авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Изучение сенсорных свойств органических и полимерных пленок на твердой подложке

На правах рукописи

Киселев Глеб Александрович

ИЗУЧЕНИЕ СЕНСОРНЫХ СВОЙСТВ ОРГАНИЧЕСКИХ И ПОЛИМЕРНЫХ

ПЛЕНОК НА ТВЕРДОЙ ПОДЛОЖКЕ

Специальности 02.00.06 – высокомолекулярные соединения,

01.04.07 – физика конденсированного состояния

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата физико-математических наук

Москва 2007

Работа выполнена на кафедре физики полимеров и кристаллов физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор Яминский Игорь Владимирович

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук, профессор Гиваргизов Евгений Инвиевич Кандидат физико-математических наук Прохоров Валерий Васильевич

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт физических проблем им. Ф.В. Лукина

Защита состоится « 25 » апреля 2007 г. в часов на заседании диссертацион ного совета Д 501.002.01 в Московском государственном университете им.

М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Воробьевы горы, МГУ, физиче ский факультет, ауд. _

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ.

Автореферат разослан « » _ 2007г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 501.002. кандидат физико-математических наук Лаптинская Т.В.

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Многие процессы, протекающие в тонких органиче ских и полимерных слоях в настоящий момент недостаточно изучены в силу огра ниченных возможностей большинства косвенных методов анализа свойств тонких пленок. При этом знания об энергетических причинах самоорганизации субьединиц монослоев и сил кооперативных взаимодействий биополимеров вблизи поверхности являются насущной необходимостью в областях сенсорных приложений, биосо вместимых материалов и медицинских приборов, контактирующих с физиологиче скими жидкостями, таких как зонды, протезы, контактные линзы и т.д. Подобная задача актуальна также в исследованиях механизмов агрегации биополимеров в клеточных мембранах, приводящих к нарушениям ионного обмена и нейродегене ративным заболеваниям человека.

Благодаря использованию современных микрокантилеверных преобразовате лей поверхностных реакций совместно с методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) становится возможным получение более полной информации о морфологии и энергетических свойствах монослойных пленок, с чем связан интенсивный рост числа публикаций по данной тематике в ведущих научных журналах.

Появление кантилеверов во многом обусловлено интенсивным развитием атомно-силовой микроскопии. Устройства с микромеханическими преобразовате лями зарекомендовали себя в качестве полноценного научного инструмента, при меняемого в исследованиях межмолекулярных взаимодействий в монослойных пленках низкомолекулярных веществ, биополимерных объектов, а также в областях химии поверхностных реакций, биологии и медицине. Существенной особенностью кантилевера, не имеющей альтернативных аналогов, является способность прямого измерения натяжения в пленках, помещенных на одну из его сторон. Благодаря этому информация о состоянии исследуемых объектов, получаемая с помощью микромеханических систем, оказывается уникальной и, вообще говоря, отличается от той, которую дают распространенные методы анализа массы, а также оптиче ских, и электрических свойств пленок. Уникальность информации состоит в том, что она непосредственно характеризует энергию межмолекулярных взаимодействий внутри пленки, преобразующуюся в статический изгиб кантилевера (энергию ана литического сигнала).

Основной целью диссертационной работы являлось получение новых экспе риментальных данных с использованием зондовой микроскопии и микрокантиле верных систем о свойствах самоорганизующихся монослойных пленок сераоргани ческих соединений, иммунных комплексов и белков, иммобилизованных на твердой подложке, и разработка методики иммобилизации биополимеров на поверхности кантилевера. Методическая часть работы включала в себя также разработку научно го прибора на основе атомно-силового микроскопа, позволяющего прецизионно из мерять массу микрообъектов и латеральные напряжения в тонких пленках, поме щенных на поверхность кантилевера. В соответствии с поставленной целью реша лись следующие задачи исследования.

1. Выявить и охарактеризовать основные механизмы, инициирующие аналити ческий сигнал деформаций микрокантилеверного преобразователя при ком плексации ионов двухвалентных металлов в рецепторном слое молекул бис 4-(2-пиридилметиленаминофинил)дисульфида на примере самоорганизую щихся монослоев сурфактантов: тиофенола, 4-аминотиофенола и гексантио ла.

2. Разработать методику ковалентной и физической иммобилизации биополи меров на кремниевой и золотой поверхностях кантилевера. Исследовать мор фологию рецепторных слоев прямых биополимерных кантилеверных анали заторов морфина и высокомолекулярного антигена – пероксидазы хрена (ПХ). Изучить механизмы, отвечающие за возникновение поверхностного на тяжения в рецепторной пленке при различных методах иммобилизации моле кул IgG в рецепторе.

3. С помощью АСМ исследовать процессы образования фибрилл лизоцима при низких pH из монослойных пленок на модифицированных гидрофильной и гидрофобной поверхностях. Изучить кинетику и измерить абсолютные зна чения сил изгиба кантилевера на примере молекул лизоцима, привитых на золотой и кремниевой сторонах кантилевера. Построить схему расчета сил парных взаимодействий соседних белковых звеньев, находящихся на поверх ности кантилевера, исходя из данных о величине изгиба кантилевера и о структуре монослойной пленки.



4. Разработать методику закрепления микрочастиц и реализовать метод измере ния их массы с использованием кантилевера атомно-силового микроскопа в резонансном режиме. Провести сопоставление модельных и эксперименталь ных результатов определения массы с помощью кантилевера для оценки от носительной погрешности измерения массы и разрешающей способности разработанной системы микровзвешивания. Исследовать индивидуальные сорбционные свойства одиночных микрочастиц хроматографического сор бента (силикагеля с модифицированной поверхностью).

Материалы и методы. Измерения проводились на атомно-силовом микро скопе ФемтоСкан (Центр перспективных технологий, Россия) в режиме прерыви стого контакта на воздухе с использованием кантилеверов NSC14 (MikroMasch, Россия) из кремния с номинальной жесткостью 5 Н/м и резонансной частотой ска нирования в диапазоне 150–170 кГц. Обработка изображений осуществлялась с по мощью программы ФемтоСкан Онлайн (Центр перспективных технологий, Россия).

В качестве подложек для образцов были выбраны свежесколотые с золотым напы лением (напылитель Eiko IB-3) и подвергнутые различным модификациям поверх ности слюды. В качестве модификатора слюды (кремния в случае кантилеверов), аминирующего поверхность, использовался 3-аминопропилсилатран (АПС), для аминирования золотой поверхности – 4-аминотиофенол. Модификация аминиро ванных поверхностей для последующей иммобилизации белков производилась с помощью глутарового альдегида. Остаточные альдегидные группы блокировались трис-(гидроксиметиламинометаном).

