авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Пространственная структура цитотоксинов naja oxiana и их взаимодействие с мицеллами и биомембранами

на правах рукописи

УДК 577.322.5

ДУБИННЫЙ Максим Анатольевич

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА ЦИТОТОКСИНОВ

NAJA OXIANA И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С МИЦЕЛЛАМИ И

БИОМЕМБРАНАМИ

03.00.02 –Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата физико-математических наук

Москва – 2006 2 Диссертация выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, на кафедре физико-химической биологии и биотехнологии МФТИ (ГУ).

Научный руководитель: Арсеньев Александр Сергеевич доктор химических наук заведующий лабораторией структурной био логии ИБХ РАН

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, Польшаков Владимир Иванович ведущий нацчный сотрудник ФГУП «Центр по химии лекарственных средств»

кандидат физико-математических наук, Горделий Валентин Иванович директор Центра биофизики и физико-химии надмолекулярных структур МФТИ ФГУ “Российский кардиологический научно-производственный комплекс

Ведущая организация:

Федерального агентства по здравоохра нению и социальному развитию”

Защита состоится “ 13 ” декабря 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (государственном универ ситете) по адресу: 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, 9., тел.: (495) 408-57-00, 408-56-27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического ин ститута (государственного университета).

Автореферат разослан “ 11 ” ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К 212.156. Брагин В.Е.

к.ф.-м.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Яды змей семейства Elapidae – сложная смесь биологически активных полипептидов, которая включает нейротоксины, цитотоксины, фосфолипазы и другие биологически ак тивные компоненты. Нейротоксины взаимодействуют с ацетилхолиновыми рецепторами, блокируя передачу нервного импульса. Цитотоксины гомологичны нейротоксинам по аминокислотной последовательности и пространственной структуре, но отличаются ши роким спектром биологической активности.

Различные представители семейства цитотоксинов способны усиливать сердцебиение при низких концентрациях и вызывать остановку сердца при высоких концентрациях (за что они получили другое название кардиотоксины), вызывать деполяризацию мышечных клеток. В больших концентрациях цитотоксины вызывают лизис фосфолипидных везикул и клеточных мембран, дестабилизируют структуру липидного бислоя, вызывают межмем бранное смешивание липидов. Цитотоксины способны связываться с гепарином, который способствует проникновению цитотоксинов в мембрану. Цитотоксины обладают повы шенной токсичностью по отношению к раковым клеткам. Большинство исследованных цитотоксинов вызывают гибель клеток по механизму цитолиза, за исключением цитоток сина III Naja atra, для которого показана апоптотическая активность по отношению к клеткам лейкемии человека K562, клеткам рака кишечника Colo205, а так же CD8+ лим фоцитам человека. Считается перспективным создание противораковых средств на основе природных или модифицированных цитотоксинов.

Цитотоксины представляют собой -структурные амфифильные одноцепочечные бел ки длиной 59–62 аминокислотных остатка и массой 6–7 кДа. В настоящий момент извест ны аминокислотные последовательности 81 цитотоксина из яда змей рода Naja, из них только для 11 цитотоксинов проводились структурные исследования и получена про странственная структура методом ЯМР или рентгеноструктурного анализа. Все известные цитотоксины имеют высокую степень гомологии по аминокислотной последовательности и пространственной структуре. Пространственная структура цитотоксинов включает два -слоя по два и три -тяжа в каждом, а так же три функционально важных «петли» цито токсина. Структура стабилизирована четырьмя консервативными дисульфидными связя ми. Небольшие различия в аминокислотной последовательности и пространственном строении трех петель цитотоксинов определяют различие в спектре их биологической ак тивности.

В настоящий момент не представляет сомнений, что биологическое действие цитоток синов на клетку включает взаимодействие с липидной мембраной, в частности, с плазма тической мембраной клетки. Изучение структуры и функции мембранных белков натал кивается на целый ряд методических трудностей. Мембраносвязанный белок не дает спек тра ЯМР высокого разрешения и не может быть закристаллизован, что затрудняет исполь зование стандартных методик определения пространственной структуры белка. Один из путей преодоления данной трудности — использование детергентных мицелл как систем моделирующих мембранное окружение. Вследствие меньшей молекулярной массы и меньшего времени вращательной корреляции по сравнению с бислойными липидными структурами, детергентные мицеллы позволяют наблюдать спектр ЯМР высокого разре шения и во многих случаях делают возможным расчет пространственной структуры бел ка.

Не смотря на наличие соответствующих методик, в настоящий момент детали взаимо действия цитотоксинов с липидными мембранами недостаточно изучены и вызывают раз ногласия между различными группами исследователей. Пространственная структура в комплексе с мицеллой получена только для одного цитотоксина, это структура цитоток сина II из яда Naja oxiana, все остальные структуры получены в водном растворе (методом ЯМР) или в кристалле (методом рентгеноструктурного анализа). За исключением того же цитотоксина II не изучено влияние липидного окружения на пространственную структуру цитотоксинов, недостает прямых данных об участках цитотоксинов, вовлеченных в непо средственное взаимодействие с мембраной/мицеллой. Различные исследователи предпо лагают существование функционально важных комплексов из нескольких молекул цито токсина на поверхности мембраны, однако прямых подтверждений существования таких комплексов в мембранах/детергентных мицеллах в настоящий момент не получено.



Цель и задачи исследования.

