авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Астрологический Прогноз на год: карьера, финансы, личная жизнь


Характеристика интегразы пенообразующего вируса и оценка возможности ее использования для направленной интеграции днк

На правах рукописи

Княжанская Екатерина Сергеевна

Характеристика интегразы пенообразующего вируса и

оценка возможности ее использования для направленной интеграции ДНК

03.01.03 – молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Москва 2011

Работа выполнена в отделе химии нуклеиновых кислот НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В.

Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Готтих Марина Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Карпов Вадим Львович доктор химических наук Тишков Владимир Иванович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики

Защита состоится 9 декабря 2011 года в 11.00 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, аудитория 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 8 ноября 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Генная терапия различных заболеваний является одним из наиболее перспективных путей развития современной медицины и биотехнологии.

Большинство одобренных генно-терапевтических протоколов основано на использовании вирусных векторов для доставки "лечебных генов". Перспективно использование ретровирусных векторов, способных встраивать вносимую ДНК в клеточный геном.

Встраивание ДНК осуществляется вирусным ферментом интегразой (ИН), которая сиквенс-специфично взаимодействует с вирусной ДНК, но не проявляет сиквенсных предпочтений при связывании клеточной ДНК. В ходе интеграции ИН взаимодействует с рядом клеточных белков, формируя прединтеграционный комплекс (ПИК), белки которого приводят интеграцию в определенные области генома. Так, показано, что ВИЧ-1 склонен интегрироваться в транскрибируемые гены, а вирус лейкемии мышей (MLV) – в участки старта транскрипции. Эти особенности интеграции ретровирусов несут в себе опасность инсерционного мутагенеза: «выключения» генов или активации онкогенов. И действительно, отмечены случаи возникновения онкологических заболеваний у пациентов, которые подвергались генной терапии с использованием ретровирусных векторов. Таким образом, очевидно, что необходима разработка методики, обеспечивающей направленность интеграции таких векторов в безопасные участки генома. Также актуален вопрос, какой именно ретровирус выбрать в качестве основы для создания генно терапевтических векторов. Основным приемом при разработке систем направленной интеграции является присоединение к ИН белкового домена, обладающего сайт специфической ДНК-связывающей активностью. Однако до сих пор не было предложено ни одной системы, способной направлять интеграцию ДНК в безопасный сайт в человеческом геноме.

Перспективными векторами для генной терапии считаются спумаретровирусы (СВ).

Представители этого подсемейства способны заражать человека, не вызывая патологического эффекта. Векторы на основе СВ размножаются в большом наборе клеточных культур, и, в частности, эффективно вводятся в гематопоэтические линии.

Известно, что СВ векторы не демонстрируют опасных предпочтений в интеграции, свойственных для векторов на основе MLV и ВИЧ-1. Тем не менее, ИН СВ еще не использовалась для разработки систем направленной интеграции. Самым хорошо исследованным представителем подсемейства СВ является вирус PFV (prototype foamy virus), в силу чего именно этот вирус целесообразно использовать для первой попытки разработать систему направленной интеграции на основе СВ.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка системы для направленной интеграции ДНК на основе гибрида ИН PFV и белка, способного специфично связываться с безопасным участком в геноме человека. В ходе работы необходимо было решить следующие задачи:

1) охарактеризовать ДНК-связывающую и каталитическую активности ИН PFV;

2) провести дизайн и конструирование нового белка, способного направить интеграцию в безопасный участок в геноме человека;

3) создать систему направленной интеграции на основе гибрида ИН PFV и сконструированного белка и оценить способность этой системы направлять интеграцию в сайт узнавания этого белка в плазмидной ДНК in vitro.

Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе впервые изучена роль металла-кофактора в процессе интеграции короткого ДНК-субстрата ИН PFV в плазмидный вектор и показано, что в присутствии Mg2+ значительно увеличивается выход продукта согласованной интеграции. Изучено влияние модификации ДНК субстрата ИН PFV на эффективность реакции 3’-процессинга и выявлены нуклеотиды, с которыми сближены остатки лизина каталитического домена ИН PFV. Исследовано влияние коротких одноцепочечных олигонуклеотидов на активность ИН PFV в реакции 3’ процессинга, и показано, что для них характерен двухсайтовый механизм связывания, обеспечивающий концентрационно-зависимую активацию, а затем ингибирование ИН.



Впервые предложено направлять интеграцию в участок длиной 18 п.о. в гене лейциновой тРНК. Синтезирован de novo ген белка tRL18, состоящего из шести доменов «цинковые пальцы» и способного специфически связывать выбранный участок. Выделен белок tRL18, сконструирован набор гибридных белков на основе tRL18 и интеграз PFV и ВИЧ-1, проведена характеристика этих белков. Исследована способность гибридных белков направлять интеграцию ДНК в плазмидный вектор, содержащий сайт узнавания tRL18, in vitro и показано, что гибридные белки на основе ИН PFV обеспечивают иной профиль интеграции, чем ИН дикого типа: снижение частоты интеграции в сайт узнавания tRL18 и повышение частоты интеграции в участки, непосредственно прилегающие к сайту.

Систему направленной интеграции, сконструированную и опробованную в данной работе, можно рассматривать как основу для создания генно-терапевтических векторов на основе PFV.

Публикации и апробация работы. По материалам работы опубликовано 4 статьи в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах. Результаты работы были доложены на следующих конференциях: международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2006», секция «Биология» (Москва, 12-15 апреля 2006 г.);

IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11-15 мая 2008 г.);

14th International Conference “Microbial enzymes in biotechnology and medicine” (Казань, 2009 г.);

VIIIth European symposium of Protein society (Цюрих, Швейцария, 14-18 июня 2009 г.);

the EMBO Meeting 2010 (Барселона, Испания, 4 7 сентября 2010 г.);

Ist International Interdisciplinary Conference “Modern problems in systemic regulation of physiological functions” (Сафага, Египет, 10-21 декабря 2010 г.);

the EMBO Meeting 2011 (Вена, Австрия, 10-13 сентября 2011 г.).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, экспериментальную часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 37 рисунками и 9 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 230 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

На сегодняшний день достаточно много известно об особенностях строения ИН PFV и об ее взаимодействии с ДНК. Существуют данные рентгено-структурного анализа ее комплекса с ДНК (Hare S. et al., 2010). Однако на момент начала нашей работы эта ИН, также как и сам вирус PFV, были изучены сравнительно мало. В этой связи мы в первую очередь исследовали особенности каталитической активности ИН PFV и ее взаимодействия с ДНК-субстратом. Полученные данные сравнивались с данными о функционировании наиболее изученной ретровирусной ИН - ИН ВИЧ-1. Большинство из описанных в литературе систем направленной интеграции использовали ИН ВИЧ-1, включая и самую успешную из таких систем (Tan W. et al, 2006, Su K. et al., 2009). Мы решили использовать обе эти ИН для конструирования системы направленной интеграции.

