авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

М.в. ломоносова химический факультет манцызов алексей борисович определение структуры, динамики и белок-белковых взаимодействий с-домена белка фактора терминации трансляции человека erf1 методом ямр с

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Манцызов Алексей Борисович

Определение структуры, динамики и белок-белковых

взаимодействий С-домена белка фактора терминации трансляции

человека eRF1 методом ЯМР спектроскопии в растворе

02.00.10 - биоорганическая химия

AВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Москва - 2010 Работа выполнена в Учебно-научном межфакультетском и междисциплинарном центре магнитной томографии и спектроскопии Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова Научный руководитель: доктор химических наук Польшаков Владимир Иванович Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Устынюк Юрий Александрович кандидат химических наук Бони Ирина Венедиктовна Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Наук Институт органической химии имени Н.Д.Зелинского Защита состоится 20 апреля 2010 года в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при химическом факультете МГУ по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1, НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан _ марта 2010 года Учёный секретарь совета, кандидат химических наук Смирнова И. Г.

Актуальность проблемы Биосинтез белка на рибосоме по матрице РНК (трансляция) является одним из важнейших биохимических процессов в клетке. Механизм трансляции находится в фокусе интенсивных исследований в течение последних пятидесяти лет. Актуальность таких исследований подтверждает, в частности, факт присуждения Нобелевской премии по химии 2009 года трем исследователям за их вклад в изучение структуры и функции рибосомы. Тем не менее, до настоящего времени установлены далеко не все детали механизма процесса трансляции.

Наибольшее количество нерешенных вопросов связано с процессом трансляции в эукариотах. В частности, не определены многие ключевые аспекты механизма остановки биосинтеза белка (терминации трансляции) при достижении стоп кодона мРНК. Известно, что ключевую роль в механизме терминации трансляции в клетках эукариот играют белки eRF1 и eRF3, называемые факторами терминации трансляции (eukaryotic Release Factor) первого и второго класса соответственно. Белок eRF1 проявляет структурно-функциональную мимикрию молекулы тРНК, и обеспечивает узнавание стоп-кодона, а также последующее освобождение синтезированного белка из терминационного рибонуклеопротеинового комплекса. Фактор терминации трансляции второго класса eRF3 является рибосомо- и eRF1-зависимой ГТФазой. Этот белок кодируется жизненно важным геном и необходим для стимулирования активности eRF1 и повышения эффективности процесса терминации. Трехмерная структура eRF1 человека была ранее определена в кристалле. Было, в частности, установлено, что белок состоит из трех доменов, соединенных гибкими линкерами. При этом каждый из доменов ответственен за определенную функцию. Так, N-терминальный домен играет ключевую роль в узнавании стоп кодона, обеспечивая строго специфическое взаимодействие eRF1 с каждым их трех возможных триплетов UAA, UAG и UGA. Средний (M) домен участвует в гидролизе связи между полипептидной цепью синтезированного белка и тРНК в пептидилтрансферазном центре 60S субъединицы рибосомы. Все функции С терминального домена до конца не установлены, но было показано, что этот домен участвует во взаимодействии с eRF3. Это позволяет предположить для него регуляторную роль в процессе терминации трансляции. Фрагмент eRF1, состоящий только из М и С-доменов способен связываться с рибосомой эукариот и индуцировать ГТФазную активность eRF3. В то же время, фрагмент, состоящий лишь из N и M доменов, сохраняет функциональную активность полноразмерного eRF1 in vitro.

Структура, динамика и функции C-домена eRF1 изучены значительно меньше чем N и M доменов белка. Так, в рентгеновских структурах полноразмерного eRF1, как в свободной форме, так и в комплексе с eRF3, С домен имеет обширные неразрешенные фрагменты. Очевидно, что установление структуры и исследование динамических свойств С-домена eRF1 необходимо для понимания его роли в механизме терминации трансляции и определения молекулярных аспектов регуляции этого процесса.

Цель работы Целью данной работы является изучение структуры в растворе, динамики и функций С-домена фактора терминации трансляции eRF1 человека. Для достижения указанных целей в работе были поставлены и решены следующие задачи:

1) Определение структуры высокого разрешения C-домена белка eRF1 в растворе методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР);

2) Экспериментальное определение динамических свойств белковой цепи C-домена eRF1 с помощью спектроскопии ЯМР;

3) Исследование молекулярной динамики и междоменных взаимодействий в eRF1 методом молекулярного моделирования in silico, с использованием полученных экспериментальных данных по структуре и динамике белка.

Научная новизна В работе впервые получены данные о структуре высокого разрешения C домена фактора терминации трансляции eRF1 человека в растворе. Впервые получены структурные данные для фрагмента 329-372 белка, не определенного ранее в кристалле. Установлено, что фрагмент 329-372 структурирован и формирует отдельный минидомен, существующий в виде двух конформеров с равной населенностью, медленно (в шкале времени от секунд до минут) переходящих друг в друга. Для каждого из конформеров определена структура высокого разрешения в растворе. Элементом новизны является сам факт определения структуры двух конформеров белка. Установлено также, что С терминальный фрагмент 414-437, не разрешенный, как и фрагмент 329-372, в кристаллической структуре eRF1, неструктурирован в растворе. Полученные семейства структур ЯМР для каждого из конформеров депонированы в банк данных белковых структур PDB (коды 2KTU и 2KTV).



Впервые методом ЯМР изучена динамика основной белковой цепи С домена eRF1 человека. Установлено, что амплитуда молекулярных движений структурированной части домена сравнительно невелика.

Исследована стабильность конформеров C-домена eRF1 при различной температуре, рН и ионной силе раствора. Показано, что при рН раствора ниже рКа протонирования имидазольного фрагмента гистидина белок неустойчив.

После рефолдинга белка из раствора с пониженным pH остается только один конформер.

Рассчитаны длинные (до 200 нс) траектории молекулярной динамики C домена eRF1 и исследованы факторы стабилизации мини-домена. Изучено влияние состояния протонирования имидазольного кольца гистидина на устойчивость конформаций белка. Рассчитаны траектории молекулярной динамики полноразмерного eRF1 с использованием полученных структур ЯМР фрагментов С-домена, не определенных в кристаллической структуре полноразмерного eRF1. Исследовано междоменное взаимодействие eRF1 и влияние на него конформационного состояния мини-домена и состояния протонирования имидазольных фрагментов остатков гистидина.

