авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Экспериментальные подходы к изучению тонкой трехмерной морфологии клеток возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы и некоторые особенности их поверхностных ультраструктур

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВ Олег Святославович

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ

ТОНКОЙ ТРЕХМЕРНОЙ МОРФОЛОГИИ КЛЕТОК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ

ЧУМЫ, ХОЛЕРЫ, СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

И НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИХ ПОВЕРХНОСТНЫХ

УЛЬТРАСТРУКТУР

03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учной степени

кандидата биологических наук

Саратов – 2010

Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Коннов Николай Павлович

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Плотников Олег Петрович доктор биологических наук, доцент Гулий Ольга Ивановна

Ведущая организация: ФГУЗ «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока»

Защита состоится «27» декабря 2010 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

(410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Автореферат разослан «23» ноября 2010 г.

Учный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Среди особо опасных инфекций бактериальной природы, в последние годы привлекающих большое внимание ученых, выделяются возбудители чумы, холеры и сибирской язвы, унесшие миллионы жизней в периоды пандемий и эпидемий.

Пристальное внимание к этим биологически опасным агентам вызвано как постоянно существующей угрозой возникновения этих заболеваний на территории России, так и довольно высокой вероятностью использования их в качестве орудия биотерроризма.

Следует отметить, что в освещении патогенеза заболеваний, вызванных возбудителями чумы, холеры и сибирской язвы, важное место занимают знания об особенностях их строения и механизмах их взаимодействия с макроорганизмом. Для понимания этих процессов целесообразно привлечение современных экспериментальных подходов.

Перспективными являются подходы, позволяющие получать новые данные о субклеточном строении бактерий при их трехмерной визуализации. Так, использование современных информационных технологий в медицине и биологии существенно расширяет возможности традиционных способов изучения микромира:

позволяет получать новую информацию об объекте исследования, осуществлять моделирование микрообъектов живой природы с сохранением их истинных размеров и форм, проводить компьютерную видовую диагностику в трехмерном режиме и накапливать информацию об их биоразнообразии [Verbeek F.J., 2002].

Создание системы экспериментальных подходов трехмерной ультраморфологии дает возможность получать, хранить и анализировать информацию о форме, рельефе поверхности и пространственных параметрах бактерий. Изучение ультраструктуры микроорганизмов необходимо, в первую очередь, для определения их приспособительной изменчивости, функциональной морфологии, поисков новых ключевых признаков и экологии микромира [Золотарев А.Г. с соавт., 2006;

Gonzalez R.C. et al., 1992]. Имеющиеся сведения по морфо функциональному анализу бактериальных клеток показывают, что они являются сложными высокоспециализированными организмами, способными к адаптации в окружающей среде и коллективному взаимодействию с другими макро- и микроорганизмами [Олескин А.В. с соавт., 2000;

Shapiro J.A., 1998;

Miller M.B. et al., 2001;

Palkovа Z. et al., 2006;

Ben-Jacob E., 2008].

Для полного понимания сложных пространственных механизмов и процессов, происходящих в клетке на ультраструктурном уровне, необходима визуализация и изучение ее трехмерной морфологии с высоким разрешением [Russ J.C., 1995].

Построение специализированной информационной системы для воссоздания цифровых трехмерных моделей микрообъектов живой природы является весьма актуальной задачей.

Однако в направлении трехмерного моделирования биологических ультраструктур имеется много нерешенных задач. В частности, не отработаны алгоритмы восстановления структур по серийным срезам, нет автоматизации процесса построения изображений, снижения его сложности и трудоемкости [Пучков Е.О., 2010;

Loebl J., 1985;

Soille P., 2004].

Все это привело к тому, что на сегодняшний день получены приближенные трехмерные изображения только нескольких видов микроорганизмов – дрожжевых клеток, кишечной палочки [Mullard A., 2007;

Gonzalez R.C., 2008]. По имеющимся литературным данным и источникам Internet в настоящее время нет сведений об исследовании тонкой трехмерной структуры бактерий особо опасных инфекций.

Известно, что поверхностные структуры микроорганизма определяют характер его взаимодействия с макроорганизмом, обеспечивая развитие инфекционного или иммунного процесса. Кроме того, поверхностные структуры принимают участие в соединении с абиотической поверхностью, что способствует выживанию патогенов при нахождении вне живого организма [Кутырев В.В.с соавт., 2007;



Mesnage S. et al., 1998;

Faruque S.M. et al., 2008]. Это обстоятельство способствует повышению интереса к изучению поверхностных структур возбудителей особо опасных инфекционных болезней, тем более что в настоящее время появились новые методические подходы для их изучения с помощью электронной и зондовой микроскопии.

При подготовке высококачественного материала к электронно- и зондово микроскопическим исследованиям требуется большое количество обязательных приемов, что приводит к потере значительного числа изучаемого материала, поэтому совершенствование технических приемов особенно актуально в связи с перспективами практического применения и возможностью максимального сохранения его ультраструктуры.

Таким образом, проведение комплекса работ, включающих создание устройства подготовки сверхмалого количества биологического материала для электронно-микроскопического исследования, разработку компьютерно математического алгоритма для трехмерного моделирования клеток возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы, является актуальной задачей.

Цель работы – разработка методических подходов к изучению трехмерной тонкой морфологии клеток возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы на базе создания компьютерно-математического алгоритма обработки изображений, исследование их поверхностных ультраструктур.

Задачи исследования:

1. Разработать устройство для подготовки сверхмалых количеств про- и эукариотических клеток для исследования с помощью электронного микроскопа.

