запасных форм цитокининов О-глюкозидов, так и с уменьшением ферментативной активности и уровня экспрессии гена цитокининоксидазы, что обеспечивало торможение распада цитокининов. Получены приоритетные сведения о существовании альтернативных путей гормональной регуляции количественного уровня пролина и экспрессии TADHN гена дегидрина пшеницы: 6-бензиламинопурин (БАП) регулирует накопление пролина и усиление транскрипции гена дегидрина опосредовано через повышение эндогенной АБК, тогда как ЭБ – независимо от АБК.

Практическая значимость работы. Совокупность полученных результатов свидетельствует о тонкой регуляции 24-эпибрассинолидом метаболизма гормонов цитокининовой природы в растениях пшеницы и расширяет знания об особенностях функционирования разных групп фитогормонов в единой гормональной системе. Сочетание у брассиностероидов свойств стимулировать ростовые процессы растений и одновременно индуцировать в них формирование защитных реакций делает их привлекательными для широкого использования в растениеводстве.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на 9 и 10 международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2005;

2006), годичных собраниях Общества физиологов растений России (Ростов, 2006, Екатеринбург, 2008), международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), XV международном конгрессе Федерации Европейских Обществ Физиологов Растений (Франция, 2006), VI съезде Общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007).

Конкурсная поддержка работы. Исследования поддержаны грантами РФФИ №№ 04-04-48853, 04-04-48900, 08-04-01563а, а также Программой государственной поддержки ведущих научных школ РФ - НШ-1785.2003.4, НШ–3692.2006.4, НШ–915.2008.4.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в журналах из перечня ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 145 страницах и иллюстрирована 27 рисунками и 1 таблицей. Список литературы включает наименования.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования служили проростки пшеницы Triticum aestivum L.

сорта Башкирская 24. Семена пшеницы проращивали в кюветах на фильтровальной бумаге, смоченной водопроводной водой, при 21-230С, 16-часовом фотопериоде и освещенности 15 клк в течение 3-х суток. После отделения эндосперма проростки выдерживали сутки на растворе 2%-ной сахарозы для снятия раневого стресса (Шакирова, Безрукова, 1998) и переносили на среду, содержащую смесь 2%-ной сахарозы с различными фитогормонами, после чего корни и побеги фиксировали в жидком азоте для последующего анализа в зависимости от задач. Контролем служили проростки, инкубированные на растворе 2%-ной сахарозы.





Содержание свободных форм АБК, ИУК и цитокининов определяли в одной растительной навеске, состоящей из корней 4-суточных проростков, методом непрямого твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа с использованием специфичных к этим соединениям кроличьих антител и меченных пероксидазой антикроличьих антител, детально описанного ранее (Shakirova et al., 2003). Концентрирование и очистку цитокининов проводили с использованием картриджа С18, как описано ранее (Vysotskaya et al., 2003).

Количество О-глюкозидов оценивали по разнице иммунореактивности до и после обработки водного остатка образца – глюкозидазой (Веселов, 1998).

Активность цитокининоксидазы определяли согласно оригинальной методике (Веселов, Симонян, 2004). Оценку содержания пролина проводили с использованием метода Bates (1973).

О росте судили по изменению линейных размеров проростков, корней и побегов, а также их сырой и сухой массы. Митотическую активность апикальной меристемы корней проростков оценивали цитологическими методами с использованием окуляр-микрометра при анализе не менее клеток (Паушева, 1988). Митотический индекс (МИ) рассчитывали как процент делящихся клеток.

РНК выделяли гуанидинтиоцианатным методом (Boothe et al., 1995).

Дот-блот анализ проводили по методу, описанному Sambrook et al. (1989).

Количественную оценку РНК генов цитокининоксидазы и TADHN дегидрина пшеницы в точках гибридизации осуществляли сканированием рентгеновской пленки и обработки изображений с помощью программы TotalLab.

Для получения кДНК на основе мРНК исследуемых генов проводили реакцию обратной транскрипции с использованием M-MuLV обратной транскриптазы согласно протоколу поставщика. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе типа ТП4-ПЦР-01-“Терцик” (“ДНК-Технология”, Россия). После амплификации фрагменты ДНК фракционировали методом электрофореза в 1-2% агарозном геле или 7% ПААГ.