Измерение сил в пленках и массы на поверхности микрокантилеверов осуще ствлялось с помощью разработанного в рамках данной работы устройства, тестиро вание которого для экспериментов прецизионного контроля массы проводилось с использованием полистироловых калибровочных микросфер и пьезосканера атом но-силового микроскопа. Диаметр полистироловых микросфер определялся на рас тровом электронном микроскопе (HITACHI S-520). Для измерения массы использо вались кантилеверы Nanosensors c резонансной частотой 320 кГц и жесткостью Н/м. При измерении сил в тонких пленках применялись кремниевые консоли fpC жесткостью 0,03 Н/м (изготовленные в Государственном научно-исследовательском институте физических проблем им. Ф.В. Лукина, Москва).

Иммобилизация белков на поверхности кантилеверов и образцов для АСМ проводилась в одинаковых условиях путем непосредственного контакта поверхно сти и буфера с модификатором.

Конъюгат морфин-овальбумин, сыворотка крови кролика, содержащая спе цифические антитела к морфину, растворы морфина были предоставлены сотруд никами Института физиологически активных веществ (ИФАВ). Эксперименты с данными веществами проводились на территории ИФАВ.

Иммобилизатор IgG – белок А, пероксидаза хрена (ПХ), анти-ПХ-IgG кроли ка, бычий сывороточный альбумин (БСА) и овальбумин были предоставлены со трудниками кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ им.

М.В. Ломоносова.

Низкомолекулярные сурфактанты (4-аминотиотиофенол, гексанотиол, тио фенол, бис-4-(2-пиридилметиленаминофинил)дисульфид, 3-аминопропилсилатран, трис-(гидроксиметиламинометан), глутаровый альдегид), буферные солевые рас творы (фосфатный (pH = 7,0), ацетатный (pH = 4,5), глициновый (рН = 3,0)), раство ры солей (MX2·6H2O, где M – Co, Cu, Ni и X – ClO4) были предоставлены сотрудни ками кафедр органической химии, химии нефти и органического катализа химиче ского факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научная новизна диссертации.

1. Установлен факт увеличения поверхностного давления в самоорганизующейся пленке молекул бис-4-(2-пиридилметиленаминофинил)дисульфида (лиганда), иммобилизованной на поверхности кантилевера, вследствие возрастания элек тростатической плотности в пленке в результате комплексации ионов Co2+, Ni2+, Cu2+ с молекулами лиганда. Показана обратимость реакции образования хелат ных комплексов в рецепторе. Обнаружено различие в значениях поверхностных сил при комплексации ионов Co2+, Ni2+, Cu2+ в слое лиганда, связываемое с тем, что энергии образования соответствующих хелатных комплексов отличаются друг от друга.

2. Разработаны методики ковалентной и физической иммобилизации белков на кремниевых и золотых поверхностях кантилевера. Впервые реализованы высо коселективные микрокантилеверные анализаторы на основе биополимерной па ры – пероксидазы хрена и IgG – с чувствительностью к нескольким наномолям аналита в 1 л буферного раствора. Показано, что конформационные изменения молекул IgG при связывании с пероксидазой генерируют аналитический сигнал деформаций кантилевера, характеризующий уменьшение энтропии макромоле кулярных комплексов.

3. Впервые реализован контроль селективной реакции определения морфина на поверхности кантилевера. Установлено, что причиной деформаций кантилевера при диссоциации комплексов морфин-IgG на его поверхности является спонтан ное снятие напряжения в рецепторной пленке, которое сообщалось системе при иммобилизации молекул IgG в рецепторе.

4. Обнаружен катализ роста фибрилл лизоцима из химически иммобилизованного монослоя на поверхностях золота и слюды при pH = 3,0. Впервые получены дан ные по морфологии и размеру фибрилл лизоцима, выросших из монослоя хими чески иммобилизованых молекул белка. С помощью микрокантилеверной сис темы проведены измерения сил в пленках привитого лизоцима на гидрофобных и гидрофильных поверхностях кантилевера при «кислом» значении pH = 3,0.

Обнаружена корреляция между скоростями процессов роста фибрилл из моно слоев на гидрофильных и гидрофобных подложках и развитием сил в пленке белка на данных поверхностях.

5. Предложена качественная модель, объясняющая возможность образования фиб рилл из молекул белка, находящихся на поверхности в связанном состоянии.

6. Предложена схема расчета парных взаимодействий соседних белковых звеньев, находящихся на поверхности кантилевера, на основе данных о величине изгиба кантилевера и структуре монослойной пленки. Экспериментально определены силы парных взаимодействий молекул лизоцима в монослое на поверхности кантилевера.

7. Разработана методика закрепления микрочастиц на поверхности кантилевера и реализован метод измерения их массы с помощью кантилевера атомно-силового микроскопа в резонансном режиме. Впервые охарактеризованы сорбционные свойства одиночных микрочастиц хроматографического сорбента диасорб-60 С16 к парам полярных и неполярных растворителей.

Практическая значимость работы. Результаты диссертации позволяют про двинуться в решении следующих задач:

- исследовании кооперативных взаимодействий в биополимерных пленках;

- разработке новых методов исследования массовых свойств микрообъектов;

- создании новых прямых методов иммунохимического анализа на базе микро электромеханических систем;

- создании высокочувствительных сенсоров на ионы металлов в жидкостях, раз работка ионоселективных электродов;

создании методов диагностики и профилактики нейродегенеративных заболева ний животных и человека, вызванных прионными патогенными белками.





Следует отметить, что результаты диссертации могут быть полезны в физике биополимеров, биофизике, молекулярной биологии и медицине.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих научных конференциях:

- Международный симпозиум «Молекулярный дизайн и синтез супрамолекуляр ных архитектур», Казань, 2004.

- Международная конференция «Scanning Tunneling Microscopy/Spectroscopy and Related Techniques in conjunction with 13th International Colloquium on Scanning Probe Microscopy», Sapporo, Japan, 2005.

- Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития»

Москва, 2005.

- Международная конференция «Малый полимерный конгресс», Москва, 2005.

- Международная конференция «Биотехнология и медицина», Москва, 2006.

- Международная конференция «International Conference on Nanoscience and Tech nology 2006», Swisserland, Basel, 2006.

- Всероссийская конференция (с международным участием) «Химия поверхности и нанотехнология», Санкт-Петербург, 2006.

- «Четвертая всероссийская каргинская конференция», Москва, Россия, 2007.