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности ДНК-субстратов ИН PFV и ИН ВИЧ- Cубстрат Нуклеотидная последовательность дуплекса Название олигонуклеотида (U5Аpfv) 3’-TATGTTTTAAGGTACTGTTA-5’ pfv U (U5Bpfv) 5’-ATACAAAATTCCATGACAAT-3’ (U5Аpfv) 3’-TATGTTTTAAGGTACTGTTA-5’ U5pfv- (U5B-2pfv) 5’-ATACAAAATTCCATGACA----3’ (U5Аpfv) 3’-----TATGTTTTAAGGTACTGTTA-5’ U5pfvFL (U5BpfvFL) 5’-FL-ATACAAAATTCCATGACAAT-3’ (U5А27pfv) 3’-TTAGTTATATGTTTTAAGGTACTGTTA-5’ pfv U5 (U5В27pfv) 5’-AATCAATATACAAAATTCCATGACAAT-3’ (U5Ahiv) 3’-CACACCTTTTAGAGATCGTCA-5’ hiv U (U5Bhiv) 5’-GTGTGGAAAATCTCTAGCAGT-3’ (U5Ahiv) 3’-CACACCTTTTAGAGATCGTCA-5’ hiv U5 - (U5Bhiv) 5’-GTGTGGAAAATCTCTAGCA-----3’ Катализируемый ретровирусными ИН процесс встраивания вирусной ДНК в клеточный геном состоит из двух стадий. На первой из них, называемой 3’-процессинг, ИН отщепляет динуклеотид с 3’-концов каждой цепи вирусной ДНК (АТ в случае PFV, GT в случае ВИЧ-1). На втором этапе ИН катализирует нуклеофильную атаку 3'-гидроксильных групп процессированных цепей ДНК по межнуклеотидным фосфатам обеих цепей клеточной ДНК с образованием ковалентного продукта. Обе эти реакции можно воспроизвести in vitro с использованием очищенного препарата ИН и олигонуклеотидных дуплексов, имитирующих конец вирусной ДНК (Таблица 1. Нуклеотидные последовательности ДНК-субстратов ИН PFV и ИН ВИЧ-1). Известно, что свойства препарата ИН сильно зависят от метода выделения. В нашей работе обе ИН были выделены согласно методике (Leh H. et al., 2000) без детергентов и в присутствии ионов Mg2+ и Zn2+.

1. Характеристика ИН PFV 1.1. Исследование ДНК-связывающей активности ИН PFV Для определения сродства ИН PFV к своему субстрату, дуплекс U5pfv в фиксированной концентрации (2 нМ) титровался возрастающими концентрациями ИН PFV. Полученные комплексы анализировались методом торможения в геле в неденатурирующих условиях. В приближении исследуемой системы к теории простого лиганд-рецепторного взаимодействия по уравнению (1) было рассчитано кажущееся значение Kd app, которое соответствовало 15–20 нМ. Это значение близко к определенному ранее Kd app ИН ВИЧ-1 с субстратом U5hiv (40 нМ, Deprez E. et al., 2004). Наше значение для ИН PFV ниже полученного другой исследовательской группой (Delelis O. et al., 2008) – нМ, однако различия могут быть обусловлены разными методами определения Kd app.

[ DNA]0 + [ IN ]0 + K d ' ([ DNA]0 + [ IN ]0 + K d ' ) 2 4 [ DNA]0 [ IN ] [ IN * DNA] = 2 (1) Нужно отметить, что метод торможения в геле не позволяет выявить разницу в ДНК связывающей активности ретровирусной ИН к ее ДНК-субстрату и к некоторой случайной последовательности ДНК той же длины. Таким образом, полученное нами значение Kd app является также и константой диссоциации комплекса между ИН PFV и неспецифической последовательностью ДНК.

Рисунок 1. Кинетика связывания 2 нМ Мы также исследовали кинетику ДНК со 100 нМ ИН ВИЧ-1 (белые кружки) и ИН PFV (черные кружки) при 25°С, связывания ИН PFV с ДНК, используя для этого исследованная методом поляризации субстрат, несущий флуоресцеин на 5’-конце В флуоресценции.

цепи (U5 FL, Таблица 1). При добавлении препарата ИН PFV к раствору U5pfvFL pfv наблюдалось резкое увеличение анизотропии флуоресцентного сигнала. Зависимость изменения анизотропии флуоресценции U5pfvFL в присутствии ИН PFV от времени приведена на Рис.Рисунок 1. Кинетика связывания 2 нМ ДНК со 100 нМ ИН ВИЧ-1 (белые кружки) и ИН PFV (черные кружки) при 25°С, исследованная методом поляризации флуоресценции.. Согласно этим данным, полное связывание ДНК-субстрата достигается в течение трех минут, в то время как связывание ДНК-субстрата ИН ВИЧ-1 занимает 20 мин (Smolov M. et al., 2006).

Таким образом, несмотря на то, что сродство к ДНК-субстрату у обоих ферментов примерно одинаково, ИН PFV значительно быстрее связывает свой ДНК-субстрат.

1.2. Исследование каталитической активности ИН PFV Ретровирусные ИН являются металл-зависимыми ферментами;

в качестве металла кофактора in vivo выступают ионы Mg2+, in vitro им также может быть Mn2+. Известно, что ИН ВИЧ-1 проявляет бльшую специфичность при связывании ДНК-субстрата в присутствии Mg2+, однако замена иона металла не сказывается на каталитической активности ИН ВИЧ-1, выделенной без использования детергентов. Также известно, что ИН PFV, выделенная с детергентом, проявляет бльшую каталитическую активность в присутствии ионов Mn2+, нежели ионов Mg2+ (Pahl A. and Flgel R., 1993;

Lee H. K. et al, 2005). Поскольку способ выделения ИН влияет на ее каталитическую активность, мы исследовали влияние кофактора на активность ИН PFV, выделенной без детергентов.

1.2.1. Активность ИН PFV в реакции 3’-процессинга и гомологичного переноса цепи Реакцию 3’-процессинга in vitro проводили, используя субстрат U5pfv и принятые в литературе условия реакции. В ходе 3’-процессинга ИН отщепляет динуклеотид АТ с 3’ конца В-цепи. Эффективность этой реакции можно оценить по накоплению укороченного продукта на радиоавтографе (Рис. 2А). Мы показали, что в присутствии Mn2+ ИН PFV в 8 Mg2+ 10 раз более активна, чем в присутствии (Рис. 2А).

Рисунок 2. Активность ИН PFV в реакции 3’-процессинга (А) и гомологичного переноса цепи (Б) в буфере, содержащем Mg2+ (левая часть радиоавтографов) и Mn2+ (правая часть радиоавтографов) при возрастающих концентрациях ИН (0-10-25-50-100-200-500 нМ для 3’-процессинга и 0-10-50-100- нМ для переноса цепи).

Те же закономерности наблюдались и при проведении реакции переноса цепи (Рис.

2Б). В этой реакции ИН использует субстрат U5-2, в котором В-цепь укорочена на нуклеотида и имитирует продукт 3’-процессинга;

при этом дуплекс U5-2 может использоваться ИН и как субстрат, и как мишень интеграции. Это так называемый гомологичный перенос цепи. Эффективность этой реакции можно оценить по накоплению продуктов с меньшей подвижностью, чем у исходного субстрата (Рис. 2Б).





При работе с ИН ВИЧ-1 обычно используют большой избыток фермента по отношению к субстрату (обычно 30:1). Оптимальными являются 2-4 нМ концентрация субстрата и 50-100 нМ концентрация фермента. Мы исследовали зависимость эффективности 3’-процессинга от концентрации ИН PFV и определили, что максимальный выход продукта 3’-процессинга достигается при 100-250 нМ ИН. Реакция проводилась в присутствии Mn2+, так как выход продукта в этом случае выше, что снижает ошибки при оценке данных. Далее, мы подобрали оптимальную концентрацию субстрата U5pfv, варьируя его концентрацию и оставив концентрацию ИН 100 нМ постоянной.

Оптимальная концентрация субстрата составила 3-10 нМ;

ее повышение не приводило к увеличению выхода продукта реакции. Таким образом, условия реакции 3’-концевого процессинга для ИН ВИЧ-1 и PFV схожи. Значительное превышение концентрации фермента над субстратом объясняется тем, что каталитически активна олигомерная форма ИН (в 3’-процессинге одного конца вирусной ДНК задействуется минимум 2 субъединицы ИН) и, в силу специфики выделения, не все молекулы ИН в растворе являются активными.

