авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Адсорбционная иммобилизация клеток алканотрофных родококков

На правах рукописи

КРИВОРУЧКО Анастасия Владимировна

АДСОРБЦИОННАЯ ИММОБИЛИЗАЦИЯ

КЛЕТОК АЛКАНОТРОФНЫХ РОДОКОККОВ

03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Пермь – 2008

2

Работа выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии биологического

факультета Пермского государственного университета и на базе лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научный руководитель:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Ившина Ирина Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Саралов Александр Иванович кандидат биологических наук Грязнова Диана Васильевна

Ведущая организация: Казанский государственный университет, Казань

Защита состоится «»_2008 г. в_ часов на заседании диссертационного совета ДМ004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (342)2446711.

Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан «»_2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биологическая особенность актинобактерий рода Rhodococcus – способность к окислительной биотрансформации нефтяных углеводородов и ксенобиотиков. Данное свойство наряду со многими другими, как то: олигокарбо- и нитрофилия, выраженная степень гидрофобности клеточной стенки, наличие пилевидных тяжей и шишковидных выростов, способность синтезировать биосурфактанты, повышенная склонность к клеточной дифференциации, колонизации поверхностей, способность к клеточной агрегации и т.д. – определяет интерес к данной группе актинобактерий как объекту промышленного использования и перспективных технологий. Реализация биотехнологического потенциала родококков требует разработки устойчивых биокатализаторов и обеспечения их гарантированной функциональной стабильности. Одним из способов повышения стабильности биокатализаторов на основе живых бактериальных клеток является использование приема адсорбционной иммобилизации. Закрепленные клетки обладают повышенной жизнеспособностью, устойчивостью к действию неблагоприятных факторов внешней среды (колебаниям температуры, концентрации ионов, влажности, антибиотикам, элиминации простейшими), повышенной каталитической активностью (Семченко и др., 2003;

McLean et al., 1997;

Obuekwe, Al-Muttawa, 2001;

Shin et al., 2002;

Resch et al., 2005). При этом адсорбционная иммобилизация является наиболее простым способом закрепления бактериальных клеток, не сопровождается стрессовым воздействием на клетки и имитирует их поведение в природе (Сироткин и др., 2007).

Прикладная задача использования иммобилизованных родококков в биотехнологических процессах требует решения фундаментальной проблемы, связанной с изучением закономерностей адгезии живых клеток родококков, поиском физико-химических и биологических факторов, регулирующих адгезию.

В отношении родококков, которые являются сравнительно новым объектом биотехнологии, эти процессы изучены очень мало по сравнению, например, с медико-биологическими агентами Streptococcus, Pseudomonas, Mycobacterium (в данных случаях описана адгезия к эпителиальным, иммунным клеткам;

достаточно хорошо изучены эти процессы в отношении образования биопленок на медицинском инструментарии) (Hoppe et al., 1997;

Zhang et al., 2005;

Landry et al., 2006). В последние годы появились единичные работы (Gertler et al., 2004), посвященные изучению механизмов адгезии родококков. Исследования особенностей процесса адгезии клеток родококков приобретают особую актуальность еще и потому, что родококки сегодня признаются наряду с сульфатредуцирующими бактериями основными участниками биокоррозионных процессов, они обнаруживаются в составе коррозионно-активных биопленок, образующихся на металлических поверхностях (Азизов, 2007;

Volkland et al., 2000).

– детальное исследование процесса Цель настоящей работы адсорбционной иммобилизации клеток алканотрофных родококков на твердых носителях.

Основные задачи исследования 1. Исследовать адгезивные свойства родококков, принадлежащих к разным видам.

2. Исследовать кинетику и термодинамику процесса адсорбционной иммобилизации клеток родококков на поверхности минеральных и органических носителей. Выявить факторы, определяющие максимальную величину адсорбции клеток родококков.

3. Исследовать жизнеспособность и углеводородокисляющую активность иммобилизованных клеток родококков в отношении индивидуальных углеводородов и сырой нефти.

4. В условиях модельного эксперимента оценить возможность использования иммобилизованных клеток родококков для биоремедиации нефтезагрязненной почвы.

Научная новизна. С помощью мутантов родококков, полученных путем in vitro неспецифического Tn5 мутагенеза и обладающих различной адгезивной и эмульгирующей активностью, исследованы адгезионные характеристики родококков разных видов из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, www.iegm.ru/iegmcol/).



Установлено, что адгезивные свойства клеток родококков зависят от их штаммовой специфичности, эмульгирующей активности и условий культивирования.

Выявлено стимулирующее влияние Rhodococcus-биосурфактанта на процесс адгезии клеток родококков. Впервые с использованием методов профилометрии высокого разрешения и инфракрасного сканирования исследованы кинетика и термодинамика процесса адсорбции родококков на поверхности твердых носителей. Определены контролируемые условия монослойного распределения клеток родококков на носителе, обеспечивающие высокую каталитическую активность родококков в отношении н-гексадекана (104 мг·л-1·ч-1) и сырой нефти (31 мг·л-1·ч-1).

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты расширяют представление об особенностях процесса адсорбционной иммобилизации алканотрофных родококков на твердых носителях. В результате проведенных исследований отобраны штаммы Rhodococcus spp. с максимальной (68-85% прикрепленных клеток) степенью адгезивной активности. В качестве носителей испытаны доступные в регионе материалы на основе древесных опилок, куриных перьев и отходов кожевенного производства. Для повышения сродства поверхности адсорбентов к бактериальным клеткам и углеводородному субстрату впервые использован прием гидрофобизации носителей. Экспериментально обосновано, что наиболее эффективными гидрофобизаторами являются Rhodococcus-биосурфактант (1:0,1) или олифа (1:0,2). Определены оптимальные величины площади поверхности и гидрофобности носителей, обеспечивающие их максимальную (38 мг сухих клеток/г носителя) адсорбционную емкость. На основе иммобилизованных на модифицированном опиле клеток родококков получен эффективный биокатализатор, характеризующийся высокой углеводородокисляющей активностью закрепленных родококков, стабильностью при хранении в течение восьми месяцев и возможностью повторного использования. На основе УФ-спектрофотометрии разработан экспрессный метод детекции полициклических ароматических углеводородов в почве. Метод не требует значительных материальных и временных затрат и пригоден для мониторинга данных приоритетных загрязнителей в полевых условиях.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Исследуемые коллекционные штаммы алканотрофных родококков обладают различной адгезивной активностью. Строгой корреляции между видовой принадлежностью родококков и их адгезивной активностью не выявляется.