Личный вклад автора. Все экспериментальные измерения зондовой микроско пии проведены автором. Все образцы приготовлены автором лично (за исключени ем синтеза химических веществ). Разработка многофункционального научного из мерительного комплекса и проведенные на нем измерения выполнены автором лич но. Анализ и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа состо ит из введения, шести глав, заключения, списка литературы, включающего 203 на именования. Работа изложена на 138 страницах, содержит 74 рисунка и 9 таблиц.

Основное содержание работы

Во введении отмечается актуальность темы диссертационной работы, опре деляются ее цели и задачи.

Глава 1 содержит обзор литературы по теме диссертации. В обзоре кратко представлены основы методов зондовой микроскопии, в особенности атомно силовой микроскопии (раздел 1.1.1) и силовой спектроскопии (раздел 1.1.2), и их применения при исследовании свойств биополимерных систем. В разделе 1.1.3 рас сматриваются аспекты функционирования современных перспективных микрокан тилеверных устройств в качестве высокочувствительных многофункциональных биохимических датчиков. Проанализированы основные факторы, отвечающие за выработку аналитического сигнала микрокантилеверных сенсоров. Представлен спектр применений микромеханических систем и схем регистрации аналитического сигнала (раздел 1.3), при этом особое внимание уделено анализу супрамолекуляр ных структур рецепторных слоев силовых преобразователей. В обзоре также кратко описаны основные характеристики и принципы функционирования распространен ных преобразователей биофизических реакций в аналитический сигнал (раздел 1.2).

Изложение результатов диссертации логически разделено на две части: экс периментальную (главы 2 – 5) и теоретическую (главы 6 – 8).

Глава 2 содержит описание разработки и конструкторской сборки научного прибора на основе атомно-силового микроскопа (раздел 2.2), предназначенного для исследования физико-химических свойств тонких пленок и микрообъектов, поме щенных на поверхность кантилевера (рис. 1б).

Рис. 1. а) Сборка жидкостной ячей ки, содержащей кантилевер. б) Универсальная микрокантилеверная сенсорная система.

В цель работы входило проведение калибровки и тестирования комплекса и создание оптимальных методов закрепления объектов исследования на поверхности кантилевера.

Частота кантилевера, кГц 0 10 20 30 40 50 60 Присоединенная масса, нг Рис. 2. Изображение кантилевера с пят- Рис. 3. Зависимость резонансной частоты балки надцатью полистирольными микроша- кантилевера от изменения массы на ее конце при риками, прикрепленными к его концу с последовательном прикреплении калибровочных помощью эпоксидного клея. микросфер. Сплошная кривая – теоретический расчет.

Ошибка метода измерения массы микрообъектов с помощью кантилеврера оценивалась на основе сопоставления экспериментальных данных и теоретического расчета массы (глава 6) последовательно, одна за другой, взвешиваемых полистиро ловых микрошариков (рис. 3), закрепляемых на свободном конце кантилевера «Nanosensors» эпоксидным клеем (рис. 2). Эта ошибка, обусловленная дисперсией локализации частиц на поверхности кантелевера, не превышала 5%. Достигнутая разрешающая способность измерения массы одиночных объектов составила 1 пг (что сравнимо с массой одной бактериальной клетки E-coli) и на порядок превзошла чувствительность традиционного метода кварцевого микровзвешивания.

В разделе 2.3.3 проанализированы артефакты метода микровзвешивания, свя занные с температурными градиентами в измерительной системе и флуктуациями плотности (влажности среды). Было установлено, что при измерении масс меньших 10-9 г во избежание теплового дрейфа и для сохранения величины ошибки не более 5% требуется поддерживать в системе стабильность температуры (колебания тем пературы не должны превышать 1 °С). Флуктуации влажности среды также значи тельно ухудшают стабильность микровзвешивающей системы. В связи с этим на примере кантилеверов CSC12(E) было показано, что микрорезонансные системы можно использовать в качестве измерителей влажности среды. Для устранения пе речисленных артефактов была разработана герметичная ячейка (рис. 1а), обеспечи вающая необходимую стабильность температурных и диссипационных вкладов в ошибку измерений.

С помощью резонансной кантилеверной системы были исследованы микрочас тицы силикагеля с поверхностью, модифицированной гидрофобными углеводород ными молекулами, для изучения сорбции паров толуола. Результаты измерений сорбции паров толуола частицами сорбента диасорб-60-С16, закрепленными на конце кантилевера, представлены на графике зависимости массы паров растворите ля поглощенных частицей частице сорбента, от массы самой частицы (рис. 4).

Зависимость массы поглощенных паров от массы частицы Масса поглощенных паров, нг Рис. 4. Зависимость массы адсорбированных паров толуола на поверхности частиц диа сорб-60-С16 от массы самих частиц сорбента.

0 50 100 150 Кантилевер с прикрепленной частицей диа Масса частицы сорбента, нг сорб-60-С16 массой 78,6±4,9 нг (справа).

Из рисунка 4 видно, что кривая, проведенная через экспериментальные точки за висимости поглощенной массы паров m от массы частиц силикагеля M, отлична от зависимости m ~ M2/3 для частицы, имеющей гладкую поверхность, как у микро сфер изображенных на рис. 2. В случае монослойной сорбции для сорбента с мак симальной фрактальной размерностью D = 3 изменение массы частицы m ~ MX, где Х = 1. В зависимости, показанной на рис. 4, степенной коэффициент X 1, что может говорить о лучшей способности частиц с большей массой к мультислойной сорбции, очевидно, обусловленной замедлением диффузии молекул сорбата во внутренних порах крупной частицы.

Метод резонансного микровзвешивания с использованием кантилевера позво ляет оценить кинетические коэффициенты сорбции и десорбции паров, которые стоят в показателе экспоненты решения уравнения Ленгмюра: kсорб=kd+kaC. В слу чае десорбции концентрация сорбата над поверхностью близка к нулю и kсорб = kd.

1, Десорбция частицей толуола Масса сорбированных паров, нг Десорбция частицей этанола 0, Чистый кантилевер в парах толуола Рис. 5. Кинетические кривые десорбции паров этанола и па 0, ров толуола с поверхности час тицы диасорб-60-С16.

0 100 200 300 400 500 600 700 -0, Время, с Различие сорбционных характеристик частицы диасорб-60-С16 при поглоще нии паров толуола и этанола объясняется тем, что модифицированная поверхность данного сорбента сорбирует молекулы полярных растворителей (спиртов, ацетона, воды) хуже, чем неполярных (толуол, бензол, хлороформ) (см. рис. 5). Коэффициент десорбции, зависящий от энергии связи молекулы сорбата с адсорбентом, для эта нола оказался большим, чем для толуола, что подтверждает гидрофобность моди фицированного силикагеля.

