авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Изучение прооксидантного действия p66shc в клетках человека

На правах рукописи

ГАЛИМОВ ЕВГЕНИЙ РАФАЭЛЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ПРООКСИДАНТНОГО ДЕЙСТВИЯ P66SHC В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В.

Ломоносова и в лаборатории пролиферации клетки Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор, Скулачев Владимир Петрович академик РАН НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ им.

М.В. Ломоносова ддоктор биологических наук, Чумаков Петр Михайлович профессор ИМБ им. В.А. Энгельгарта РАН

Официальные оппоненты:

Лазаревич Наталья Леонидовна доктор биологических наук, профессор ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН Белоусов Всеволод Вадимович кандидат биологических наук ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова РАН Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН

Ведущая организация:

.

Защита состоится «02» марта 2012 г. в _ часов на заседании Совета Д 501.001. по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан «02» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного cовета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АФК – активные формы кислорода A549 – клетки карциномы легких человека DCF (CM-DCF-DA) – 5-(и-6)-карбокси-2',7'-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат HDF – иммортализванные теломеразой кожные фибробласты человека RKO – клетки карциномы толстой кишки человека shRNA – короткие шпилечные РНК SkQ1 – 10-(6'-пластохинонил) децилтрифенилфосфоний SkQR1 – 10-(6'-пластохинонил) децилродамин 0 клетки – клетки, не содержащие митохондриальной ДНК АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ С появлением методов генетического нокаута в последние 20 лет был произведен прорыв в изучении генетики старения. У различных модельных организмов – дрожжей, нематоды, дрозофилы и мыши – выявлено несколько десятков генов, изменение активности которых замедляет скорость старения. К одним из наиболее интенсивно изучаемых относится белок p66shc. Относительно эволюционно “молодой”, появившийся у позвоночных животных белок p66shc вовлечен сразу в два процесса тесно связанных со старением: передача сигналов в регуляторных путях, связанных с осью гормон роста/инсулиноподобный фактор роста-1 и развитие окислительного стресса. Мыши с генетическим нокаутом характеризуются увеличенной на 30% p66shc продолжительностью жизни и сохранением нормального фенотипа и фертильности, что делает эту модель особенно значимой для изучения физиологического и патологического старения млекопитающих. Делеция p66shc у мышей значительно повысила их устойчивость к окислительному стрессу и развитию связанных с ним патологий, таких, как атеросклероз, возрастное нарушение функций эндотелия сосудов, токсическое поражение печени, осложнений, возникающих при сахарном диабете. Изучение культур клеток мыши показало, что p66shc необходим для развития окислительного стресса и апоптоза, вызванных различными индукторами. При этом обнаружено, что p66shc может перераспределяться в митохондрии и, действуя в них как оксидоредуктаза, приводить к образованию перекиси водорода [Giorgio и др, 2005]. Эти данные свидетельствует в пользу генетически регулируемой роли митохондрий в старении.

В последнее время появляется много работ, свидетельствующих о роли p66shc в канцерогенезе, особенно в развитии видов рака, зависимых от стероидных гормонов, таких распространенных как рак простаты и рак груди. Недавние исследования показали также, что высокий уровень экспрессии p66shc коррелирует с неблагоприятным прогнозом при раке толстой кишки. Таким образом, детальное изучение функций p66shc в развитии окислительного стресса и клеточной гибели может быть использовано в диагностике и фармакотерапии онкологических заболеваний и патологий, ассоциированных со старением.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью данной работы было исследование роли p66shc в различных моделях окислительного стресса клеток человека, опосредованного митохондриями. Были поставлены следующие задачи:

1. Получить стабильные линии клеток карциномы толстого кишечника человека RKO, карциномы легких человека A549 и иммортализованных кожных фибробластов человека HDF с генетическим нокдауном и оверэкспрессией p66shc.

2. Установить роль p66shc в накоплении эндогенных активных форм кислорода, при обработке перекисью водорода в клетках RKO и HDF. Выявить роль митохондрий в этом процессе, используя митохондриально-направленные антиоксиданты и локализованный в митохондриях белок - сенсор перекиси Hyper-mito, а так же клетки с неактивной дыхательной цепью.

3. Изучить эффект изменения экспрессии на фрагментацию p66shc митохондриального ретикулума и гибель клеток, вызванную обработкой перекисью водорода, а также определить тип наблюдаемой клеточной смерти.



Исследовать наблюдаемый эффект в клетках с неактивной дыхательной цепью.

4. Изучить роль p66shc в оксилительном стрессе, вызванным инкубацией в бессывороточной среде в клетках RKO и HDF. Определить участие митохондрий в этом процессе с помощью митохондриально-направленных антиоксидантов, сенсора Hyper-mito и клеток с неактивной дыхательной цепью.

5. Проследить эффект изменения экспрессии p66shc на окислительный стресс и гибель клеток карциномы легких A549, индуцированные антираковым препаратом таксолом.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ В работе мы исследовали окислительный стресс в клетках RKO и HDF, вызываемый перекисью водорода или культивацией в среде без сыворотки.

Использование специфических антиоксидантов, направленных в митохондрии, а также белкового сенсора перекиси Hyper-mito позволило установить, что изучаемые стрессы в значительной степени определяются функционированием митохондрий в клетках человека. С помощью лентивирусных конструкций получены стабильные линии клеток карцином толстого кишечника и легких, а также иммортализованных фибробластов человека с генетическим нокдауном и оверэкспрессией p66shc.