Данная работа ставит целью комплексное изучение двух цитотоксинов из яда кобры Naja oxiana: цитотоксинов I и II методами ЯМР и ЭПР спектроскопии. Данная цель подра зумевает:

1. Получение пространственной структуры цитотоксина I из яда Naja oxiana в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ методом ЯМР высокого разрешения. Анализ по лученных структур и их сопоставление с известными аналогами – трехпетлевыми белками из ядов змей.

2. Измерение pKa боковых цепей отрицательно заряженных аминокислотных остатков, анализ влияния липидного окружения на структуру и свойства заряженных аминокислот ных остатков цитотоксина I.

3. Изучение взаимодействия цитотоксинов с мицеллой/липидной мембраной. Мониторинг связывания цитотоксинов с мицеллой методом ЯМР и с липидной мембраной методом ЭПР с использованием спин-меченого аналога цитотоксина II.

Методы исследования.

В работе применяются методы гомоядерной одномерной и двумерной 1Н ЯМР спектро скопии высокого разрешения. Для моделирования мембранного окружения при расчете структуры цитотоксина I использованы дейтерированные мицеллы додецилфосфатидил холина (ДФХ). Отнесение сигналов белка производится методом последовательного отне сения сигналов, водородные связи выделяются на основе скоростей дейтерообмена амид ных протонов. Ограничения на торсионные углы определяются из значений констант спин-спинового взаимодействия. Связанная молекула воды идентифицируется при помо щи ROESY спектроскопии, ее наличие проверяется методом молекулярной динамики в явно заданном растворителе. Структура белка рассчитывается на основе ограничений, по лученных из двумерных NOESY спектров белка и констант спин-спинового взаимодейст вия минимизацией штрафной функции в программе CYANA.

Константы pKa депротонирования боковых цепей отрицательно заряженных аминокис лотных остатков определяются по изменению химических сдвигов в двумерных спектрах ЯМР.

Взаимодействие цитотоксинов с мицеллой ДФХ изучается мониторингом химических сдвигов в двумерных спектрах белка и коэффициента трансляционной диффузии белка методом градиентного спин-эха. Для анализа полученных данных разрабатывается ори гинальная математическая модель, которая позволяет одновременно анализировать изме нения химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии белок/мицелляр ного комплекса.

Взаимодействие цитотоксина II с модельной липидной мембраной изучается методом ЭПР спектроскопии с использованием спин-меченого аналога цитотоксина. Кривая связы вания с липидной мембраной анализируется в рамках модели Гуи-Чапмена.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Все результаты, изложенные в настоящей работе, получены впервые.

1. Получена структура высокого разрешения для цитотоксина I в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ. Обнаружена связанная молекула воды в составе второй пет ли цитотоксина I в водном растворе. Показано, что при связывании с мицеллой ДФХ про исходит сильное изменение структуры второй петли цитотоксина. Факт существенного изменения структуры цитотоксина при связывании с мицеллой показан для цитотоксинов впервые. Две структуры высокого разрешения депонированы в Банк Данных Белков (PDB) с кодом 1RL5 (цитотоксин I в водном растворе) и 1ZAD (цитотоксин I в комплексе с мицеллой ДФХ).

2. Анализ pH – зависимостей химических сдвигов цитотоксина I показал высокую кон сервативность свойств заряженных остатков Asp40 и Asp57 и выявил особую роль остатка Asp29 в конформации второй петли молекулы.

3. По данным об изменении химического сдвига и коэффициента трансляционной диффу зии построена модель связывания токсинов с мицеллой. Показано, что для корректного описания диффузионных данных необходимо учесть долю объема, занятую мицеллами в растворе и вытеснение части детергента из состава мицеллы при связывании молекулы цитотоксина. Согласно данной модели цитотоксины связываются с мицеллой ДФХ анти кооперативно, что свидетельствует против формирования комплекса из нескольких моле кул токсина. Константа связывания первой молекулы с мицеллой согласуется с констан той связывания спин-меченого цитотоксина с липидным бислоем.

4. Изучено связывание спин-меченого аналога цитотоксина II с модельной липидной мембраной, кривая связывания описана моделью Гуи-Чапмена и определена константа связывания цитотоксина с липидной мембраной.

Разработанные в настоящей диссертации методики представляют самостоятельный ин терес и могут быть применены к исследованию других мембраносвязывающихся белков.

Модель динамического равновесия в системе белок-мицелла может быть использована при анализе ЯМР данных для определения количества молекул белка, связанного с ми целлой, выявления кооперативности/антикооперативности связывания белков с мицеллой, а так же для оценки объема белка, погруженного в мицеллу через способность белка вы теснять часть детергента при связывании с мицеллой. Несмотря на то, что изменение хи мических сдвигов и трансляционной диффузии традиционно используются при изучения формирования белок–белковых и белок–лигандных комплексов, изучение формирования комплекса белка с мицеллой на основе аналогичных данных является новым подходом.





Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на российских и международных конференциях посвященных спектроскопии ЯМР: открытая российско шведская конференция «методы ЯМР во взаимодействии белок-белок и белок-ДНК»

(Моксва, 2000);

X юбилейная международная конференция и дискуссионный научный клуб. Новые информационные технологии в медицине и экологии (Украина, Крым, Ялта Гурзуф 2002);

VI чтения, посвященные памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва Пущино, Россия, 2002), ХVII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные на правления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005).

Публикации.