Опыты проводили в двух-четырех биологических и четырех-шести аналитических повторностях. В иллюстрациях представлены средние арифметические значения и ошибки средних.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Значение эндогенных цитокининов в проявлении ростстимулирующего действия 24-эпибрассинолида на растения пшеницы. Ранее было выявлено, что оптимальными в активации роста корней являются концентрации ЭБ 0.4 нМ и 0.4 мкМ (Шакирова, 2001). Поскольку ЭБ в этих концентрациях вызывал почти двукратное увеличение содержания ЦК в растениях (Авальбаев и др., 2003), можно предположить, что именно с этим эффектом ЭБ связано проявление его ростстимулирующего действия на проростки пшеницы. В связи с этим нами были предприняты опыты с обработкой растений пшеницы ЭБ в вышеуказанных концентрациях, а также в концентрации 4 нМ, характеризующейся наименьшим стимулирующим действием на рост корней (Шакирова, 2001).

На рис. 1А видно, что обработка проростков ЭБ в оптимальных в стимуляции роста концентрациях вызывала почти двукратное увеличение количественного уровня ЦК в корнях, тогда как при воздействии ЭБ в концентрации 4 нМ, неоптимальной в стимуляции роста, наблюдалось существенно меньшее повышение содержания ЦК в корнях.

Известно, что одной из наиболее характерных для ЦК ответных реакций является стимуляция роста клеток делением и растяжением (Кулаева, 1973;

Pasternak et al., 2000;

Kim, Park, 2007). Активация деления и элонгации клеток разных растительных объектов также выявлена и для брассиностероидов (Rao et al., 2002;

Mussig, 2005;

Howell et al., 2007;

Fu et al., 2008). В связи с этим мы проанализировали влияние ЭБ в разных концентрациях на митотическую активность апикальной меристемы корней 4-суточных проростков пшеницы.

Из рис. 1Б видно, что ЭБ во всех исследованных концентрациях оказал стимулирующий эффект на деление клеток апикальной меристемы корней, однако вновь обращает на себя внимание факт наличия корреляции митотической активности клеток корней с уровнем эндогенных цитокининов:

ЭБ в оптимальных в стимуляции роста корней концентрациях, 0.4 нМ и 0.4 мкМ, повышал митотический индекс корней более чем на 50% в сравнении с контролем, тогда как 4 нМ ЭБ – не более чем, на 30%.

Б А 0.4 нМ ЭБ 250 4 нМ ЭБ Cодержание цитокининов, Митотический индекс, 0.4 мкМ ЭБ % от контроля % от контроля 100 3 9 24 0.4 нМ 4 нМ 0.4 мкМ 24-Эпибрассинолид Bремя, ч Рис. 1. Влияние 24-эпибрассинолида в разных концентрациях на динамику содержания эндогенных цитокининов (А) и митотический индекс клеток кончиков корней 4-сут проростков пшеницы (Б). 4-сут проростки инкубировали 24 ч на опытных растворах Полученные результаты указывают на корреляцию между способностью ЭБ стимулировать рост корней в исследованных концентрациях и накоплением цитокининов в них, соответственно, и дают основание полагать, что стимуляции роста корней обработанных ЭБ проростков может реализоваться опосредовано через увеличение содержания эндогенных цитокининов.

Динамика ЭБ-индуцированного накопления цитокининов в корнях и побегах пшеницы. Обнаружено, что ЭБ в корнях вызывал существенное увеличение концентрации ЦК уже через 5 минут от начала воздействия (рис. 2), которое сохранялось на уровне почти вдвое выше контрольного значения даже на протяжении 30 ч инкубирования проростков на ЭБ (рис. 3). В побегах двукратное накопление ЦК наблюдалось позднее, через час (рис. 2), что согласуется с данными о том, что местом преимущественного синтеза ЦК являются корни, из которых они затем транспортируются в побеги (Кулаева, 1973;

Incoll et al., 1990;

Sakakibara, 2005).