Показано, что нокдаун p66shc ингибирует образование эндогенных АФК, индуцированных перекисью водорода в клетках карциномы толстого кишечника. Было также обнаружено, что этот эффект зависит от функциональной активности митохондриальной дыхательной цепи. Впервые установлено, что нокдаун p66shc в клетках человека предотвращает фрагментацию митохондриального ретикулума и защищает от каспаз-независимой гибели с признаками некроза, индуцированной перекисью водорода. Получены новые данные, свидетельствующие о роли p66shc в индукции опосредованного митохондриями окислительного стресса, вызванного инкубацией в среде без сыворотки. Впервые показано, что подавление экспрессии p66shc защищает от гибели и ингибирует накопление АФК в клетках карциномы легких A549, индуцированные противораковым препаратом таксолом.

Вместе, полученные данные указывают на то, что прооксидантное действие p66shc в клетках человека зависит от образования АФК в митохондриях. Изучение механизмов редокс-активности p66shc имеет большое значение для этиологии и лечения множества заболеваний, ассоциированных со старением и окислительным стрессом. Среди них атеросклероз, воспаление, инфаркт миокарда, различные ишемические состояния, нейродегенеративные заболевания, а также рак и диабет.

АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Результаты работы доложены на VI Международной крымской конференции “Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии”, Судак, Украина 2010 г.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на страницах и содержит следующие разделы: введение и цель работы, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован рисунками, таблицами и содержит ссылок на литературные источники.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Окислительный стресс, вызванный перекисью водорода в клетках карциномы толстого кишечника человека RKO и в иммортализованных фибробластаx Окислительный стресс, возникающий в результате дисбаланса генерации и удаления активных форм кислорода (АФК) относится к патологическим состояниям в физиологии клетки и является важным звеном в развитии старения и самых различных заболеваний человека. Возникающее при окислительном стрессе накопление АФК может приводить к повреждению клеточных структур и молекул, и, в то же время, регулировать разнообразные сигнальные пути. В нашей работе мы исследовали окислительный стресс в культуре клеток карциномы толстого кишечника человека RKO и в культуре нетрансформированных клеток, иммортализованных путем оверэкспрессии теломеразы кожных фибробластов человека HDF. В качестве индуктора использовали перeкись водорода, которая накапливается при окислительном стрессе в различных тканях. Ранее в нашей лаборатории [Черняк и др., 2006] было обнаружено, что перекись водорода, добавленная к культуре клеток, разрушается в среде инкубации в течение получаса и вызывает медленное повышение уровня эндогенных АФК, которое достигает максимума через 2-3 часа. С помощью специфического флуоресцентного красителя CM-DCF-DA (далее DCF) мы показали, что перекись водорода вызывает значительную индукцию АФК в клетках RKO (рис. 1А).

Одним из источников АФК при окислительном стрессе являются митохондрии.

Чтобы изучить их роль в наблюдаемом окислительном стрессе мы использовали специфические направленные в митохондрии антиоксиданты SkQ1 и SkQR1, разработанные в нашей лаборатории. SkQ1 состоит из обладающего антиоксидантными свойствами производного пластохинона и конъюгированного с ним катиона децилтрифенилфосфония, транспортирующего хинон в митохондрии за счет мембранного потенциала. В случае SkQR1 в качестве катиона использовался децилродамин 19.

Митохондрии являются единственным компартментом клетки заряженным отрицательно относительно цитоплазмы. Способность антиоксидантов SkQ1 и SkQR1 накапливаться в митохондриях за счет мембранного потенциала на внутренней мембране митохондрий определяет их высокую эффективность в чрезвычайно низких дозах. Преинкубация клеток RKO в течение 3-х дней с 2 нМ SkQ1 или с 0,2 нМ SkQR1 значительно снижало накопление эндогенных АФК (рис. 1А, Б), вызванное обработкой перекисью водорода.





Схожие результаты были получены на культуре нетрансформированных фибробластов HDF (рис. 1В). Полученные данные подтвердили эффективность антиоксидантнов SkQ1 и SkQR1 и митохондриальное происхождение вторичных АФК, индуцированных перекисью водорода.

Рис. 1. Направленные в митохондрии антиоксиданты ряда SkQ защищают от окислительного стресса, вызванного перекисью водорода в клетках RKO и HDF. Клетки RKO и HDF преинкубировали с указанными концентрациями SkQ1 и SkQR1 в течение 3-х дней. (А) Флуоресценцию DCF измеряли на проточном флуориметре Beckman Coulter Epix XL4. Черным контуром показано распределение клеток в контроле. Серый пик обозначает флуоресценцию в клетках, обработанных перекисью водорода. (Б) Уровень флуоресценции DCF в контрольных клетках RKO и в клетках, обработанных 1200 мкМ перекиси водорода в течение 3-х часов. (В) Уровень флуоресценции DCF в контрольных клетках HDF и в клетках, обработанных 900 и 1200 мкМ перекисью водорода в течение 3-х часов. Представлены средние значения интенсивности флуоресценции DCF, измеренные параллельно в трех культурах клеток. Здесь и на других рисунках: Анализ данных проточной флуоцитометрии производился с помощью программы Summit. Значимые различия между указанными группами определены с помощью парного T-теста. Показаны значения стандартного отклонения;

*p 0.05.