Основные результаты диссертации изложены в 4 тезисах докладов и в 6 статьях в рефе рируемых российских и зарубежных журналах.

Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, двух глав, включая литературный обзор, заключения и выводов. Общий объем работы составляет 97 страниц текста, включая 12 рисунков, таблиц и список литературы, содержащий 95 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ.

Во введении обоснована необходимость и актуальность исследования структур цито токсинов, в особенности в среде, моделирующей мембранное окружение фосфолипидного бислоя. Кратко формулируются основные цели и задачи исследования: получение про странственной структуры цитотоксина I высокого разрешения методом ЯМР в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ, измерение pKa боковых цепей отрицательно за ряженных аминокислотных остатков, анализ взаимодействия цитотоксинов с мицеллой и липидной мембраной.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава состоит из двух частей. В первой проводится обзор семейства «трехпальцевых»

(«трехпетлевых») белков из ядов змей, обсуждается широкое разнообразие функций бел ков со сходной структурной организацией. Кратко рассмотрена биологическая актив ность, структура и связь структуры и функции для нейротоксинов (длинные и короткие нейротоксины, -токсины, мускариновые токсины), ингибиторов ацетилхолинэстеразы (фасцикулинов), блокаторов кальциевых каналов L-типа, дендроаспинов (дезинтегринов) и цитотоксинов (кардиотоксинов). Показана высокая степень структурного сходства бел ков данных типов. Приведены два примера ошибочного отнесения трехпетлевых белков к другому функциональному типу, когда цитотоксин, проявляющий слабую цитотоксич ность, в последствии оказывается дезинтегрином или ингибитором ацетилхолинэстеразы.

В качестве обобщения сделан вывод о том, что наиболее значимые аминокислотные ос татки для каждого из видов токсинов находятся в трех функционально важных петлях мо лекулы.

Во второй части приведен обзор структурных и функциональных исследований цито токсинов. Всего в настоящий момент методом рентгеноструктурного анализа получено пространственных структур для 5 цитотоксинов из яда змей рода Naja и методом ядерного магнитного резонанса 12 структур для 9 цитотоксинов. При этом только одна из извест ных структур (цитотоксин II N. oxiana) получена в водном растворе в комплексе с мицел лой ДФХ, так же в одном случае (цитотоксин III N. atra) удалось получать кристалл в комплексе с детергентом додецилсульфатом натрия. В обоих случаях не обнаружено за метного различия в структуре белка при переходе из водного раствора в липидное окру жение. Наибольшие различия в пространственной структуре цитотоксинов локализованы в области трех функционально важных петель белков. На основе данных о структуре и спектре биологической активности белков рассмотрены способы классификации цитоток синов: деление цитотоксинов на S- и P- тип по признаку присутствия остатков Ser28 или Pro30 и структуре второй петли молекулы и деление на цитотоксины I и II типа по нали чию полосы в спектре кругового дихроизма на длине волны 225 нм.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Вторая глава состоит из четырех частей. Первая часть посвящена расчету структуры цитотоксина I N. oxiana в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ методом ЯМР спектроскопии высокого разрешения. Во второй части исследуются рН-зависимости хи мических сдвигов цитотоксина I, определяются значения pKa боковых цепей отрицатель но заряженных аминокислотных остатков в растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ, об суждается роль зарядов в структуре цитотоксина. В третьей части обсуждаются различные модели связывания белка с мицеллой детергента. Выводится ряд уравнений, которое по зволяют описать изменение химического сдвига и трансляционной диффузии белка при различных соотношениях белок/детергент. В четвертой части изучается связывание спин меченого аналога цитотоксина II c модельной липидной мембраной. Изотерма связывания описывается уравнением Гуи-Чапмена, определяется константа связывания цитотоксина II с липидной мембраной.

Материалы и методы изложены отдельно для каждой части.

В первой части второй главы подробно изложены применяемые в с методы ЯМР спектроскопии, приготовление образцов, сбор ЯМР данных и расчет структуры. Среди наиболее важных моментов структурной части работы следует упомянуть следующее.

В процессе отнесения сигналов цитотоксина в водном растворе были обнаружены два набора спиновых систем для аминокислотных остатков 4–13 (первая петля цитотоксина) и остатка Gly37 (рис. 1). Две формы белка представлены в растворе в соотношении 5:1.

Аналогичное явление ранее наблюдалось для цитотоксина II N. oxiana в водном растворе.

Конформационная гетерогенность обусловлена изомеризацией пептидной связи Val7 Pro8: для основной формы белка данная пептидная связь имеет транс-, а для минорной – цис- конформацию. Из предыдущих исследований цитотоксина II известно, что минорная форма цитотоксина не взаимодействует с мицеллой ДФХ, аналогично не взаимодействует с мицеллой ДФХ и минорная форма цитотоксина I. Расчет структуры производился толь ко с использованием сигналов основной формы цитотоксина.

Рис. 1. Область HN-H сиг налов в TOCSY спектре ци тотоксина I в водном рас творе. Указаны номера ос татков, дающих два набора кросс-пиков вследствие изомеризации пептидной связи Val7-Pro8 (остатки 4–13 и 37). Жирным шриф том выделены сигналы ос новной формы белка (транс- конфигурация пеп тидной связи), курсивом – сигналы минорной формы белка (цис- конфигурация пептидной связи).