На основании полученных результатов установлены основные факторы стабилизации конформаций мини-домена и сделаны предположения о функциональной роли С-домена в процессе терминации трансляции.

Практическая значимость работы Полученные результаты дополняют имеющиеся данные о структуре eRF человека и представляют новую информацию об организации фрагментов белка, структура которых была неизвестна ранее. Установление структуры мини-домена 329-372 позволило исследовать детали молекулярного механизма междоменных взаимодействий в факторе терминации трансляции eRF1 человека методами молекулярной динамики и сделать рациональный выбор мутаций аминокислотных остатков в области мини-домена для исследования их влияния на уровень терминационной активности фактора. Результаты работы позволили расширить понимание молекулярных основ регуляции процесса терминации трансляции и выдвинуть новые экспериментально обоснованные предположения о функции C-домена eRF1 человека в этом процессе.

Апробация работы Основные положения данной работы и ее результаты были представлены на семи международных конференциях и научных школах:

1. International Youth Scientific School “Actual problems of magnetic resonance and its application”, 23-28 September, 2007, Kazan, Russia.

2. XV International Scientific Conference of Undergraduate, Postgraduate Students and Young Scientists “Lomonosov”, 8-11 April, 2008, Moscow, Russia.

3. EUROMAR 2008, 6-11 July, St. Petersburg, Russia.

4. International Conference “Advances in NMR of protein and nucleic acid molecular recognition”, 16-18 October, 2008, Murnau, Germany.

5. Joint NMR-life and Extended-NMR Meeting “New approaches to biomolecular structure determination”, 27-29, October, 2008, Berlin, Germany.

6. XVI International Scientific Conference of Undergraduate, Postgraduate Students and Young Scientists “Lomonosov”, 13-18 April, 2009, Moscow, Russia.

7. EMBO World Practical Course, “Structure and dynamics of biomolecules by NMR spectroscopy”, 21-30, September, 2009, Rosario, Argentina.

Публикации По материалам диссертационного исследования на момент подготовки автореферата опубликованы 1 статья в реферируемом журнале, 1 статья в сборнике трудов научной конференции и 5 тезисов докладов. 1 статья принята к печати в журнале FEBS Journal.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 125 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы (177 наименований).

Диссертация содержит 37 рисунков и 10 таблиц.

МАТЕРИАЛЛЫ И МЕТОДЫ Экспериментальная часть диссертации содержит подробное описание методик, использованных в работе, и условий проведения экспериментов.

Для экспрессии белка использовали плазмиду конструкции pET23b(+) (Novagen), содержащую ген белка C-eRF1 (аминокислотные остатки 276-437) с фрагментом, кодирующим аффинный таг из 6 гистидинов на С-конце.

Экспрессию проводили в минимальной среде М9 под контролем промотера РНК полимеразы фага T7. Выделение белка из супернатанта, содержащего растворимую часть клеточного лизата, осуществляли на Ni-NTA агарозной смоле, полученный белок далее очищали с помощью анионообменной хроматографии низкого давления на HiTrap SP колонках (GE Healthcare). Для получения образца, меченного изотопами 13С и/или 15N, использовали [13C6]-D-глюкозу и/или 15NH4Cl (Cambridge Isotope Laboratories Inc.) в качестве единственных источников углерода и/или азота при экспрессии белка в минимальной среде М9.

Концентрация белка в конечных образцах для измерения спектров ЯМР составляла ~1 мМ. Для поддержания постоянной величины рН 7.0 использовали 20 мМ фосфатный буфер. Для повышения стабильности образца ионную силу буферного раствора повышали, добавляя NaCl до концентрации 50 мМ. Для предотвращения окисления двух свободных остатков цистеина (в положениях и 335), добавляли -меркаптоэтанол. Азид натрия в концентрации 0.01% использовали для подавления бактериального заражения образцов.

Приготовленные образцы подвергали лиофилизации и хранили при –20 С. Перед проведением ЯМР экспериментов образец растворяли в 95% H2O / 5% D2O или в 99.95% D2O.

Спектры ЯМР измеряли на приборах Varian INOVA 600 и 800 MHz и Bruker AVANCE 600 и 700 MHz. Все спектрометры были оборудованы датчиками с возможностью одновременного возбуждения резонанса ядер 1H, 13C и 15N, детектирования сигналов ядер 1H и создания градиента магнитного поля по оси Z.

Спектрометры 700 и 800 MHz были оснащены высокочувствительными криодатчиками. Для накопления одного 3D спектра требовалось в среднем от до 72 часов. Проведено измерение серии 3D экспериментов ЯМР для отнесения сигналов атомов основной и боковых цепей белка (HNCO, HNCA, HN(CO)CA, HNCACB, CBCA(CO)NH, HNHAHB, HBHA(CO)NH и HNHA при 298К и HCCH TOCSY при 313К). Для определения межатомных расстояний были измерены спектры [1H,15N]-NOESY-HSQC (в 95% H2O) и [1H,13C]-NOESY-HSQC (в D2O).

Измерены константы остаточного диполь-дипольного взаимодействия (КДДВ) белка в различных разбавленных анизотропных средах.

Лиофилизированный образец белка, меченного изотопом 15N, растворяли в 5% водных растворах смесей 1,2-дигексаноил-sn-глицеро-3-фосфохолина с 1,2 димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолином (соотношение DMPC/DHPC = 3 – 3.5) или в 5% водных растворах смесей алкил-полиэтиленгликоля C12E5 с n гексанолом. Для изменения ориентирующих свойств жидкокристаллической среды бицеллы DMPC/DHPC модифицировали, добавляя к раствору отрицательно заряженный додецилсульфат натрия (SDS). Для измерения остаточных КДДВ накапливали спектры IPAP-[1H,15N] HSQC (In-Phase – Anti-Phase) полученных образцов в слабо ориентирующих средах, как в изотропных, так и в анизотропных условиях. Фазовый переход осуществляли путем изменения температуры среды и контролировали его по величине квадрупольного расщепления ядер дейтерия.

Значения остаточных КДДВ измеряли по разнице величин расщепления сигналов в изотропных и анизотропных условиях.