Для дальнейшего изучения митохондриальной продукции АФК мы использовали белковый сенсор перекиси Hyper. Hyper – является первым генетически-кодируемым биосенсором, позволяющим проводить анализ изменений концентрации перекиси водорода - одной из основных АФК, образующихся в клетке при окислительном стрессе.

Данный белковый сенсор сконструирован на основе желтого флуоресцентного белка, аминокислотная последовательность которого была вставлена в регуляторный домен белка OxyR из Е.coli. Применение Hyper лишено некоторых недостатков, присущих измерению АФК с помощью DCF-DA. В нашей лаборатории была создана лентивирусная конструкция (pLCMVHyper-mito), где Hyper содержал последовательность, кодирующую сигнальный пептид импорта в митохондрии. Используя эту конструкцию мы получили стабильную линию клеток RKO, экспрессирующих направленный в митохондрии белок Hyper (рис. 2). Аналогичным образом мы получили линию клеток HDF, экспрессирующих Hyper-mito.

Используя полученные модельные клетки RKO и HDF мы показали, что под действием перекиси водорода происходит усиление флуоресценции Hyper, что говорит о повышенной продукции эндогенной перекиси водорода в митохондриях.

Митохондриально-направленные антиоксиданты SkQ1 и SkQR1 эффективно снижали в этой системе генерацию АФК (рис. 3).

Мы также изучили выживаемость клеток RKO, обработанных перекисью водорода.

На рис. 4. представлены данные о дозозависимой гибели клеток через 20 часов после обработки перекисью водорода. Преинкубация с SkQ1 или SkQR1 в течение 3-х суток значительно повышала выживаемость клеток.

Таким образом, исследование окислительного стресса, индуцированного перекисью водорода позволяет заключить, что продукция эндогенных АФК в клетках RKO и HDF в значительной степени имеет митохондриальное происхождение и играет важную роль в процессе гибели клеток RKO.

Рис. 2. Локализация белкового сенсора перекиси Hyper с сигналом импорта в митохондрии (Hyper mito). Клетки визуализировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP5. (A) Флуоресценция Hyper-mito в клетках RKO. (Б) Митохондрии клеток RKO, окрашенные специфическим потенциал-зависимым красителем тетраметилродамином (TMRM). (В) Колокализация Hyper-mito и митохондрий, окрашенных тетраметилродамином. Масштаб – 10 мкм.

Рис. 3. Направленные в митохондрии актиоксиданты SkQ ингибируют накопление АФК в митохондриях, индуцированное перекисью водорода в клетках RKO и HDF. Клетки экспрессирующие Hyper-mito преинкубировали с указанными концентрациями SkQ1 и SkQR1 в течение 3-х дней. Усиление флуоресценции Hyper-mito в клетках (A) RKO, (Б) HDF, обработанных 1200 мкМ перекиси водорода в течение 3-х часов. Представлены средние значения усиления флуоресценции Hyper-mito, измеренные параллельно в трех культурах клеток. Данные воспроизведены в двух независимых опытах.

Рис. 4. SkQ1 и SkQR1 защищают клетки RKO от токсического действия перекиси водорода. Клетки преинкубировали с 2 нМ SkQ1 или 0,2 нМ SkQR1 в течении 3-х суток. Выживаемость клеток RKO определяли после обработки 900 или 1200 мкМ перекисью водорода в течение 20 ч. Для измерения выживаемости здесь и в последующих экспериментах использовали реактив Cell Titer Blue и плашечный флуориметр Plate Chameleon V. Представлены средние значения выживаемости, определенные параллельно в пяти культурах клеток. Данные воспроизведены в двух независимых опытах.

Создание лентивирусных конструкций и получение стабильных линий клеток с генетическим нокдауном и оверэкспрессией p66shc.

Следующим этапом нашей работы было получение стабильных линий с повышенной или со сниженной экспрессией белка p66shc. Чтобы получить клетки с генетическим нокдауном изоформы p66shc, мы создали конструкции на основе лентивирусного вектора pLSLP, экспрессирующие две различные короткие шпилечные РНК (shRNA), нацеленные на уникальный для p66shc CH2-домен (конструкции pLSLPsh p66(1) и pLSLPsh-p66(2), рис 5А). В то время как последовательность sh-p66(1) была ранее опубликована, sh-p66(2) была применена нами впервые.

Рис. 5. Карты лентивирусных конструкций (А) pLSLPsh-p66(2) и (Б) pLCMVpuro-p66shc. RSV LTR – длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса, содержащий промотор;

HIV LTR - укороченный длинный концевой повтор вируса иммунодефицита человека, содержащий промотор;

Gag, env – структурные белки вирусной частицы;

cPPT – центральный полипуриновый тракт;

WPRE – посттранскрипционный регуляторный элемент из вируса гепатита Вудчака;

3’-dLTR – 3’-длинный концевой повтор вируса иммунодефицита человека;

H1 RNA – промотор для РНК-полимеразы III, под контролем которого находится транскрипция целевых shRNA;

SV40 ori – ориджин репликации в эукариотических клетках вируса SV40;

SV40 EEL poly(A)s – сигнал полиаденилирования вируса SV40;

Puro – ген устойчивости к пуромицину (пуромицин N-ацетилтрансфераза);

AmpR – ген устойчивости к ампицилину ( лактамаза);

Ori – ориджин репликации для E.coli.;

H4 – промотор гистона H4 человека;

NP promoter TP53 – промотор гена p53 человека;

CMV IE promoter - промотор ранних генов цитомегаловируса человека.