Адгезивные свойства родококков зависят от их штаммовой специфичности, эмульгирующей активности и условий культивирования.

2. Использование приема гидрофобизации поверхности органических носителей способствует существенному увеличению их адсорбционной емкости в отношении клеток алканотрофных родококков. Наиболее эффективными гидрофобизующими агентами являются Rhodococcus-биосурфактант и олифа.

3. Клетки родококков, предварительно выращенные в присутствии н-гексадекана и иммобилизованные на гидрофобизованных древесных опилках, характеризуются максимальной углеводородокисляющей активностью.

4. Для ускорения процесса биоремедиации нефтезагрязненной почвы целесообразно применение клеток родококков, закрепленных на гидрофобизованном древесном опиле.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на II Региональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой", Саратов, 2004;

II Межрегиональной конференции молодых ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии", Пермь, 2007;

I и III Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2005, 2007;

II FEMS Congress of European Microbiologists, Мадрид, Испания, 2006;

I Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз Россия 2008", Казань, 2008;

III Международной конференции "Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал", Пермь-Н. Новгород-Пермь, 2008.

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них четыре в рецензируемых научных журналах.

Объем и структура работы. Работа изложена на 174 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 27 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 226 наименований, в том числе 73 на русском и 153 на английском языках.

Связь работы с крупными программами. Работа выполнена на базе кафедры микробиологии и иммунологии биологического факультета Пермского государственного университета и Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. Является частью исследований, проводимых в лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов по теме «Изучение и сохранение функционального и видового разнообразия алканотрофных родококков in/ex situ, полезного для экоценозов и практической деятельности человека» (индекс приоритетного направления 5.28, номер госрегистрации 01.9. 70 005279), а также в рамках ФЦНТП РФ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения», подпрограмма «Биологическое разнообразие».

Исследования поддержаны грантами РФФИ № 04-04-97518-р_офи, INTAS 01- и NATO ESP.NR.NRCLG 982051.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Рабочая коллекция, условия культивирования родококков. В работе использовали культуры родококков из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур 768, www.iegm.ru/iegmcol/), принадлежащих к видам: Rhodococcus erythropolis (2 штамма), “R. longus" (2 штамма), R. opacus (2 штамма), R. rhodochrous (2 штамма), R. ruber (2 штамма), а также 142 мутантных клона R. ruber ИЭГМ 231, полученных методом неспецифического in vitro Tn5 мутагенеза. Мутагенез бактериальных клеток проводили с использованием транспозомного комплекса EZ::TNTM KAN-2Tnp TransposomeTM (Epicentre Technologies, США) методом электропорации. Присутствие Tn5 транспозона в ДНК клеток родококков подтверждали с помощью полимеразной цепной реакции. Родококки выращивали на мясопептонном агаре (МПА), в мясопептонном бульоне (МПБ) или в минеральной среде К (Каталог штаммов.., 1994) с добавлением н-гексадекана или смеси полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), состоящей из антрацена, аценафтена, нафталина и фенантрена, в качестве единственного источника углерода и энергии при 28°С в течение 28-120 ч. Культивирование родококков в жидких средах осуществляли при перемешивании (160 об/мин).





Исследование адгезивных свойств клеток родококков. Адгезивную активность клеток родококков изучали с использованием 96-луночных полистирольных микропланшетов (Медполимер, Санкт-Петербург) по окрашиванию прикрепленных клеток кристаллическим фиолетовым (Huber et al., 2001). Использовали покоящиеся (суспендированные в натрий-фосфатном буфере) или растущие (суспендированные в питательной среде) клетки. Степень гидрофобности, заряд и величину свободной поверхностной энергии клеток родококков определяли методом MATS (Microbial adhesion to solvents) по величине адгезии клеток к органическим субстратам: н-гексану, н-декану, н-гексадекану, этилацетату, диэтиловому эфиру, хлороформу (Bellone-Fontaine et al., 1996).

Влияние Rhodococcus-биосурфактанта на адгезионный процесс изучали с использованием очищенного препарата биосурфактанта (Kuyukina et al., 2001), выделенного из клеток R. ruber ИЭГМ 231, выращенных в присутствии н-додекана.

Rhodococcus-биосурфактант наносили на поверхность лунок планшета в виде 1101- раствора нг/мл изопропанола. Эмульгирующую активность бактериальных культур оценивали по индексу эмульгирования н-гексадекана, который регистрировали через 6 мин, 1 ч, 24 ч и далее через каждые сутки в течение 1 недели.

Исследование кинетики и термодинамики процесса адсорбции клеток родококков. В качестве носителей использовали углеродный материал на основе каталитического волокнистого углерода (КВУ), материалы на основе керамзита (Институт катализа имени Г.К. Борескова СО РАН, Новосибирск, Россия), целлюлозосодержащие материалы на основе кукурузных початков (компания "Hodmarket", Сегед, Венгрия) и древесных опилок, кератинсодержащие материалы на основе куриных перьев и коллагенсодержащие материалы на основе отходов кожевенного производства (Институт элементоорганических соединений имени А.Н. Несмеянова РАН, Москва, Россия). Для повышения сродства поверхности адсорбентов к бактериальным клеткам и углеводородному субстрату использовали прием гидрофобизации носителей. С этой целью поверхность керамзита обрабатывали с помощью графитизированного углерода (Коваленко и др., 2004), органические носители – с помощью н-гексадекана, силиконовой эмульсии, Rhodococcus-биосурфактанта или олифы в объемном соотношении носителя и олифы 1:2,0, 1:1,5, 1:0,2 или 1:0,1. Носители сравнивали между собой по величине сорбционной влажности, водопоглощающей способности и относительной гидрофобности, которую определяли по расположению носителей в системе н-гексадекан/вода.