Глава 3 посвящена применению разработанной микрокантилеверной сис темы (раздел 2.2) для исследования свойств самоорганизующегося рецептор ного слоя молекул бис-4-(2 пиридилметиленаминофинил)дисульфида Рис.6. Вверху: схема химической реакции бис- (лиганда), способных образовывать хелат 4-(2-пиридилметиленаминофинил)дисульфида ный комплекс с ионами двухвалентных с золотой подложкой. Внизу: реакция обратимого образования металлокомплекса.

металлов: Co2+, Ni2+, Cu2+, как показано на рис. 6. Обратимое разрушение образовавшихся металлокомплексов в слое молекул лиганда осуществлялось посредством инкубации кантилевера в водном растворе соляной кислоты (10-2 М), которая производилась в течение 1 часа.

Хемосорбция лиганда на золотой стороне кантилевера сопровождалась изги бом балки в сторону растущего монослоя (рис. 7), т.е. наблюдался эффект увеличе ния поверхностного натяжения. Данные по изменению краевого угла смачивания капли воды на золотой отклонение кантилев ера при сорбции подложке в зависимости от лиганда (0,001М) нормиров анное изменение краев ого угла 0, смачив ания при сорбции лиганда (0,001М) времени ее инкубации в Поверхностное натяжение,Н/м растворе лиганда (10-3М) 0 2 4 6 8 10 -0, соответствуют результатам, -0, -0, полученным с помощью -0, микрокантилеверной сис -0, темы (рис. 7), которые го -0, Время протекания процесса, ч ворят о том, что за 8 – часов на золотой поверхно Рис. 7. Хемосорбция лиганда 10-3 М из метанола на зо лотую поверхность. Данные изгиба кантилевера – сти из раствора лиганда об верхняя кривая. Нормированное изменение краевого разуется плотно упакован угла смачивания капли воды на золотой подложке, мо дифицированной лигандом, с течением времени – ниж ный слой молекул.

няя кривая. Направление изгиба кантилевера показано на вставке. При помещении кан тилевера в водный раствор, содержащий ионы Co2+, наблюдался его значительный изгиб в сторону немодифицированной кремниевой поверхности (рис. 8а). Данное поведение системы обуславливалось увеличением зарядовой плотности рецептор ного слоя за счет привнесения ионов атомов двухвалентных металлов, которые вме сте с молекулами лиганда, иммобилизованными на золотой поверхности, образуют хелатные комплексы (рис. 6). После инкубации кантилевера в водном растворе со ляной кислоты (10-2 M) наблюдалась его релаксация в исходное состояние, в кото ром он находился до момента помещения в раствор соли (рис. 8б). Таким образом, с помощью метода измерения силового изгиба кантилевера была подтверждена обра тимость реакции образования металлокомплекса (см. рис. 6). Повторное помещение кантилевера в раствор соли вызывало отклик системы, аналогичный наблюдавше муся в предыдущем цикле эксперимента (рис. 8в).

С понижением концентрации ионов кобальта в растворе величина деформа ции кантилевера 0, уменьшалась, а a б в Рис. 8. Кинетика изгиба 0, Поверхностное натяжение,Н/м при концентрации кантилевера при после 0, довательной инкубации 10-7М соотноше 0, в водных растворах: а) Co(ClO4)2·6H2O (кон- ние сигнал/шум 0, - центрация 10 М), б) 0, составляло HCl и в) Co(ClO4)2·6H2O (концентрация 10-3М).

0 50 100 150 200 250 300 350 2,3 ± 0,1, что Время протекания процесса, мин близко мини мальному обнаруживаемому сигналу. Таким образом, можно заключить, что пре дельная концентрация обнаружения ионов кобальта в воде для описанной системы составляла порядка 10-7 М.

Конкурирующим фактором для сил электростатического отталкивания явля ются конформационные изменения молекул при образовании металлокомплексов. В случае ионов Co2+ проявляется явное доминирование электростатических сил от талкивания, создающих в слое избыточное давление. На рисунке 9 показаны откли ки кантилевера на первичный цикл инкубации в водном растворе (10-3 M) солей двухвалентных металлов MX2·6H2O (где M – Co, Cu, Ni;

X – ClO4). Наибольший си ловой отклик соответствует нахождению кантилевера в водном растворе соли ко бальта, а наименьший – в растворе соли меди. По данным электронной спектроско пии комплексов бис-4-(2-пиридилметиленаминофинил)дисульфида с ионами Co(ClO4)2 6H2O (0,001M) 0, Рис. 9. Кинетика изгиба кан Ni(ClO4)2 6H2O (0,001M) Cu(ClO4)2 6H2O (0,001M) 0, тилевера при инкубации в Поверхностное натяжение,Н/м водных растворах: MX2·6H2O 0, (M – Co, Cu, Ni;

X – ClO4) 0, (цикл 1, концентрация 10-3М).

0, В правой части рисунка изо 0, бражены соответствующие формы комплексов.

0 10 20 30 40 50 60 70 -0, Время протекания прорцесса, мин металлов было показано, что комплексы с никелем имеют форму плоского квадрата, комплексы с кобальтом – тетраэдральную форму, а форма комплекса с медью не может быть определена однозначно на основе электронного спектра. Таким обра зом, можно заключить, что степень отклика кантилевера при комплексообразовании непосредственно зависит также от формы комплекса, определяемой величиной за траченной энергии.

Глава 4 содержит результаты исследования реакций афинного взаимодейст вия макромолекул антител на поверхности кантилевера со специфическими антиге нами двух типов – гаптеном Рис. 10. Схема конку рентного иммуноана и высокомолекулярным лиза: А) кантилевер с белком, вследствие чего монослойной пленкой антигенов;

Б) адсорб разбита на две части. В раз- ция антител на специ фическую рецептор деле 4.1 предложен прото ную поверхность кан тип анализатора опиатных тилевера, содержащую антиген;

В) десорбция препаратов, работающего антител с поверхности под действием молекул по конкурентной схеме антигена.