Рис. 2. Фрагменты спектра ROESY-75 мс цитотоксина I в водном растворе при различ ных температурах. (а) 10С;

(б) 30 С и (с) 50 С. Овалом отмечен отрицательный кросс пик между сигналами HN Met26 и H2O. Показаны так же кросс-пики между HN Met26 и H Phe25, H Met26 которые использовались при отнесении сигналов.

Анализ ROESY спектров цитотоксина в водном окружении при трех температурах (10, 30 и 50С, рис. 2) выявил интенсивный отрицательный кросс-пик ROE с сигнала HN Met на сигнал воды. Данный сигнал может быть интерпретирован либо как признак существо вания долгоживущей связанной с белком молекулы воды, либо как присутствие лабиль ной гидроксильной группы боковой цепи белка в непосредственной окрестности HN Met26. Предварительные расчеты пространственной структуры цитотоксина показали, что ближайший к HN Met26 лабильный протон (OH Ser28) удален на расстояние более 5.

Медленная скорость дейтерообмена HN Met26 говорит о наличии водородной связи с его участием, однако в ходе предварительных расчетов структуры подходящий акцептор во дородной связи обнаружен не был. Все приведенные данные однозначно свидетельствуют о наличии связанной воды в петле II цитотоксина. Связанная вода в аналогичном положе нии наблюдалась в структурах цитотоксинов, полученных как методом рентгеноструктур ного анализа, так и методом ЯМР-спектроскопии. Наличие долгоживущей прочно связан ной молекулы воды было подтверждено методом молекулярной динамики с явно задан ным растворителем. В течение интервалов времени от одной до пяти наносекунд различ ные молекулы растворителя оккупировали один и тот же сайт во второй петле цитотокси на, удерживаясь в нем при помощи четырех водородных связей: с атомами HN Met26, СO Asp29, O Asp29 и СO Ile32 (рис. 3(а), 4(а)). Все указанные водородные связи вместе с во дородными связями, удерживающими пять -тяжей цитотоксина, были включены в расчет структуры.

Всего для расчета структуры цитотоксина I в водном окружении было использовано 107 констант спин-спинового взаимодействия, 270 ограничений на торсионные углы, ог раничения на 34 водородные связи (25 водородных связей с участием атомов основной цепи) и 517 верхних ограничений на межатомные расстояния. Окончательный набор из структур характеризуется среднеквадратичным отклонением (СКО) 0.31 по атомам ос новной цепи и 0.87 по всем тяжелым атомам. Те же значения СКО по элементам вторич ной структуры (-тяжам) равны 0.20 и 0.86, соответственно. Набор структур вместе с использованными при расчете ограничениями и локализованной молекулой прочно свя занной воды депонирован в Банк Данных Белков (PDB) под кодом 1RL5 (рис. 3(а)).

При расчете структуры цитотоксина в комплексе с мицеллой ДФХ возникла дополни тельная трудность, связанная с сильным ослаблением сигналов в области окончания вто рой петли цитотоксина, поэтому однозначного отнесения сигналов основной цепи остат ков Ser28 и Asp29 получить не удалось. Такое ослабление сигналов по-видимому объясня (а) Цитотоксин I в водном растворе (б) Цитотоксин I в комплексе с мицеллой ДФХ Рис. 3. Стереоизображение пространственной структуры цитотоксина I (20 структур) в водном растворе (а) и в комплексе с мицеллой ДФХ (б). Основная цепь показана синим цветом, HN атомы основной цепи – красным, CO атомы – желтым, боковые цепи – розо вым, водородные связи – зеленым, прочно связанная молекула воды на рис. (а) – серым цветом. Римскими цифрами I – III обозначены номера петель цитотоксина.

ется наличием конформационного перехода, скорость которого удовлетворяет условию «промежуточного обмена» в шкале времени ЯМР, при котором скорость обмена между двумя конформациями молекулы близка к разнице резонансных частот протонов.

Изменение условий регистрации спектров ЯМР (температура, рН среды, концентрация ДФХ) не привела к улучшению их качества. Сигнал связанной воды в области второй пет ли обнаружен не был, поэтому связанная вода в расчете структуры не участвовала. Для корректного определения конформации второй петли цитотоксина сигналы NOESY спек тра второй петли (аминокислотные остатки с Met26 по Ile32) калибровались отдельно от остальных NOE кросс-пиков. Такой подход позволил извлечь достаточно информации из ЯМР спектра для определения конформации второй петли молекулы и обнаружить силь ное изменение структуры данного участка белка по сравнению со структурой в водном растворе (рис. 4(а) и (б)).

Всего для расчета структуры цитотоксина I в комплексе с мицеллой ДФХ было ис пользовано 121 константа спин-спинового взаимодействия, 260 ограничений на торсион ные углы, ограничения на 24 водородные связи (18 водородных связей с участием атомов основной цепи) и 523 верхних ограничений на межатомные расстояния. Окончательный набор из 20 структур характеризуется СКО 0.31 по атомам основной цепи и 0.94 по всем тяжелым атомам. Те же значения СКО по элементам вторичной структуры (-тяжам) (а) Цитотоксин I в водном растворе (б) Цитотоксин I в комплексе с мицеллой ДФХ Рис. 4. Стереоизображение структуры петли II (остатки 24–34) цитотоксина I в вод ном растворе (а) и в комплексе с мицеллой ДФХ (б). На рис. (а) показана прочно связанная молекула воды, которая образует водородные связи с остатками Met26, Asp29, Ile32.