2. Создать компьютерно-математический алгоритм обработки изображений бактериальных микроструктур и программное обеспечение для последующего их использования в трехмерном моделировании.

3. Визуализировать ультраструктуры чумного микроба, холерного вибриона и возбудителя сибирской язвы методом трехмерного моделирования.

4. Определить возможности вейвлет-анализа с целью увеличения разрешающей способности и контрастности электронных и зондовых микроскопических изображений.

5. Показать особенности трехмерной ультраструктуры капсулы чумного микроба методом сканирующей зондовой микроскопии.

6. Выявить структуру экзополисахаридного слоя (капсулу) холерного вибриона электронно-гистохимическим методом.

7. Изучить субмикроскопическую морфологию S-слоя возбудителей чумы и сибирской язвы методами электронной и зондовой микроскопии с применением компьютерно-математических преобразований.

Научная новизна Разработано устройство (фторопластовый контейнер) для концентрации, фиксации, последующей обработки и заливки в эпоксидную смолу малого количества (несколько десятков) клеток для последующего изучения их ультраструктуры (патент на полезную модель РФ № 40318 от 10.09.2004 г.).

На основе серийных ультратонких срезов бактерий и полученных электронограмм, разработана структура программного обеспечения ЭВМ, способствующая моделированию тонкой трехмерной морфологии клеток.

Программа автоматического построения изображений бактерий имеет современный интерфейс, позволяет поворачивать изучаемый объект на произвольно выбранный угол в произвольной плоскости.

Проведена реконструкция трехмерной структуры бактериальных клеток на основе методического подхода к данным электронограмм трансмиссионого электронного микроскопа и разработанного компьютерно-математического алгоритма.

Впервые получены трехмерные изображения поверхностных и внутренних тонких структур бактерий чумы, холеры и сибирской язвы с высоким пространственным разрешением с помощью программы для моделирования бактериальных клеток.

Создана программа проведения фильтрации от различного уровня загрязнений и шумов (свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ – № 2005610679 от 22.03.2005 г.), позволяющая увеличить разрешающую способность и контрастность электронно-зондовых изображений бактерий, макромолекул (ДНК), на основе вейвлет-анализа.

С помощью сканирующей туннельной микроскопии капсульного антигена – FI (капсулы) чумного микроба впервые показана его ультраструктура в виде геля размерностью частиц 50 нм, с упорядоченным поверхностным и внутренним строением по типу трехмерной пространственной решетки, выполняющей функцию дополнительной «мембраны» клеточной стенки.

Электронно-гистохимическим методом выявлен экзополисахаридный слой бактерии у клеток О-клонов холерного вибриона классического биовара. На поверхности колонии указанных клонов методом сканирующей электронной микроскопии показано присутствие рыхлого слоя.

Показано наличие упорядоченной структуры S-слоя клеточной поверхности чумного микроба методами негативного контрастирования и ультратонких срезов.

При электронно-микроскопическом исследовании установлено, что изолированный белок формирует пластинчатые структуры с кристаллоподобной поверхностью.

С помощью трансмиссионного электронного микроскопа, в негативно окрашенных препаратах, визуализирована ультраструктура белков S-слоя (Sap и ЕА1) сибиреязвенного микроба, которая представлена в виде решетчатых структур размерами 7–9 нм с наклонной симметрией. Впервые продемонстрированы методом прямого преобразования Фурье их скрытые изображения со строго выраженной периодичностью и волнообразной симметрией.

С помощью атомно-силовой микроскопии дана субмикроскопическая морфологическая характеристика белков Sap и ЕА1 сибиреязвенного микроба в виде параллельных рядов упорядоченных линейных цепочек размерами кластеров 2–3 нм и 7–8 нм соответственно.

Практическая значимость Разработан способ обеззараживания микроорганизмов I–IV групп патогенности для исследования методом сканирующей зондовой микроскопии (Акт комиссионных испытаний утвержден директором РосНИПЧИ «Микроб», 2009 г.).

Данный способ применяется в отделе диагностики инфекционных болезней ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» при приготовлении препаратов для зондовой и атомно силовой микроскопии.

Применяется на практике: «Устройство для концентрации сверхмалого количества клеток при приготовлении электронно-микроскопических препаратов» в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»





и Учреждении Российской академии наук «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов» (Акт от 28 июня 2010 г.).

Создана программа для реконструкции трехмерной организации клеточных наноструктур и оценки качества полученного изображения. Она максимально автоматизирована, проста в использовании и не требует вмешательства высокопрофессионального оператора, может использоваться для прикладных и фундаментальных исследований. Программу используют в учебном процессе кафедры программного обеспечения вычислительной техники и автоматических систем Саратовского государственного технического университета (Акт от 29 июня 2010 г.).

Материалы диссертации используют в учебном процессе на курсах профессиональной переподготовки и повышении квалификации специалистов отдела образовательных программ и подготовки специалистов ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (Акт от 2 июля 2010 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработано устройство, позволяющее проводить электронно микроскопическое исследование сверхмалого количества клеток.

2. Комплексный методический подход, созданный на основе трансмиссионных электронных изображений серийных ультратонких срезов, и разработанное программное обеспечение позволяют воссоздать трехмерное изображение бактерий чумы, холеры и сибирской язвы с высоким пространственным разрешением.

3. Компьютерно-математическая обработка и фильтрация изображений с помощью ортогональных и стационарных вейвлетов Добеши и Фурье преобразований увеличивает разрешающую способность электронограмм и сканограмм.