Расчет структуры проводили в программе CNS в картезианских координатах. Для поиска семейства структур, наилучшим образом удовлетворяющих экспериментально полученным пространственным ограничениям (см. ниже), применялся метод моделированного отжига, а также алгоритм Пауэла для завершающей минимизации энергии структуры. В расчете использовались три типа ограничений: (1) Расстояния между протонами, определенные из интенсивностей кросс-пиков в трехмерных спектрах NOESY HSQC;





(2) Диэдральные углы и, полученные из анализа величин химических сдвигов атомов C, C, H, HN и N белка CeRF1 с помощью программы TALOS;

и (3) Остаточные КДДВ между атомами HN и N основной белковой цепи, несущие информацию об ориентации амидных фрагментов. В результате проведенных расчетов получены семейства из 24 структур для каждого из конформеров C домена eRF1. Структуры депонированы в банк данных PDB.

Для исследования динамики атомов основной белковой цепи измеряли скорости продольной R1 и поперечной R2 релаксации, а также величины гетероядерных эффектов Оверхаузера 15N{1H}. Анализ полученных данных выполняли с использованием безмодельного подхода Липари и Сзабо в программе Tensor-2.

Стабильность конформеров белка изучали при различных значениях рН (в диапазоне от 3.5 до 8.0), температуры (от 278 до 313К) и ионной силы раствора (концентрация NaCl 50 и 100mM). Относительную населенность конформационных состояний определяли путем сравнения интенсивностей сигналов двух конформеров в 2D спектрах [1H,15N] HSQC.

Репрезентативные структуры рассчитанных семейств ЯМР C-домена eRF определяли по критерию максимального приближения к средним координатам атомов по семействам. Выбранные структуры далее использовали для расчета длинных (от 100 до 200 нс) траекторий молекулярной динамики (МД) в водном окружении в программном пакете Gromacs 4. Для обоих конформеров белка были рассчитаны траектории МД как при незаряженных остатках гистидина, так и с полностью протонированными имидазольными фрагментами всех гистидинов.

Поскольку в диапазоне рН от 4.7 до 7.0 гистидин является единственной аминокислотой, которая может менять состояние протонирования боковой группы (рКа 6.0), расчет динамики для двух различных состояний имидазольного кольца моделировал поведение белка в слабо кислой и нейтральной средах.

Исходные структуры для расчета траекторий МД полноразмерного eRF были подготовлены путем достройки кристаллической структуры полноразмерного eRF1 недостающими фрагментами мини-домена 329-372 и C терминального фрагмента 414-437 взятых из репрезентативных структур ЯМР.

Далее были рассчитаны 4 траектории по 60 нс для открытого и закрытого конформеров, как для протонированного, так и для нейтрального состояний имидазольных фрагментов остатков гистидина.

Все расчеты проводились при температуре 300К. Перед началом расчета все структуры были минимизированы по алгоритму скорейшего спуска и далее уравновешены в растворителе (воде) с помощью метода динамики с ограниченными позициями (position restrained dynamics).

РЕЗУЛЬТАТЫ Отнесение сигналов в спектрах ЯМР Отнесение сигналов атомов C-домена eRF1 человека проводили по классическому методу, основанному на использовании гетероядерных 3D экспериментов ЯМР с переносом намагниченности посредством непрямого спин спинового взаимодействия. Для отнесения сигналов атомов основной цепи использовали 3D спектры HNCA, HN(CO)CA и HNCO, для отнесения сигналов боковых цепей - спектры HCCH-TOCSY, HNCACB и CBCA(CO)NH.

Получены значения химических сдвигов 99% атомов 1H, 13C и 15N основной белковой цепи. Не удалось сделать отнесение лишь сигналов 1H и 15N амидных фрагментов остатков Asp277, Asn325 и Glu397, что связано с существенным перекрыванием сигналов на частотах резонанса этих ядер. Для атомов боковых цепей получено отнесение более 78% сигналов 1H, 13C и 15N.

Обнаружено удвоение сигналов для остатков находящихся во фрагменте 329-372 (а именно 333-344, 351 и 357-370, рис. 1). Этот факт является прямым доказательством присутствия двух конформаций белка в области мини-домена 329-372, который не был ранее разрешен в кристаллической структуре eRF1.

Время конформационого перехода между двумя состояниями белка оказывается медленнее секунд или минут. Вместе с тем, следует отметить, что разделить два конформера методом гель-фильтрации не удается. Это может быть обусловлено либо тем, что скорость конформационного перехода лежит в минутной шкале времени, либо (что более вероятно) тем, что физические свойства двух конформеров слишком близки для их разделения этим методом.

Для большинства остатков мини-домена 329-372 разница химических сдвигов между удваивающимися сигналами достаточно велика (Рис. 2), что позволило получить отнесение сигналов для каждого конформера в отдельности.

Рисунок 1. Фрагмент спектра [1H,15N]- Рисунок 2. Величины разницы х.с.

HSQC. Обозначены удваивающиеся между конформерами для сигналов HN (А), Н (В) и 15N (С) основной сигналы. Сигналы второго конформера отмечены символом*. белковой цепи.

Структура C-домена фактора терминации трансляции eRF1человека Статистическая характеристика семейств структур ЯМР, включая величины средних квадратичных отклонений (СКО) координат атомов, представлена в таблице 1.

Рисунок 3. Репрезентативные структуры семейств открытого (А) и закрытого (Б) конформеров.

Детальный анализ NOESY спектров позволил идентифицировать ряд ограничений на межатомные расстояния, различающиеся для двух конформеров белка. Кроме того, было установлено, что в 5% растворе фосфолипидных бицелл DMPC/DHPC присутствует только один из конформеров (далее «открытый», Рис.

3А), тогда как в разбавленной анизотропной среде, приготовленной на основе смеси C12E5/n-гексанол, обнаружен только второй конформер (далее «закрытый», Рис. 3Б). Это обстоятельство позволило получить величины остаточных КДДВ индивидуально для каждого конформера C-eRF1 и на основании полученных данных определить их структуры.

Таблица 1. Статистические характеристики полученных семейств структур ЯМР C домена eRF1 человека.

Ограничения, использованные в расчетах Открытый Закрытый Открытый Закрытый 1857 1852 90 Всего ЯЭО КДДВ DNH Дальние (|i-j|4) 497 Средние (1|i-j|4) 332 332 216 Диэдральные углы На соседние остатки Phi () 516 516 108 (|i-j|=1) Внутри одного Psi () 512 514 108 остатка Нарушения ограничений (для ансамблей из 24 структур) Отсутствуют нарушения ограничений на расстояния и диэдральные углы более чем на 0.2 A и 50 соответственно.