Очевидно изменение ориентации боковой цепи Asp29 при связывании с мицеллой. Пункти ром обозначены водородные связи белок – белок и белок – связанная вода.

равны 0.18 и 0.93, соответственно. Набор структур вместе с использованными при рас чете ограничениями депонирован в Банк Данных Белков под кодом 1ZAD (рис. 3(б)).

Во второй части второй главы обсуждаются рН зависимости химических сдвигов цитотоксина I в растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ и определяются значения pKa боковых цепей отрицательно заряженных аминокислотных остатков.

рН зависимости химических сдвигов цитотоксина I измерялись по серии двумерных NOESY спектров в диапазоне значений рН 2.0–6.0 с шагом 0.3–0.5 единицы рН. Зависи мость химического сдвига сигнала ядра от рН в случае титрования одной ионогенной группы описывается уравнением:

h + l 10pK a pH = (1) 1 + 10pK a pH здесь h и l – химический сдвиг атома при высоких и низких значениях рН, соответст венно. Значения, h, l и pKa определялись нелинейной регрессией экспериментальных за висимостей к уравнению (1). Большое положительное значение = h – l (изменение химического сдвига при титровании) позволяет выявить водородные связи, которые обра зует титрующаяся заряженная группа, а значение pKa (в сравнении со значением pKa для свободной аминокислоты) говорит о ее локальном окружении.

Цитотоксин I содержит 4 аминокислотных остатка с отрицательно заряженной боковой цепью: Glu16, Asp29, Asp40 и Asp57. Последние два остатка консервативны и присутст вуют в большинстве известных цитотоксинов. При титровании заряженной группы Asp наиболее сильно изменяется химический сдвиг HN Lys2 ( = +0.78 м.д.), что говорит о наличии водородной связи между карбоксильной группой аспарагиновой кислоты и HN атомом лизина. Аналогичная водородная связь присутствует в известных рентгеновских структурах цитотоксинов и не противоречит имеющимся ограничениям на расстояния и торсионные углы цитотоксина I. Введение водородной связи между COO– Asp57 и HN Lys2 позволяет существенно улучшить локальное качество структуры по сравнению с другими структурами цитотоксинов, полученными методом ЯМР. Пространственная бли зость N- и С- концевых остатков является общим свойством токсинов с трехпетлевой структурой (за исключением длинных нейротоксинов, в которых присутствует дополни тельный С-концевой пептидный фрагмент). Низкое значение pKa Asp57 (2.3 по сравнению с 3.7 для свободной аспарагиновой кислоты) свидетельствует о близости положительно заряженного остатка. Такими остатками согласно полученной пространственной структу ре являются боковые цепи Lys2 и Arg58. Значения химических сдвигов и pKa аспарагино вой кислоты не изменяются при переходе из водного растворе в мицеллярное окружение, что говорит о том, что данная область белка удалена от поверхности мицеллы, в согласии с принятой моделью комплекса цитотоксин/мицелла.

Аналогичный анализ позволяет установить две водородные связи с группы COO– Asp на атомы HN Asp40 и Val41, которые так же присутствуют в известных рентгеновских структурах. Низкое значение pKa Asp40 определяется присутствием в ближайшей окрест ности боковой цепи Lys18. Титрование боковой цепи остатка Glu16 практически не вызы вает изменений химических сдвигов, значение pKa Glu16 (3.75) близко к значению для свободной аминокислоты (4.3) и не изменяется при встраивании в мицеллу ДФХ. Следо вательно, данная ионогенная группа экспонирована в водное окружение и находится в об ласти белка, удаленной от мицеллы, что так же согласуется со структурными данными.

Из всех отрицательно заряженных групп боковая цепь Asp29 наиболее чувствительна к переходу цитотоксина из водного окружения в мицеллу ДФХ. Этот расположенный во второй петле заряженный остаток уникален для цитотоксина I и может играть важную роль в его функционировании. В предыдущей части было показано, что конформация бо ковой цепи Asp29 существенно изменяется при переходе цитотоксина из раствора в ми целлу (рис. 4(а) и (б)), то же можно сказать и о значении pKa данного остатка. Если в вод ном окружении значение pKa Asp29 меньше значения свободной аминокислоты на 0. единицы рН, то после связывании цитотоксина с мицеллой значение рКа становится больше соответствующего свободного значения на 0.93 единицы. Вместе с конформацией данного остатка меняется и вся конформация второй петли белка, из нее «уходит» связан ная вода. Все это говорит о том, что боковая цепь Asp29 и, по-видимому, вся вторая петля цитотоксина I погружаются в липидное окружение мицеллы ДФХ.

В третьей части второй главы обсуждаются различные модели связывания белка с мицеллой детергента и их применение для анализа изменений химического сдвига сигна лов в спектре ЯМР и трансляционной диффузии белка при связывании с мицеллой.

Взаимодействие белка с мицеллой является сложным динамическим процессом. Ми целла представляет собой сравнительно небольшой агрегат из нескольких десятков моле кул детергента и обычно имеет форму близкую к сферической. Мембраноактивные и мембраносвязывающиеся белки обычно способны связываться с мицеллами подходящего состава. Обычно мицелла способна связывать несколько молекул белка, при этом нельзя исключать изменения размера мицеллы при связывании каждой последующей молекулы белка. Метод ЯМР позволяет наблюдать изменение химических сдвигов сигналов белка и коэффициента трансляционной диффузии комплекса белок/мицелла в зависимости от со отношения белок/детергент. В третьей части настоящей главы предлагается аналитическая модель для анализа химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии в сис теме белок/мицелла.