4. Выявлены особенности субмикроскопической морфологии капсулы бактерий чумы и холерного вибриона, а также трехмерной организации S-слоя Y. pestis и B. anthracis при использовании трансмиссионной и растровой электронной микроскопии, сканирующей зондовой микроскопии и электронно-гистохимических методов.

Апробация работы Результаты работы доложены и представлены на ежегодных итоговых научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (2002, 2003, 2005, 2006–2009 гг.), ежегодных симпозиумах и конференциях по электронной микроскопии Российской Академии наук в г. Черноголовка (2000, 2002, 2005, 2007–2009 гг.). Работа выполнялась в рамках тем: «Создание диагностических и профилактических препаратов нового поколения, на основе модифицированных биологически активных веществ возбудителей ООИ» НИОКР 34–03.08 и «Конструирование современных средств специфической профилактики и иммунодиагностики сибирской язвы»

НИОКР 41–33.09.

Публикации Основное содержание диссертации отражено в 23 научных работах, из которых 5 опубликованы в рекомендованных ВАК РФ изданиях.

Структура и объм диссертации Диссертация представлена на 115 страницах текста, состоит из введения, главы обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения и выводов.

Работа иллюстрирована 4 таблицами и 38 рисунками. Библиографический указатель содержит 147 работ, в том числе – 94 иностранных.

.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы. Работа выполнена на штаммах Yersinia pestis EV НИИЭГ и Yersinia pestis КМ218 (бесплазмидный, дериват EV НИИЭГ);

штаммах Vibrio cholerae Дакка 35 и Vibrio cholerae 641/67 CRC IDH, Bacillus anthracis Sterne T Prt Sap+. Штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». Все исследования на моделях чумного микроба, холерного вибриона и сибиреязвенного микроба проводились в соответствии с требованиями Санитарных правил 1.3.1285–03 «Безопасность работы с микроорганизмами I–II групп патогенности» и Санитарных правил 1.3.2322–08 «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности».

Образцы S-слоя чумного и сибиреязвенного микробов были любезно предоставлены сотрудниками лаборатории экспериментальной биотехнологии и прикладной генетики ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» [Антонова О.А., 1999;

Гончарова А.Ю., 2007].

Методы. Методы подготовки проб проводились согласно «Методическим рекомендациям по дезинфицирующим режимам фиксации для электронной микроскопии материала, зараженного возбудителями чумы, сапа, мелиоидоза, холеры, туляремии, бруцеллеза, кокцидиоидоза», Волгоград, 1983 г.

Методы электронной микроскопии:

– негативного контрастирования (ТЭМ-микроскопия);

– ультратонких срезов (ТЭМ-микроскопия);

(Препараты просматривали на электронных микроскопах JEM-7A или HU-12A при ускоряющем напряжении 80 и 75кВ соответственно).

– сканирующей электронной микроскопии (РЭМ-микроскопия);

(Образцы просматривали на сканирующей приставке HSE-2 электронного микроскопа HU-12A при ускоряющем напряжении – 10-50 кВ).

Методы зондовой микроскопии:

– туннельной микроскопии;

– атомно-силовой микроскопии;

(Препараты просматривали на атомно-силовом микроскопе Solver P47-PRO («NT-MDT», Россия), используя программу управления микроскопом «NOVA».

Работа велась в режиме полуконтактного (SemiContact) метода зондирования. Поле сканирования варьировалось в пределах 5050 – 1010 мкм. При работе использовались кантилеверы Bioset/50 – NSG01/30 с прямоугольными балками, фирмы «NT-MDT», Россия).

Компьютерно-математические методы обработки экпериментальных данных Для трехмерной реконструкции бактериальных клеток использовали язык программирования Delphi под программу Microsoft DirectX.

Для этапа улучшенной трехмерной визуализации использовали стандартный коммерческий пакет трехмерного моделирования и дизайна 3D StudioMax, фирмы Kinetix, США.

Преобразования Фурье и вейвлет-анализ выполняли с использованием пакета математических программ MatLab (MatLab от Matrix Laboratory, США).

Результаты исследований Разработка устройства для подготовки сверхмалых количеств биологического материала при проведении исследования с помощью трансмиссионного электронного микроскопа Одним из наиболее информативных физических методов изучения ультраструктуры клеток является электронная микроскопия их ультратонких срезов.

Данный метод до настоящего времени остается единственным физическим способом изучения вновь открываемых микроорганизмов и эукариотических клеток. Однако, несмотря на значительные достижения при использовании вышеуказанного метода, значительное число биологических объектов остаются малоизученными по причине их малого количества в объекте исследования.

Для изучения малых количеств биологического материала было изготовлено устройство для концентрации, последующей обработки и заливки образца в эпоксидную смолу (рисунок 1).

Методический подход заключался в следующем: бактерии выращивали на типичных средах, фиксировали, обезвоживали в градиенте спиртов и заливали четырехкомпонентной смолой Spurr с применением вышеуказанного устройства.

Серийные ультратонкие срезы толщиной 300 нм выполняли на ультрамикротоме, переносили на микроскопические сетки и исследовали в трансмиссионном электронном микроскопе.

Устройство использовано при приготовлении электронно-микроскопического материала, данные которого входили в информационную базу для последующей трехмерной визуализации бактериальных клеток.

Рисунок 1 – Этапы приготовления образца с помощью созданного устройства.

1 – фиксация, дегидратация;

2 – концентрация, пропитка;

3 – заливка;

4 – полимеризация (а – контейнер устройства;

б – отвинчивающийся цилиндр;

в – изучаемый материал;

г – готовый блок смолы для резки на ультрамикротоме).