Среднее СКО по ансамблю Открытый Закрытый Для экспериментальных ограничений Расстояния (A) 0.017±0.001 0.019±0. Диэдральные углы ( ) 0.42±0.06 0.4±0. Для ковалентной геометрии Связи (A) 0.0022±0.0001 0.0025±0. Углы ( ) 0.43±0.01 0.49±0. % остатков в наиболее благоприятной области карты 91.1% 85.5% Рамачандрана % остатков в запрещенной 0 области карты Рамачандрана Суперпозиция структур семейства на репрезентативную структуру СКО по атомам C, C, O и N остатков основной цепи 277- 0.42 0. 328 и 373-413 (A) Изображение репрезентативных структур двух рассчитанных семейств приведено на рисунке 3. В структурах обоих конформеров можно выделить три основных фрагмента: (1) структурное ядро белка (остатки 277-328 и 373-413) (2) мини-домен 329-373;

и (3) неструктурированный С-терминальный фрагмент 414 437.

Структура основного ядра белка идентична в обоих конформерах. Она образована четырьмя -тяжами 1, 2, 6 и 7 (остатки 301-303, 320-323, 389- -структуру белка, и 409-412 соответственно) формирующими единую окруженную четырьмя -спиралями 1, 2, 4 и 5 (остатки 278-294, 305-313, 374-381 и 397-405 соответственно).

Структура мини-домена 329-372, координаты атомов которого отсутствуют в известных кристаллических структурах eRF1 человека (коды PDB 1DT9 и 3E1Y), сформирована тремя антипараллельными -тяжами 3, 4 и 5 (остатки 329-335, 339-344 и 367-372 соответственно) и искаженной -спиралью (остатки 348-356). Установлено, что элементы вторичной структуры мини-домена 329-372 для обоих конформеров практически идентичны. Наиболее существенными структурными различиями между конформерами являются положение искаженной -спирали по отношению к -структуре и сопутствующий сдвиг петли 357-366 (Рис. 4). Положение боковой группы остатка His 356 также существенно отличается: в одном из конформеров (называемом «закрытым») имидазольный фрагмент пространственно сближен с отрицательно заряженными боковыми группами Glu 365 и Glu 367 (рис. 4Б), тогда как в другом конформере (называемом «открытым») боковая группа His356 расположена вблизи Asp353 и ароматических колец Tyr 331 и Phe 357 (рис. 4A).

Рисунок 4. Структура мини-домена 329-372 Рисунок 5. Фрагменты 1 в открытом (А) и закрытом (Б) конформерах. спектров [ H, N]-NOESY Указаны ограничения на расстояния, HSQC открытого (левый) и соответствующие пикам с существенно закрытого (правый) отличающейся интенсивностью для конформеров, в которых открытого и закрытого конформеров. наблюдаются различия в интенсивностях сигналов.

Различные ориентации петли 357-366 по отношению к искаженной спирали соответствуют различным конформациям основной цепи Phe (величины диэдральных углов составляют -60o ± 3o () и -38o ± 4o () в открытом конформере и +57o ± 3o () и +6o ± 4o () – в закрытом), что полностью согласуется с наблюдаемыми различиями в интенсивностях ЯЭО HN357- HN358 в спектрах NOESY. Перестройка конформации основной цепи приводит к изменению расстояний между атомами остатков верхнего витка искаженной спирали, что также соответствует изменению ЯЭО в спектрах (Рис. 5). Наиболее существенно меняется расстояние между атомами HN358 - H355: кросс пик наблюдается только для открытого конформера, в то время как ЯЭО HN358 - H наблюдается в обоих случаях.

Структура петли 358-363 идентична в обоих конформерах, что подтверждается большим количеством интенсивных ЯЭО, соответствующих контактам между удаленными по цепи аминокислотными остатками.

Конформация петли стабилизируется водородной связью между кислородом карбонильной группы Asp 359 и протонами HN Thr 362 и Gly 363, а также гидрофобным взаимодействием метильных групп остатков Thr 358 и Thr 362 и CH2 протонов остатка Asp 359 (Рис. 6).

Наблюдаемые температурные эффекты Повышение температуры от до 313К ведет к существенному снижению интенсивности кросс пиков ЯЭО от HN Gly 337, а также ЯЭО между атомами HN Thr358 H His356 и H Thr338 - HN Glu339 в открытом конформере. При этом интенсивности аналогичных сигналов в закрытом конформере остаются неизменными. Такой эффект для сигналов Gly337 можно объяснить увеличением скорости обмена Рисунок 6. Структура петли 358-363. амидного протона с водой. Этот вывод Пунктиром обозначены водородные подтверждается наблюдением стабилизации интенсивного обменного сигнала связи, важные для между резонансом HN Gly 337 и воды.

структуры петли.

Уменьшение интенсивности кросс пиков между соседними остатками для Thr338 и Thr358 обусловлено динамическими процессами. Указанные данные свидетельствуют о том, что при повышенной температуре петля 336-338, а также фрагмент 356-358 в открытом конформере оказываются более подвижными, чем в закрытом.

Для остатков His334, Leu368, Ile369 и Glu370 наблюдается существенное сужение линий и повышение интенсивностей сигналов HN кросс пиков при увеличении температуры от 298 до 313К. Данный эффект объясняется ростом скорости конформационного обмена с повышением температуры, т.к. для этих остатков не обнаружено кросс пиков HN-растворитель. His334 находится на центральном тяже -листовой пластины мини-домена и пространственно сближен с остатками Leu368, Ile369 и Glu370, что объясняет одинаковый характер конформационных перестроек, происходящих в остатках, находящихся далеко друг от друга в аминокислотной последовательности белка.

Исследование стабильности конформеров В спектрах [1Н,15N]-HSQC наблюдалась незначительная разница в интенсивностях пиков различных конформеров в зависимости от образца, что является свидетельством приблизительно одинаковой населенности обоих состояний. Было проведено исследование стабильности конформеров в зависимости от температуры, ионной силы и рН раствора.