Для каждой лентивирусной конструкции были получены вирусные стоки, которыми заражали клетки RKO, HDF и клетки карциномы легких A549. Фракцию клеток с интегрированной конструкцией выделяли путем селекции на среде с пуромицином.

Степень подавления изоформы p66shc определяли с помощью Вестерн-блота, используя антитела anti-SHC (610082, “BD Biosciences”). Количественная оценка данных, представленных на и рис. 6 (А и Б) показала, что экспрессия shRNAp66(1) приводила к снижению уровня белка p66shc на 87% от исходного уровня, а shRNAp66(2) – к почти полному подавлению его экспрессии. Использованные антитела выявляли также изоформы p52shc и p46shc. При этом в клетках, экспрессирующих shRNAp66, уровень этих белков не изменялся, что подтверждает высокую селективность выбранных shRNA.

Высокая степень подавления экспрессии p66shc с помощью shRNAp66(2) была достигнута также в клетках A549 (на 94%, рис. 7А). В клетках HDF используя данную shRNA удалось снизить уровень p66shc на 55% (рис. 7Б).

При получении конструкции для оверэкспрессии p66shc, соответствующая кДНК была амплифицирована из препарата клеток RKO методом ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией). Затем полученная кДНК была клонирована в лентивирусный вектор pLCMV, в котором область, кодирующая p66shc, находилась под контролем сильного цитомегаловирусного промотора (CMV-промотора, рис 5Б). В качестве контроля был использован пустой вектор pLCMV. Для каждой из конструкций были получены вирусные стоки. После трансдукции была проведена селекция клеток RKO и HDF на среде с пуромицином. Результаты Вестерн-анализа, представленные на рис. 6В, указывают на повышение в 4.8 раза уровня изоформы р66shc в клетках RKO/pLCMVpuro-p66shc.

Отмечено также появление дополнительной полосы, не соответствующей ни одной из изоформ, которая, вероятно, образуется в результате частичной деградации рекомбинантной изоформы p66shc в экстракте клеток. В клетках HDF с помощью полученной конструкции удалось добиться повышения экспрессии p66shc в ~15 раз (рис.

7В).

Рис. 6. Иммуноблотинг белков – продуктов гена SHC1 в стабильных сублиниях клеток RKO.

Стабильные линии клеток были получены с помощью лентивирусной трансдукции конструкциями, кодирующими (A) контрольную shRNA – sh-C и shRNA против CH2-домена p66shc – sh-p66(1), (Б) sh-C и sh-p66(2), (В) p66 дикого типа. Содержание p66shc указано относительно контрольной линии клеток, либо экспрессирующей sh-C, либо содержащей пустой вектор pLCMV (V).

Рис. 7. Иммуноблотинг белков – продуктов гена SHC1 в стабильных сублиниях клеток A549 и HDF.

Стабильные линии были получены с помощью лентивирусной трансдукции конструкциями, кодирующими контрольную shRNA – sh-C и shRNA против CH2-домена p66shc – sh-p66(2) в клетках (A) A549, (Б) HDF, (В) p66 дикого в клетках HDF. Содержание p66shc указано относительно контрольной линии клеток, либо экспрессирующей sh-C, либо содержащей пустой вектор pLCMV (V).

Роль p66shc в окислительном стрессе, индуцированном перекисью водорода.

P66 известен как белок, негативно регулирующий продолжительность жизни у млекопитающих. В литературе влияние p66shc на старение преимущественно связывают с его прооксидантными свойствами. Показано, что у мышей p66shc может участвовать в развитии окислительного стресса через несколько механизмов, включающих снижение экспрессии антиоксидантных белков, активацию NADPH-оксидаз, деградацию ферритина или неопосредованную оксидоредуктазную активность p66shc в митохондриях. Однако роль p66shc в клетках человека, в том числе и при окислительном стрессе изучена недостаточно.

Мы проверили, как влияет снижение или увеличение содержания p66shc на внутриклеточный уровень АФК в ответ на окислительную нагрузку в клетках RKO и HDF.

Окислительный стресс индуцировали путем инкубации с перекисью водорода, которая, как показано выше, сопровождается выработкой эндогенных АФК в митохондриях. В клетках RKO c повышенным уровнем p66shc продукция АФК усиливалась, в то время как в клетках с подавленным синтезом p66shc образование эндогенных АФК было значительно снижено (рис. 8A, Б). Аналогичные результаты были получены на двух линиях клеток RKO, экспрессирующих shRNA-р66(1) и shRNA-р66(2). В нетрансформированных клетках HDF изменение экспрессии p66shc приводило к схожему эффекту (рис. 9А, Б). При подавлении экспрессии изоформы p66shc в необработанных перекисью водорода клетках HDF c введенным shRNA-p66(2) существенно снижался уровень АФК (рис. 9А). В клетках RKO эффект нокдауна p66 был незначительным (рис.

8А, Б). Возможно, это связано с приспособительной реакцией клеток на подавление экспрессии p66. Это противоречие планируется изучить в дальнейшей работе.

Рис. 8. Подавление p66shc ингибирует, а оверэкспрессия повышает образование эндогенных АФК, индуцированных перекисью водорода в клетках RKO. (A) Уровень флуоресценции DCF в обработанных перекисью водорода в указанных концентрациях в течение 3 ч. клетках, экспрессирующих (А) sh-C и sh p66(1), (Б) sh-C и sh-p66(2), (В) p66 или содержащих пустой вектор (V). Представлены средние значения интенсивности флуоресценции DCF, измеренные параллельно в трех культурах клеток. Данные воспроизведены в трех независимых опытах. Здесь и на других рисунках: Клеткам с контрольной shRNA (sh-C) соответствуют светлые столбцы, клеткам, экспрессирующим sh-p66(1) или sh-p66(2) – черные столбцы. Клеткам с контрольным вектором pLCMV соответствуют светлые столбцы, клеткам, сверхэкспрессирующим p66 – темные столбцы.