Иммобилизацию клеток родококков проводили в колбах Эрленмейера, содержащих 50 мл клеточной суспензии и 4 мл носителя, на орбитальном шейкере при 130 об/мин в течение 1-10 сут. Иммобилизацию на КВУ проводили в статических условиях. Процесс адсорбции контролировали нефелометрически при 600 нм с помощью спектрофотометра Lambda EZ201 (Perkin-Elmer, США).

Десорбцию иммобилизованных клеток проводили 1М NaCl. Для исследования кинетики и термодинамики адсорбционного процесса использовали методы профилометрии высокого разрешения с помощью интерференционного микроскопа New View 5000 (Zygo, США) и инфракрасного сканирования с помощью инфракрасной камеры CEDIP Silver 450M (CEDIP Infrared Systems, Франция). Изменение свободной энергии Гиббса при взаимодействии клеток родококков с поверхностью носителей определяли методом прикрепленной капли с использованием дистиллированной воды и н-гексадекана в качестве стандартных жидкостей при измерении краевых углов смачивания (Bos et al., 1999;

Elkin et al., 1999). Разработку математической модели адсорбции клеток родококков при различных скоростях перемешивания клеток и частиц носителя проводили на базе кафедры теоретической механики Пермского государственного технического университета (зав. кафедры, д.т.н. Ю.И. Няшин).

Сравнительные исследования жизнеспособности и функциональной активности свободных и иммобилизованных клеток родококков. Численность жизнеспособных клеток родококков определяли микрометодом точечных высевов (Веслополова, 1995) и по окрашиванию иодонитротетразолием фиолетовым (Wrenn, Venosa, 1996). Углеводородокисляющую активность клеток родококков оценивали в модельных экспериментах по биодеградации н-гексадекана, модельной и сырой нефти (Осинское месторождение, скв. 499, 20 = 0,8896 г/см3).

В качестве модельной нефти использовали смесь индивидуальных углеводородов (н-декан, н-ундекан, н-додекан, н-тетрадекан, н-гексадекан, н-гептадекан, н-нонадекан – 11,90 вес. % каждый, пристан – 3,96 вес. %, антрацен, аценафтен, нафталин, фенантрен – 2,68 вес. % каждый). Содержание остаточных углеводородов определяли весовым методом после экстракции хлороформом, ПАУ – экспрессным методом, разработанным на основе использования УФ спектрофотометрии. Структурный анализ экстрагированных нефтепродуктов проводили с применением газового хроматографа Agilent 6890N, снабженного квадрупольном масс-спектрометрическим детектором Agilent MSD 5973N и кварцевой колонкой HP-5 MS SN US 1518974-1 (Agilent Technologies, США).

Статистическая обработка результатов. Все эксперименты проводили в 3 12-кратной повторности. Математическую обработку полученных данных осуществляли с помощью компьютерных программ Excel 2003 и Statistica v. 6.0.

Определяли тип распределения, рассчитывали медиану, средние значения и стандартные отклонения. Для сравнения групп использовали непарные критерии Стьюдента, Крускала-Уоллиса, Ньюмена-Кейлса и F-критерий. Связь между переменными определяли с помощью коэффициентов корреляции Пирсона или Спирмена в зависимости от типа распределения (Лакин, 1990;

Гланц, 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика адгезивных свойств актинобактерий рода Rhodococcus.

В табл. 1 представлены результаты исследований адгезионных характеристик различных представителей родококков. По нашим данным, исследуемые бактериальные штаммы обладают различной адгезивной активностью в отношении гидрофобной твердой поверхности. При этом строгой корреляции между видовой принадлежностью родококков и их адгезивными свойствами не выявлено.

Установлено, что штаммы родококков в пределах одного вида по показателю адгезии отличаются друг от друга в 1,2-5,6 раза. Большинство культур обладает невысокой адгезивной активностью от 11,4 до 29,6% прикрепленных клеток.

Наиболее высокий уровень адгезии 68,1 и 84,7%, соответственно, выявлен в отношении двух штаммов R. erythropolis ИЭГМ 271 и R. ruber ИЭГМ 231.

В сравнительных исследованиях адгезивной активности растущих и покоящихся клеток родококков, выращенных на разных средах, установлено влияние условий культивирования на адгезивную способность родококков.

Выявленный эффект при этом наблюдается не у всех используемых в работе культур, а лишь у трех штаммов R. erythropolis ИЭГМ 271, R. rhodochrous Таблица 1.

Адгезивная активность исследуемых штаммов родококков Адгезивная активность, % Штамм прикрепленных клеток R. erythropolis ИЭГМ 271 84,7 ± 20, R. erythropolis ИЭГМ 708 11,4 ± 4, "R. longus" ИЭГМ 32 58,1 ± 10, "R. longus" ИЭГМ 68 12,9 ± 3, R. opacus ИЭГМ 56 42,1 ± 5, R. opacus ИЭГМ 60 12,3 ± 3, R. rhodochrous ИЭГМ 66 25,0 ± 5, R. rhodochrous ИЭГМ 608 29,6 ± 6, R. ruber ИЭГМ 231 68,1 ± 22, R. ruber ИЭГМ 327 14,2 ± 3, Примечание. Адгезивную активность клеток родококков изучали с использованием 96-луночных полистирольных микропланшетов по окрашиванию прикрепленных клеток кристаллическим фиолетовым.