Стоит отметить, что ранее в нашей лаборатории был показан так называемый однооборотный механизм каталитического процесса для ИН ВИЧ-1, при котором один каталитически активный мультимер ИН связывается с молекулой субстрата, катализирует отщепление динуклеотида и остается связанным с ДНК в силу высокого сродства к ней, а значит выводится из дальнейшего каталитического процесса (Smolov M. et al., 2006).

Возможно, эта же модель может быть применима и для ИН PFV.

Мы также исследовали зависимость накопления продуктов 3’-процессинга от времени и рассчитали стационарную скорость накопления продукта на линейной стадии роста Vlinear=0,014 нмоль/мин. Сравнение полученной для ИН PFV величины Vlinear с аналогичной характеристикой для ИН ВИЧ-1, равной 0,011 нмоль/мин (Smolov M. et al., 2006), показывает, что оба фермента характеризуются очень низкой скоростью 3’ процессинга.

1.2.2. Активность ИН PFV в реакции гетерологичного переноса цепи Мы также сравнили активности ИН PFV и ИН ВИЧ-1 в реакции гетерологичного переноса цепи, т.е. интеграции ДНК-субстрата в плазмидную ДНК. В качестве субстрата использовались дуплексы U5-2, содержащие радиоактивную метку на 5’-конце процессированной цепи. В качестве мишени для интеграции использовали плазмиду pbr322 (Fermentas). В ходе этой реакции ИН может встраивать одну молекулу ДНК субстрата в одну цепь плазмидной ДНК, этот процесс называется точечной интеграцией и приводит к образованию релаксированной формы плазмиды. Возможно также встраивание двух молекул ДНК-субстрата в разные цепи плазмидной ДНК, приводящее к образованию ее линейной формы. Этот процесс называется согласованной интеграцией и соответствует интеграции in vivo. Анализ продуктов реакции, содержащих радиоактивную метку, проводился в неденатурирующем агарозном геле.

Рисунок 3. Анализ в неденатурируещем агарозном геле продуктов интеграции в плазмиду pbr322.

Гетерологичный перенос субстрата U5-2pfv, катализуемый ИН PFV в буфере, содержащем Mn2+ (А) и Mg2+ (Б). В. Гетерологичный перенос субстрата U5-2hiv, катализуемый ИН ВИЧ-1 в буфере, содержащем Mn2+, в присутствии LEDGF. Все эксперименты проводились при возрастающих концентрациях ИН: 0-0,5-0,75-1-1,5 мкМ.

В буфере, содержащем Mn2+, гетерологичный перенос, катализуемый ИН PFV, происходит достаточно эффективно (Рис. 3А), причем примерно 30% от общего продукта составляет продукт согласованной интеграции, соответствующий по подвижности линейной форме плазмиды. Интересно, что в присутствии ионов Mg2+, общая эффективность интеграции в плазмиду практически не отличалась от интеграции в присутствии Mn2+, однако распределение продуктов точечного и согласованного переноса изменилось: около 80% от общего продукта интеграции пришлось на согласованную интеграцию (Рис. 3Б). В целом, наши результаты согласуются с результатами (Valkov E. et al., 2009), однако, мы впервые показали влияние иона металла-кофактора на распределение продуктов гетерологичной интеграции ИН PFV.

В случае ИН ВИЧ-1, нам не удалось детектировать продуктов интеграции в плазмиду ни в присутствии Mg2+, ни Mn2+. Только добавление в реакционную смесь активатора ИН ВИЧ-1, белка LEDGF, позволило осуществить гетерологичный перенос субстрата U5-2hiv с преимущественным формированием релаксированной формы плазмиды (Рис. 3В). Транскрипционный фактор LEDGF/p75 является клеточным ко-фактором ИН ВИЧ-1. Известно, что in vitro ИН ВИЧ-1 в комплексе с LEDGF проявляет повышенную активность в реакции гомологичного переноса цепи. В то же время, недавно было показано (Kessl J. J. et al, 2011.), что пресформированный комплекс ИН/LEDGF не способен катализировать согласованную интеграцию. Авторы полагают, что причиной этого служит жесткая конформация комплекса ИН/LEDGF, не способная к перестройке, необходимой для успешного протекания согласованной интеграции, то есть для одновременного переноса двух молекул субстратной ДНК (в клетке – двух концов вирусной ДНК) в ДНК мишень. В нашем эксперименте добавление LEDGF стимулировало активность ИН ВИЧ- в реакции гетерологичного переноса цепи, однако процент продукта согласованной интеграции был крайне низок.

Итак, мы показали, что в реакции 3’-процессинга ИН PFV слабо активна в буфере с Mg, но проявляет высокую активность в буфере, содержащем Mn2+. В то же время в 2+ реакции гетерологичного переноса субстрата U5-2 в плазмидный вектор ИН PFV активна как в буфере с Mn2+, так и с Mg2+, а ИН ВИЧ-1 способна осуществить эту реакцию исключительно в присутствии ее природного клеточного ко-фактора LEDGF.

2. Изучение особенностей взаимодействия ИН PFV с концевым участком U5 субстрата Как уже отмечалось, на момент начала нашей работы в литературе отсутствовали данные о структуре ИН PFV и ее комплекса с субстратом. Считается, что все ретровирусные интегразы содержат в каталитическом центре консервативный D,D,E мотив;

для ИН ВИЧ-1 также показано наличие двух остатков лизина, взаимодействующих с концом вирусной ДНК. Мы решили выяснить, присутствуют ли в структуре ИН PFV остатки лизина, также контактирующие с нуклеотидами в районе точки процессинга. Для этого мы использовали набор аналогов U5-субстрата, в которых природные дезоксирибонуклеотиды были заменены на модифицированные нуклеотиды, содержащие в 2’-положении 2,3-пропандиольную группировку (Рис. 4Б). Эта группировка может быть окислена NaIO4 с образованием альдегидной группы, которая, в свою очередь, способна формировать основание Шиффа с аминогруппой остатков лизина в структуре белка.

Последующее восстановление получающегося соединения NaBH3CN приводит к возникновению прочного ковалентного комплекса между аналогом U5-субстрата и определенным остатком лизина в белке. Выходы полученных ковалентных комплексов можно оценить путем предварительного введения в аналог субстрата радиоактивной метки и анализа продуктов реакции электрофорезом по методу Лэммли. Такой подход к исследованию взаимодействий ИН PFV с ДНК-субстратом был применен впервые.

Рисунок 4. Изучение взаимодействия ИН PFV с модифицированным аналогом субстрата U5. А.

Положения модифицированных нуклеотидов в дуплексе U5pfv. Б. Структура модифицированного нуклеотида. В. Ковалентные комплексы, образованные между модифицированными аналогами субстрата U5pfv и ИН PFV. 1 – субстрат B1, 2 – субстрат В4, 3 – субстрат А3, 4 – маркеры.

Проведенные нами эксперименты с модифицированными субстратами, содержащими модификации в 1 и 4 положениях процессируемой цепи (B1 и B4, соответственно) и 3 положении непроцессируемой цепи (A3) (Рис. 4А), показали успешное образование ковалентных комплексов для всех трех положений, причем выходы этих комплексов были достаточно высокими и сравнимыми по величине (B1 – 34%, B4 – 36%, А3 – 28%) (Рис. 4В). Высокая эффективность образования ковалентных комплексов позволила нам предположить, что каждый из модифицированных нуклеотидов сближен с остатком лизина в активном центре ИН. Это предположение было позднее подтверждено данными рентгено-структурного анализа кристаллического комплекса ИН PFV с ДНК субстратом (Hare S. et al., 2010).