Рис. 9. Подавление p66shc ингибирует, а оверэкспрессия повышает образование эндогенных АФК, индуцированных перекисью водорода в клетках HDF. Уровень флуоресценции DCF в обработанных перекисью водорода в указанных концентрациях в течение 3 ч. клетках, экспрессирующих (А) sh-C и sh p66(2), (Б) p66 или содержащих пустой вектор (V). Представлены средние значения интенсивности флуоресценции DCF, измеренные параллельно в трех культурах клеток. Данные воспроизведены в трех независимых опытах.

Чтобы изучить роль митохондрий в прооксидантном действии p66shc, путем длительной инкубации в среде, содержавшей бромистый этидий, пируват и уридин мы получили клетки RKO, не содержащие митохондриальной ДНК (0 клетки). В отсутствие митохондриальной ДНК (рис. 10) дыхательная цепь в этих клетках содержит дефекты и не может нормально функционировать, и, следовательно, служить источником АФК. С помощью лентивирусной трансдукции мы ввели в RKO0 клетки sh-p66(2). В полученных клетках нокдаун по p66shc не влиял на накопление АФК индуцированное перекисью водорода (рис. 11А). Жизнеспособность 0 клеток снижалась под действием перекиси водорода значительно сильнее, чем в контрольных клетках. Возможно, это происходит за счет известного для 0 клеток повышения содержания ионов железа и других металлов.

Выживаемость RKO0 клеток обработанных перекисью водорода не изменялась при нокдауне по p66shc (рис. 11В). Эти данные указывают на то, что прооксидантное действие p66shc связано с митохондриями.

Действие p66shc на фрагментацию митохондриального ретикулума, индуцированную перекисью водорода.

Одним из ранних маркеров окислительного стресса считается фрагментация митохондрий. В покое митохондрии имеют, как правило, вытянутую форму и образуют разветвленную сеть. Окислительный стресс, вызванный перекисью водорода, приводит к фрагментации митохондриальной сети в линии клеток RKO. Отмечена первоначальная частичная фрагментация митохондрий, после чего митохондрии распадались на множество шарообразных структур (рис. 12Б, отмечено стрелкой). Эти процессы наблюдались при сублетальных дозах перекиси водорода, когда гибель клеток не превышала 20-25% (рис. 13Б).

В необработанных перекисью водорода клетках, экспрессирующих либо контрольнyю sh-С, либо shр66(2), не отмечено изменений в митохондриальной сети (рис.

12A, В). При обработке умеренной дозой перекиси водорода (до 800 мкM) клеток с подавленным синтезом изоформы p66shc, фрагментацию митохондрий наблюдали в значительно меньшей части клеток, чем в контроле (рис. 13А). При повышении концентрации перекиси водорода до 1000 мкM число клеток с фрагментированными митохондриями резко возрастало, а защитный эффект нокдауна p66shc пропадал.

Возможно, в этих условиях основной причиной фрагментации митохондрий служило не накопление АФК, а снижение мембранного потенциала. Известно, что антиоксиданты, направленные в митохондрии, предотвращают фрагментацию митохондрий в клетках, обработанных перекисью водорода, нейтрализуя АФК в митохондриях [Черняк и др., 2006]. Защитный эффект этих антиоксидантов, так же как при нокдауне p66shc, пропадал при повышенных концентрациях перекиси водорода.

Полученные данные указывают на то, что фрагментация митохондриальной сети при окислительном стрессе зависит от опосредованного p66shc накопления АФК в митохондриях.

Рис. 10. Окрашиевание ДНК с помощью специфической краски Sybr Green I (А) в клетках RKO и (Б) в клетках, не содержащих митохондриальную ДНК RKO. Масштаб – 10 мкм.

Рис. 11. Ингибирование прооксидантных свойств p66shc в клетках RKO с неактивной дыхательной цепью. (А) Уровень флуоресценци DCF в клетках, обработанных перекисью водорода в указанных концентрациях в течение 3 ч. (Б) Уровень флуоресценции субстрата каспаз 3 и 7 Z-DEVD-R110 в клетках RKO, обработанных в течение 20 часов 400 мкМ перекисью водорода. (В) Выживаемость клеток RKO через 20 часов после обработки перекисью водорода в указанных концентрациях. Представлены средние значения выживаемости, определенные параллельно в пяти культурах клеток. Данные воспроизведены в двух независимых опытах.

Рис. 12. Митохондриальная сеть в Рис. 13.Генетический нокдаун p66shc клетках линии RKО. (А) Необработанные защищает митохондриальную сеть от клетки с контрольной shRNA (sh-C). (Б) Клетки с фрагментации под действием перекиси контрольной sh-C, обработанные перекисью водорода. (А) Содержание клеток с водорода (800 мкМ), в течение 20 ч. (В) фрагментированными митохондриями после Необработанные клетки с shRNA p66-2. (Г) обработки перекисью водорода в указанных Клетки с shRNA p66-2, обработанные перекисью концентрациях в течение 20 ч. (Б) водорода (800 мкМ), в течение 20 ч. Выживаемость клеток после обработки Митохондрии окрашивали 100 нМ раствором перекисью водорода (800 мкМ) в течение Mitotracker Red в течение 15 минут при 37°С. ч. Представлены средние значения Видно, что в контрольных клетках (А и В) выживаемости, определенные параллельно в имеются тяжи митохондрий, а после обработки пяти культурах клеток. Данные перекисью (Б) эти тяжи фрагментированы воспроизведены в трех независимых опытах.