ИЭГМ 608 и R. ruber ИЭГМ 231. Как видно из рис. 1, прединкубация родококков в присутствии н-гексадекана способствует увеличению их адгезивной активности в 3-6 раз по сравнению с таковой родококков, выращенных на МПА;

растущие в МПБ клетки в 5-13 раз лучше прикрепляются к твердой поверхности, чем покоящиеся.

Для более детального изучения адгезивных свойств клеток родококков получена библиотека Tn5 мутантов, обладающих различной адгезивной и эмульгирующей активностью. Установлено, что мутантные клоны с выраженной эмульгирующей активностью и, наоборот, потерявшие способность к эмульгированию, характеризуются повышенной (в 1,5-3,3 раза) адгезивной активностью по сравнению с таковой родительского штамма (рис. 2). Известно (Ivshina et al., 1998), что эмульгирующая активность родококков обусловлена их способностью синтезировать биосурфактанты. При этом Rhodococcus биосурфактанты способствуют изменению физико-химических свойств клеточной поверхности, что, в свою очередь, сопровождается изменением адгезивности бактериальных клеток.

А Адгезивная активность, % В Б R. erythropolis R. rhodochrous R. ruber ИЭГМ 271 ИЭГМ 608 ИЭГМ Рис. 1. Адгезивная активность растущих и покоящихся клеток родококков.

А – растущие клетки родококков в МПБ;

Б – покоящиеся клетки родококков, предварительно выращенные на МПА, В – покоящиеся клетки родококков, предварительно выращенные на минеральной среде в присутствии н-гексадекана.

Адгезивная Число Tn активность, % мутантов Индекс эмульгирования, % * 80 40,8-73,4 9,9-94,2 * 47,5-59,6 20 * 47,5-92,7 Исходный 0 25 50 75 100 125 150 175 27, штамм Время, ч Рис. 2. Адгезивная и эмульгирующая активности Tn5 мутантов.

* Динамика индекса эмульгирования н-гексадекана данными Tn5 мутантами статистически достоверно отличается от таковой исходного штамма при р0,05.

По нашим данным, в экспериментах с нанесением Rhodococcus биосурфактанта на поверхность твердого субстрата установлено, что присутствие даже незначительных (10 нг/мл) его количеств способствует увеличению числа закрепленных клеток родококков в 1,8-2,3 раза (рис. 3).

Адгезивная активность, % y = -2,3x + 22,9x + 28, R = 0,80, р = 0, 0 1 2 3 4 Концентрация Rhodococcus -биосурфактанта, lg[нг/мл] Рис. 3. Влияние Rhodococcus-биосурфактанта на адгезию клеток родококков.

В табл. 2 приведены значения коэффициентов корреляции и их достоверность между величинами адгезии клеток родококков к твердой поверхности и MATS-субстратам. По нашим данным, не наблюдается статистически достоверной корреляции между исследуемыми показателями адгезии. Это свидетельствует о том, что адгезивные свойства клеток родококков не Таблица 2.

Коэффициенты корреляции между величинами адгезии клеток родококков к полистиролу и MATS-субстратам ЛВ, мДж/м2 +, мДж/м2 -, мДж/м MATS-субстрат RСпирмена р 18,4 0,0 0,0 0,22 0, н-Гексан Диэтиловый эфир 16,7 0,0 16,4 0,28 0, 23,9 0,0 0,0 0,36 0, н-Декан Этилацетат 23,9 0,0 19,4 0,06 0, 27,7 0,0 0,0 0,42 0, н-Гексадекан Хлороформ 27,2 3,8 0,0 0,37 0, Примечание. ЛВ, +, - - неполярный и полярный (обусловленные наличием "+" и "-" заряженных групп) компоненты поверхностной свободной энергии (цит. по Bellone-Fontaine et al., 1996);

RСпирмена – коэффициент корреляции Спирмена (р0,05).

зависят от интегральных характеристик клеточной поверхности, таких как степень гидрофобности и заряд. Очевидно, взаимодействие клеток родококков с твердым субстратом происходит при участии не всей поверхности клеточной стенки, а лишь на ее отдельных участках, которые обычно являются характерными выростами, пилями, фибриллами (Ившина и др., 1982;

Глазачева и др., 1990). Эти участки содержат адгезины, обладают повышенной гидрофобностью, низкой величиной свободной поверхностной энергии и способны легко преодолевать энергетический барьер при сближении с субстратом (Bos et al., 1999).

Кинетика и термодинамика процесса адсорбции клеток родококков. В результате изучения кинетики адсорбции клеток родококков установлена зависимость между исследуемыми показателями данного процесса и природой используемых носителей. Как видно из рис. 4, адсорбция клеток родококков на нативных носителях завершается через 1-3 сут, тогда как на гидрофобизованных – через 4-6 сут. Однако важно отметить, что использование приема гидрофобизации способствует значительному (от 1,3 до 43,0 раз) увеличению адсорбционной емкости носителей. Исключение составляют лишь носители на основе древесных опилок, обработанных олифой в объемном соотношении древесных опилок и 1, 1, 1,000 1, 0,800 0, ОП600 нм ОП600 нм 1 0, 2 0, 0, 0, 0, 0,200 0, 0, 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 Время, сут Время, сут Гидрофобизованные носители Негидрофобизованные носители Рис. 4. Кинетика процесса адсорбции клеток родококков.

Носители на основе: 1 – КВУ;

2 – кукурузных початков;

3 – древесных опилок;

4 – куриных перьев;

5- кожевенных отходов;

6-9 – древесных опилок, гидрофобизованных олифой 1:1,5 (6) или 1:0,2 (7), Rhodococcus-биосурфактантом (8), н-гексадеканом (9);

10 – куриных перьев, гидрофобизованных силиконовой эмульсией;

11 – кожевенных отходов, гидрофобизованных силиконовой эмульсией.