3. Влияние олигонуклеотидных ингибиторов 3’-процессинга на активность ИН PFV Цикл работ нашей лаборатории, посвященных поиску ингибиторов ИН ВИЧ-1, выявил интересное влияние на активность этой ИН со стороны коротких одноцепочечных олигонуклеотидов (КОО, длина 10-21 нуклеотидов). Так, было показано, что КОО при низких концентрациях (1-100 нМ) способны стимулировать активность ИН ВИЧ-1 в реакции 3’-процессинга, а при увеличении их концентрации наблюдается обратный эффект: ингибирование каталитической активности ИН (Рис. 5А). Также было отмечено, что присоединение молекулы эозина к 3’-концу КОО (КОО-Э) усиливает обе эти активности и приводит к их проявлению при более низких концентрациях (Рис. 5Б). Было высказано предположение, что такая активность КОО и КОО–Э обусловлена наличием двух независимых сайтов в составе ИН ВИЧ-1, с каждым из которых эти соединения могут связываться. Эти сайты были названы сайтами ингибирования и активации согласно эффектам, к которым приводит связывание КОО. Сродство КОО к сайту активации выше, чем к сайту ингибирования, поэтому при низких концентрациях КОО связывается преимущественно в сайте активации, а при увеличении концентрации начинается связывание в сайте ингибирования. Присоединение к КОО молекулы эозина повышает аффиность КОО к обоим сайтам в структуре ИН ВИЧ-1.

Мы исследовали влияние КОО и КОО-Э на активность ИН PFV в реакции 3’ процессинга. Использовались КОО состава GGTTTTTGTGT (11-ДНК) и GGUUUUUGUGU (11-РНК), а также соответствующие им конъюгаты с эозином – 11-ДНК-Э и 11-РНК-Э. Для этих соединений была показана наибольшая активность как в стимуляции, так и в ингибировании процессинга, катализируемого ИН ВИЧ-1, причем природа сахара (ДНК или РНК) не влияла на величину оказываемого эффекта.

В случае ИН PFV для трех соединений из четырех исследованных (11-ДНК, 11 ДНК-Э, 11-РНК-Э) было показано наличие той же колоколообразной зависимости активности ИН от концентрации КОО, которая наблюдалась в случае ВИЧ-1 (Рис. 5В): при низких концентрациях КОО происходила активация фермента, а при повышении концентрации – его ингибирование. Соединение 11-РНК было способно активировать ИН PFV несколько хуже своего ДНК-аналога, но не проявило ингибирующей активности даже при 100 мкМ концентрации. Следовательно, природа сахара играет важную роль при связывании КОО с ИН PFV, и РНК-подобная структура соединения 11-РНК значительно снижает сродство КОО в первую очередь к сайту ингибирования.

Присоединение эозина к обоим КОО усилило как активирующий, так и ингибирующий эффект, и, в частности, привело к появлению ингибирующего действия для соединения 11-ОМ-Э. Для всех испытанных соединений активирующий эффект был сильнее, чем в случае ИН ВИЧ-1, а ингибирующий – слабее.

Рисунок 5. Влияние коротких одноцепочечных олигонуклеотидов и их конъюгатов с эозином на каталитическую активность ИН PFV и ИН ВИЧ-1 в реакции 3’-процессинга. А. Эффективность 3’ процессинга ИН ВИЧ-1 в присутствии 11-ДНК и 11-РНК. Б. Эффективность 3’-процессинга ИН ВИЧ- в присутствии 11-ДНК-Э и 11-РНК-Э. В. Эффективность 3’-процессинга ИН PFV в присутствии 11 ДНК, 11-РНК, 11-ДНК-Э и 11-РНК-Э.

Наши результаты позволяют предположить, что каталитическая активность всех ретровирусных интеграз в реакции 3’-процессинга может быть стимулирована под действием КОО. Влияния КОО на активность обеих интеграз в реакции гомологичного переноса процессированного субстрата U5-2 нами обнаружено не было.

4. Создание системы направленной интеграции на основе ИН PFV и ИН ВИЧ- 4.1. Выбор сайта для направленной интеграции в геноме человека В качестве сайта для направленной интеграции в человеческом геноме мы выбрали участок длиной 18 п.о. в гене лейциновой тРНК (Рис. 6А), который назвали trg.

Последовательность trg располагается с гене тРНК лейцина для антикодона TAG (хромосома 17) и в гене тРНК лейцина для антикодона AAG (хромосомы 14, 20, а также два локуса в хромосоме 5). Участок trg удовлетворяет следующим требованиям:

а) сайт trg уникален для генов лейциновой тРНК (согласно поиску в базе данных BLAST);

б) интеграция в него или вокруг него не затрагивает важные для жизнедеятельности клетки и человека участки, поскольку гены тРНК располагаются в геноме в виде тандемных копий и многократно повторены, а частота интеграционных событий не превышает 10-ти на клетку (часто имеет место одна интеграция);

в) сайт trg располагается в транскрипционно-активных областях генома, что обеспечит успешную транскрипцию трансгена.

Таким образом, интеграция в район выбранной нами последовательности не должна привести к нарушению белкового синтеза в клетке, и, в то же время, будет происходить вдали от протоонкогенов и в транскрипционно-активной области генома.

4.2. Дизайн белка, состоящего из доменов «цинковые пальцы» и способного связывать последовательность trg Белки, имеющие структуру типа «цинковые пальцы», обладают высокой, сиквенс специфической ДНК-связывающей активностью. Для связывания ДНК им не требуется димеризация. Один домен «цинковый палец» имеет длину около 30 а.к. и связывает один триплет ДНК. Хорошая изученность принципов функционирования таких Рисунок 6. Структуры белка tRL18 и его сайта узнавания trg. А.

Последовательность trg. Б. Аминокислотная белков позволила последовательность белка tRL18. Красным цветом выделены исследователям выявить консервативные остатки 2-х Cys и 2-х His. Фиолетовым выделен линкер, соединяющий 2 соседних «пальца». аминокислотную Последовательность, участвующая в связывании последовательность доменов нуклеотидного триплета, выделена зеленым.

или модулей, распознающих разные триплеты. В связи с этим, в настоящее время доступны программы, способные предсказать аминокислотную последовательность белков «цинковые пальцы» для значительного процента последовательностей ДНК. Мы воспользовались одной из таких программ, Zinc Finger Tools (Mandell J.G. et al., 2006), для получения аминокислотной структуры белка, состоящего из 6 модулей и теоретически способного связывать последовательность trg (Рис. 6Б). Этот белок назвали tRL18. Его длина составила 163 а.к. С помощью программы предсказания нуклеотидной последовательности по аминокислотной ресурса molbiol.ru (http://www.molbiol.ru/scripts/01_19.html) была получена нуклеотидная последовательность гена, кодирующего этот белок (ген trl18), после чего мы приступили к дизайну системы для синтеза этого гена de novo.

4.3. Синтез гена trl Прежде чем приступить к синтезу гена trl18, мы оптимизировали его нуклеотидную структуру с учетом кодоновых предпочтений E. сoli, так как именно эту культуру планировалось использовать для последующего выделения белка tRL18. Затем мы приступили к дизайну олигонуклеотидов для синтеза гена. Было использовано две стратегии для сборки гена trl18.

4.3.1. Первый подход к синтезу гена trl Первый подход был основан на лигировании коротких олигонуклеотидных фрагментов гена trl18. Каждая из цепей гена была разбита на 15 фрагментов, длина которых составляла от 28 до 45 нуклеотидных звеньев, таким образом, чтобы каждый из фрагментов в одной цепи был комплементарен двум фрагментам в другой цепи.