(показано стрелкой). Масштаб – 10 мкм.

Эффект изменения экспрессии p66shc на гибель клеток, вызванную окислительным стрессом и аноикис Мы показали, что снижение уровня белка p66shc в клетках RKO человека значительно повышает их выживаемость при цитотоксическом действии перекиси водорода (рис. 14А). Аналогичное действие нокдауна p66shc наблюдалось в клетках A (рис. 14В). Этот эффект согласуется со снижением окислительного стресса индуцированного перекисью водорода в клетках с подавлением экспрессии p66shc. В отличие от эффекта нокдауна, оверэкспрессия p66 не повлияла на гибель клеток RKO, под действием перекиси водорода (рис. 14Б). Возможно, это связано с высоким уровнем исходной экспрессии p66shc в клетках RKO.

Чтобы изучить тип клеточной смерти, вызываемый высокими дозами перекиси водорода мы измерили активность эффекторных каспаз 3 и 7. Обработка перекисью приводила к значительной активации каспаз 3 и 7 в клетках RKO, а подавление экспрессии p66shc несколько снизило эту активацию (рис. 15Б). Для определения роли каспаз в процессе гибели этих клеток мы использовали ингибитор каспаз широкого спектра действия ZVAD-FMK. Выяснилось, что преинкубация со ZVAD не влияет на гибель этих клеток (рис. 15А). Кроме того, мы проверили возможна ли в данной системе клеточная гибель путем программируемого некроза («некроптоза»). Для этого мы преинкубировали клетки RKO с некростатином (Nec-1), ингибитором киназы RIP, играющей ключевую роль в развитии некроптоза. Однако некростатин также не оказал влияния на гибель клеток (рис. 15В). Так как ингибитор каспаз не повлиял на клеточную смерть, мы исследовали целостность мембран клеток, используя пропидий йодид, чтобы оценить степень некроза. Оказалось, что после обработки перекисью водорода около 50% процентов клеток были окрашены пропидий йодидом, что свидетельствует в пользу некротического типа клеточной смерти. В клетках RKO с подавленным синтезом p66shc пропидий-положительных клеток было существенно меньше (рис. 16).

Для исследования роли митохондрий в клеточной гибели, индуцированной перексиью водорода мы использовали клетки RKO0. Как было указано выше, эти клетки оказались значительно более чувствительными к перекиси. Нокдаун p66shc не повлиял на выживаемость RKO0 клеток, и лишь незначительно снизил активацию каспаз после обработки перекисью водорода, что соответствовало малым изменеиям уровня АФК (рис.

11).

Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что p66shc в клетках RKO действует как прооксидантный белок, индуцирующий образование эндогенных митохондриальных АФК под действием перекиси водорода и необходим для развития клеточной смерти с признаками некроза.

Рис. 14. Генетический нокдаун p66shc защищает клетки RKO и A549 от цитотоксического действия перекиси водорода. Выживаемость после обработки перекисью водорода в течение 20 ч. клеток RKO, экспрессирующих (A) sh-C и sh-p66(2), (Б) p66 или содержащих пустой вектор (V) или клеток A549 с введенными sh-C и sh-p66(2). Представлены средние значения выживаемости, определенные параллельно в пяти культурах клеток. Данные воспроизведены в трех независимых опытах.

Рис. 15. Клеточная гибель, вызванная перекисью водорода в клетках RKO не зависит от активности каспаз и киназы RIP. Клетки обрабатывали 900 или 1200 мкМ перекиси водорода в течение 20 ч. (A) Влияние преинкубации с ZVAD-FMK (100мкМ) в течении 40 мин на выживаемость клеток. (Б) Флуоресценция субстрата каспаз 3 и 7 в Z-DEVD-R110 в клетках. (В) Влияние преинкубации с Nec-1 ( мкМ) в течении 40 мин на выживаемость клеток. Представлены средние значения выживаемости, определенные параллельно в пяти культурах клеток. Данные воспроизведены в трех независимых опытах.

Рис. 16. Генетический нокдаун p66shc снижает количество клеток RKO окрашенных пропидий йодидом после обработки перекисью водорода. Клетки были обработаны 1200 мкМ перекисью водорода в течение 20 часов и окрашены пропидий йодидом (40 мкг/мл) и Sybr Green I (0,05x) (A) Клетки с введенной контрольной shRNA-C. (Б) Клетки, экспрессирующие shRNA-p66(2). (В) Результаты подсчета клеток окрашенных пропидием йодида. Представлены средние значения, определенные параллельно в пяти культурах. Данные воспроизведены в двух независимых опытах.