Данный способ апробирован на бактериальных клетках, а также клетках гемолимфы блох и дал положительные результаты. При проведении процедуры фиксации, обезвоживания и проводки материала для последующей заливки в эпоксидную смолу потери изучаемого материала минимальные.

Таким образом, предлагаемый метод и устройство позволяют получать уникальные данные ультраструктуры единичных клеток.

Трехмерная визуализация ультраструктуры бактерий чумы, сибирской язвы и холерного вибриона программными средствами DirectX и 3D StudioMax Для получения трехмерных изображений бактериальных клеток с высоким пространственным разрешением в данной работе впервые был использован разработанный авторами способ и его программное обеспечение, основанное на компьютерной реконструкции поверхности бактериальной клетки по трансмиссионным электронно-микроскопическим фотографиям серийных ультратонких срезов бактерий.

После получения необходимого количества электронограмм (серий), относящихся к одной случайно выбранной бактериальной клетке, создана база данных, содержащая десятки микрофотографий бактериальной клетки по уровням срезов для каждого отдельного объекта исследования.

С помощью графического редактора контуры изображения одной клетки на микрофотографии очерчивали вручную. Для правильной трехмерной реконструкции клетки проставлена общая точка начала координат (рисунок 2). Этап работы, по выделению индивидуального контура клетки, повторялся для каждой микрофотографии. Количество снимков для объекта было в пределах 50. Для визуализации в 3D StudioMax составлялся собственный набор контуров, который включал в себя элементы внутренней структуры, соответствующий одному из микрокомпонентов клетки. Таким образом, формировалась база данных по контурам и объектам исследования.

Рисунок 2 – Схема сборки трехмерной реконструкции клетки в программе Kinetix 3D StudioMax.

А – Трансмиссионные электронно-микроскопические фотографии ультратонких срезов бактериальных клеток возбудителя чумы (исходное изображение, изображение среза оконтурено вручную (показано стрелкой).

Отмечено начало координат (точка), необходимое для сборки трехмерного изображения;

Б – сборка контуров трехмерной модели.

В дальнейшем трехмерная реконструкция выполнялась с помощью программы трехмерного моделирования Kinetix 3D StudioMax (рисунок 3).

А Б В Г Рисунок 3 – Трехмерное изображение клеток возбудителя чумы, полученное с помощью программы Kinetix 3D StudioMax.

А – окно программы;

Б – итог визуализации внешней структуры клетки;

В, Г внутренняя структура клетки: В – секущие плоскости модели;

Г – итог визуализации внутренней структуры клетки.

Применение указанной мощной графической программы (Kinetix 3D StudioMax) позволяет получать репрезентативные изображения с использованием различных подсветок и теней.

В связи со сложностью вышеуказанной программы нами была разработана специальная программа автоматического построения изображений, написанная на языке программирования Delphi с использованием системы DirectX. Программа работает в графической среде Microsoft Windows и имеет современный и удобный графический интерфейс, позволяет поворачивать объект на любой угол в произвольной плоскости. Ее использование для автоматического построения 3D изображений не требует вмешательства оператора, она наиболее применима на начальном этапе предварительной оценки качества полученного объекта. В результате использования данной программы были получены трехмерные изображения бактериальных клеток Yersinia pestis, Vibrio cholerae и Bacillus anthracis, показанные под различными углами зрения, созданные в программе автоматического построения изображений с использованием системы прорисовки DirectX (рисунок 4).

А Б В Г Рисунок 4 – Трехмерное изображение бактерий, полученное с помощью программы автоматического построения изображений.

А – клетка возбудителя чумы;

Б – клетка холерного вибриона;

В, Г – клетка возбудителя сибирской язвы.

Возможности программы позволяют производить анимацию полученного изображения. Созданный ролик можно просматривать на современном компьютере.

В связи с этим полученные данные могут использоваться в учебном процессе как наглядное пособие.

Таким образом, применение нового подхода к трехмерной визуализации бактериальных клеток позволяет получить 3D изображения как внешней, так и внутренней структуры клеток.

Использование вейвлет-анализа для фильтрации изображений в электронной и зондовой микроскопии При исследовании биологических объектов одним из основных условий является повышенное требование к получению максимально возможного разрешения изображения на микрофотографиях. Однако специфика самих объектов способствует созданию помех, вызванных наличием загрязнений различной природы (остатки питательной среды, конгломераты вещества-контрастера, красок;

дефекты подложки, различного рода шумов аппаратуры и др.) присутствующих в исследуемом материале и ухудшающих воспроизведение исследуемых субмикроскопических структур.

Наиболее многообещающим методом увеличения разрешения изображения в настоящее время является дискретный вейвлет-анализ, способствующий уменьшению шумов, удалению мелких дефектов, повышению контрастности, сжатию и масштабированию [Дремин И.М. с соавт., 2001]. Дискретный вейвлет анализ позволяет проводить обработку изображений за счет разделения их на высоко- и низкочастотные составляющие, что делает возможным подавление искажений не затрагивая при этом исследуемой структуры.

Алгоритм обработки изображений состоит в вейвлет-разложении исходного изображения до заданного уровня и изменения детализирующих коэффициентов (уменьшение – для фильтрации шума и увеличение – для подчеркивания границ), после чего производится обратная операция вейвлет-синтеза изображения.

Для обработки микроскопических изображений с учетом особенностей выявления наноразмерных структур применяют различные типы вейвлет-анализа. В данной работе приведены результаты применения ортогональных и стационарных вейвлетов на основе вейвлетов Добеши [Астафьева Н.М., 1996].