Для поддержания повышенного уровня ЦК необходим именно ЭБ, поскольку удаление его из среды инкубации проростков приводит к снижению до уровня контроля содержания ЦК через 1 ч в корнях и 2-3 ч – в побегах (рис. 4).

побеги корни Содержание цитокининов, 0.4 мкМ ЭБ 0.4 мкМ ЭБ Содержание цитокининов, 0.4 нМ ЭБ 0.4 нМ ЭБ % от контроля % от контроля 150 100 5 15 30 60 120 300 5 15 30 60 120 Время, мин Время, мин Рис. 2. Динамика содержания цитокининов в корнях и побегах при коротких экспозициях проростков пшеницы на среде, содержащей 0.4 нМ и 0.4 мкМ 24-эпибрассинолид К Содержание цитокининов, 0.4 мкМ ЭБ нг/г сырой массы 9 24 Время, ч Рис. 3. Динамика содержания цитокининов в корнях проростков пшеницы при длительной экспозиции их на растворе 0.4 мкМ 24-эпибрассинолида Полученные данные свидетельствуют в пользу важной роли эндогенных цитокининов в проявлении физиологического действия 24-эпибрассинолида на растения пшеницы и вероятности участия ЭБ в регуляции метаболизма цитокининов.

корни побеги 300 ЭБ Содержание цитокининов, Содержание цитокининов, ЭБ 0.4 мкМ ЭБ 0.4 мкМ ЭБ % от контроля % от контроля 0.4 нМ ЭБ 0.4 нМ ЭБ -ЭБ -ЭБ 1 2 3 1 3 1 2 3 1 3 Время, ч Время, ч Рис. 4. Влияние присутствия 24-эпибрассинолида и его удаления из среды инкубирования на содержание цитокининов в корнях и побегах 4-сут проростков пшеницы Участие 24-эпибрассинолида в регуляции деградации цитокининов в растениях пшеницы. Известно, что содержание активных форм ЦК в растениях эффективно регулируется цитокининоксидазой (ЦО), обеспечивающей их распад (Hare, van Staden, 1994;

Novakova et al., 2005). В связи с этим можно было предположить, что ЭБ-индуцированное увеличение содержания эндогенных ЦК в проростках пшеницы обусловлено торможением их деградации под влиянием ЭБ. Нами были проведены опыты по оценке влияния ЭБ на интенсивность транскрипции гена цитокининоксидазы и ее ферментативную активность в корнях и побегах проростков пшеницы.

Оказалось, что ЭБ вызывал существенное торможение транскрипционной активности экспрессии гена ЦО сначала в корнях (через 30 мин), а затем в побегах (через 3 ч), причем максимальный уровень вызванного ЭБ снижения транскрипционной активности гена ЦО в целом сопоставим в корнях и побегах (рис. 5А).

В то же время детальный анализ содержания ЦК в корнях проростков выявил их значительное накопление уже через 5 мин от начала воздействия ЭБ (рис. 2). Столь быстрые изменения в содержании цитокининовых гормонов могут быть обусловлены изменениями в ферментативной активности ЦО под влиянием ЭБ. Действительно, в корнях обработанных ЭБ проростков некоторое уменьшение активности ЦО наблюдалось уже через 5 мин;

через 20 мин оно достигало 30%-ного уменьшения от уровня контроля, которое сохранялось на этом уровне в течение всего опыта (рис. 5Б). ЭБ тормозил активность ЦО также в побегах, причем исходный уровень активности ЦО в побегах превышал таковую в корнях, а ингибирование под влиянием ЭБ активности фермента в побегах более сильно выражено (рис. 5Б).