Необходимо отметить, что белок tRL18 содержит большое количество повторяющихся структурных модулей, обеспечивающих организацию «цинковых пальцев».

Соответственно, последовательность гена также содержала большое число повторяющихся последовательностей, что могло затруднить правильную сборку олигонуклеотидов.

Последовательность каждого из олигонуклеотидных фрагментов была оптимизирована таким образом, чтобы свести к минимуму образование внутримолекулярных дуплексов и шпилек, так как их возникновение могло нарушить синтез гена. Сначала мы проводили одновременное лигирование всех фрагментов с последующей амплификацией лигазной смеси с помощью праймеров, комплементарных концевым участкам гена trl18. Затем попытались собрать ген последовательным наращиванием фрагментов. Однако ни один из этих приемов не позволил нам получить продукт, соответствующий по подвижности целевому гену (около 500 п.о.). В связи с этим, нам пришлось изменить систему сбоки гена trl18 так, как это описано ниже.

4.3.2. Второй подход к синтезу гена trl Второй подход к сборке гена был основан на методе полимеразной достройки одноцепочечных участков с последующим лигированием разрывов в отдельных фрагментах. Сборка фрагментов в целый ген trl18 проводилась методами молекулярного клонирования. В рамках этого подхода, нуклеотидная последовательность гена trl18 была изменена таким образом, чтобы двумя внутренними сайтами для эндонуклеаз рестрикции BsiWI ген был разбит на 3 примерно одинаковые по длине части: А, B и C (Рис. 7). Каждая из этих частей была в свою очередь составлена из 5 олигонуклеотидных фрагментов (длиной от 45 до 60 нуклеотидных остатков). Как и в предыдущем случае, между олигонуклеотидами разных цепей были значительные области перекрывания, между которыми находились одноцепочечные «бреши». Последовательность каждого из олигонуклеотидных фрагментов была еще раз оптимизирована таким образом, чтобы свести к минимуму образование внутримолекулярных дуплексов и шпилек. Пара праймеров Pr5’/PrA служила для амплификации фрагмента А, пара PrB1/PrB2 для амплификации фрагмента В, а пара PrC/Pr3’ для амплификации фрагмента С. Праймер Pr5’ содержал сайт для эндонуклеазы рестрикции NdeI, а праймер Pr3’ – для BamHI, необходимые для проведения последующих генно-инженерных мероприятий. Сборка каждого фрагмента осуществлялась отдельно. Олигонуклеотиды смешивались в эквимолярных количествах для формирования дуплексов с разрывами. Далее проводилась полимеразная достройка разрывов фрагментом Кленова exo-. Затем следовала реакция лигирования разрывов Т4-лигазой, после чего полученная лигазная смесь амплифицировалась с соответствующей парой праймеров.

Рисунок 7. Схематическое изображение второго подхода к синтезу гена trl18 путем полимеразной достройки и лигирования фрагментов А, В и С (Этап I), и последующей сборки этих фрагментов методами молекулярного клонирования (Этапы II-IV).

Такой подход позволил получить амплифицированные фрагменты требуемой длины (около 170 п.о.). Однако анализ их нуклеотидной последовательности выявил значительное количество точечных замен и делеций во фрагментах В и С, возникших, вероятно, в результате полимеразной достройки. Сборка фрагмента А прошла успешно.

Мы снова слегка изменили систему, использовав дополнительные олигонуклеотиды n3’’ и n5’’, комплементарные одноцепочечным участкам олигонуклеотидов n4 и n5’ соответственно (Рис. 7). Их введение в систему позволило избежать возникновения мутаций при полимеразной достройке и привело к успешной сборке фрагментов В и С.

Все фрагменты были затем отдельно клонированы в вектор для клонирования продуктов ПЦР pDrive (Qiagen) (Рис. 7). Далее, фрагмент С был клонирован в вектор pDrive-A, с образованием вектора pDrive-AC. В этот вектор клонировали фрагмент В с получением вектора pDrive-ABC, кодирующего полную последовательность гена trl18, правильность которой была подтверждена секвенированием.

4.4. Получение генетических конструкций для экспрессии белка tRL18 и его гибридов с интегразами PFV и ВИЧ- Наличие сайтов для эндонуклеаз рестрикции NdeI и BamHI на концах гена trl позволило осуществить его клонирование в вектор для прокариотической экспрессии белков pET15b (Novagen) (Рис. 8), содержащий с 5’-конца полилинкера участок, кодирующий последовательность His6 и позволяющий получать белки, содержащие His6 tag на N-конце. Ген trl18 был амплифицирован с использованием пары праймеров Pr5’ и альтернативным вариантом праймера Pr3’ – Pr3’STOP, вводящим СТОП-кодон на 3’-конец гена. ПЦР продукт был вначале клонирован в вектор pDrive, а затем перенесен в вектор pET15b.

Рисунок 8. Схема констурирования гибридных белков. Бордовыми стрелками отмечены этапы, проведенные через стадию ПЦР-амплификации.

У нас имелись конструкции для бактериальной экспрессии ИН PFV и ВИЧ-1 на базе того же вектора pET15b, где гены ИН также располагались между сайтами рестрикции NdeI и BamHI (векторы pET15b-ИНhiv и pET15b-ИНpfv). На их базе мы получили конструкции для экспрессии гибридных белков tRL18-ИНhiv и tRL18-ИНpfv (N-концевые гибриды). (Рис. 8). Конструкции были получены путем ПЦР амплификации гена trl18 с использованием пар праймеров, вносящих на оба конца гена сайты NdeI. Эти праймеры были разработаны таким образом, чтобы между геном ИН и геном trl18 располагался линкер из 6 аминокислот состава GSQSAG, вводившийся в конструкцию для уменьшения взаимного влияния двух белков в гибриде. Полученные ПЦР-продукты были клонированы в векторы pET15b-ИНhiv и pET15b-ИНpfv через промежуточный этап: клонирование в вектор pDrive. Конструкции для экспрессии гибридов состава ИНhiv-tRL18 и ИНpfv-tRL (С-концевые гибриды) были получены на базе конструкции pET15b-tRL18. Для этого гены ИН PFV и ИН ВИЧ-1 были амплифицированы с использованием пары праймеров, также вносящих на оба конца гена сайты NdeI и аминокислотный линкер между двумя белками.

Клонирование продуктов ПЦР-амплификации в вектор pET15b-tRL18 позволило получить конструкции для экспрессии С-концевых гибридов. Правильность сборки всех конструкций была подтверждена анализом их нуклеотидной последовательности.

4.5. Характеристика белка tRL18 и гибридных белков tRL18-ИНhiv, tRL18 ИНpfv, ИНhiv-tRL18 и ИНpfv-tRL18.

Выделение белка tRL18, а также всех гибридных белков проводилось аналогично выделению ИН PFV и ИН ВИЧ-1. Их подвижность в геле по Лэммли соответствовала теоретически предсказанной. Введение белкового домена как на N-, так и на С-конец ИН ВИЧ-1 повысило уровень протеолитического гидролиза этого белка, что затруднило его выделение. Гибриды ИН PFV выделялись на уровне белка дикого типа (Рис. 9).

4.5.1. Изучение ДНК-связывающей активности белка tRL18 и гибридных белков tRL18-ИНhiv, tRL18-ИНpfv, ИНhiv-tRL18 и ИНpfv-tRL Структура нового белка tRL18 была исследована методом кругового дихроизма (КД) в присутствии ионов Zn2+, необходимых для формирования «цинковых пальцев». Спектры КД подтвердили, что структура, типичная для этого класса белков образуется только в присутствии ионов Zn2+.