олифы 1:1,5 или 1:2,0, на поверхности которых практически не происходит адсорбции бактериальных клеток.

Известно (Козляк и др., 1991;

Самонин, Еликова, 2004), что основным фактором эффективности адсорбционного процесса является величина удельной поверхности носителя, доступная для закрепления бактериальных клеток. В связи с этим мы проводили сканирование поверхности целлюлозосодержащих носителей в электронном микроскопе. На электронограммах, представленных на рис. 5, можно заметить, что избыточная гидрофобизация олифой приводит к сглаживанию рельефа поверхности древесных опилок, что ведет к уменьшению площади поверхности и, соответственно, к снижению величины адсорбционной емкости носителя.

Древесные опилки Древесные опилки, Древесные опилки, гидрофобизованные гидрофобизованные олифой 1:2,0 олифой 1:0, Рис. 5. Поверхность целлюлозосодержащих носителей в электронном сканирующем микроскопе.

Электронограммы выполнены на базе Напиер университета, Эдинбург, Великобритания.

В табл. 3 приведены величины адсорбционной емкости испытуемых носителей в зависимости от их физико-химических свойств. По нашим данным, наиболее высокой адсорбционной емкостью характеризуются органические носители на основе древесных опилок, куриных перьев и кожевенных отходов, гидрофобизованных силиконовой эмульсией, н-гексадеканом, Rhodococcus биосурфактантом или олифой в соотношении 1:0,2, сорбирующие от 60 до 90% клеток родококков. При этом выявлена четкая положительная (R=0,77, p=0,04) Таблица 3.

Адсорбционная емкость и физико-химические свойства носителей клеток родококков Сорбционная Водопоглощаю Адсорбцион- Расположе влажность, г щая способ- G, ная емкость, ние в системе Материал носителя мДж/м Н2О/г ность, г Н2О/г % С16/ вода носителя носителя Куриные перья 1,0 0,27±0,02 н. о. С16/Вода -7, Древесные опилки 5,1* 0,12±0,02* 0,39±0,02* -24,8* С + О 1:2, Керамзит 14,3 н. о. н. о. Вода -1, Керамзит со слоем 18,7* графитизированного н. о. н. о. Вода н. о.

угля (1,56%) Кукурузные початки 19,4 0,20±0,01 н.д. Вода -11, Древесные опилки 19,4* 0,10±0,02* 0,28±0,03* -25,0* С + О 1:1, КВУ 27,0 н. о. н. о. Вода н. о.

Кожевенные отходы 32,9 н. о. н. о. Вода н. о.

Древесные опилки 46,8 0,34±0,02 2,55±0,15 Вода -12, Древесные опилки + 1,60±0,10* 49,4 0,33±0,02 С16/Вода -10, О 1:0, Куриные перья + 62,7* 0,26±0,01 н. о. С16/Вода -10, СЭ Древесные опилки + 67,0* 0,78±0,02* 1,54±0,02* С16/Вода -14, БС Древесные опилки 79,4* 1,24±0,09* 0,35±0,01 С16/Вода -12, + О 1:0, Древесные опилки 86,1* 1,68±0,12* 0,31±0,02 С16/Вода -13, + С Куриные перья + О 86,2* -15,8* 0,30±0,02 н. о. С16/Вода 1:0, Древесные опилки 90,8* н. о. н. о. С16/Вода н. о.

+ СЭ Кожевенные отходы 93,1* н. о. н. о. Вода н. о.

+ СЭ Примечание. С16 – н-гексадекан;

О – олифа;

БС – Rhodococcus-биосурфактант;

СЭ – силиконовая эмульсия;

G – изменение энергии Гиббса;

н. о. – не определено;

* достоверно при р0,05 от негидрофобизованного носителя.

корреляция между адсорбционной емкостью и сорбционной влажностью носителей.

В результате использования сугубо физических методов исследования – профилометрии высокого разрешения и инфракрасного сканирования – получены новые данные об адсорбции и активности адсорбированных клеток родококков. В частности, при использовании интерференционного микроскопа обнаружены различия в расположении клеток на поверхности носителей, обработанных различными гидрофобизаторами. Так, на поверхности древесных опилок, обработанных н-гексадеканом, клетки родококков располагаются в виде кластеров, в отличие от остальных носителей, на поверхности которых клетки располагаются равномерно на всей площади (рис. 6).

Древесные опилки, обработанные Древесные опилки с иммобилизованными н-гексадеканом, с иммобилизованными клетками родококков клетками родококков Древесные опилки, обработанные олифой Древесные опилки, обработанные олифой 1:0,2, с иммобилизованными клетками 1:0,2 (без клеток) родококков Рис. 6. Поверхность органических носителей в интерференционном микроскопе (Ув. 4000).

Стрелками указаны иммобилизованные клетки родококков.

На рис. 7 представлены результаты инфракрасного сканирования поверхности носителей на основе древесных опилок. Как видно из представленных данных, количество клеток родококков, при котором наблюдается их монослойное распределение на поверхности твердых носителей, составляет от 1,1·107 до 1,9· КОЕ/см2 носителя. При этом присутствие клеток на носителе создает дополнительный источник тепла (t, °С), по величине которого судят об их активности и, как следствие, эффективности способа предварительной подготовки носителя. По нашим данным, гидрофобизация поверхности древесных опилок Rhodococcus-биосурфактантом или олифой в соотношении 1:0,2 создает наиболее благоприятные условия для закрепления клеток родококков, обеспечивая их высокую метаболическую активность, тогда как обработка н-гексадеканом приводит к 23%-ному снижению активности.