Для этого нами написана программа в среде Matlab, которая способствовала проведению фильтрация шумов и повышению контрастности электронно- и зондово микроскопических изображений, (пример на рисунке 5), использованных впоследствии при трехмерной визуализации и при выявлении ультраструктурных особенностей морфологии бактерий.

Рисунок 5 – Электронограмма жгутика холерного вибриона до и после обработки программой стационарного вейвлет-анализа.

А – до обработки;

Б – после обработки программой.

Резюмируя данный раздел работы, можно сделать следующее заключение:

представленные данные по применению вейвлет-анализа открывают новые возможности этого математического аппарата, позволяющего улучшить качество получаемых изображений, повысить их контрастность, снизить уровень шума.

Выявление некоторых особенностей поверхностных ультраструктур бактерий чумы, холеры и сибирской язвы Особенности ультраструктуры капсулы (FI-антигена) чумного микроба К наиболее полно изученным антигенам чумного микроба относится капсульный – FI антиген, кодируемый плазмидой рFra (96,2 т.п.н.).

Первые шаги в его изучении были предприняты более полувека назад. Однако, со временем стали накапливаться факты, свидетельствующие о наличии некоторых денатурационных изменений в молекуле FI, образование которых связывали с особенностями ее структурного состояния [Сердобинцев Л.Н., 1984].

С возникновением и интенсивным развитием в конце 80-х годов ХХ века сканирующей туннельной микроскопии (СТМ) [Binnig G. et al., 1982] появилась возможность исследования поверхностей твердых тел с атомарным разрешением (около 0,1 нм в плоскости объекта и 0,01 нм в перпендикулярном направлении).

В нашей работе приводятся результаты визуализации поверхностей бактерий возбудителя чумы с высоким пространственным разрешением (5–8 нм). На рисунке 6 А приведено сканирующее туннельно-микроскопическое (СТМ) изображение фрагментов бактериальных клеток чумы, а на рисунке 6 Б увеличенное изображение фрагмента поверхности бактерии, на котором видны отдельные глобулы белка – FI (стрелка). Размерность глобул составила 50 нм.

А Б Рисунок 6 – Результаты визуализации поверхности бактерий чумы.

А – СТМ изображение фрагмента клеток возбудителя чумы, покрытых пленкой Pt/Ir толщиной 10 нм. Размер участка сканирования – 33 мкм;

Б – СТМ изображение фрагмента поверхности чумного микроба размером 700700 нм.

На основании полученных результатов следует, что ультраструктура капсульного антигена (FI) чумного микроба представляет собой гель с упорядоченным поверхностным и внутренним строением по типу трехмерной пространственной решетки. Можно предположить, что такая особенность капсулы может выполнять роль механического и биохимического буфера.

Выявление экзополисахаридного слоя холерного вибриона электронно гистохимическим методом При изучении популяционного состава природных штаммов холерного вибриона классического биовара были выявлены штаммы, в популяции которых присутствовали как типичные прозрачные Т-колонии, так и клоны, формирующие атипичные мутные О-колонии [Смирнова Н.И. с соавт., 2004]. Кроме морфологии колоний Т- и О-клоны отличались по продукции ряда факторов патогенности и персистенции [Исаев Н.Д. с соавт., 2005].

Для выявления структур, участвующих в изменении морфологии колоний в штаммах холерного вибриона, нами изучены поверхность клеток и содержание в них поли--гидроксибутирата модельного штамма V. cholerae Дакка 35 классического биовара, имеющего в популяции Т- и О-клоны. Обнаружено, что клетки Т- и О клонов содержали различные клеточные элементы, но электронно-плотных гранул поли--гидроксибутирата в клетках не обнаружено. В то же время при электронно микроскопическом изучении двух фенотипически измененных вариантов V. cholerae Дакка 35 выявлено, что на поверхности и между клетками О-вариантов присутствует рыхлый слой, который отсутствует у Т-клонов.

Обнаруженный дополнительный слой был выделен с поверхности двух фенотипически разных вариантов штамма V. cholerae Дакка 35 и при биохимическом исследовании установлено, что он имеет полисахаридную природу [Заднова С.П. с соавт., 2004].

Для подтверждения факта обнаружения у штамма V. cholerae Дакка экзополисахаридного слоя бактерии Т- и О-клонов исследованы электронно гистохимическим методом после их обработки красителем рутением красным, применяемым для обнаружения экзополисахарида у грамотрицательных бактерий [Johnson J.A.et al., 1992;

Yildiz F.H. et al., 2001]. При изучении ультратонких срезов выявлено, что между клетками О-варианта Дакка 35 выявляется аморфный электронно-плотный слой окрашенных экзополисахаридов, тогда как у Т-варианта такой слой отсутствовал.

Для подтверждения выявления в О-вариантах штамма V. cholerae Дакка экзополисахарида в работу был взят штамм V. cholerae 641/67 CRC IDH эльтор биовара, в популяции которого также присутствуют Т- и О-варианты. При электронно-гистохимическом исследовании штамма V. cholerae 641/67 CRC IDH в О вариантах обнаружен экзополисахаридный слой, который выявлялся в виде аморфного электронно-плотного слоя при окраске бактерий рутением красным (рисунок 7).

А Б Рисунок 7 – Электронограмма эльтор вибрионов V. cholerae 641/67 CRC IDH, окрашенных рутением красным (ультратонкие срезы).

А – Т-колонии, не синтезирующие экзополисахарид;

Б – О-колонии, продуцирующие экзополисахарид (экзополисахаридный слой показан стрелками).