Обнаружено, что в диапазоне температур от 278 до 313K, а также при увеличении концентрации NaCl в растворе от 50 до 100мМ оба конформера остаются стабильными, и сдвиг равновесия в сторону какой-либо одной формы не наблюдается. При изменении рН раствора в диапазоне от 6.0 до 8.0 также не наблюдается изменений населенности конформеров, однако, при понижении рН ниже 6.0 происходит медленная агрегация, которая существенно ускоряется при рН ниже 5.4. Процесс преципитации обратим, однако после рефолдинга белка из кислого раствора (рН 3.5) в смеси наблюдается только закрытый конформер.

Важно отметить, что рН 6.0 соответствует рКа протонирования боковой группы имимдазольного кольца остатков гистидина. В аминокислотной последовательности C-eRF1, используемой при экспресси белка, присутствует три остатка гистидина - 335, 356 и 366 в области мини-домена (если не считать аффинный таг из 6-ти гистидинов на C конце). Можно предположить, что состояние протонирования боковой группы остатка гистидина оказывает влияние как на баланс населенности конформеров белка, так и на их стабильность.

Также обнаружено, что относительная населенность конформационных состояний высоко чувствительна к природе ориентирующий среды, используемой для измерения КДДВ: в среде C12E5/n-гексанол устойчив лишь закрытый конформер, тогда как в DMPC/DHPC присутствует 90% открытого конформера.

Динамические свойства белковой цепи C-домена eRF Экспериментально определены релаксационные параметры ядер 15N (R1, скорость продольной релаксации;

R2, скорость поперечной релаксации и величины гетероядерных ЯЭО 15N{1H}). Рассчитаны параметры тензора вращательной диффузии. Экспериментальным данным наилучшим образом удовлетворяет модель полностью асимметричного тензора. Использование безмодельного подхода Липари-Сзабо позволило определить характер движений и параметры порядка для 15N атомов основной цепи белка, которые отражают амплитуду движения атомов 15N в пико-наносекундной шкале времени.

Полученные величины параметров порядка приведены на рисунке 7.

Анализ данных показал, что наиболее подвижным фрагментом C-eRF1, помимо неструктурированного С-терминального фрагмента, является петля 357 366. Важно отметить, что существенных отличий между конформерами в величинах R1, R2 и 15N{1H} ЯЭО, измеренных при 298К, не наблюдается. Это означает примерно равную подвижность атомов основной цепи в двух состояниях при температуре измерений. Для атомов в области 357-359 наблюдается значительный вклад компоненты химического обмена в процесс релаксации (рис.

7Д). Это наблюдение согласуется со структурными данными, в соответствии с которыми основные конформационные изменения претерпевает именно этот фрагмент белковой цепи мини-домена.

Рисунок 7. Результаты релаксационных экспериментов (А-В) и рассчитанные из этих данных параметры порядка S2 (Г) и вклады конформационного обмена в скорость поперечной релаксации Rex (Д) для C-домена eRF1 человека.

Расчет молекулярной динамики С-домена eRF В связи с наблюдаемыми эффектами влияния рН среды на стабильность конформеров, представлялось необходимым провести расчет длинных (до 200 нс) траекторий молекулярной динамики C-домена eRF1 для каждого из конформеров белка и изучить влияние состояние протонирования боковых групп остатков гистидина на структуру и стабильность конформеров.

Все четыре рассчитанные траектории МД были стабильны в течение всего времени, что определялось по отсутствию значимых колебаний энергии, температуры, объема и плотности системы белка и растворителя.

При незаряженных имидазольных фрагментах остатков гистидина (рН 7.0) перехода между двумя конформационными состояниями белка не наблюдалось.

Однако, в моделях с положительно заряженными боковыми группами гистидина открытый конформер переходил в закрытый в течение первых двух наносекунд.

Конформационный переход определялся по изменению положения боковой группы остатка His356, которое однозначно характеризует каждый из конформеров. Вслед за изменением положения имидазольного кольца происходило постепенное изменение положения искаженной -спирали. Вместе с тем, закрытый конформер с положительно заряженными боковыми группами гистидинов оставался стабильным до конца траектории МД (т.е. до 200 нс).

Этот результат согласуется с экспериментальными данными, согласно которым после рефолдинга из кислой среды остается только закрытый конформер.

Конформация основного структурного ядра белка (остатки 277-328 и 373 413) не претерпевала существенных изменений для обоих конформеров при каждом из двух значений рН среды. Об этом свидетельствуют низкие значения СКО при суперпозиции по всем тяжелым атомам основной цепи белка структур, соответствующих различным участкам траектории МД.

Конформация мини-домена 329-372 более лабильна. Его -структура остается практически неизменной во всех траекториях, однако -спираль, петля 357-366 и петля 336-338 проявляют значительную подвижность. При этом следует отметить тот факт, что в отсутствии протонирования остатков гистидина, петля 336-338 оказывается более подвижной в открытом конформере. Это наблюдение находится в полном соответствии с экспериментальными данными.

Действительно, ЯЭО между H338 и HN339, а также все сигналы от HN становятся менее интенсивными в открытом конформере при повышении температуры. Это указывает на меньшую стабильность этого структурного элемента в открытом конформере. Искаженная -спираль также оказывается более подвижна в открытом конформере. В то же время подвижность петли 357 366 оказывается несколько выше в закрытом конформере.

Протонирование остатков гистидина приводит к образованию более жесткой структуры мини-домена 329 - 372, что выражается в снижении СКО координат атомов белковой цепи. Важно отметить то, что во всех четырех рассчитанных траекториях фрагмент, содержащий остаток His356, показывает сравнительно низкие значения СКО, что подтверждает предположение о важной структурирующей роли этого аминокислотного остатка.

С-терминальный неструктурированный фрагмент белка претерпевает высокоамплитудные движения, однако на некоторых участках траектории МД этот фрагмент располагался вдоль структурного ядра белка и удерживался там за счет зарядовых взаимодействий. Это взаимодействие приводило к некоторому искажению структуры белкового ядра, причем искажение оказывалось более заметным в моделях с протонированными остатками гистидина.

Анализ динамики C-домена eRF1 методом разложения молекулярных движений на главные компоненты (Principal component analysis) показал, что все движения в белке можно условно разделить на два класса: 1) взаимное колебание основного структурного ядра белка и мини-домена 329-372 друг относительно друга как жестких фрагментов;

и 2) колебания отдельных фрагментов молекулы.

Расчет молекулярной динамики полноразмерного eRF Все четыре траектории МД были стабильны на всем протяжении расчета.