Б А 1 2 3 Способ обработки поверхности Число живых клеток № п/п t, °С родококков/см2 носителя носителя 1, 1 Гидрофобизация олифой 1:0,2 3,14±0, Гидрофобизация Rhodococcus 1, 2 2,97±0, биосурфактантом 2,29±0,72* 1, 3 Гидрофобизация н-гексадеканом 1,38±0,53* 0,4107* 4 Гидрофобизация олифой 1:1, Рис. 7. Поверхность носителей на основе древесных опилок в инфракрасной камере.

А – поверхность носителя без клеток родококков;

Б – поверхность носителя с иммобилизованными клетками родококков;

*достоверно при р0,05 от остальных значений.

На основании данных, полученных в экспериментах по математическому моделированию, построена кинетическая модель процесса адсорбции клеток родококков при различных скоростях перемешивания бактериальных клеток и частиц носителя:

ns (Ti ( ) / Td ( ) + exp( (1 / Ti ( ) + 1 / Td ( ))t ) ) n s (t ) = 1 + Ti ( ) / Td ( ) (K ( ) ( K ( ) 1) exp( t / T f ( )) ), где ns(t) – концентрация свободных клеток родококков в суспензии в момент времени t, КОЕ/мл;

ns0 - исходная концентрация клеток в суспензии, КОЕ/мл;

– круговая частота, рад/мин;

Ti – общее время иммобилизации, ч;

Td – общее время десорбции, ч;

K – число клеток, образующихся в процессе фрагментации;

Tf – время фрагментации, ч. С помощью разработанной модели подобраны оптимальные режимы перемешивания с использованием круговых частот от 2· до 2·160 рад/мин, которые обеспечивают адсорбционную емкость до 100% прикрепленных клеток родококков и не влияют на процесс фрагментации бактериальных клеток (К1,2).

Жизнеспособность и функциональная активность иммобилизованных клеток родококков. В табл. 5 представлены результаты сравнительных экспериментов с использованием свободных и иммобилизованных клеток родококков. По нашим данным, в иммобилизованном состоянии родококки сохраняют углеводородокисляющую активность. При этом они в 1,6-6,0 раз более активны, чем свободные клетки. Как видно из табл. 5, убыль углеводорода из среды культивирования родококков происходит не только за счет окисления его иммобилизованными клетками, но и сорбции материалом носителя.

При исследовании динамики процесса биодеградации н-гексадекана клетками родококков обнаружено, что иммобилизация способствует стабилизации их функциональной активности. Так, адсорбированные родококки дольше сохраняют высокую углеводородокисляющую активность (на протяжении всего периода эксперимента), тогда как процесс деградации углеводорода свободными клетками начинает замедляться на четвертые сутки эксперимента (рис. 8).

На рис. 9 представлены результаты экспериментов по биодеградации иммобилизованными клетками родококков, выращенными в н-гексадекана различных питательных средах. По нашим данным, предварительное выращивание родококков в присутствии н-гексадекана (с целью индукции оксигеназ) и последующая их иммобилизация на носителях способствует 2-х-кратному Таблица 5.

Убыль н-гексадекана из среды культивирования родококков Активность клеток, Адсорбция С Вариант опыта Убыль С16, % мг окисленного носителем, % С16/мг АСВ клеток Суспензия свободных клеток 16,4 — 5± родококков Клетки, иммобилизованные 12,9* 19±3* н. д.

на кожевенные отходы Клетки, иммобилизованные 11±2* 20,7 н. д.

на кожевенные отходы + СЭ Клетки, иммобилизованные 34,4* 16±0* 44, на древесные опилки + СЭ Клетки, иммобилизованные 34,5* 23,4 6± на древесные опилки + БС Клетки, иммобилизованные 41,0* 19±1* 8, на древесные опилки + О 1:0, Клетки, иммобилизованные 52,6* 30±4* н. д.

на кукурузные початки Клетки, иммобилизованные 65,5* 11±2* 22, на древесные опилки + О 1:0, Клетки, иммобилизованные 65,5* 30±0* 48, на куриные перья Клетки, иммобилизованные 73,3* 20±2* 8, на древесные опилки Клетки, иммобилизованные 86,2* 75,9 6± на куриные перья + СЭ Примечание. С16 – н-гексадекан;

О – олифа;

БС – Rhodococcus-биосурфактант;

СЭ – силиконовая эмульсия;

н. д. – ниже детектируемого уровня;

*достоверно при р0,05 от свободных клеток.

Концентрация н- гексадекана, мг/мл А* Б* 1 2 3 4 5 Время, сут Рис. 8. Динамика биодеградации н-гексадекана клетками родококков.

А – свободные клетки;

Б – иммобилизованные клетки;

*достоверно при р0,05.

увеличению скорости процесса биодеградации н-гексадекана иммобилизованными клетками, при этом количество клеток на носителе не изменяется. Родококки, иммобилизованные на гидрофобизованных олифой (1:0,2) древесных опилках, проявляют максимальную (104 мг гексадекана·л-1·ч-1) углеводородокисляющую активность.

70 * 60 Количество живых клеток, Скорость биодеградации мг АСВ клеток/г носителя н- гексадекана, мг/(л•ч) Б 50 А Б* * 20 А 0 1 2 3 1 2 Носители Рис. 9. Биодеградация н-гексадекана иммобилизованными клетками родококков.

Среда культивирования: А – мясопептонный бульон;

Б – минеральная среда с н гексадеканом. Носители: 1 – древесные опилки, гидрофобизованные н-гексадеканом;

2 – древесные опилки, гидрофобизованные олифой 1:0,2;

3 – древесные опилки, гидрофобизованные олифой 1:1,5;

*достоверно при р0,05.

В экспериментах с использованием модельной и сырой нефти установлено, что иммобилизованные клетки родококков в 2 раза быстрее окисляют углеводороды с длиной цепи 12-19 атомов углерода и ПАУ по сравнению со свободными клетками, и в отличие от свободных клеток иммобилизованные клетки родококков способны к более эффективному (до 66%) окислению полиароматического углеводорода антрацена (рис. 10).