Мы предполагаем, что присутствие экзополисахаридного слоя на поверхности клеток О-вариантов приводит к изменению структуры колоний. Для проверки данного предположения нами проведено изучение двух фенотипически разных вариантов штамма V. cholerae Дакка 35 в растровом электронном микроскопе, которое показало, что О-колонии V. cholerae Дакка 35 имели рыхлую поверхность с отпочкованными конгломератами бактерий (микроколонии, рисунок 8 А, стрелка), расположенными на ее поверхности. В основном, клетки были покрыты слизистой оболочкой в результате продукции экзополисахарида. Иное строение колоний просматривалось у популяции Т-клонов (рисунок 8 Б) – поверхность бактерий имела гладкую форму.

А Б Рисунок 8 – Сканограммы колоний V. cholerae Дакка 35.

А – колонии О-варианта;

Б – колонии Т-варианта.

Таким образом, с помощью растровой электронной микроскопии подтверждено присутствие экзополисахаридного слоя у О-вариантов холерных вибрионов классического биовара, определяющего морфологию колоний данных вариантов.

Субмикроскопическая морфология белка чумного и S-слоя сибиреязвенного микробов Согласно литературным данным показано, что S-слои микроорганизмов представляют собой наиболее простой тип биологической мембраны, сформировавшийся в процессе эволюции. Функциональная роль этих структур разнообразна [Sleytr U., 1983].

Для изучения особенностей структурной организации и функциональной роли белка S-слоя Y. pestis и B. anthracis мы провели исследования, применив при этом методы негативного контрастирования, сканирующей электронной и иммуно электронной микроскопии.

А Б В Г Рисунок 9 – Электронограммы (ТЭМ) клеток штамма чумного микроба и белка S-слоя.

А – Y. pestis КМ218;

Б, В – Y. pestis EV НИИЭГ (В – после ультразвуковой обработки);

Г – конгломераты белка S-слоя;

ВМ – внешняя мембрана;

ЦМ – цитоплазматическая мембрана;

S – S-слой;

П – поры.

Субмикроскопическая морфология белка S-слоя чумного микроба. Для понимания особенностей структурной организации S-слоя возбудителя чумы проведены исследования с использованием методов трансмиссионной электронной и сканирующей зондовой микроскопии.

По данным Н.П. Коннова с соавт. (1998) после ультразвуковой обработки бактериальной взвеси вакцинного штамма чумного микроба в некоторых случаях наблюдалось слущивание поверхностного слоя с тела клетки. На ультратонких срезах бактерий, над их внешней мембраной имелся четко выраженный дополнительный листок, в местах разрыва которого он заворачивался в кольцеобразные структуры завитками внутрь. Структура эта была отнесена к S-слою чумного микроба [Antonova O.A. et al., 1998].

С использованием методов сканирующей туннельной и атомно-силовой микроскопии нами показано значительное отличие клеточных поверхностей штамма Y. pestis EV НИИЭГ и бесплазмидного производного – Y. pestis KM218 (рисунок 9). В эксперименте с клетками последнего штамма прослеживается наличие упорядоченной структуры, отсутствие которой на поверхности клеток родительского штамма мы объясняем экранированием S-слоя другими поверхностными антигенами. Иммуно-электронномикроскопическим анализом ранее [Антонова О.А., 1999] было подтверждено присутствие S-белка именно на поверхности клетки как бесплазмидного, так и плазмидсодержащего штамма.

Проведенный анализ продуктов самосборки белка S-слоя подтверждает сделанное ранее предположение о его относительно регулярном (паракристаллическом) строении (рисунок 10 В).

А Б В Рисунок 10 – Зондовая микроскопия поверхности клеток чумного микроба и продуктов самосборки S-слоя.

А – штамм Y. pestis КМ218, бесплазмидный;

Б – штамм Y. pestis EV НИИЭГ;

В – продукты самосборки белка S-слоя на поверхности слюды. Участок сканирования 700700 нм.

Электронно-микроскопические исследования показали, что молекулы изолированного белка образовывали паракристаллические пластинчатые структуры с размером пор 6–7 нм (рисунок 9 Г). Дополнительно была проведена Фурье фильтрация полученных электронограмм, которая детально выявила упорядоченные поры изучаемого слоя.

Сканирующая туннельная и атомно-силовая микроскопия также показала значительное отличие бактериальных поверхностей штамма Y. pestis EV НИИЭГ и его бесплазмидного производного – Y. pestis KM 218 (рисунок 10).

Субмикроскопическая морфология белка S-слоя сибиреязвенного микроба. S слои сибиреязвенного микроба, составляющие приблизительно 10 % бактериального белка [Farchaus J. et al., 1995], являются компонентами сложной поверхностной клеточной организации, функциональная роль которых определяется специфическим взаимодействием с ассоциированными надмолекулярными структурами.

А Б Рисунок 11 – Электронограммы препаратов белков Sap и ЕА1, выделенных из штамма B. аnthracis Sterne Т Рrt- после диализа и негативного контрастирования.

А – белок Sap;

Б – белок ЕА1.

Исследование белков S-слоя сибиреязвенного микроба нами проводилось на бесплазмидном протеазонегативном производном вакцинного штамма B. аnthracis Sterne 34F2 (Рrt-). При просмотре препаратов белка в трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ) обнаруживались мелкие решетчатые структуры размером 79 нм со строго выраженной наклонной симметрией (рисунок 11 А, Б).

Для более детального исследования пространственной ультраструктурной организации изображения белков S-слоя был применен метод прямого преобразования Фурье, позволяющий выявить скрытое изображение в исследуемом объекте.