Клинические исследования показали, что высокий уровень экспрессии p66shc коррелирует с неблагоприятным прогнозом при раке толстой кишки. В то же время показано, что p66shc способствует гибели клеток карциномы легких при отрыве от субстрата («аноикису»). В последнем случае эффект связан с тем, что p66shc усиливает активацию малой ГТФазы RhoA. Мы исследовали влияние p66shc на аноикис в клетках карциномы толстой кишки. Для изучения аноикиса использовали планшеты, обработанные полимером полиХЕМА, предотвращающим прикрепление клеток к субстрату. Мы выявили защитное действие нокдауна p66shc при аноикисе в клетках RKO (рис. 17). Этот результат согласуется с данными о том, что одной из причин аноикиса является избыточная продукция АФК в митохондриях.

Рис. 17. Генетический нокдаун p66shc защищает от гибели клетки RKO, неприкрепленные к субстрату. Представлена выживаемость клеток RKO после культивации в течение 24 часов в планшетах, дно которых обработано полимером полиХЕМА. Представлены средние значения выживаемости, определенные параллельно в пяти культурах клеток. Выживаемость прикрепленных клеток принята за 100%. Данные воспроизведены в двух независимых опытах.

Роль p66shc в оксилительном стрессе, вызванном инкубацией в бессывороточной среде.

В качестве еще одной модели окислительного стресса мы использовали инкубацию клеток в среде без сыворотки. Известно, что попадание клеток в бессывороточную среду сопровождается окислительным стрессом, что может приводить к запуску апоптоза.

Показано, что, при этом, по крайней мере, часть АФК вырабатывается в митохондриях, и за это отвечает митохондриальный белок Romo1. Инкубация клеток RKO и HDF в среде без сыворотки также приводила к выраженной продукции АФК, которая была ингибирована под действием направленных в митохондрии антиоксидантов SkQ (рис.18А, Б) и SkQR1 (рис. 18Б, В). Эти результаты, вместе с данными литературы, свидетельствуют о митохондриальном происхождении АФК при стрессе, вызванном культивацией в среде без сыворотки.

Рис. 18. Направленные в митохондрии актиоксиданты ряда SkQ защищают клетки RKO и HDF от окислительного стресса, индуцированного инкубацией клеток в среде без сыворотки. Клетки RKO и HDF преинкубировали с указанными концентрациями SkQ1 и SkQR1 в течение 3-х дней, а затем в среде без сыворотки в течение 24 часов. Уровень флуоресценции DCF в клетках HDF (А, В) и RKO (Б) после культивации в среде без сыворотки. Представлены средние значения интенсивности флуоресценции DCF, измеренные параллельно в трех культурах клеток. Данные воспроизведены в трех независимых опытах.

Лишение клеток сыворотки относится к клеточным стрессам, возникающим при таких патологических состояниях как ишемия и рост опухолей. Нашей следующей задачей было выяснение действия p66shc на раковые и нетрансформированные клетки, культивируемые в среде без сыворотки. В данных стрессовых условиях в клетках RKO подавление синтеза p66shc приводило к существенному снижению как уровня цитоплазматических АФК, измеренного с помощью DCF-DA (рис. 19А), так и уровня митохондриальных АФК, измеренного с помощью Hyper-mito (рис. 20). В клетках RKO защитное действие нокдауна p66shc не наблюдалось (рис. 19Б).

Рис. 19. Нокдаун p66shc ингибирует образование АФК, индуцированное инкубацией в среде без сыворотки в клетках RKO, но не в клетках RKO с неактивной дыхательной цепью. Уровень флуоресценции DCF измеряли после 24 часов культивации в среде без сыворотки клеток (A) RKO, (Б) RKO. Представлены средние значения интенсивности флуоресценции DCF, измеренные параллельно в трех культурах клеток. Данные воспроизведены в трех независимых опытах.

Схожий результат был получен на нетрансформированных клетках HDF, в которых нокдаун снижал, в то время как оверэкспрессия p66shc, наоборот стимулировала образование эндогенных АФК (рис. 21А, Б). Эти данные, наряду с результатами, представленными выше, свидетельствует в пользу митохондриального происхождения АФК, индуцированных инкубацией в среде без сыворотки и прооксидантной роли p66shc в митохондриях. Эффект нокдауна p66shc в нормальных клетках оказался несколько слабее, чем в раковых. Аналогичная тенденция наблюдалась при индукции окислительного стресса перекисью водорода (сравн. рис 8 и рис. 9). Возможно, эти различия отражают больший вклад p66shc в продукцию АФК в раковых клетках.

Рис. 20. Нокдаун p66shc ингибирует накопление в митохондриях АФК, индуцированное инкубацией клеток RKO в среде без сыворотки. Показано усиление флуоресценции Hyper-mito в клетках RKO, инкубированных в среде без сыворотки в течение 24 часов. Представлены средние значения усиления флуоресценции Hyper-Mito, измеренные параллельно в трех культурах клеток. Данные воспроизведены в двух независимых опытах.

Рис. 21. Подавление p66shc ингибирует, а оверэкспрессия повышает образование эндогенных АФК, индуцированное инкубацией клеток HDF в среде без сыворотки. Уровень флуоресценции DCF в клетках, культивируемых в среде без сыворотки в течение 24 часов и экспрессирующих (A) sh-C и sh-p66(2), (Б) p или содержащих пустой вектор (V). Представлены средние значения интенсивности флуоресценции DCF, измеренные параллельно в трех культурах клеток. Данные воспроизведены в двух независимых опытах.

Окислительный стресс и гибель клеток карциномы легких A549, вызванные антираковым препаратом таксолом. Роль p66shc.

Одним из известных противораковых препаратов является таксол, который нарушает процесс митоза благодаря стабилизации микротрубочек веретена. Показано, что этот широко применяемый в лечении рака легких и груди препарат вызывает апоптоз.