18 антрацен фенантрен аценафтен 16 нафталин Концентрация углеводорода, мг/мл С пристан С 10 С А* * 8 Б С * 6 * С С С 0 2 3 Время, нед Рис. 10. Динамика биодеградации нефтяных углеводородов клетками родококков в условиях опыта с модельной нефтью.

А – свободные клетки;

Б – иммобилизованные клетки;

*достоверно при р0,05.

Модельные эксперименты по биоремедиации нефтезагрязненной почвы с использованием иммобилизованных клеток родококков. По нашим данным, использование иммобилизованных клеток родококков способствует 65%-ному удалению нефти из почвы в течение 6 недель, что оказывается на 23% эффективнее, чем в контрольной почве (рис. 11).

На рис. 12 показана динамика биодеградации ПАУ иммобилизованными клетками родококков. Следует отметить, что для детекции ПАУ в почве применялся модифированный экспресс-метод на основе УФ-спектрофотометрии, результаты которого показали полное совпадение с данными хроматомасс спектрометрии. С помощью использованного метода установлено, что применение иммобилизованных родококков эффективно для очистки почвы с высоким (500 мг ПАУ/г почвы) уровнем загрязнения ПАУ и способствует 40%-ной деградации данных приоритетных загрязнителей в течение 7 месяцев.

Концентрация нефти, г/кг почвы y = -0,87x + 498, Концентрация ПАУ, мг/кг почвы 500 R = 0,71, р =0, 1 2 3 0 50 100 150 Вариант опыта Время, сут Рис. 11. Изменение концентрации Рис. 12. Биодеградация нефти в почве после 6 недель полициклических ароматических биоремедиации. углеводородов с использованием иммобилизованных клеток 1 – Исходная концентрация;

2 – родококков в почве.

контроль (почва без внесения клеток родококков);

3 – почва с иммобилизованными клетками родококков.

В табл. 6 представлены основные характеристики биокатализатора на основе иммобилизованных клеток родококков, разработанного нами для ускорения процесса деградации нефтяных углеводородов в почве. Полученный биокатализатор характеризуется высокой углеводородокисляющей активностью закрепленных клеток родококков, стабильностью при хранении в течение восьми месяцев, возможностью повторного использования и отвечает основным требованиям промышленной биотехнологии. При этом исходным сырьем для его изготовления является относительно дешевый, доступный материал, представляющий собой отходы деревообрабатывающей промышленности. В качестве гидрофобизаторов древесных опилок рекомендуется использовать – агент с высокой степенью экологической Rhodococcus-биосурфактант безопасности, либо олифу в соотношении 1:0,2, обработка которой обеспечивает максимальную углеводородокисляющую активность биокатализатора.

Таким образом, в результате проведенных исследований изучены особенности процесса адсорбционной иммобилизации клеток алканотрофных родококков. В качестве носителей испытаны доступные в регионе материалы на основе древесных опилок, куриных перьев и отходов кожевенного производства.

Для повышения сродства поверхности адсорбентов к бактериальным клеткам и Таблица 6.

Характеристика биокатализатора, полученного на основе иммобилизованных клеток родококков Носитель Носитель обработан обработан Параметр олифой 1:0,2 биосурфактантом Материал носителя Древесные опилки Диаметр частиц биокатализатора, мм 1- Клеточная нагрузка на носителе, мг АСВ клеток/г 38 носителя Водопоглощающая способность, г Н2О/г носителя 1,2±0,09 1,5±0, Сорбционная влажность, г паров Н2О/г носителя 0,3±0,01 0,3±0, Каталитическая активность в отношении, мг окисленного субстрата/л/ч:

104 н-гексадекана сырой нефти 31 — Продолжительность хранения без потери функциональной активности, мес Количество циклов повторного использования углеводородному субстрату впервые использован прием гидрофобизации носителей. С помощью Tn5 мутантов исследованы адгезионные характеристики родококков. С использованием методов профилометрии высокого разрешения и инфракрасного сканирования изучены кинетика и термодинамика адсорбции родококков на поверхности твердых носителей. Показано, что адгезивные свойства клеток родококков зависят от их штаммовой специфичности, эмульгирующей активности и условий культивирования. Отобраны штаммы родококков с максимальной степенью адгезивной активности. Выявлено стимулирующее влияние Rhodococcus-биосурфактанта на процесс адгезии клеток родококков.

Установлены оптимальные величины площади поверхности и гидрофобности носителей, обусловливающие их максимальную адсорбционную емкость.

Определены контролируемые условия монослойного распределения клеток родококков на носителе, обеспечивающие высокую каталитическую активность родококков в отношении и сырой нефти. На основе н-гексадекана иммобилизованных на модифицированном опиле клеток родококков получен эффективный катализатор процесса биодеградации нефтяных углеводородов.

Выводы 1. Установлено, что исследуемые коллекционные штаммы алканотрофных родококков обладают различной адгезивной активностью. Адгезивные свойства родококков зависят от их штаммовой специфичности, эмульгирующей активности и условий культивирования.

2. Показано, что прием гидрофобизации поверхности органических носителей способствует существенному (от 1,3 до 43,0 раз) увеличению адсорбционной емкости в отношении клеток алканотрофных родококков. Наиболее эффективными гидрофобизаторами являются Rhodococcus-биосурфактант (1:0,1) и олифа (1:0,2).

3. Впервые обоснована возможность использования методов профилометрии высокого разрешения и инфракрасного сканирования для контролирования монослойного распределения клеток родококков на поверхности твердых носителей.

4. Установлено, что клетки родококков, предварительно выращенные в присутствии н-гексадекана и иммобилизованные на гидрофобизованных древесных гексадекана·л-1·ч-1) опилках, характеризуются максимальной (104 мг углеводородокисляющей активностью.