Рис. 5. Схематическое представление связывания двух (n = 2) молекул белка с мицеллой.

Свободная мицелла состоит из M0 молекул детергента (слева внизу, показаны черным цветом). Первая молекула белка связывается с мицеллой с константой k0 и вытесняет M молекул детергента, новая мицелла состоит из M1 = M0 – M молекул детергента.

Вытесненный детергент распределяется между остальными мицеллами (показаны ввер ху серым цветом). Аналогично вторая молекула белка связывается с константой k1 и вытесняет еще M молекул детергента.

Для моделирования изменения химических сдвигов белка предложена модель, осно ванная на следующих допущениях (см. рис. 5):

1. Одна мицелла способна связывать не более N молекул белка. Величину N будем услов но называть «валентностью мицеллы» по отношению к данному белку;

2. Обмен между различными олигомерными состояниями белка является быстрым в мас штабах ЯМР эксперимента;

3. Все молекулы белка, связанные с мицеллой, имеют одинаковые химические сдвиги.

Так же совпадают химические сдвиги у комплексов, содержащих различное количество молекул белка;

4. Связывание n-й молекулы белка с мицеллой, содержащей n – 1 молекул белка, описы вается константой бимолекулярного равновесия kn;

5. Размер мицеллы может зависеть от количества связанных молекул белка. Мицелла, со держащая n молекул белка ( n = 0, N ), состоит из Mn молекул детергента;

Для описания зависимости коэффициента трансляционной диффузии дополнительно были введены еще два предположения:

6. Коэффициент трансляционной диффузии комплекса белок/мицелла хорошо аппрокси мируется уравнением Стокса-Эйнштейна (приближение сферического комплекса эква валентного объема);

7. Влияние вытесненного объема на трансляционную диффузию комплексов хорошо при ближается линейным членом в модели Токуями и Оппенгейма.

Под вытесненным объемом подразумевается доля объема раствора, занятого мицелла ми детергента.

В работе выведена общая модель для описания химического сдвига и измеряемого в эксперименте коэффициента трансляционной диффузии Dt белка:

P = 1 (2) Pt P L S ( P) Dt = D f,0 + t D (3) Pt Pt S M ( P ) P 1 S ( P) L Dt = D f,0 + t (1 3.59247) D (4) Pt 1 + SM ( P) Pt для трансляционной диффузии. Здесь уравнение (3) описывает трансляционную диффу зию без учета эффекта вытесненного объема, уравнение (4) учитывает влияние вытеснен ного объема на коэффициент трансляционной диффузии частиц. В уравнениях (2)–(4) ис пользуются следующие обозначения: – изменение химического сдвига при полном связывании белка с мицеллой, Df,0 – коэффициент трансляционной диффузии свободного белка в растворе, P – концентрация свободного (не связанного с мицеллами) белка в рас творе, Pt – общая концентрация белка в растворе, Lt – общая концентрация детергента в растворе, – объемная доля мицеллярных частиц в растворе.

Концентрация свободного белка в растворе определяется из следующей системы урав нений:

S ( P) r= n, Pt = P + rLt (5) SM ( P) Здесь r – степень связывания белка с детергентом (отношение концентрации связанного с детергентом белка к общей концентрации детергента). Первое из уравнений (5) описывает кривую связывания белка с мицеллой, второе задает условие сохранения общего количе ства белка в растворе. В уравнения (3), (4) и (5) входят суммы Sn(P), SM(P) и SD(P), кото рые выражаются через константы связывания kn и размеры мицелл Mn для олигомерных комплексов с различным количеством молекул белка n:

Pn N n Sn ( P ) = (6) Kn n = Pn N Mn SM ( P) = (7) Kn n = Pn N n SD ( P) = (8) n = 0 M n + n K n Здесь для удобства введено обозначение:

k k … kn, n Kn = 1 2 (9) n= Безразмерный параметр равен отношению объема одной молекулы детергента к объему молекулы белка.

Приведенные выше уравнения позволяют описать изменения химических сдвигов сиг налов белка и коэффициента трансляционной диффузии белка, если заданы константы связывания kn и размеры мицелл Mn. Для того чтобы применить данную модель к экспе риментальным данным, необходимо сделать дальнейшие предположения относительно возможных kn и Mn. Если предположить все константы и размеры мицелл полностью про извольными и подлежащими определению из экспериментальных данных, то уже для N = 3 получится 6 параметров, подлежащих определению из эксперимента. Большое количе ство свободных параметров приводит к сильной избыточности модели уже при весьма умеренных N. Кроме того, количество параметров, подлежащих определению сильно за Рис. 6. Результат моделирования химических сдвигов (слева) и трансляционной диффузии (справа) цитотоксинов I и II.

висит от «валентности мицеллы» N, что затрудняет сравнение моделей с разными N меж ду собой. Для разрешения этой трудности в дальнейшем в работе предполагается, что ве личины kn и Mn являются простыми функциями от n и рассматриваются два вида таких функций.