Изображение S-слоя подвергнуто полосовой Фурье-фильтрации в диапазонах частот, соответствующих локальным максимумам (рисунок 12 А). Полученное в результате фильтрации изображение представлено на рисунке 12 Б.

ТЭМ исследование белков S-слоя сибиреязвенного микроба, с использованием преобразования Фурье, дало наглядную картину их ультраструктур со строго выраженной периодичностью и волнообразной симметрией.

А Б Рисунок 12 – Результат полосовой Фурье-фильтрации изображения S-слоя сибиреязвенного микроба.

А – диапазон частот, соответствующих локальным максимумам изображения;

Б – итог полосовой Фурье-фильтрации изображения.

На изображениях атомно-силового микроскопа отчетливо видны параллельные ряды упорядоченных линейных цепочек белков с высотами 2–3 нм для белка Sap (рисунок 13 А) и 7–8 нм для ЕА1 (рисунок 13 Б).

А Б Рисунок 13 – СЗМ изображение препаратов белков Sap и ЕА1, выделенных из штамма B. аnthracis Sterne Т Рrt- после диализа и высушивания на поверхности слюды (сила взаимодействия острия и поверхности 2,6 нН).

А – белок Sap. Участок сканирования – 600600 нм;

Б – белок ЕА1. Участок сканирования – 100500 нм.

Таким образом, исследование белков сибиреязвенного микроба методами ТЭМ и АСМ показало хорошую корреляцию, симметричность и упорядоченность ультраструктуры образуемых ими слоев.

ВЫВОДЫ 1. Создано устройство для осаждения и заливки в смолу сверхмалого количества (несколько десятков) про- или эукариотических клеток для электронно микроскопических исследований. Показана высокая эффективность устройства, соответствующая классическим методам приготовления образцов для ультратонких срезов в электронной микроскопии.

2. Разработан алгоритм и программное обеспечение для построения трехмерных изображений бактериальных клеток на основе трансмиссионных электронных изображений серийных ультратонких срезов. Воссозданы трехмерные изображения бактериальных клеток Yersinia pestis, Bacillus anthracis и Vibrio cholerae с высоким пространственным разрешением.

3. Создана программа в среде Matlab, которая способствует эффективному проведению фильтрации шумов и повышению контрастности электронно микроскопических и сканирующих зондовых изображений. Представлены результаты применения ортогональных и стационарных вейвлетов на основе вейвлетов Добеши.

4. Выявлены особенности ультраструктурного строения капсулы чумного микроба. Методом сканирующей туннельной микроскопии показано наличие на поверхности клеток упорядоченных по типу трехмерной пространственной решетки микроструктур диаметром со стороной куба 50 нм.

5. На поверхности клеток О-вариантов холерного вибриона классического биовара с помощью электронно-гистохимического метода негативно окрашенных бактерий выявлено наличие экзополисахаридного слоя, определяющего морфологию колоний этих вариантов.

6. Установлено, что изолированный белок S-слоя чумного микроба состоит из пластинчатых структур с кристаллоподобной волнообразной поверхностью, формирующий паракристаллический наружный слой клетки. Фурье-фильтрацией электронограмм показано наличие пор в структуре S-слоя чумного микроба, размерность которых составила 6–7 нм.

7. Выявлены особенности в строении S-слоя сибиреязвенного микроба.

Сканирующей электронной микроскопией показано наличие мелких решетчатых структур размером 79 нм со строго выраженной наклонной симметрией. Данные о выраженной периодичности и волнообразной симметрии ультраструктур S-слоя сибиреязвенного микроба подтверждены атомно-силовой микроскопией и Фурье фильтрацией.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Коннов Н.П., Байбурин В.Б., Новикова О.В., Кузнецов О.С., Волков Ю.П.

Универсальный малогабаритный комплекс СЗМ для работы в полевых условиях // XVIII Российская конференция по электронной микроскопии РЭМ`2000. – Черноголовка, 2000. – С. 250.

2. Baibyrin V.B., Konnov N. P., Kuznetsov O.S., Volkov U.P. Versatile Near Field Scanning Optical Microscope // SPIE Proc. – San-Jose, USA, 2000. – Vol. 3915. – P. 258– 262.

3. Коннов Н.П., Осин А.В., Кузнецов О.С., Смирнова Н.И. Изучение полисахаридной капсулы у авирулентных штаммов Vibrio cholerae O139 серогруппы методом электронной микроскопии // XIX Российская конференция по электронной микроскопии РЭМ`2002. – Черноголовка, 2002. – С. 230.

4. Коннов Н.П., Байбурин В.Б., Волков Ю.П. Кузнецов О.С. Сканирующая туннельная микроскопия возбудителей особо опасных инфекций // Проблемы особо опасных инфекций. – 2002. – Вып. 1(83). – С. 90–95.

5. Коннов Н.П., Волков Ю.П., Кузнецов О.С., Якименко Р.А., Новикова О.В., Микшис Н.И. Трехмерная микроскопия бактериальных клеток с высоким пространственным разрешением // Проблемы особо опасных инфекций. – 2002. – Вып. 1(83). – С. 86–90.

6. Коннов Н.П., Волков Ю.П., Корсакова А.Ю., Данилова Т.В., Микшис Н.И., Мантуров А.О., Кузнецов О.С., Попов Ю.А., Киреев М.Н. Трансмиссионная электронная и сканирующая силовая микроскопия белков S-слоя сибиреязвенного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. – 2004. – Вып. 88. – С. 34–36.