Как и при расчете траекторий МД изолированного C-домена, оба конформера были устойчивы в случае незаряженных остатков гистидина. При появлении положительного заряда на остатках гистидина только закрытый конформер оказался стабилен. Во всех случаях, когда наблюдалось взаимодействие мини домена 329-372 с N-доменом eRF1, интерфейс такого взаимодействия формировался главным образом аминокислотными остатками -спирали 348-356, в то время как -ядро (остатки 329-335, 339-344, 367-372) находились на удалении от N-домена eRF1.

A Б В Рисунок 8. Конформации eRF1 из траектории МД. (A) Стартовая модель eRF1 с закрытой конформацией мини-домена 329-372, (Б) Стартовая модель eRF1 с открытой конформацией мини-домена 329-372, (В) Закрытый конформер с протонированными остатками гистидина в конце траектории МД (60 нс).

Непротонированные остатки гистидина Структуры eRF1 как открытого, так и закрытого конформеров в отсутствии заряда на имидазольных фрагментах остатков гистидина не претерпевают существенных конформационных перестроек. Однако в этом случае взаимодействие мини-домена 329-372 с N-доменом eRF1 наблюдается только для закрытого конформера. Это обусловлено различиями в ориентации искаженной альфа-спарали 348-356 в двух конформерах (рис. 8, А и Б). В закрытом конформере остатки Q350, E351 и D353 этого фрагмента оказываются пространственно сближены с заряженными остатками R81, K106, K108 и K109 N домена eRF1, что приводит к электростатическому взаимодействию между ними.

Важно отметить, что в ЯМР спектрах наблюдалось удвоение сигналов остатка E351.

Из анализа траектории молекулярной динамики видно, что взаимодействие мини-домена 329-372 с N-доменом eRF1 в закрытом непротонированном конформере ведет к отдалению, но не сближению, фрагментов NIKS-GGQ за счет сближения N и C доменов белка.

Положительно заряженные остатки гистидина При введении положительного заряда на все имидазольные фрагменты остатков гистидина открытый конформер переходит в закрытый во время молекулярной динамики. Структура закрытого конформера при этом претерпевает существенные конформационные изменения, которые ведут к сближению фрагмента NIKS в N-домене с трипептидом GGQ в M-домене (Рис.

8В). Так, расстояние между атомами C остатков Ile62 и Gln185 изменяется от 97.47 в начале расчета до 62.44 в конце траектории МД. Мини-домен 329- играет существенную роль в этом процессе. Этот вывод следует из следующих результатов:

1. Конформационная перестройка молекулы eRF1, приводящая к сближению фрагментов NIKS и GGQ, наблюдается только в случае протонированных (т.е.

положительно заряженных) остатков гистидина.

2. Конформационная перестройка наблюдается только для закрытого конформера мини-домена 329-372. На траектории МД, где в качестве стартовой структуры была использована протонированная форма открытого конформера (переходящего в ходе молекулярной динамики в закрытый конформер) изменения взаимной ориентации N и M доменов eRF1 не наблюдалось. Это обусловлено тем, что за время перехода мини-домена 329-372 из открытой формы в закрытую, он успевает удалиться от N-домена.

3. Взаимодействие мини-домена 329-372 с N-доменом eRF1 наблюдалось только на первых 30 нс траектории, после чего начиналась медленная конформационная перестройка всей молекулы eRF1, приводящая к сближению фрагментов NIKS и GGQ.

Таким образом, взаимодействие доменов eRF1, является важным регулирующим элементом для конформационной перестройки белка. Следует также отметить, что интерфейс взаимодействия мини-домена 329-372 с N-доменом eRF различается для протонированной и непротонированной формы белка (табл. 2).

Таблица 2. Остатки, формирующие интерфейс взаимодействия мини-домена 329-372 с N-доменом eRF1.

Закрытый/непротонированный Закрытый/протонированный конформер конформер Мини-домен Мини-домен N-домен N-домен 329-372 329- Gln80, Arg81, Lys352, Lys354, Gln350, Glu351, Ser23, Glu103, Lys106, Lys108, Ser355, His356, Asp353, (Lys354) Glu104, (Lys106) Lys109, Asn111 Ser ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Сравнение структуры С-домена eRF1 в растворе и в кристалле На данный момент в банке данных PDB имеется две структуры C-домена eRF1 человека - свободный белок (1DT9), и в комплекс с eRF3 (3E1Y). Обе структуры получены методом рентгеновской кристаллографии. В этих моделях хорошо разрешено центральное ядро C-домена (а.о. 277-328 и 373-413).

Структуры двух конформеров C домена eRF1 в растворе, полученные методом ЯМР, хорошо согласуются в области центрального ядра белка с обеими рентгеновскими структурами (СКО при суперпозировании по атомам С, C и N фрагментов 277-328 и 373-413 репрезентативной структуры каждого конформера на рентгеновскую структуру 1DT9 составляет 1.58 ± 0.06 ). Вместе с тем, следует отметить, что в структурах eRF1 в кристалле координаты атомов мини домена 329-372 не определены. Таким образом, полученные в данной работе модели С-домена eRF1 человека впервые содержат информацию об этом фрагменте белка. Кроме того, впервые удалось установить и сам факт существования двух конформационных состояний eRF1 в растворе.

Стабилизация конформеров С-домена eRF Населенность двух конформационных состояний C-домена eRF1 в растворе приблизительно равна, что следует из анализа интенсивностей сигналов ЯМР каждого из конформеров. Следовательно, энергии образования конформеров также приблизительно равны. Вместе с тем, энергетический барьер перехода между двумя конформерами велик, что следует из того факта, что времена жизни двух конформеров оказываются дольше секунд или даже минут. Точно оценить энергетические параметры не представляется возможным, поскольку при нагревании белка до температуры 313K не наблюдается коалесценции сигналов ЯМР или даже заметного их уширения.

Можно было предположить, что существование двух конформеров белка обусловлено процессами цис-транс изомеризации остатков пролина, как это достаточно часто встречается. Действительно, мини-домен eRF1 содержит два остатка пролина в положениях 348 и 372. Однако удвоения сигналов ЯМР не наблюдается ни для указанных остатков пролина ни для соседних с ними аминокислотных остатков.