Основным требованием, предъявляемым к белку tRL18, является его способность сиквенс специфично связывать последовательность trg, которая является его ДНК-субстратом.

Субстрат trg титровался возрастающими концентрациями Рисунок 9. Анализ препаратов белков в геле по Лэммли. 1 – маркеры, 2 – ИН ВИЧ-1, 3 – tRL-ИНhiv, 4 – ИНhiv-tRL, 5 – tRL18, и полученные комплексы были tRL18, 6 – ИН PFV, 7 – tRL-ИНpfv, 8 – ИНpfv-tRL.

проанализированы методом торможения в геле. Экспериментальные данные позволили нам рассчитать значение Kd app для комплекса tRL18/trg, которое составило 30±9 нмоль (Таблица 2). Мы также исследовали взаимодействие белка tRL18 со случайной последовательностью ДНК. В этом случае стабильных комплексов не было обнаружено вплоть до 1 мкМ концентрации tRL18.

Это позволяет сделать вывод о наличие специфических взаимодействий белка tRL18 с последовательностью trg.

Таблица 2. Значения кажущихся констант диссоциации для комплексов последовательности trg с белком tRL18, а также его гибридами с ИН PFV и ВИЧ-1.

ИНpfv Тип tRL tRL- ИНhiv- tRL ИНpfv гибридного ИНhiv tRL tRL белка 30±9 25±6 30±8 25±7 20± Kd app, нМ Для успешного протекания направленной интеграции необходимо также учитывать способность полученных нами гибридных белков успешно связывать последовательность trg, так как присоединение к белку tRL18 большого белкового домена (45 кДа для ИН PFV и 32 кДа для ИН ВИЧ-1) могло сказаться на его правильной укладке. Мы провели оценку этой способности методом торможения в геле (Таблица 2). Все значения констант диссоциации оказались сравнимы между собой. Надо также отметить, что они оказались близки со значениями констант диссоциации комплексов интеграз PFV и ВИЧ-1 с неспецифическими последовательностями ДНК. Поскольку сродство белка tRL18 к последовательности trg сравнимо со сродством обеих ИН к случайной последовательности ДНК, это могло снизить эффективность направленной интеграции полученными гибридами в последовательность trg.

4.5.2. Каталитическая активность гибридных белков tRL18-ИНhiv, tRL18-ИНpfv, ИНhiv-tRL18 и ИНpfv-tRL Критически важным фактором для успешного протекания экспериментов по направленной интеграции является способность полученных гибридных белков осуществлять реакцию 3’-процессинга и, в особенности, переноса цепи. Эти активности наших гибридов были протестированы в стандартной системе, описанной выше, и полученные значения сравнивались со значениями для обеих ИН дикого типа (Таблица 3).

Субстратами для 3’-процессинга служили дуплексы U5, для гомологичного переноса цепи – дуплексы U5-2. Оценка активности гибридных белков на основе ИН PFV проводилась в присутствии Mn2+. Активность гибридов на основе ИН ВИЧ-1 измерялась в присутствии ионов обоих металлов, и были получены одинаковые результаты.

Активность N-концевых гибридов обеих ИН в реакции 3’-процессинга снизилась приблизительно на 30% от активности исходных белков, а активность С-концевых гибридов – на 70%. Таким образом, влияние присоединенного белкового домена на активность обеих ИН в реакции 3’-процессинга одинаково.

Таблица 3. Активность гибридных белков в реакциях 3’-процессинга и переноса цепи, оцененная относительно активности белков дикого типа, для которых она принята за 100%.

Тип гибридного белка PFV ВИЧ- tRL-ИНpfv ИНpfv-tRL tRL-ИНhiv ИНhiv-tRL Относительная активность в 66% 35% 76% 30% реакции 3’-процессинга Относительная активность в реакции гомологичного 150% 200% 63% 31% переноса цепи При анализе активности гибридов в реакции гомологичного переноса цепи выявились отличия. Активность обоих гибридов на основе ИН ВИЧ-1 была снижена, причем С-концевой гибрид был менее активен, чем N-концевой. В случае ИН PFV, добавление домена tRL18 стимулировало активность обоих гибридов на ее основе в реакции переноса цепи, причем активность С-концевого гибрида возросла вдвое.

Ранее неоднократно отмечалось, что добавление белковых доменов как на N- так и на С-конец ИН ВИЧ-1 не оказывает существенного влияния на ее каталитическую активность (Bushman F. D., 1994;

Goulaouic H. and Chow S., 1996;

Tan W. et al., 2004). Здесь мы впервые показываем снижение каталитической активности ИН ВИЧ-1 при присоединении к ней белкового домена. Влияние присоединения белкового домена к ИН PFV было изучено впервые.

4.5.3. Активность гибридных белков при интеграции субстрата в плазмидный вектор Анализ активности гибридов в гетерологичном переносе цепи мы проводили по методике, описанной в главе 1.2.3 для белков дикого типа (Рис. 3). Напомним, что для ИН PFV распределение продуктов гетерологичного переноса зависело от того, какой металл кофактор использовался в реакции. В качестве мишени для интеграции использовалась плазмида pbr322;

субстратами служили дуплексы U5-2.

Активность гибридов ИН PFV в буфере с Mn2+ была сравнима с активностью ИН дикого типа, но наблюдались изменения в распределении продуктов точечной и согласованной интеграции (Рис. 10А1). Для самой ИН PFV продукт согласованной интеграции составлял 22% от общего продукта интеграции в плазмиду, для гибрида tRL18 ИНpfv - 70%, а для гибрида состава ИНpfv-tRL18 – 45%.

В буфере, содержащем Mg2+, общая эффективность переноса субстрата U5-2pfv в плазмиду pbr322 также совпадала с эффективностью реакции, катализируемой ферментом дикого типа (Рис. 10А2). Однако в этом случае распределение продуктов точечной и согласованной интеграции для разных белков было одинаковым. Во всех трех случаях продукт согласованной интеграции составлял около 75% от общего продукта интеграции.

Попытки провести перенос субстрата U5-2hiv в вектор pbr322 гибридными белками на основе ИН ВИЧ-1 в отсутствие LEDGF не привели к положительному результату. В присутствие LEDGF в буфере с Mn2+ наблюдалась небольшая активность для С-концевого гибрида (ИНhiv-tRL18) (Рис. 10Б). Активности в реакции гетерологичного переноса цепи для N-концевого гибрида (tRL18-ИНhiv) детектировать не удалось. Напомним, что активность гибридов на основе ИН ВИЧ-1, и особенно N-концевого гибрида, в реакции гомологичного переноса цепи была снижена относительно фермента дикого типа. Эта же закономерность наблюдалась и в реакции гетерологичного переноса.

Рисунок 10. Катализ гибридами гетерологичного переноса цепи в плазмидный вектор pbr322. А1-2.

Интеграция, катализуемая гибридами на основе ИН PFV. А1 – интеграция в присутствии Mn2+. А2 – интеграция в присутствии Mg2+. Дорожки 1 – ДНК-маркеры;

2,7,12 – реакционные смеси без ИН;

3- – интеграция ИН PFV;

8-11 – интеграция гибридом tRL-ИНpfv;

13-16 – интеграция гибридом ИНpfv tRL. Б. Интеграция, катализуемая гибридами на основе ИН ВИЧ-1 в присутствии Mn2+ и LEDGF.

Дорожки 1,6,11 – реакционные смеси без ИН;

2-5 – интеграция ИН ВИЧ-1;

7-10 – интеграция гибридом tRL-ИНhiv;

12-15 – интеграция гибридом ИНhiv-tRL. Реакции проводились при возрастающих концентрациях ИН: 0-0,5-0,75-1-1,5 мкМ.