Для параметров kn вводится две возможные модели: постоянные kn kn = k0 = const (10) и экспоненциально изменяющиеся kn:

k n = k0 p n (11) что соответствует антикооперативному связыванию при p 1 и кооперативному связыва нию при p 1. Для размеров мицелл Mn так же вводится две возможные модели: постоян ные Mn:

M n = M 0 = const (12) и линейно уменьшающиеся Mn:

M n = M 0 nM (13) Комбинация одного из уравнений (10), (11) с одним из уравнений (12), (13) дает одну из четырех возможных моделей связывания белка с мицеллой. В случае постоянных кон стант связывания kn (10) в работе выведено замкнутое выражение для сумм (6)–(8). При этом уравнение для суммы SD(P) и коэффициента трансляционной диффузии Dt белка со держат трансцендентную функцию Лерча. В этом случае теория может быть условно обобщена на произвольные (не только целые) значения N, что можно использовать для определения эффективной «валентности мицеллы» из экспериментальных данных мето дом нелинейной регрессии.

Справедливость предложенной теории была проверена при анализе связывания цито токсинов I и II N. oxiana с мицеллами ДФХ (рис. 6.). Анализ экспериментальных данных показал, что оптимальной моделью связывания цитотоксинов является модель, которая учитывает (i) эффект вытесненного объема (4), (ii) изменение констант связывания по за кону (11) и (iii) изменение размера мицеллы по закону (13). Для цитотоксина I наилучший результат получен при N = 3 (молекулы белка на мицеллу), для цитотоксина II – при N = 4.

Константа связывания первой молекулы белка с мицеллой для цитотоксина I составила приблизительно k0 = 70 мкм, для цитотоксина II k0 = 7 мкм. При этом оба цитотоксина при связывании вытесняют от 7 до 10 молекул детергента. Константа связывания цитотоксина с мицеллой может быть пересчитана в константу связывания с липидным бислоем при помощи простого соотношения:

Kбисл. = (14) M 0k миц.

Что дает оценку для константы связывания с бислоем для цитотоксина I Kбисл = 2. M-1, а для цитотоксина II Kбисл = 2.3103 M-1.

В четвертой части второй главы изучается связывание спин-меченого аналога цито токсина II c модельной липидной мембраной. Спин-меченый аналог цитотоксина был по лучен присоединением нитроксильной спиновой метки к боковой цепи Lys35. Спектры ЭПР спин-меченого аналога цитотоксина в водном растворе (рис. 7(а)) и при связывании с липидной мембраной (рис. 7(б)) позволяют отчетливо различить свободное и мембранос вязанное состояние цитотоксина и получить кривую связывания цитотоксина с бислоем (рис. 7(в)).

Полученные экспериментальные данные анализировали в рамках модели Гуи-Чапмена, которая в данной работе была модифицирована с целью учета отличия заряда белка в рас творе (zPS) от заряда после связывания с липидной мембраной (zPM):

2z r z r CPf = exp PS arcsinh b z L + PM, (15) K zs здесь K (M-1) – константа связывания белка с мембраной, которая наблюдалась бы в от сутствие электростатического взаимодействия между белком и липидной мембраной, zL – средний заряд липидной молекулы (zL = –0.1 для использованных в данном эксперименте фосфолипидных липосом), – доля липидной поверхности, доступной белку для связыва ния ( = 0.5), zs – заряд ионов электролита (zs = 1), b – параметр, учитывающий концентра цию электролита (b = 15.2 для 25 мМ ацетатного буфера рН 5.5). Кривая связывания дает выражение для концентрации свободного белка в растворе CPf от степени связывания бел ка с мембраной r. Вывод уравнения (15) основывается на предположении, что связывание заряженного белка с заряженной мембраной происходит в два этапа: (i) электростатиче ское притяжение/отталкивание белка и мембраны, которое изменяет локальную концен трацию белка вблизи поверхности мембраны и (ii) встраивание белка в мембрану с кон стантой K с последующим изменением заряда мембраны.

В работе обсуждается физический смысл заряда белка в водном растворе (zPS) и в ком плексе с липидной мембраной (zPM). Показано, что значительное различие двух зарядов может существенно повлиять на оценку константы связывания из экспериментальных данных. В случае цитотоксина II различие зарядов связано с изменением рКа боковой це пи остатка His31, которое изменяется от значения 5.15 в водном растворе до 5.75 в ком Рис. 7. Спектры ЭПР спин мещеного аналога цитотоксина II в водном растворе (а) и в комплексе с модельной липидной мембраной, состоящей из на 90% из яичного фосфити дилхолина и на 10% из димиристоилфосфатидилглицерина (б). Кривая связывания спин меченого цитотоксина II с модельной мембраной (в), полученная методом ЭПР.

плексе с мицеллой ДФХ. Предположив, что аналогичное изменение имеет место при свя зывании с липидной мембраной, вводится дополнительное ограничение zPM = zPS + 0.5, что приводит к оценке значений параметров zPS = 3.9, zPM = 4.4 и K = (8±3)103 M-1. Получен ное значение константы связывания с липидной мембраной близко к полученному в пре дыдущей части значению Kбисл = 2.3103 M-1 для цитотоксина II, что подтверждает кор ректность используемых методик анализа экспериментальных данных.

Наблюдаемое различие в константе связывания цитотоксинов I и II Naja oxiana соот ветствуют различию в биологической активности цитотоксинов. Наблюдаемое изменение в структуре второй петли цитотоксина I при взаимодействии с мицеллой ДФХ в сравне нии с отсутствием аналогичных изменений в структуре цитотоксина II представляет на глядный пример связи структуры и функции цитотоксинов из рода змей семейства Naja.

ВЫВОДЫ.