(рис. 10), аналитом для ко торого являлся морфин. В настоящей работе химическая иммобилизация антигена производилась посредством его ковалентного конъюгирования с овальбумином и последующей прививки конъ югата к поверхности кантилевера для сохранения иммуногенных свойств морфина (рис. 10а). В соответствии с конкурентной схемой анализа (рис. 10) для получения на поверхности кантилевера иммунных комплексов проводилась адсорбция антител на привитый конъюгат. Адсорбция антител кролика на поверхности кантилевера, содержащей морфин, сопровождалась изгибом балки в сторону рецепторного слоя (рис. 12). Такое поведение системы объясняется стремлением антител связать, по меньшей мере, две соседние молекулы конъюгата на поверхности, что вызывает эффективное натяжение белкового слоя. Этот факт был подтвержден также данны ми атомно-силовой микроскопии (рис. 11). При контакте гидрофобизированной по верхности слюды, модифицированной физически сорбированным конъюгатом мор фин-овальбумина (рис. 11а), с антителосодержащей сывороткой было замечено воз никновение агрегированных каплевидных образований (рис. 11б), которые свиде тельствуют о том, что молекулы антител, связываясь с конъюгатом, инициируют поверхностное натяжение в белковой пленке.

Рис. 11. а) Слой конъюгата а б на поверхности гидрофоби зированой слюды после многократной промывки в фосфатном буфере (ФБ) (размер изображения 2,8х2, мкм). б) Слой конъюгата на поверхности гидрофобизи рованой слюды после кон такта с разбавленной в ФБ сывороткой крови со спе цифическими антителами (размер изображения 2,8х2, мкм).

Как видно из рис. 12, при сорбции антител из сыворотки крови кролика с раз бавлением 1:150 кривая сорбции 0, удовлетворяет экспоненциальной Поверхностное натяжение, Степени разбавления исходной сыворотки аппроксимации уравнения Лен- крови -0, иммунизированного кролика гмюра и выходит на насыщение за -0, Н/м -0, 70–80 минут. При повышенных -0, концентрациях сыворотки (1:50) -0, из-за сильных флуктуаций интен- -0, 0 10 20 30 40 50 60 70 Время протекания процесса, мин сивности, связанных с оптической Рис. 12. Сорбция антител на поверхность канти неоднородностью раствора, шум в левера, содержащую конъюгат овальбумина с морфином.

системе увеличивался, но сила из гиба кантилевера оставалась прежней. Данные результаты говорят о том, что канти левер с иммобилизированным антигеном можно использовать в качестве теста, по зволяющего анализировать плазму крови на предмет содержания в ней специфиче ских антител, при диагностике различных заболеваний или допинг-теста.

0,0 Рис. 13. Десорбция Увеличенный фрагмент Поверхностное натяжение, Н/м 1 0 0 м к г /м л 0,0 выделенной области антител с поверхности 1 0 м к г /м л 0,0 3 3 м к г /м л сенсора под действием 0,0 1 9 0,0 морфина с 0,0 1 0,0 0 9 концентрациями 3, 10 и -0,0 0 0 0 3 6 9 12 100 мкг/мл - 0,0 - 0,0 0 10 20 30 40 50 60 70 Вр е м я п р о т е к а н и я п р о ц е с с а, м и н Интенсивный изгиб балки в начале процесса десорбции антител при введении морфина (5–10 мин) объясняется резким снятием напряжения в рецепторной пленке (рис. 13) при появлении в ней структурных дефектов. После интенсивного изгиба кантилевера, сопровождающегося разрушением монослоя связанных молекул анти тел, начинается параллельный конкурирующий процесс реорганизации белкового слоя в рецепторе, что приводит к значительному замедлению развития напряжений в пленке и потере информативности аналитического сигнала.

Таким образом, с использованием микрокантилеверов впервые проведены ре акции образования и разрушения биополимерных комплексов на поверхности кан тилевера по конкурентной схеме. Пороговая чувствительность сенсора к морфину составила 3 мкг/мл. Полученные результаты позволяют говорить о потенциальной применимости микрокантилеверных преобразователей для детектирования низко молекулярных веществ в плазме крови животных или человека.

В разделе 4.2 основной задачей являлось определение возможности прямого анализа белков с помощью микрокантилеверных систем, а точнее, эксперименталь ное определение степени латеральных напряжений в монослойной пленке макромо лекул IgG при связывании с классическим белком – пероксидазой хрена (ПХ). Во многих методах прямого анализа аналитический сигнал вырабатывается в результа те изменения плотности рецепторного слоя, которое может быть обусловлено также неспецифическим связыванием посторонних биополимерных объектов, содержа щихся в анализируемом растворе. В случае определения фактов связыва ния аналита с помощью измерения сил, генерируемых в белковом слое, степень влияния неспецифического связывания на аналитический сигнал заметно уменьшается благодаря низ ким энергиям неспецифических свя- Рис. 14. Архитектура рецептора микрокан тилеверного анализатора пероксидазы хре зей и, следовательно, их незначи- на: а) при иммобилизации IgG с помощью тельному вкладу в поверхностное на- белка А на позолоченную сторону кантиле вера, б) при ковалентной иммобилизации тяжение рецепторной пленки. антител на кремниевую сторону кантилеве В данной работе ставилось це- ра.

лью сопоставление эффективности методов физической иммобилизации (с помо щью белка А) и статистической ковалентной прививки IgG на поверхности канти левера (рис. 14) по отношению к генерируемому сигналу связывания антигена. Для исключения неспецифического связывания c немодифицированной поверхностью кантилевера, не имеющей рецепторного слоя, она блокировалась химически приви тым БСА (метод ковалентной иммобилизации белков описан в разделе 4.1.2).

После добавления ПХ в фосфатный солевой буферный раствор (ФСБР) с pH = 7,0 кантилевер с физически иммобилизованным рецептором начинал дефор мироваться в сторону рецепторного слоя (кинетика изгиба показана на рис. 15).

0, Рис. 15. Кинетика из Поверхностное натяжение,Н/м 0 2 4 6 8 10 12 14 гиба кантилевера с -0, Пероксидаза хрена (3 мкг/мл) физически иммобили -0, Экспоненциальное приближение зированным рецеп -0, торным слоем при Ввод -0, введении раствора ПХ пероксидазы -0, с концентрацией 3 мкг/мл.

-0, Время протекания процесса, ч После регенерации сенсора в глициновом буфере с pH = 3,0 и повторной по стадийной иммобилизации антител его чувствительность к пероксидазе понизилась более чем в четыре раза (см. табл. 1).