Другим фактором, способствующим стабилизации двух конформационных состояний белка, может являться взаимодействие боковых групп полярных аминокислотных остатков, которыми насыщен мини-домен 329-372. Из полученных экспериментальных данных следует, что для стабилизации закрытого конформера особенно важную роль играет взаимодействие имидазольного фрагмента остатка His356 с карбоксильными группами Glu365 и Glu367. В структуре открытого конформера боковая группа His356 сближена с карбоксильной группой Asp353 и ароматическими фрагментами остатков Tyr и Phe357. Таким образом, конформация открытой формы может быть стабилизирована как за счет -стэккинг взаимодействия Tyr331-His356-Phe357, так и за счет полярного взаимодействия с карбоксильной группой остатка Asp (Рис. 4). В связи с высокой подвижностью мини-домена 329-372 определить положения боковых групп аминокислотных остатков с высокой точностью не представлялось возможным. Вместе с тем, последующий расчет траекторий МД позволил проверить все выдвинутые на основании данных спектроскопии ЯМР предположения in silico.

Так, было установлено, что на всей траектории расчета МД прямые полярные взаимодействия боковых групп аминокислотных остатков мини-домена или взаимодействия через молекулу растворителя играют ключевую роль в определении взаимной ориентации элементов вторичной структуры. Эти взаимодействия оказались важны и для стабилизации структуры петли 357-366 и -спирали 348-356.

Фиксация имидазольного фрагмента His356 играет ключевую роль в определении ориентации -спирали 348-356 относительно -листовой пластины мини-домена. В структуре закрытого конформера имидазольное кольцо этого остатка участвует во взаимодействии с полярными группами а.о. 357-366 (как основной белковой цепи, так и боковых заместителей). Наиболее значимым оказывается взаимодействие имидазольного фрагмента His356 с карбоксильными группами Glu 365 и Glu 367 (Табл. 3, Рис. 9, А). При протонировании остатка His356 это взаимодействие усиливается, что приводит к сближению верхнего витка искаженной -спирали 354-356 с -листом 367-372 и формированию водородной связи CO355···HN368. Важным фактором структурной стабилизации оказывается и -стэккинг взаимодействие ароматических систем остатков Tyr и Phe357, которое, однако, ослабляется при введении положительного заряда на имидазольные группы остатков гистидина.

Открытый конформер устойчив только при отсутствии протонирования остатков гистидина. В этом случае имидазольный фрагмент His356 ориентирован между ароматическими системами Tyr331 и Phe357 и располагается в гидрофобном кармане внутри структуры мини-домена (Табл. 3, Рис. 9, Б). Таким образом, положение His356 в открытом конформере стабилизируется в значительной степени за счет стэкинг взаимодействия ароматических систем. При введении положительного заряда, протонированному имидазольному кольцу His356 гидрофобное окружение кармана становится менее выгодно, что приводит к конформационной перестройке белка в закрытую форму, в которой боковая группа His356 позиционируется в окружение полярных остатков и при этом может быть эффективно гидратирована.

Агрегация белка при понижении рН ниже рКа имидазольного фрагмента остатков гистидина может быть обусловлена присутствием последовательности из шести гистидинов на C конце белка. Это предположение согласуется с результатами расчетов траектории МД: введение положительного заряда на остатки гистидинов в модельной структуре, содержащей только один гистидин на C конце, приводит к искажению конформации основного структурного ядра белка в результате взаимодействия C терминального гистидина с отрицательно заряженными аминокислотными остатками центральной части C домена eRF человека.

Рисунок 9. Стабилизация положения имидазольного кольца гистидина 356 в закрытом (А) и открытом (Б) конформерах по данным расчета молекулярной динамики. Линиями показаны наблюдаемые взаимодействия.

Таблица 3. Средние по траектории молекулярной динамики расстояния () между некоторыми группами боковых цепей остатков мини-домена 329-372 1).

Закр./ Закр./ Откр./ Откр./ нейтр. прот. нейтр. прот.

His356 - Glu365 5.4 5.1 15.7 9. His356 - Glu367 7.0 8.8 13.8 10. Phe357 - Tyr331 5.0 9.4 7.9 5. Phe357 - His356 9.8 10.5 5.1 9. His356 - Tyr331 12.8 14.5 6.0 13. 1) Для расчета расстояний использованы центры ароматических систем остатков His, Phe и Tyr и центр карбоксильной группы остатков Glu.

Исследование динамики атомов основной цепи С-домен фактора терминации трансляции eRF1 человека имеет достаточно сложную картину молекулярных движений. Анализ параметров релаксации ядер N показывает, что основное структурное ядро белка оказывается относительно жестким в растворе в широком интервале характеристических времен движений (от пикосекунд до секунд). Эти данные находятся в согласии с результатами рентгеновской кристаллографии для динамики белка в кристалле, а также подтверждаются расчетами молекулярной динамики. Мини-домен 329-372 eRF более подвижен. Этот фрагмент существует в растворе в двух конформационных состояниях, причем переход между ними происходит в шкале времени от секунд и медленнее. Однако, амплитуды быстрых движений атомов основной белковой цепи мини-домена (в шкале времени от пс до нс) сравнительно невелики, о чем свидетельствуют большие величины параметра порядка S2, близкие по своим величинам к аналогичным значениям структурного ядра C домена eRF1.

Наиболее подвижными участками мини-домена 329-372 оказываются петли 333-339 и 357-366. Подробный анализ релаксационных данных для фрагмента 335-339 оказался невозможным из-за перекрывания сигналов в спектрах корреляции ядер 15N и 1H, однако аналогичные параметры для фрагмента 357- удалось измерить и проанализировать. Как видно из рисунка 7, петля 357- оказывается наиболее подвижным участком C-домена eRF1, если не считать C терминальный неструктурированный «хвост» белка. Для этой петли характерны и более медленные движения, соответствующие конформационным перестройкам, протекающим в миллисекундной шкале. Об этом свидетельствуют величины Rex, соответствующие вкладам химического обмена в скорость поперечной (спин спиновой) релаксации ядер 15N аминокислотных остатков 357-359 (рис. 7Д).

Других значимых конформационных переходов, протекающих в милисекундной шкале времени, как и движений основной цепи белка со временами корреляции порядка 1 наносекунды, обнаружено не было. Не удалось также обнаружить и существенных различий в относительной подвижности двух конформеров C-домена eRF1. Полученные экспериментальные данные хорошо согласуются с результатами расчета молекулярной динамики.