Механизмы индуцированного таксолом апоптоза малоизученны, однако известно, что необходимым этапом его развититя является окислительный стресс. Мы решили выяснить роль p66shc в цитотоксическом действии таксола. Было обнаружено, что нокдаун p66shc защищал клетки карциномы легких A549 от гибели, вызванной высокими концентрациями таксола (рис. 22А). В нескольких работах было показано, что p66shc может способствовать пролиферации гормон-зависимых раковых клеток: карцином груди и простаты. Эффект нокаута p66shc на пролиферацию клеток карциномы легких A549 мог бы объяснить его защитное действие в экспериментах с таксолом, так как неделящиеся клетки устойчивы к ингибиторам митоза. Для проверки этой возможности клетки A были клонированы и трансдуцированы лентивирусом, кодирующим shRNA-p66(2). Из рис. 23 видно, что нокдаун не повлиял на темпы роста этих клеток. В то же время подавление экспрессии p66shc снижало индуцированную таксолом продукцию АФК (рис 22Б). Эти результаты согласуются с данными о роли АФК в таксол-зависимой клеточной смерти и указывают на то, что белок p66shc принимает участие в ее развитии благодаря своему прооксидантному действию.

Рис. 22. Подавление экспрессии p66shc защищает клетки A549 от окислительного стресса и гибели, вызванных таксолом. (А) Выживаемость клеток A549 после обработки таксолом в течение 48 ч.

Представлены средние значения выживаемости, определенные параллельно в пяти культурах клеток. (Б) Уровень флуоресценции DCF в клетках, обработанных 1000 нМ таксолом в течение 24 ч. Представлены средние значения интенсивности флуоресценции DCF, измеренные параллельно в трех культурах клеток.

Данные воспроизведены в двух независимых опытах.

Рис. 23. Подавление экспрессии p66shc в клетках A549 не влияет на скорость их роста. (А) Кривая роста и (Б) темпы прироста клеток A549 с введенными контрольной shRNA (sh-C) и sh-p66(2).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Исследование окислительного стресса, индуцированного добавлением экзогенных оксидантов или вызванного нарушением внутриклеточных сигналлингов свидетельствует о прооксидантной роли p66shc в культурах раковых и нетрансформированных клеток человека. Показано, что активность p66shc опосредована образованием эндогенных АФК в митохондриях и может приводить к фрагментации митохондриального ретикулума. Эти данные согласуются с результатами полученными на мышиных фибробластах, где p66shc может транслоцироваться в митохондрии и участвовать в образовании митохондриальных АФК.

Показано, что помимо стимуляции апоптоза, описанной в литературе, p66shc может участвовать в некротической гибели клеток при окислительном стрессе. Кроме того продемонстрировано, что в клетках карциномы легких p66shc участвует в клеточной гибели, вызванной таксолом. Полученные данные помогают составить более полное представление о прооксидантном действии p66shc, реализуемом в митохондриях.

Понимание механизмов генерации АФК, а также регуляции их образования в митохондриях может быть использовано в фармакотерапии различных заболеваний и в борьбе cо старением.

ВЫВОДЫ 1. Под действием перекиси водорода или при лишении сыворотки происходит накопление эндогенных активных форм кислорода (АФК) в митохондриях клеток карциномы толстой кишки человека RKO и иммортализованных фибробластов кожи человека HDF 2. С помощью лентивирусных конструкций получены стабильные линии клеток RKO, карциномы легких человека A549 и иммортализованных фибробластов человека с генетическим нокдауном и оверэкспрессией p66shc. Получены клетки RKO, экспрессирующие белковый сенсор Hyper-mito локализованный в митохондриях.

3. В клетках RKO и HDF подавление p66shc ингибирует, а оверэкспрессия повышает образование эндогенных АФК, индуцированных перекисью водорода или лишением сыворотки. В клетках с неактивной дыхательной цепью защитный эффект нокдауна по p66shc не наблюдается.

4. Генетический нокдаун p66shc предотвращает зависимую от образования митохондриальных АФК фрагментацию митохондрий и гибель клеток RKO.

Клеточная гибель не зависит от активности каспаз и имеет признаки некроза.

Нокдаун p66shc не защищает клетки RKO с неактивной дыхательной цепью от гибели, вызванной обработкой перекисью водорода.

5. Подавление экспрессии p66shc в клетках A549 не влияет на скорость их роста, однако защищает от окислительного стресса и клеточной гибели, вызванных противораковым препаратом таксолом.

6. Данные, полученные на различных моделях окислительного стресса клеток человека свидетельствуют о том, что прооксидантное действие p66shc зависит от образования АФК в митохондриях.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Галимов Е.Р., Сидоренко А.С., Терешкова А.В., Плетюшкина О.Ю., Черняк Б.В., Чумаков П.М. Действие белка p66shc на устойчивость клеток рака толстого кишечника RKO к окислительному стрессу.// Молекулярная биология. 2012. Т. 46. № 1. С. 126-133.

2. Галимов Е.Р. Роль p66shc в окислительном стрессе и апоптозе.// Acta Naturae. 2010.

Т. 2. №4. С. 49-57.

3. Галимов Е.Р., Черняк Б.В., Чумаков П.М., Скулачев В.П. Роль p66shc в регуляции митохондриальных активных форм кислорода.// VI Международная крымская конференция “Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии”. Судак.

Украина. 2010. Сборник тезисов. С. 11.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.