С помощью атомно-силового микроскопа был произведен контроль свойств поверхности рецепторного слоя кантилевера на стадиях подготовки и функциони рования сенсора. На рисунке 16 показаны изменения параметров шероховатости поверхностей в результате появления на ней новых белковых комплексов:

N N N 1 rn, Rsk = rn, Rq = N r 2 Ra =, Rmax, n NRq N n =1 n = n = где Ra, Rq, Rsk, Rmax – средняя и среднеквадратичные шероховатости, параметр сим метрии, максимальный профиль поверхности соответственно;

rn – высоты точек массива изображения;

N – число точек. Исходя из данных, полученных с помощью АСМ, можно сделать вывод, что на поверхности образуются специфические им мунные пары антител с пероксидазой, которые изменяют рельеф рецепторного слоя с увеличением параметров шероховатости, т.е. на поверхности появляются качест венно новые объекты, очевидно, влияющие на развитие сил в сенсорном слое.

б а 1, Шероховатость (Ra, Rmax, Rq, Rsk), нм г в Ra 0, Rmax 0, Rq 0,4 Rsk 0, Белок А Белок А+IgG Белок А+IgG+ПХ Рис. 16. Изображения поверхностей зо лота с нанесенными а) белком А, б) бел ком А и IgG, в) белком А, IgG и ПХ;

г) графики нормированных шероховатостей каждой из поверхностей.

При высоком уровне воспроизводимости после нескольких циклов регенера ции кантилевер с ковалентно иммобилизированными макромолекулами IgG (рис.17) показал чувствительность в полтора раза меньшую, чем в случае иммобилизации антител с помощью белка А. Блокировка поверхности сенсора, не являющейся ре цепторным слоем, обеспечила невосприимчивость анализатора к внешним неспе цифическим воздействиям контрольных белков (БСА и овальбумина) при высоких концентрациях (рис. 17).

Сопоставляя результаты контроля иммунохимических реакций на поверхно сти кантилевера (табл. 1), можно увидеть, что в результате физической иммобили зации антител на поверхности кантилевера силы, возникающие в монослое антител, в полтора раза больше, чем при химической прививке. Это связывается с увеличен ной мобильностью молекул IgG на поверхности в комплексе с белком А и жесткой детерменированностью их посадки на поверхность, в результате чего конформаци онные изменения молекул IgG при образовании иммунной пары могут быть боль шими, чем при случайной химической иммобилизации антител.

0, 0, Поверхностное натяжение,Н/м 0, 0, 0, -0,05 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3, -0, -0,15 Контроль1 БСА (1 мг/мл) Контроль2 Овальбумин (1 мг/мл) -0,2 Пероксидаза цикл N (3 мкг/мл) Пероксидаза цикл N+1 (3 мкг/мл) -0, Время протекания процесса, ч Рис. 17. Кинетика изгиба кантилевера с ковалентно иммобилизированным рецептор ным слоем при N-ом и (N+1)-ом циклах регенерации в глициновом буфере (pH = 3,0) при введении раствора ПХ с концентрацией 3 мкг/мл. Контрольные белки БСА и овальбумин с концентрациями 1 мг/мл. Нулевой уровень отклонений кантилевера сиг налов контрольных белков для наглядности смещен в сторону отрицательных значе ний.

Известно, что в непосредственной близости к поверхности многие белковые молекулы из-за частичной денатурации могут в значительной степени изменить свою конформацию, кроме того при афинном типе связывания IgG с белком хими ческая прививка не позволяет молекулам IgG естественным образом изменять про странственную структуру, т.е. константа связывания антител может уменьшиться.

Таблица 1. Сравнение характеристик рецепторных слоев молекул IgG, закреплен ных на поверхности с помощью методов физической и химической иммобилизации.

Параметры Чувствительность (мак- Воспроизводимость Невосприимчи- Скорость рабо анализатора симальная сила изгиба после регенерации вость к БСА и ты сенсора при при одинаковых концен- (отношение сил из- овальбумину одинаковых трациях, 3 мкг/мл, за гиба кантилевера до концентрациях Метод время работы анализато- и после его регене- анализируемого вещества, ч- иммобилизации ра), Н/м. рации) Физическая при- БСА – есть 0,28± 0,03 0,23±0,001 0,33±0, вивка Овальбумин – данных нет Химическая БСА – есть 0,18± 0,02 0,89±0,04 0,77±0, прививка Овальбумин – есть Химическая прививка показала два основных достоинства, связанных с более высокой концентрацией IgG на поверхности, обеспеченной методом иммобилиза ции: повышенная скорость определения аналита и высокая степень воспроизводи мости результатов после физического разрушения белкового комплекса IgG и ПХ с помощью глицинового буфера (pH = 3,0). Высокая степень воспроизводимости по максимальной силе аналитического сигнала (чувствительности) связана, по видимому, с отсутствием сложных белковых комплексов, помимо образовавшихся иммунных пар в рецепторном слое, которые в «кислой» среде глицинового буфера (pH = 3,0) могут необратимо агрегировать, из-за чего константа связывания антител может значительно понизиться. При обоих способах посадки молекул IgG было об наружено, что связавшиеся молекулы пероксидазы повышают поверхностное натя жение рецепторной пленки, поэтому кантилевер изгибается в сторону иммобилизи рованного слоя антител. Аналогичные результаты, полученные на других объектах исследования, объяснялись некоторыми авторами изменением электростатического заряда и полярности образующихся иммунных комплексов. На основе полученных данных (табл. 1), предполагается также, что ослабления латеральных сил в биопо лимерной пленке могут быть связаны с эффектом уменьшения конфигурационной энтропии комплексов, обусловленной увеличением компактности или «жесткости»

иммунных пар. В более общей форме генезис поверхностного натяжения белковых пленок связывается с реорганизацией ее субъединиц, стремящихся минимизировать свободную энергию системы в целом.

Глава 5 посвящена исследованию процессов образования фибрилл вблизи поверхности в зависимости от ее типа на примере лизоцима из куриных яиц.

Для определения кинетики агрегации лизоцима вблизи поверхности белок c концентрацией 1мг/мл иммобилизировался на поверхности кантилевера, покрытой золотой пленкой, с помощью метода химической прививки из ацетатного буфера (pH = 4,5). Белок также химически прививался к гидрофильной кремниевой поверх ности кантилевера в то время, когда его сторона, покрытая золотом, оставалась не модифицированной. Установлено, что время процесса агрегации соседних молекул ковалентно иммобилизованного монослоя лизоцима на золоте при комнатной тем пературе и pH = 3,0 составляет 14 часов, после чего в монослое возникает плотная сетка фибриллярных образований. Как известно, агрегация в объеме происходит в тех же условиях при более высокой температуре, 57 оС.

Рис. 18. Зависимость от времени 0, а поверхностного натяжения плен Поверхностное натяжение,Н/м 0, ки лизоцима, находящейся а) на кремниевой и г) золотой поверх 0, б ностях кантилевера. б), в) Резуль -0, в 0 2 4 6 8 10 12 таты двух контрольных экспери -0, ментов, единственное отличие которых заключается в отсутст -0, вии этапа обработки кантилевера -0, лизоцимом, показаны соответст г -0, венно для золотой и кремниевой Время протекания процесса, ч поверхностей кантиливера.