4.5.4. Влияние олигонуклеотида 11-ДНК на активность гибридных белков в реакции гетерологичного переноса цепи Во всех наших экспериментах гетерологичный перенос был более эффективен в случае процессированного субстрата U5-2, а не исходного дуплекса U5. Это может объясняться относительно низкой эффективностью 3’-процессинга, в ходе которого ИН формирует свой субстрат для переноса цепи. В связи с тем, что одноцепочечные олигонуклеотиды при концентрациях до 1 мкМ стимулируют активность ИН PFV в реакции 3’-процессинга (раздел 3), мы предположили, что они также смогут стимулировать гетерологичный перенос субстрата U5. Мы сравнили эффективность интеграции субстрата U5 в присутствии 11-ДНК в вектор pbr322 с эффективностью интеграции субстрата U5-2 (Рис. 11). Как сама ИН PFV, так и гибриды на ее основе осуществляли интеграцию более эффективно в присутствии 11-ДНК. Этот результат показывает, что КОО, стимулируя активность ИН в реакции 3’-процессинга, способствует формированию большего количества каталитически-активного в переносе цепи комплекса ИН с процессированным субстратом U5-2, чем образуется при простом добавлении ИН к дуплексу U5-2.

Таким образом, нам удалось сконструировать набор гибридных белков для экспериментов по направленной интеграции на основе ретровирусных интеграз. Три из полученных нами четырех гибридов были каталитически активны как в реакциях 3’ процессинга и гомологичного переноса цепи, так и в реакции гетерологичного переноса ДНК-субстрата в плазмиду. Детектировать активность гибрида состава tRL18-ИНhiv в реакции гетерологичного переноса цепи нам не удалось. Ранее в работах по конструированию систем направленной интеграции на основе ИН ВИЧ-1 присоединение белкового домена на N-конец ИН не приводило к значительному снижению ее активности (Bushman F. D., 1994;

Tan W. et al., 2004). Однако подобный эффект может зависеть от природы домена и от взаимодействий, возникающих между двумя белками в составе гибрида. Известно, что N-концевой домен ИН ВИЧ-1 участвует в мультимеризации ИН, которая необходима для ее каталитической активности. Возможно, введение белка tRL на N-конец ИН ВИЧ-1 влияет на межсубъединичные взаимодействия в олигомерах ИН.

Рисунок 11. Катализ гетерологичного переноса цепи гибридами ИН PFV в присутствии (дорожки 6-8, 13-15, 20-22) и отсутствии (дорожки 2-5, 9-12, 16-19) одноцепочечного олигонуклеотида 11-ДНК (1мкМ). Дорожки 2, 9, 16 – в смеси отсутствовал препарат ИН;

3, 6, 10, 13, 17, 20 – 0,75 мкМ ИН;

4, 7, 11, 14, 18, 21 – 1 мкМ ИН;

5, 8, 12, 15, 19, 22 – 1,5 мкМ ИН. Использовалась 20 нМ концентрация субстратов U5 и U5-2.

4.6. Анализ распределения интеграции, катализируемой гибридными белками 4.6.1. Получение конструкции pbr322trg Для проведения экспериментов, призванных определить возможность использования полученных нами конструктов для направленной интеграции в геном, необходимо было создать систему, в которой последовательность trg располагается в некотором нуклеотидном окружении достаточно большой длины. Для этого последовательность trg была клонирована в вектор pbr322 с получением вектора pbr322trg.

4.6.2. Оценка направленности интеграции, катализируемой гибридными белками Как указано выше, гибрид ИНhiv-tRL18 показал себя неактивным в реакции гетерологического переноса цепи. Тем не менее, эксперименты по определению направленности интеграции проводились с использованием всех полученных нами гибридных белков в связи с тем, что применяемый в этой работе метод ПЦР-анализа является более чувствительным, чем анализ продуктов интеграции путем миграции в агарозном геле.

Рисунок 12. Схема эксперимента по оценке направленности интеграции. Этап I: гетерологичный перенос радиоактивно-меченного дуплекса U5-2 в плазмидный вектор pbr322trg. Этап II: продукты реакции анализируются методом ПЦР с использованием пары праймеров U5b-2*/PP (интеграционный профиль в цепь А), пара праймеров U5b-2*/OP2 (интеграционный профиль в цепь Б). Этап III: Анализ продуктов ПЦР в денатурирующем ПААГ. Дорожки 1-6: интеграция гибридами ИН PFV в присутствии Mn2+ (1-3) и Mg2+(4-6);

дорожки 7-9: интеграция гибридами ИН ВИЧ-1 в присутствии Mn2+ и LEDGF. Дорожки 1, 4, 7 – интеграция белками дикого типа;

2, 5, 8 – интеграция N-концевыми гибридами;

3, 6, 9 – интеграция С-концевыми гибридами. Стрелками отмечены «горячие точки» интеграции. Положение сайта trg отмечено слева от геля.

Эксперимент по оценке направленности интеграции состоял из трех этапов (Рис. 12).

На первом этапе проводилась интеграция процессированного субстрата U5-2 (своего для каждой ИН) в вектор pbr322trg. Этот субстрат использовался для простоты постановки эксперимента. Интеграция, катализируемая ферментом дикого типа, служила в качестве контрольного эксперимента. На втором этапе (Рис. 12, этап II) проводился ПЦР-анализ полученных реакционных смесей. Один праймер представлял собой процессированную цепь субстрата U5-2 (U5B-2), которая содержала радиоактивную метку. Второй праймер был комплементарен участку, располагающемуся на расстоянии 160 п.о. от сайта trg выше него по цепи (праймер PP3). ПЦР с использованием пары праймеров U5B-2*/PP3 служила для оценки распределения интеграции вблизи сайта trg в одну из цепей вектора pbr322trg (далее для удобства мы называем ее цепь А). Для того, чтобы оценить частоту интеграции в другую цепь (цепь Б), использовалась пара праймеров U5B-2*/OP2, где праймер ОР2 был комплементарен участку в цепи Б на расстоянии 180 п.о. от сайта trg. После проведения ПЦР продукты анализировались в сиквенсном ПААГ (Рис. 13, этап III). В качестве контроля подвижности на гель наносился продукт секвенирования с использованием либо радиоактивно меченного праймера РР3 (если этот праймер использовался для аналитической ПЦР), либо с меченым праймером ОР2 (если в ПЦР использовался ОР2). В качестве матрицы для секвенирования служил вектор pbr322trg. Благодаря совместной миграции с продуктами секвенирования можно было точно обозначить район сайта trg на радиоавтографе и выявить произошедшие изменения в распределении продуктов интеграции в районе этого сайта. На рис. 13 приведены результаты анализа продуктов интеграции в цепь А;

при анализе продуктов интеграции в цепь Б наблюдались те же закономерности, но они были менее выражены.