7. Волков Ю.П., Коннов Н.П., Кузнецов О.С., Киреев М.Н. Использование атомного силового микроскопа в иммунохимических исследованиях // Медицинская микробиология – XXI век: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. – Саратов, 2004. – С. 61–62.

8. Голова А.Б., Федорова В.А., Девдариани З.Л., Уткин Д.В., Кузнецов О.С., Коннов Н.П. Особенности синтеза капсульной субстанции Yersinia pestis // Сб. тез.

НИЦ им. Сеченова III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». – М., 2004.

– С. 166.

9. Федорова В.А., Петрова А.В., Девдариани З.Л., Голова А.Б., Панькина Л.Н., Кузнецов О.С. Модификация полисахаридных цепей углеводсодержащих антигенов патогенных иерсиний в зависимости от условий культивирования бактерий // Материалы конференции, посвященной 70-летию Противочумного центра «Противочумные учреждения России и их роль в обеспечении эпидемиологического благополучия населения страны». – М., 2004. – С. 164.

10. Пат. 40318 Российская Федерация, МПК7 С12 М 1/00, U1. Устройство для осаждения и заливки в эпоксидную смолу сверхмалых количеств клеток / Коннов Н.П., Волков Ю.П., Кузнецов О.С., Нечаева О.В.;

заявитель и патентообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». – № 2004113812/22;

заявл. 06.05.04;

опубл. 10.09.04, Бюл. № 25. – 2 с.: ил.

11. Киреев М.Н., Коннов Н.П., Волков Ю.П., Кузнецов О.С.

Иммунохимическая детекция белка чумного микроба методом сканирующей силовой микроскопии // XIV Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел РЭМ`2005. – Черноголовка, 2005. – С. 255.

12. Кузнецов О.С., Заднова С.П., Исаев Н.Д., Смирнова Н.И., Коннов Н.П.

Изучение морфологии колоний Vibrio cholerae ДАККА35 методами растровой и трансмиссионной электронной микроскопии // XIV Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел РЭМ`2005. – Черноголовка, 2005. – С. 261.

13. Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2005610679 Российская Федерация. Программа для реконструкции трехмерной организации клеточных наноструктур / Коннов Н.П., Волков Ю.П., Кузнецов О.С., Киреев М.Н.;

заявитель и правообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». – № 2005610136;

заявл. 25.01.05;

опубл. 22.03.05. – 2 с.

14. Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2006612852 Российская Федерация. Универсальная компьютерная программа для количественного учета биохимических реакций / Киреев М.Н., Данилова Т.В., Волков Ю.П., Коннов Н.П., Кузнецов О.С.;

заявитель и правообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». – № 2006612059;

заявл. 20.06.06;

опубл. 10.08.06. – 2 с.

15. Коннов Н.П., Волков Ю.П., Кузнецов О.С., Киреев М.Н. Применение атомно-силовой микроскопии для детекции антител к возбудителям иерсиниозов // Инфекции, обусловленные иерсиниями. Материалы II Всероссийской научно практической конференции с международным участием. – СПб., 2006. – С. 23.

16. Бугоркова С.А., Ливанова Л.Ф., Кобкова И.М., Бугоркова Т.В., Коннов Н.П., Кузнецов О.С., Смирнова Н.И. Ультраструктурные аспекты изучения влияния рекомбинантных штаммов холерного вибриона на организм биомодели // Проблемы особо опасных инфекций. – 2006. – Вып. 1(91). – С. 53–56.

17. Кузнецов О.С., Коннов Н.П., Князева Т.В., Мокроусова Т.В., Волков Ю.П., Киреев М.Н. Исследование ультратонких срезов гемолимфы блох // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов и паразитологов. – М., 2007. – Т. 3. – С. 342.

18. Коннов Н.П., Волков Ю.П., Кузнецов О.С., Киреев М.Н. Вейвлет-анализ в распознавании различных ультраструктур бактерий при электронно микроскопических исследованиях особо опасных инфекций // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов и паразитологов. – М., 2007. – Т. 2. – С. 249.

19. Кузнецов О.С., Коннов Н.П., Киреев М.Н., Волков Ю.П. Использование вейвлет-анализа для фильтрации электронно-микроскопических изображений биологических объектов // XV Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел РЭМ`2007. – Черноголовка, 2007. – С. 294.

20. Волков Ю.П., Коннов Н.П., Кузнецов О.С., Киреев М.Н. Устройство для осаждения и заливки в эпоксидную смолу сверхмалых количеств клеток для ультратонких срезов // XXII Российская конференция по электронной микроскопии РЭМ`2008. – Черноголовка, 2008. – С. 262.

21. Коннов Н.П., Волков Ю.П., Киреев М.Н., Кузнецов О.С. Использование вейвлет-анализа для фильтрации изображений в электронной и зондовой микроскопии // Проблемы особо опасных инфекций. – 2008. – Вып. 3(97). – С. 60–63.

22. Коннов Н.П., Байбурин В.Б., Волков Ю.П., Кузнецов О.С., Киреев М.Н.

Устройство для концентрации и ультраструктурного исследования сверхмалого количества клеток // Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине – 2008. / Под ред. проф. Д.А. Усанова. – Саратов, 2008. – С. 165–168.

23. Ерохин П.С., Уткин Д.В., Кузнецов О.С., Портенко С.А. Влияние различных способов фиксации на морфологию клеток холерного вибриона при проведении исследований с применением сканирующей зондовой микроскопии // Российская конференция по электронной микроскопии РЭМ’2010. – Черноголовка, 2010. – C. 355.



 

Похожие работы:


 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.