Обнаружено также, что кинетический коэффициент развития латеральных напряжений в монослое лизоцима на модифицированной гидрофобной (золотой) поверхности в 4.6 раз выше, чем на модифицированной гидрофильной (кремниевой) поверхности (рис.18), что коррелирует с данными атомно-силовой микроскопии, согласно которым среднее количество фибрилл на указанных подложках различает ся в 5 раз (рис. 19). Таким образом, было установлено, что скорости роста фибрилл пропорциональны скоростям развития сил агрегации молекул лизоцима на поверх ностях с различными свойствами.

б) 4,5 ч. высота фибрилл 3.0±0.4 нм а) 1 мин., фибриллы отсутствуют в) 19 ч., плотная сетка фибрилл: более 30 на кадре г) после 16 ч., плотность фибрилл: 5±2 на кадре 13Х13мкм, высота фибрилл 3-10 нм 13Х13мкм Рис. 19. Изменение формы агрегатов лизоцима на гидрофобной поверхности золота а), б), в) и гидрофильной отрицательно заряженной поверхности слюды (кремния);

г) в различные моменты времени нахождения монослоя в буфере (pH = 3,0) при химической иммобилиза ции белка.

Для расчета силы взаимодействия двух соседних молекул лизоцима в пленке на основе экспериментальных данных (рис. 18а, г) использовалась модель гексаго нальной упаковки молекул в монослое (глава 7), состоящего из белковых глобул, каждая молекула которого взаимодействует с шестью соседними. Полученное зна чение силы взаимодействия составило 113 ± 24 пН, что близко к значению силы (FT4=64±16 пН), которую необходимо приложить к агрегату, состоящему из не скольких мономеров лизоцима T4 для того, чтобы разорвать связь между 21 и остатками одного мономера.

В главе 6 рассмотрена модель колебаний балки, закрепленной с одного кон ца, в свободном колебательном состоянии. Модель позволят численно рассчитывать изменения собственной частоты кантилевера при изменении массы, сосредоточен ной на его незакрепленном конце.

Глава 7 содержит новый метод оценки сил парных взаимодействий соседних белковых глобул в монослойной пленке, иммобилизованной на поверхности канти левера, с учетом принятия допущения о структуре пленки. В данной модели рас сматривается плотнейшая гексагональная упаковка белковых молекул на поверхно сти кантилевера (рис. 20).

Рис. 20. Модель плотнейшей гексаго нальной упаковки монослоя белка на поверхности кантилевера. Стрелками указаны направления действия сил межмолекулярных взаимодействий и результирующей силы, влияющей на поверхностное натяжение белковой пленки.

Результирующая сила взаимодействия Fрез, приходящаяся на одну молекулу белка и представляющая собой суммарный вклад со стороны двух соседних моле кул в эффективное поверхностное натяжение (рис. 20), рассчитывается по формуле Fрез = d, (1) где d – характерный линейный размер (диаметр) молекулы, – поверхностное на тяжение монослойной пленки. При расчете силы взаимодействия двух молекул F учитывалось, что при образовании плотнейшего монослоя, состоящего из белковых глобул, каждая молекула взаимодействует с шестью соседними. Из принятой моде ли плотнейшей гексагональной упаковки следует, что результирующая сила Fрез может быть разложена по базису сил парных взаимодействий молекул (рис. 20), то гда Fрез F2 =. (2) 2 cos( / 6) В главе 8 на основе мирового экспериментального опыта и новых данных атомно-силовой микроскопии белковых фибрилл, полученных в данной работе, предложена модель, описывающая механизм организации ковалентно иммобилизо ванных молекул на подложке в фибрилы.

Рис. 21. Качественная модель образования фиб рилл в монослое гексаго нально упакованных бел ковых молекул. а) Трех мерная модель, б) дву мерная модель сечения фибриллы.

Если считать молекулы сферами, прикрепленными к поверхности за один линкер (рис. 21б), то, опираясь на данные атомно-силовой микроскопии поверхно сти монослоя лизоцима на золоте, содержащего фибриллы (рис. 19б), можно пред положить, что в процессе агрегации происходит изменение конформации молекулы белка таким образом, что одна ее часть переходит непосредственно в фибриллу, а другая, находящаяся в частично денатурированном состоянии, остается вне ее же сткого стержня.

Выводы 1. Впервые произведен прямой контроль сил, действующих в монослойных плен ках группы серосодержащих соединений, во время их самоорганизации на золо той поверхности микрокантилевера. В низкомолекулярных пленках выявлены механизмы генерации латеральных сил, обусловленные гидрофобным и электро статическим взаимодействием между мономерами пленки. Показана связь сил, действующих в пленке, со структурой ее мономерного звена.

2. Впервые создан микрокантилеверный анализатор с рецептором из молекул бис 4-(2-пиридилметиленаминофинил)дисульфида, селективный к ионам тяжелых двухвалентных металлов – Co2+, Cu2+, Ni2+, образующих с этими молекулами хе латный комплекс. Показано, что механический изгиб кантилевера главным обра зом зависит от двух конкурирующих факторов: конформационных трансформа ций молекул в слое и изменения их зарядовой плотности. Определен порог чув ствительности сенсора – 10-7 М.

3. Разработаны методики ковалентной и физической иммобилизации белков на кремниевой и золотой поверхностях кантилевера. Впервые реализованы высоко селективные микрокантилеверные анализаторы на основе пары комплиментар ных биополимеров – пероксидазы хрена и IgG – с чувствительностью к несколь ким наномолям пероксидазы в литре буферного раствора. Показано, что кон формационные изменения молекул IgG при связывании с пероксидазой умень шают энтропию системы и генерируют аналитический сигнал деформаций кан тилевера.

4. Впервые проведена реакция диссоциации макромолекулярного комплекса анти тело–конъюгат (морфин-овальбумин) под действием морфина на поверхности кантилевера, показавшая, что скорость анализа морфина, по конкурентной схе ме, может быть выше, чем скорость прямого анализа, проводимого с помощью кантилеверных сенсоров, за счет резкого снятия напряжений в рецепторе (при десорбции молекул антител), возникающих при длительном процессе реоргани заций молекул рецепторного слоя.