Для начала рассмотрим результаты, полученные для гибридов на основе ИН PFV (Рис. 12, 1-6). Мы анализировали продукты интеграции, проведенной как в буфере, содержащем Mg2+, так Mn2+, поскольку, как указывалось выше, сама ИН PFV и ее гибриды активны в реакции гетерологического переноса при использовании обоих металлов кофакторов, однако распределение между продуктами точечной и согласованной интеграции различается. ПЦР анализ продуктов интеграции в присутствии Mn2+ выявил слабые отличия в распределении сайтов интеграции между контрольным экспериментом (интеграция ИН PFV дикого типа, дорожка 1) и интеграцией обоими гибридами. Можно отметить падение интенсивности интеграции N-концевым гибридом ниже по цепи от сайта trg, а также появление двух минорных «горячех» точек интеграции ниже целевого сайта (дорожка 2). Для С-концевого гибрида наблюдается одна «горячая» точка выше по цепи от сайта trg (дорожка 3). Анализ продуктов интеграции в буфере, содержащем Mg2+, показал увеличенную направленность интеграции для гибридных белков. Так, значительно снизилась интенсивность интеграции N-концевым гибридом вокруг сайта (дорожка 5). Это верно также и для С-концевого гибрида, однако в этом случае присутствуют и несколько «горячих» точек (дорожка 6). Диаграмма распределения частот интеграции в районе сайта trg, построенная одновременно для гибрида и для белка дикого типа, позволяет оценить «горячие точки» интеграции для наиболее специфически интегрирующего гибрида ИНpfv tRL (Рис. 13). Видно, что точки интеграции для белка дикого типа равномерно распределены вдоль последовательности, в то время как частота интеграции гибридом падает в районе сайта trg, и возрастает в участках, непосредственно прилегающих к сайту.

«Горячие точки» располагаются в позициях 6, 20, 46 и 52 выше по цепи от сайта trg, и в позициях 4, 12, 18 и 46 ниже по цепи от сайта (Рис. 13). Таким образом, гибрид состава ИНpfv-tRL18 показал определенную способность направлять интеграцию в районы, близкие к сайту trg.

Анализ интеграции в плазмиду, осуществленной ИН ВИЧ-1 и ее гибридами в присутствии белкового кофактора LEDGF в буфере с Mn2+, показал снижение эффективности интеграции обоими гибридами в районе сайта trg, а также общее изменение в распределении сайтов интеграции (дорожки 8, 9). Также можно выявить несколько «горячих точек» - 20-30 п.о. выше по цепи от сайта, 30 и 50 п.о. ниже по цепи.

Рисунок 13. Оценка частоты интеграции гибридом ИНpfv-tRL по сравнению с интеграцией, катализируемой ИН PFV дикого типа. Под графиком расположена нуклеотидная последовательность, окружающая сайт trg в векторе pbr322trg. Сайт trg выделен черной рамкой.

Крупный шрифтом выделены нуклеотиды «горячих точек» интеграции.

Ранее в работе по конструированию гибридов на основе ИН вируса лейкоза птиц не наблюдалось отличий в направленности интеграции, катализируемой N- и С-концевым гибридом (Katz R. A. et al., 1996). В то же время, было показано, что С-концевой гибрид ИН ВИЧ-1 с 6-доменным белком «цинковые пальцы» Е2С, аналогичным белку tRL18, проявляет бльшую направленность интеграции, чем N-концевой (Tan W. et al., 2004). В наших экспериментах гибриды на основе ИН ВИЧ-1 в целом проявляли низкую направленность интеграции, что затрудняет их сравнение. Однако направленность интеграции С-концевым гибридом на основе ИН PFV была выше, чем N-концевым, что согласуется с данными работы (Tan W. et al., 2004).

ВЫВОДЫ 1. Получены характеристики ДНК-связывающей и каталитической активностей интегразы PFV: константа диссоциации комплекса ИН/субстрат, начальная скорость реакции 3’-процессинга, скорость связывания интегразой своего субстрата.

2. Исследовано влияние металла-кофактора на распределение продуктов точечной и согласованной интеграции при гетерологичном переносе цепи интегразой PFV и впервые показано, что в присутствии ионов Mg2+ резко возрастает эффективность согласованной интеграции.

3. Впервые исследовано влияние коротких одноцепочечных олигонуклеотидов на активность ИН PFV в реакции 3’-процессинга и гетерологичного переноса цепи. Для реакции 3’-процессинга установлен двухсайтовый механизм связывания, обеспечивающий концентрационно-зависимую активацию, а затем ингибирование ИН. Также показано, что короткие одноцепочечные олигонуклеотиды повышают эффективность гетерологичного переноса цепи ИН PFV.

4. Сконструирована новая система для направленной интеграции ретровирусных векторов в безопасный участок в геноме человека, в качестве которого выбран участок в гене лейциновой тРНК. Сконструирован, выделен и охарактеризован синтетический белок, узнающий выбранный сайт интеграции.

5. Впервые показано, что интеграза PFV может быть использована для создания системы направленной интеграции. Получены гибриды интеграз PFV и ВИЧ-1 и нового синтетического белка. Эффективность системы направленной интеграции, основанной на использовании этих гибридных белков, проверена в экспериментах in vitro.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Княжанская Е.С., Смолов М.А., Кондрашина О.В., Готтих М.Б. Сравнительное изучение каталитических характеристик интеграз пенообразующего вируса человека и ВИЧ-1// Acta Naturaе. 2009. Т. 2, С. 84-87.

2. Agapkina J., Zatsepin T., Knyazhanskaya E., Mouscadet J.-F., Gottikh M. Structure–Activity Relationship Studies of HIV-1 Integrase Oligonucleotide Inhibitors// ACS Med. Chem. Lett. 2011. V. 2.

P. 532–537.

3. Korolev S., Knyazhanskaya E., Anisenko A., Tashlitskii V., Zatsepin T.S., Gottikh M., Agapkina J. Modulation of HIV-1 Integrase Activity by Single-Stranded Oligonucleotides and their Conjugates with Eosin// Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 2011 V. 30. P. 651–666.

4. Княжанская Е.С., Кондрашина О.В., Готтих М.Б. Подходы к направленной интеграции ДНК на основе транспозаз и ретровирусных интеграз// Мол. Биол.. 2011. Т. 45. C. 931-948.

5. Knyazhanskaya E.S., Smolov M.V., Gottikh M.B. Взаимодействие интеграз ВИЧ и ПВЧ с концевыми повторами своих ДНК субстратов// Сборник тезисов конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006». 12-15 апреля 2006 года. г. Москва. С. 115.

6. Княжанская Е.С., Смолов М.А., Готтих М.Б. Изучение особенностей действия интегразы HFV и сравнение их с аналогичными данными для интегразы ВИЧ// Сборник тезисов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008 года. г.

Новосибирск. С. 55.

7. Knyazhanskaya E.S., Smolov M.V., Kondrashina O.V., Gottikh M.B. Study of human foamy virus integrase and perspectives of its application for directed integration of retroviruses// Book of abstracts of the 14th International Conference “Microbial enzymes in biotechnology and medicine”. 2009.

Kazan, Russia. P. 34-35.

8. Knyazhanskaya E.S., Smolov M.V., Kondrashina O.V., Gottikh M.B. The study of the specificity of action of HFV integrase and its comparison with HIV-1 integrase// Book of abstracts of the VIIIth European symposium of Protein society. 14-18 June 2009. Zurich, Switzerland. P. 134.

9. Knyazhanskaya E., Kondrashina O., Smolov M., Gottikh M. Designing chimeric proteins for directed DNA integration into human genome// Book of abstracts of the The EMBO Meeting. 4- September 2010. Barcelona, Spain. P. 110.

10. Knyazhanskaya E.S., Kondrashina O.V., Smolov M.V., Gottikh M.B. Directed DNA integration into human genome through the use of chimeric proteins// Book of abstracts of the Ist International Interdisciplinary Conference “Modern problems in systemic regulation of physiological functions”. 10-21 December 2010. Safaga, Egypt. P. 100.

11. Kondrashina O.V., Knyazhanskaya E.S., Smolov M.A., Gottikh M.B. The use of artificial “zinc-finger”protein for directed DNA integration into safe position in the human genome// Book of abstracts of the 3rd EMBO Meeting. 10-13 September 2011. Vienna, Austria. P. 27.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.