побеги корни А Экспрессия гена ЦО, Экспрессия гена ЦО, % от контроля % от контроля К 0.5 1 3 7 К 0.5 1 3 Время, ч Время, ч корни побеги Б 400 пмоль/мг белка*ч пмоль/мг белка*ч 300 Активность ЦО, Активность ЦО, 200 100 Контроль Контроль 0.4 мкМ ЭБ 0.4 мкМ ЭБ 0 5 20 40 60 5 20 40 Время, мин Время, мин Рис. 5. Влияние 0.4 мкМ 24-эпибрассинолида на экспрессию гена (А) и ферментативную активность (Б) цитокининоксидазы в корнях и побегах 4-сут проростков пшеницы. К – контроль Удаление ЭБ из среды инкубирования вызывало постепенное возвращение транскрипционной активности гена цитокининоксидазы к контрольному значению, которое в корнях фиксировалось уже через 30 мин после прекращения действия гормона, а к трем часам - уровень экспрессии ЦО корней опытных проростков соответствовал контролю. В побегах заметное увеличение уровня транскриптов ЦО наблюдалось позднее – через 1 ч после прекращения обработки (рис. 6А). Что касается ферментативной активности ЦО, то в корнях активность ЦО возрастала до контрольного значения уже к мин прекращения действия гормона, а в побегах - к 60 мин (рис. 6Б).

корни побеги А 120 120 ЭБ -ЭБ ЭБ -ЭБ 100 Экспрессия гена ЦО, Экспрессия гена ЦО, % от контроля % от контроля 80 60 40 20 0 К 3 0.5 1 К 3 0.5 1 Время, ч Время, ч корни побеги Б Контроль 400 800 Контроль 0.4 мкМ ЭБ 0.4 мкМ ЭБ пмоль/мг белка*ч пмоль/мг белка*ч Активность ЦО, Активность ЦО, 5 20 40 60 40 5 20 40 60 40 ЭБ -ЭБ ЭБ -ЭБ Время, мин Время, мин Рис. 6. Влияние присутствия 24-эпибрассинолида и его удаления из среды инкубирования на экспрессию гена (А) и ферментативную активность (Б) цитокининоксидазы в корнях и побегах 4-сут проростков пшеницы. К-контроль Таким образом, нами впервые продемонстрировано участие ЭБ в регуляции ферментативной активности и экспрессионного статуса гена ЦО в растениях пшеницы.

Влияние 24-эпибрассинолида на новообразование гормонов цитокининовой природы в растениях пшеницы. ЭБ-индуцированное увеличение содержание эндогенных ЦК в проростках пшеницы может быть обусловлено и влиянием ЭБ на новообразование цитокининов. В связи с этим мы исследовали влияние 0.4 мкМ ЭБ на суммарный уровень производных изопентиниладенина, иммунореактивных к сыворотке, полученной к изопентиниладенозину, и нуклеотида зеатина (НК), которые рассматривают в качестве первичных соединений на пути биосинтеза зеатина (Haberer, Kieber, 2002;

Hirose et al., 2008). Обнаружено, что обработка проростков ЭБ вызывала существенное увеличение нуклеотида зеатина и суммарного уровня производных изопентиниладенина и в корнях, и в побегах 4-сут проростков пшеницы (рис. 7А), что свидетельствует в пользу активации под влиянием ЭБ синтеза ЦК.

корни побеги А 500 500 НК НК Содержание форм ЦК, ИПА Содержание форм ЦК, ИПА 400 % от контроля % от контроля 300 200 100 0 0,5 1 3 0,5 1 Время, ч Время, ч корни побеги Б 800 0.4 мкМ ЭБ 0.4 мкМ ЭБ % от контроля о-глюкозидов, % от контроля о-глюкозидов, Содержание Содержание 400 0 10 20 40 10 20 Время, мин Время, мин Рис. 7. Влияние 0.4 мкМ 24-эпибрассинолида на уровень нуклеотида зеатина и суммарное содержание производных изопентиниладенина (А) и накопление О-глюкозидов (Б) в корнях и побегах 4 сут проростков пшеницы Другим механизмом регуляции быстрого накопления ЦК может служить гидролиз O-глюкозидов - запасных форм активных ЦК. Однако, как видно из рис. 7Б, в ответ на обработку ЭБ и в корнях, и побегах наблюдалось быстрое и довольно сильное повышение уровня O-глюкозидов. По-видимому, этот результат связан с тем, что опыты проводились на молодых активно метаболизирующих интенсивно растущих проростках, не имеющих больших резервов цитокининов, и накопление O-глюкозидов может служить дополнительным доводом в пользу активации под влиянием ЭБ биосинтеза ЦК, значительно превышающих запросы на них побегов, избыток которых выводится в запасной пул.