5. Впервые произведен контроль агрегации молекул лизоцима, физически и кова лентно иммобилизированных на поверхности кантилевера и образующих плот ноупакованный монослой, посредством регистрации средних силовых напряже ний в пленке. Обнаружено что агрегация молекул в связанном состоянии на по верхностях золота, кремния и слюды происходит в условиях, при которых в объ еме они не агрегируют.

6. Построена универсальная модель изгиба кантилевера при взаимодействии субъ единиц пленки, имеющих плотнейшую упаковку, которая позволяет произво дить расчет средней силы их парных взаимодействий. Предложена качественная модель, объясняющая возможность образования фибрилл из молекул белка, на ходящихся в связанном состоянии на поверхности.

Список публикаций по теме диссертации 1. Е.В. Украинцев, Г.А. Киселев, Д.В. Багров, П.В. Горелкин, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В. Яминский. Атомные весы: новые возможности исследо вания взаимодействия молекул // Датчики и системы, – 2007, – № 1 (номер подписан в печать 22.10.2006), – сс.18-21.

2. Е.В. Украинцев, Г.А. Киселев, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В. Ямин ский. Формирование фибрилл лизоцима на твердой подложке в условиях, при которых они не образуются в растворе // Высокомолекулярные соединения, – 2007, – том 49, – № 1, – сс.125-129 (публикация принята к печати 24.08.2006).

3. E. Beloglazkina, A. Majouga, N. Zyk, R. Rakhimov, I. Yaminsky, P. Gorelkin, G.

Kiselev, A. Kutateladze. Bis-(4-(2-pyridylmethyleneiminophenyl))disulfide — A chelating ligand capable of self assembly on gold surface and its complexes with M(BF4)2 and M(ClO4)2;

M – Co, Cu and Ni. Experimental and theoretical study // Thin solid films, – 2007,– Vol.515, – No.11, – pp.4649-4661.

4. I. Yaminsky, P. Gorelkin, G. Kiselev. Concurrence of Intermolecular Foces in Monolayers // Japanese Journal of Applied Physics, – 2006, – Vol.45, – No.3B, – pp.2316-2318.

5. Г.А. Киселев, Д.В. Багров, П.В. Горелкин, И.В. Яминский. Сенсор на основе атомно-силового микроскопа // Сенсор, – 2005, – No.4, – сс.22-26.

6. I.V. Yaminsky, G.A. Kiselev. Scanning Probe Microscopy of Biomacromolecules:

Instrumentation and Experiments, in "Frontiers of Multifunctional Integrated Nanosystems" // Ed. by E. Buzaneva, P. Schraff. Kluwer Academic Publishers, – 2003, – pp.221-228.

7. И.В. Яминский, Г. А.Киселев, А.С. Филонов. Программа управления много функциональным биосенсорным устройством – «Фемтоскан Бионайн» // Сви дейтельство об официальной регистрации программы ЭВМ №2005612859.

Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товар ным знакам, Москва, – 2005.

8. Яминский И.В., Киселев Г.А., Филонов А.С. Аппаратура и методы наноско пии для биологии и медицины. // Международная Конференция "Биотехно логия и медицина", Москва, – 2006, – c.21.

9. Киселев Г. А., Яминский И.В. Атомные весы, как основа биологических и химических сенсоров. // Международная Конференция "Биотехнология и ме дицина", Москва, – 2006, – c.26.

10. I. Yaminsky, P. Gorelkin and G. Kiselev. Concurrence of Intermolecular Forces in Monolayers. // 13th International Conference on Scanning Tunneling Micros copy/Spectroscopy and Related Techniques in conjunction with 13th International Colloquium on Scanning Probe Microscopy. Sapporo, Japan, – 2005. – p.327.

11. Яминский И.В., Киселев Г.А. Разработка биологических и химических сенсо ров на базе микрокантилеверов. // Международный конгресс "Биотехнология:

состояние и перспективы развития". Материалы конгресса, часть 1, Моск ва, – 2005. – с.168.

12. Киселев Г.А., Мешков Г.Б., Горелкин П.В., Багров Д.В., Дубровин Е.В., Ло моносов А.М., Филонов А.С., Лебедева О.В., Киселева О.И., Яминский И.В., Виноградова О.И. Механические свойства полиэлектролитных композитных нано/микроструктур: от нанокапсул и нанотрубок к вирусам. // Малый поли мерный конгресс, Москва, – 2005, с. 24.

13. Г.А. Киселев, П.В. Горелкин, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В. Ямин ский. Универсальный сенсор на основе атомно-силового микроскопа. // Ма лый Полимерный Конгресс, Москва, – 2005, – с.94.

14. G.A. Kiselev, I.V. Yaminsky, G.F. Tereshenko. Chemical sensor on the basis of atomic force microscope. // Third International Symposium "Molecular Design and Synthesis of Supramolecular Architectures". Kazan, Russia, – 2004. – p.102.

15. Украинцев Е.В., Киселев Г.А., Кудринский А.А., Лисичкин Г.В., Яминский И.В. Изучение агрегации лизоцима, иммобилизированного на поверхности золота и слюды, с помощью кантилевера для атомно-силовой микроскопии // Третья всероссийская конференция «Химия поверхности и нанотехнология», Санкт-Петербург, – 2007, – сс.189-190.

16. Кудринский А.А., Киселев Г.А., Вертелов Г.К., Мягкова М.А., Яминский И.В., Лисичкин Г.В. Разработка микромеханического сенсора для определе ния морфина // Третья всероссийская конференция «Химия поверхности и нанотехнология», Санкт-Петербург, – 2007,– сс.260.

17. G. Kiselev, A. Kudrinskii, E. Ukraintsev, I. Yaminsky, G. Lisichkin Atomic Bal ance Observation of Protein Aggregation on a Cantilever Surface // International Conference on Nanoscience and Technology 2006, Swisserland, Basel, – 2006, – p.761.

18. Горелкин П.В., Киселев Г.А., Киселев Г.А., Мажуга А.Г., Белоглазкина Е.К., Зык Н.В., Яминский И.В. Исследование формирования заряженных пленок на твердых поверхностях // Четвертая всероссийская каргинская конференция, Москва, – 2007, – том 3, – с.107.

19. Горелкин П.В., Киселев Г.А., Яминский И.В. Универсальный прецизионный прибор для изучения физико-химических свойств тонких пленок // Четвер тая всероссийская каргинская конференция, Москва, – 2007, – том 3, – с.108.

20. Киселев Г.А., Горелкин П.В., Яминский И.В. Прецизионный анализ процес сов развития латеральных напряжений в тонких полимерных пленках на твердых поверхностях // Четвертая всероссийская каргинская конференция, Москва, – 2007, – том 2, – с.391.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.