5. Обоснована целесообразность применения иммобилизованных клеток родококков для ускорения процесса биоремедиации нефтезагрязненной почвы.

В модельных экспериментах с использованием иммобилизованных клеток родококков достигнута 65%-ная степень очистки нефтезагрязненной почвы в течение 6 недель биоремедиации.

6. На основе клеток ИЭГМ 231, иммобилизованных на R. ruber модифицированном древесном опиле, разработан эффективный биокатализатор, характеризующийся высокой углеводородокисляющей активностью закрепленных клеток родококков, стабильностью при хранении в течение восьми месяцев, возможностью повторного использования. На основе УФ-спектрофотометрии разработан и апробирован экспрессный метод детекции полициклических ароматических углеводородов в почве. Метод не требует значительных материальных и временных затрат и пригоден для мониторинга данных приоритетных загрязнителей в полевых условиях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Криворучко А.В. Поиск эффективных способов иммобилизации алканотрофных родококков на минеральных и органических носителях//Матер. II междунар. конф. "Экология и научно-технический прогресс". – Пермь, 2003. – С. 297-302.

2. Рычкова М.И., Куюкина М.С., Криворучко А.В., Ившина И.Б.

Сравнительная характеристика нефтедеградирующих свойств биопрепаратов микробного происхождения//Вестник Пермского университета. Серия Биология. – 2004. – Вып. 2. – С. 142-147.

3. Криворучко А.В. Изучение углеводородокисляющей активности иммобилизованных клеток актинобактерий рода Rhodococcus//Сб. трудов молодых ученых ИЭГМ УрО РАН "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии". – Екатеринбург-Пермь, 2004. – С. 102-110.

4. Криворучко А.В., Куюкина М.С., Ившина И.Б. Сравнительное изучение углеводородокисляющей активности свободных и иммобилизованных клеток актинобактерий рода Rhodococcus//Матер. II Регион. конф. "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой". – Саратов, 2004. – С. 44.

5. Криворучко А.В., Ившина И.Б. Эффективные способы поверхностной иммобилизации клеток алканотрофных родококков//Матер. I Всерос. молодежной школы-конф. "Актуальные аспекты современной микробиологии". – Москва, 2005.

– С. 93-94.

6. Криворучко А.В., Куюкина М.С., Ившина И.Б. Изучение процесса биодеградации нефтяных углеводородов иммобилизованными клетками родококков//Труды II Всерос. конф. "Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах". – Краснодар, 2005. – С. 73-75.

7. Krivoruchko A.V., Ivshina I.B., Kuyukina M.S., Podorozhko E.A., Lozinsky V.I., Philp J.C. Immobilized Rhodococcus cells as new bioaugmentation agents for crude oil-contaminated soil bioremediation//Abstracts of 2nd FEMS Congress of European Microbiologists. – Spain, Madrid, 2006. – P. 120.

8. Куюкина М.С., Ившина И.Б., Осипенко М.А., Няшин Ю.И., Тюленева А.Н., Серебрянникова М.К., Криворучко А.В. Кинетическая модель процесса иммобилизации бактериальных клеток на твердом носителе//Рос. журн. биомех. – 2007. – Т. 11, № 2. – С. 79-87.

9. Ившина И.Б., Куюкина М.С., Рычкова М.И., Криворучко А.В., Каннингхэм К. Дж., Пешкур Т.А., Андерсон П. Экологически безопасная технология биоремедиации нефтезагрязненных почв и грунтов//Матер. IV Междунар. конф. "Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности". – Санкт-Петербург, 2007. – С. 94-95.

10. Криворучко А.В. Особенности процесса иммобилизации клеток родококков на твердых носителях//Матер. III Всерос. молодежной школы-конф.

"Актуальные аспекты современной микробиологии". – Москва, 2007. – С. 55-57.

11. Криворучко А.В., Ившина И.Б., Куюкина М.С. Эффективный биокатализатор процесса окисления нефтяных углеводородов//Матер. Межрегион.

конф. "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии". – Пермь, 2007. – С. 68-70.

12. Kuyukina M., Ivshina I., Krivoruchko A., Podorozhko E., Lozinsky V., Cunningham C., Philp J. Novel biocatalysts based on immobilized Rhodococcus cells for oil-contaminated water purification//J. Biotechnol. – 2007. – V. 131. – P. 99-100.

13. Криворучко А.В., Рубцова Е.В., Серебренникова М.К., Куюкина М.С., Ившина И.Б. Исследование адгезивных свойств актинобактерий рода Rhodococcus с помощью Tn5 мутагенеза//Ученые записки КГУ. Серия Естественные науки. – Казань, 2008. – Т. 150, № 4. – стр. 143-147.

14. Рубцова Е.В., Криворучко А.В., Куюкина М.С., Ившина И.Б.

Адгезивные свойства коллекционных культур Rhodococcus spp.//Матер. VI Междунар. конф. "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии". – Минск, 2008. – Т. 2. – С. 259-261.

15. Podorozhko E.A., Lozinsky V.I., Ivshina I.B., Kuyukina M.S., Krivoruchko A.V., Philp J.C., Cunningham C.J. Hydrophobised sawdust as a carrier for immobilisation of the hydrocarbon-oxidizing bacterium Rhodococcus ruber//Biores.

Technol. – 2008. – V 99, № 6. – P. 2001-2008.

КРИВОРУЧКО Анастасия Владимировна АДСОРБЦИОННАЯ ИММОБИЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК АЛКАНОТРОФНЫХ РОДОКОККОВ Автореферат Лицензия _ от _.

Подписано в печать – 06.10.2008. Тираж 120 экз. Усл. печ. л. 1, Формат 6084/16. Набор компьютерный. Заказ №.

Отпечатано на ризографе в отделе Электронных издательских систем ОЦНИТ Пермского государственного технического университета.

614600, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, к. 113. Тел.: (342)2198033.



 

Похожие работы:


 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.