1. Методом ЯМР высокого разрешения рассчитана пространственная структура цитоток сина I Naja oxiana в двух средах: в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ.

Структуры депонированы в Банк Данных Белков (PDB) с кодом 1RL5 (в водном рас творе) и 1ZAD (в комплексе с мицеллой ДФХ).

2. Показано наличие связанной воды в петле II цитотоксина в водном растворе и ее отсут ствие в комплексе с мицеллой ДФХ.

3. Показано значительное изменение конформации функционально важной петли II при переходе цитотоксина из водного раствора в липидное окружение.

4. Изучены рН-зависимости химических сдвигов цитотоксина I. Показано, что наблюдае мые изменения химических сдвигов и констант pKa, а так же их изменение при перехо де из раствора в мицеллу находятся в согласии с полученными пространственными ст руктурами, системой водородных связей и принятой моделью расположения цитоток сина на поверхности липидной мембраны.

5. Предложена математическая модель для описания химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии белка при связывании с мицеллой.

6. На примере цитотоксинов I и II Naja oxiana показано, что совместный анализ химиче ских сдвигов и коэффициента трансляционной диффузии позволяет оценить коопера тивность/антикооперативность связывания белка с мицеллой, эффект вытеснения де тергента из мицеллы и ожидаемую константу связывания белка с липидной мембраной.

7. При помощи спин-меченого аналога цитотоксина II Naja oxiana изучено связывание цитотоксина с липидной мембраной. Оценены значения эффективного заряда и кон станты связывания цитотоксина с мембраной. Последняя величина находится в согла сии с константой, полученной при анализе связывания белка с мицеллой детергента.

8. На примере двух цитотоксинов из яда Naja oxiana продемонстрирована связь структу ры и функции для данного класса белков.

Материалы диссертации изложены в следующих работах:

1. Уткин Ю.Н., Дубовский П.В., Дубинный М.А., Жаравин В.А., Симонова Т.Н., Бар суков Л.И., Арсеньев А.С.. Спин-меченый по Lys35 цитотоксин II из яда кобры Naja oxiana для исследования его взаимодействия с фосфолипидными мембранами методом ЭПР. // Биоорган. химия, 1999, т. 25, № 12, с. 930-932.

2. Dubinnyi M.A., Dubovskii P.V., Utkin Yu.N., Simonova T.N., Barsukov L.I., Arseniev A.S.

EPR study of the interaction of cytotoxin II from Naja oxiana with phospholipid membranes.

// Open Russian-Swedish Conference “NMR in Protein-Protein and Protein-DNA Recogni tion”, Moscow, Russia, 26 June-2 July, 2000, p. 3. Дубинный М.А., Дубовский П.В., Уткин Ю.Н., Симонова Т.Н., Барсуков Л.И., Арсеньев А.С. Изучение методом ЭПР взаимодействия цитотоксина II из яда кобры Naja oxiana с фосфолипидными мембранами. // Биоорган. химия, 2001, т. 27, № 2, с.

102-113.

4. Дубинный М.А., Дубовский П.В., Уткин Ю.Н., Арсеньев А.С. Механизм рН-зависимой активации цитотоксина II из яда кобры Naja oxiana. // X юбилейная международная конференция и дискуссионный научный клуб. Новые информационные технологии в медицине и экологии. Украина, Крым, Ялта-Гурзуф. 2002. Труды. с. 373-375.

5. Дубинный М.А., Дубовский П.В., Уткин Ю.Н., Сырцев Н.П., Арсеньев А.С. Анализ структуры комплекса белок-мицелла методом липидных спиновых меток: новый количественный подход на примере цитотоксина II. // VI чтения, посвященные памяти академика Ю.А.Овчинникова, Москва-Пущино, Россия, 25 ноября -2 декабря 2002 г., тезисы докладов, с. 54-55.

6. Dubovskii P.V., Lesovoy D.M., Dubinnyi M.A., Utkin Yu.N., Arseniev A.S. Interaction of the P-type cardiotoxin with phospholipid membranes. // Eur. J. Biochem. 2003. v. 270 (9), p.

2038-2046.

7. Феофанов А.В., Шаронов Г.В., Дубинный М.А., Астапова М.В., Куделина И.А., Дубов ский П.В., Родионов Д.И., Уткин Ю.Н., Арсеньев А.С.. Сравнительное исследование структуры и активности цитотоксинов из яда кобр Naja oxiana, Naja kaouthia и Naja haje. // Биохимия, 2004, т. 69, № 10, с.1410-1421.

8. Dubovskii P.V., Lesovoy D.M., Dubinnyi M.A., Konshina A.G., Utkin Yu.N., Efremov R.G.

and Arseniev A.S. Interaction of three-finger toxins with phospholipid membranes: compari son of S-type versus P-type cytotoxin. // Biochem. J., 2005, v. 387, p. 807-815.

9. Лесовой Д.М., Дубинный М.А., Дубовский П.В. Анализ 31Р-ЯМР спектров широких линий фосфолипидных дисперсий с помощью программы P-FIT. // ХVII Зимняя моло дежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 2005. Тезисы докладов и стендовых сообщений, с. 69.

10. Dubinnyi M.A., Lesovoy D.M., Dubovskii P.V., Chupin V.V. and Arseniev A.S. Mod eling of 31P-NMR Spectra of Magnetically Oriented Phospholipid Liposomes. A new analytical solution. // Solid State Nucl. Magn. Reson., 2006, v. 29, p. 309-315.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.