Влияние предобработки 24-эпибрассинолидом на рост и гормональный статус проростков пшеницы при засолении. При сравнении функций брассиностероидов и цитокининов обращает на себя внимание тот факт, что обе эти группы фитогормонов обладают ярко выраженным ростстимулирующим и антистрессовым действием (Liu, Huang, 2002;

Чернядьев, 2005;

Arteca, Arteca, 2008;

Vert et al. 2008;

Bajguz, Hayat, 2009). В связи с этим, можно предположить, что не только ростстимулирующий, но и антистрессовый эффект ЭБ может быть опосредован регуляцией под его влиянием стойкого увеличения вдвое уровня цитокининов. Поэтому мы провели анализ влияния ЭБ на рост растений пшеницы в норме и при воздействии засоления с оценкой вклада эндогенных цитокининов в этот процесс.

Из рис. 8 видно, что предобработка 3-сут проростков пшеницы 0.4 мкМ ЭБ в течение 24 ч хотя и не предотвращала повреждающего действия засоления на рост растений пшеницы, но значительно снижала его степень. Кроме того, оценка интенсивности деления клеток корней проростков пшеницы, предобработанных и необработанных ЭБ и подвергнутых кратковременному воздействию засоления, выявила защитный эффект фитогормона на этот показатель, который проявился в поддержании повышенного уровня МИ клеток меристемы кончиков корней предобработанных ЭБ проростков в сравнении с необработанными (рис. 9).

Митотический индекс, % 1 проростка, см Длина 8 К NaCl ЭБ+NaCl К NaCl ЭБ + NaCl 1 проростка, мг Рис. 9. Митотическая активность Сырая масса клеток меристемы кончиков корней 75 обработанных и необработанных 24-эпибрассинолидом 4-сут проростков пшеницы в условиях засоления. 3-сут проростки К NaCl ЭБ+NaCl предобрабатывали в течение 24 ч 0.4 мкМ ЭБ и затем подвергали действию 2%-ного NaCl в течение 1 проростка, мг 3 ч. Контрольные проростки (К) Сухая масса 7, обрабатывали дистиллированной водой 6, Известно, что рост растений К NaCl ЭБ+NaCl находится под контролем эндогенной гормональной системы Рис. 8. Влияние предобработки 24-эпибрассинолидом на ростовые и одновременный анализ разных параметры проростков пшеницы в групп фитогормонов в одних и тех условиях засоления. 3-сут проростки инкубировали в течение 24 ч на среде, же растениях позволяет получить содержащей 0.4 мкМ ЭБ, и затем комплексную картину изменений в подвергали воздействию 2%-ного NaCl в течение 7 ч. Контрольные растения (К) состоянии гормональной системы. В обрабатывали дистиллированной водой связи с этим нами был проведен анализ количественного уровня АБК, ИУК и ЦК в предобработанных и необработанных ЭБ растениях, подвергнутых воздействию 2%-ного хлорида натрия.

Как видно из рис. 10, засоление вызывает в растениях перестройки в гормональной системе, связанные с накоплением АБК и существенным снижением уровня ауксина и ЦК. Предобработка ЭБ способствовала снижению степени повреждающего действия 200 К NaCl ЭБ ЭБ+NaCl нг/г сырой массы солевого стресса на баланс АБК и Содержание АБК, ИУК, в то время как содержание ЦК в предобработанных ЭБ и подвергнутых стрессу растениях поддерживалось на уровне 2 4 предобработанных гормоном растениях в норме.

нг/г сырой массы Содержание ИУК, Следовательно, способность ЭБ регулировать метаболизм ЦК, вероятно, лежит в основе предотвращения снижения в обработанных ЭБ растениях 2 4 концентрации цитокининовых гормонов при засолении, что, в нг/г сырой массы конечном счете, может Содержание ЦК, способствовать повышению 50 устойчивости предобработанных ЭБ растений пшеницы к натрий хлоридному засолению.

2 4 Время, ч Таким образом, полученные Рис. 10. Динамика содержания АБК, результаты свидетельствуют в ИУК и цитокининов в пользу важной роли эндогенных ЦК предобработанных и необработанных 24-эпибрассинолидом 4-сут проростках в проявлении ростстимулирующего пшеницы в условиях засоления.

действия ЭБ в норме, а также, 3-сут проростки предобрабатывали в течение 24 ч 0.4 мкМ ЭБ и затем вероятно, и в поддержании ростовых переносили на среду с 2%-ным NaCl.

процессов растений при стрессе на Контрольные растения обрабатывали дистиллированной водой уровне близком контролю.

Сравнительный анализ влияния 24-эпибрассинолида и 6-бензиламинопурина на уровень осмопротектантов в растениях пшеницы.

С целью выявления возможного вклада эндогенных ЦК в реализацию предадаптирующего действия ЭБ на растения к последующему воздействию стресса нами были проведены опыты по сравнительному анализу влияния ЭБ и БАП на уровень экспрессии TADHN гена дегидрина и концентрацию пролина как ключевых осмопротектантов, играющих важную роль в формировании устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды, вызывающим обезвоживание (Beck et al., 2007;

Silva-Ortega et al., 2008).

Уровень экспрессии 3.7 мкМ АБК % от контроля гена TADHN, 0.4 мкМ ЭБ 1 3 6 12 16 Время, ч Рис. 11. Уровень экспрессии гена TADHN дегидрина в корнях 4-сут обработанных 3.7 мкМ АБК и 0.4 мкМ 24-эпибрассинолидом проростков пшеницы Из данных, приведенных на рис. 11 и 12, видно, что ЭБ и БАП повышали уровень экспрессии TADHN гена дегидрина пшеницы, хотя динамика этого процесса в ответ на обработку гормонами заметно различалась. Так, ЭБ вызывал относительно быстрое усиление экспрессии TADHN гена, сопоставимое по времени с действием экзогенной АБК, являющейся признанным индуктором транскрипции генов дегидринов (Аллагулова и др., 2003), с максимумом на 6 ч, правда, уступая ей по уровню действия. В то время как активация транскрипционной активности TADHN гена дегидрина под влиянием БАП происходила лишь спустя 6 ч от начала воздействия (рис. 12).

Это позволило предположить, что наблюдаемый эффект БАП опосредован увеличением под его влиянием содержания АБК, поскольку в литературе имеются сведения о способности не только экзогенных, но и эндогенных цитокининов вызывать накопление АБК (Авальбаев и др., 2001;

Arkhipova et al., 2007).

220 TADHN Уровень экспрессии АБК Содержание АБК, 180 % от контроля % от контроля гена TADHN, 140 100 0 0.5 1.5 3 5 6 9 60 Время, ч Рис. 12. Динамика содержания АБК и уровня экспрессии гена TADHN дегидрина в корнях 4-сут проростков пшеницы в ходе обработки 4.4 мкМ 6-бензиламинопурином Действительно, БАП индуцировал обратимое накопление АБК в проростках, предшествующее усилению транскрипции гена дегидрина, что говорит в пользу вероятности регуляции БАП экспрессии гена дегидрина опосредовано через накопление АБК.

Таким образом, полученные данные показывают, что ЭБ способен активировать экспрессию TADHN гена дегидрина независимо от АБК, поскольку обработка проростков ЭБ в используемой концентрации не вызывает изменений в содержании эндогенной АБК (Шакирова и др., 2002;

Авальбаев и др., 2003), тогда как регуляция транскрипции исследуемого гена под влиянием цитокинина, вероятно, является АБК-зависимой.

С целью выяснения вовлечения эндогенной АБК в формирование индуцируемых ЭБ и БАП защитных реакций в растениях мы провели опыты с использованием эффективного ингибитора биосинтеза АБК флуридона.

Из рис. 13А видно, что флуридон, подавляя новообразование АБК, не оказал никакого эффекта на вызываемое ЭБ накопление пролина в проростках, в то же время полностью предотвратил действие БАП на этот показатель (рис.

13Б).

А Б 1 0,9 0, Содержание пролина, Содержание пролина, мМ/г сырой массы мМ/г сырой массы 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, Контроль БАП Фл+БАП Контроль ЭБ Фл+ЭБ Рис. 13. Влияние 0.4 мкМ 24-эпибрассинолида (А) и 4.4 мкМ 6-бензиламинопурина (Б) на концентрацию пролина в 4-сут проростках пшеницы в присутствии или отсутствии флуридона. После отделения эндосперма 3-сут проростки корнями помещали в стаканы с раствором 2%-ной сахарозы в смеси с 5 мг/л флуридоном на сутки. Затем 4-сут проростки переносили на 7 ч на свежую смесь 2%-ной сахарозы, флуридона и ЭБ или БАП Таким образом, реализация предадаптирующего эффекта ЭБ на растения пшеницы может осуществляться АБК-независимым образом в отличие от действия БАП, который, по крайней мере в используемой нами концентрации, реализует свой предадаптирующий эффект посредством обратимого накопления АБК.

Суммируя полученные результаты, можно заключить, что в основе выявленного феномена поддержания быстрого и стойкого двукратного накопления цитокининов в проростках пшеницы в ходе обработки ЭБ лежит стимуляция под его влиянием новообразования ЦК и ингибирование деградации этих гормонов. Нами впервые обнаружено, что ЭБ вызывает накопление первичных форм на пути биосинтеза ЦК – нуклеотида зеатина и суммарного уровня производных изопентиниладенина, а также быстрое повышение содержания запасных форм – О–глюкозидов. С другой стороны, ЭБ, посредством снижения ферментативной активности цитокининоксидазы и транскрипции кодирующего этот фермент гена, способствует торможению деградации ЦК. Эти эффекты наблюдаются лишь в присутствии ЭБ и его удаление из среды инкубирования проростков приводит к возврату экспрессионного статуса гена ЦО и активности фермента к контрольному значению и, как следствие, постепенной нормализации концентрации цитокининов в проростках. Совокупность данных указывает на участие ЭБ в регуляции метаболизма цитокининов и подразумевает важную роль эндогенных цитокининов в проявлении физиологического действия ЭБ на растения пшеницы, вероятно, в первую очередь, ярко выраженного ростстимулирующего эффекта.

ВЫВОДЫ 1. Выявлено быстрое и стойкое двукратное повышение содержания активных форм цитокининов сначала в корнях (уже через 5 мин), а затем в побегах проростков пшеницы в присутствии 24-эпибрассинолида. Удаление ЭБ из среды приводило к постепенному снижению концентрации цитокининов до контрольного уровня.

2. Установлено, что в регуляцию 24-эпибрассинолидом количественного уровня цитокининов в проростках пшеницы важный вклад вносит изменение под его влиянием ферментативной активности и уровня экспрессии гена цитокининоксидазы. Обработка ЭБ вызывает быстрое торможение активности фермента и экспрессии гена цитокининоксидазы в корнях, а затем в побегах.

Прекращение обработки ЭБ приводит к постепенному восстановлению этих показателей в той же последовательности.

3. ЭБ-индуцированное увеличение суммарного содержания производных изопентениладенина и нуклеотида зеатина в корнях, а затем в побегах указывает на принципиальную способность ЭБ оказывать влияние на биосинтез цитокининов в растениях пшеницы.

4. Быстрое многократное накопление запасных форм цитокининов – О-глюкозидов - сначала в корнях, а затем в побегах в ответ на обработку проростков пшеницы ЭБ также может служить аргументом в пользу стимуляции под влиянием ЭБ новообразования ЦК в корнях пшеницы.

5. Впервые показана независимая от АБК ЭБ-индуцированная экспрессия TADHN гена дегидрина в растениях пшеницы. С использованием ингибитора синтеза АБК флуридона выявлена способность ЭБ регулировать количественный уровень пролина независимо от эндогенной АБК.

Совокупность полученных результатов указывает на участие 24-эпибрассинолида в регуляции метаболизма гормонов цитокининовой природы и вовлечении эндогенных цитокининов в реализацию ростстимулирующего действия ЭБ на растения пшеницы и поддержании ростовых процессов в стрессовых условиях на уровне близком контролю.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Avalbaev A.M., Yuldashev R.A., Shakirova F.M. Cytokinin oxidase in wheat seedlings // NCBI Accession No. AY831399, 2004.

2. Юлдашев Р.А., Авальбаев А.М. Влияние 24-эпибрассинолида на экспрессию гена цитокининоксидазы в корнях проростков пшеницы // Материалы 9-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино, 2005 г. С. 62.

3. Авальбаев А.М., Юлдашев Р.А., Шакирова Ф.М. Физиологическое действие на растения фитогормонов стероидной природы брассиностероидов // Успехи современной биологии. 2006. Т. 126. №2. С. 72-80.

4. Авальбаев А.М., Юлдашев Р.А., Высоцкая Л.Б., Шакирова Ф.М.

Регуляция 24-эпибрассинолидом экспрессии гена и активности цитокининоксидазы в корнях проростков пшеницы // Доклады РАН. 2006.

Т. 410. № 6. С. 825-827.

5. Юлдашев Р.А., Авальбаев А.М. Комплексная оценка влияния 24-эпибрассинолида на экспрессию гена и активность цитокининоксидазы в корнях проростков пшеницы // Материалы 10-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино, 2006. С. 61.

6. Авальбаев А.М., Юлдашев Р.А., Шакирова Ф.М. Активность 24 эпибрассинолида в специфических для цитокининов тест-системах // Материалы международной конференции “Физиология растений – фундаментальная основа современной фитобиотехнологии”. Годичное собрание ВОФР. Ростов, 2006. С. 51.

7. Avalbaev A.M., Yuldashev R.A., Shakirova F.M. Influence of 24-epibrassinolide on gene expression and activity of cytokinin oxidase in wheat seedling roots // XV Congress of the FESPB: Abstracts. Lyon, France. 2006. P. 116.

8. Авальбаев А.М., Юлдашев Р.А., Шакирова Ф.М. Молекулярные механизмы регуляции 24-эпибрассинолидом содержания цитокининов в проростках пшеницы // Материалы международной конференции “Современная физиология растений: от молекул до экосистем”. VI съезд ВОФР. Сыктывкар, 2007. Т. 1. С. 171-173.

9. Аллагулова Ч.Р., Гималов Ф.Р., Сахабутдинова А.Р., Авальбаев А.М., Юлдашев Р.А., Шакирова Ф.М. Структура дегидрин-подобного гена TADHN мягкой пшеницы и участие АБК и 24-эпибрассинолида в активации его экспрессии // Физиология растений. 2007. Т. 54. № 1. С. 131-136.

10. Юлдашев Р.А., Авальбаев А.М., Сафутдинова Ю. В. Сопоставление действия экзогенных 24-эпибрассинолида и цитокининов на растения пшеницы // Матеріали третьої міжнародної конференції молодих науковців “Біологія: від молекули до біосфери”. Харків, 2008. С. 304-305.

11. Авальбаев А.М., Юлдашев Р.А., Евстафьев А.В., Шакирова Ф.М.

Сравнительный анализ защитного действия 24-эпибрассинолида и цитокинина 6-бензиламинопурина на растения пшеницы в условиях обезвоживания // Материалы международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений». Годичное собрание ВОФР. Екатеринбург, 2008 г. С. 36-37.

12. Авальбаев А.М., Юлдашев Р.А., Высоцкая Л.Б. Экспрессия гена цитокининоксидазы при воздействиях, вызывающих изменение содержания цитокининов в растениях пшеницы // Аграрная Россия. Спец. Выпуск. 2009.

С. 77.

Автор выражает глубокую благодарность проф. В.А. Хрипачу (Институт биоорганической химии АН Беларуси, г. Минск) за любезно предоставленный 24-эпибрассинолид, а также своему научному руководителю д.б.н., проф.

Ф.М. Шакировой, к.б.н. А.М. Авальбаеву, к.б.н. Л.Б. Высоцкой, к.б.н.

М.В. Безруковой, к.б.н. Р.А. Фатхутдиновой, к.б.н. Ч.Р. Аллагуловой и к.б.н.

И.И. Губайдуллину за постоянное внимание к работе и помощь в ходе ее выполнения, обсуждения и написания.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.