Предполагаемая функциональная роль мини-домена 329-372 eRF Существует несколько белков, способных связываться с eRF1. Недавно было показано, что один из таких белков, фосфатаза PP2A, взаимодействует с областью 338 – 381 eRF1, которая почти точно соответствует минидомену. PP2A не влияет на эффективность процесса терминации трансляции, но играет важную роль в близко связанном процессе – NMD (nonsense-mediated decay), т.е.

разрушении мРНК, в которой стоп-кодон в результате ошибки транскрипции находится в середине кодирующей последовательности. Многие детали того, каким образом eRF1 участвует этом процессе, еще предстоит установить.

Основным партнером eRF1 в процессе терминации трансляции является фактор терминации второго класса eRF3. Однако было показано, что интерфейс взаимодействия eRF1 с eRF3, включает в себя кластер гидрофобных остатков Phe291, Ile294, Tyr301, Phe303 и Phe406, расположенных в удалении от мини домена 329-372. Вместе с тем, полученные структурные данные указывают на вероятную близость мини-домена к N-домену eRF1, ответственному за узнавание стоп-кодонов. Проведенные расчеты молекулярной динамики полноразмерного белка eRF1 показали, что мини-домен 329-372 действительно способен взаимодействовать с N доменом eRF1. Полученные результаты позволили предложить места точечных замен аминокислотных остатков мини-домена для определения их роли в процессе терминации трансляции. Исследование, проведенное в лаборатории структурно-функциональной геномики ИМБ РАН (зав. лаб. Л.Ю. Фролова) показало, что замены аминокислотных остатков, находящихся на верхушке мини-домена 329-372 на аланин, влияют на специфичность узнавания стоп-кодонов. Было установлено, в частности, что мутации Y331A, H356A, F357A, D359A, G363A и E365A приводили к увеличению терминационной эффективности eRF1 при узнавании стоп кодона UAG, не влияя заметным образом на обработку стоп-сигналов UAA и UGA. При этом было показано, что такое изменение специфичности узнавания стоп кодонов обусловлено прямым взаимодействием мини-домена с N доменом и не связано с регуляторным действием eRF3.

Взаимодействие мини-домена 329-372 с N доменом eRF1 может также оказывать влияние на подвижность трех доменов eRF1 друг относительно друга и вызывать конформационные перестройки внутри молекулы белка. Как было показано выше, регуляторами таких конформационных перестроек могут быть состояние протонирования остатков гистидина и конформация мини-домена 329 372. Расстояние между фрагментом NIKS в N домене (вероятным центром узнавания стоп кодона) и трипептидом GGQ в M домене (ответственном за гидролиз связи пептидил-тРНК) в кристаллической структуре eRF1 по меньшей мере на 20 превышает расстояние между антикодоном и аминоацильной группой в тРНК. Многие исследователи предполагают, что для успешного функционирования eRF1 должна менять свою конформацию при образовании терминационного комплекса. Описанные выше расчеты МД позволили наблюдать именно такое изменение конформации белка, стимулированное состоянием протонирования остатков гистидтина и конформацией мини-домена 329-372.

Полученные данные позволяют выдвинуть предположение о роли мини-домена, как конформационного переключателя, способного влиять как на специфичность узнавания стоп-кодонов, так и на эффективность образования терминационного комплекса.

ВЫВОДЫ 1. Проведено отнесение 99% сигналов ЯМР ядер 1H, 13C и 15N основной белковой цепи и более 78% сигналов 1H, 13C и 15N боковых цепей аминокислотных остатков С-домена фактора терминации трансляции eRF1 человека. Результаты отнесения депонированы в международный банк данных BioMagResBank (код 15366).

2. Установлено, что C-домен eRF1 человека существует в растворе в виде двух конформеров с приблизительно равной населенностью. Изучено влияние температуры, рН и ионной силы раствора на стабильность конформеров.

Установлено, что при понижении рН ниже величины рКа имидазольных фрагментов гистидина, происходит денатурация белка. Рефолдинг белка из кислой среды приводит к образованию лишь одного конформера.

3. Определены структуры ЯМР высокого разрешения в растворе двух конформеров C-домена eRF1 человека. Координаты атомов депонированы в банк белковых структур (коды 2KTU и 2KTV). Получены структуры обоих конформеров мини-домена 329-372, отсутствовавшего в опубликованных ранее рентгеновских структурах eRF1 человека. Установлена роль остатка His356 в структурной стабилизации конформеров.

4. Методом ЯМР исследованы динамические свойства основной белковой цепи C-домена eRF1 человека. Установлено, что мини-домен 329-372 претерпевает медленные (в шкале времени от мс до минут) конформационные перегруппировки. В то же время, амплитуда движений белковой цепи мини домена в шкале времени от пс до нс сравнительно невелика, и лишь немного превышает подвижность атомов основного структурного ядра белка (а.о. 277 328 и 373-413).

5. Для определения факторов стабилизации двух конформационных состояний мини-домена 329-372 и роли протонирования остатков гистидина в структурных перестройках белка, проведен расчет длинных (до 200 нс) траекторий молекулярной динамики C-домена eRF1 и полноразмерного белка.

Установлено, что конформационное состояние мини-домена и состояние протонирования остатков гистидина стимулируют изменение взаимной ориентации доменов eRF1.

6. Полученные результаты позволили спланировать проведение функциональных исследований роли мини-домена 329-372 eRF1 в механизме терминации трансляции. Совокупность полученных данных позволяет предполагать, что мини-домен играет роль конформационного переключателя, способного влиять как на специфичность узнавания стоп-кодонов, так и на эффективность образования терминационного комплекса.

Материалы работы изложены в следующих публикациях 1. A.B.Mantsyzov, E.V.Ivanova, B.Birdsall, P.M.Kolosov, L.L.Kisselev, V.I.Polshakov, 2007, NMR assignments of the C-terminal domain of human polypeptide release factor eRF1, Biomol. NMR Assign., 1 (2), p. 183-185.

2. A.B.Mantsyzov, E.V.Ivanova, B.Birdsall, P.M.Kolosov, L.L.Kisselev, V.I.Polshakov, NMR assignments of the C-terminal domain of human polypeptide release factor eRF1. Materials of the International Youth Scientific School “Actual problems of magnetic resonance and its application”, 23- September, 2007, p. 137-139, Kazan, Russia.

3. А.Б.Манцызов, Е.В.Иванова, Б.Бирдсалл, Л.Л.Кисселев, В.И.Польшаков, ЯМР отнесения и исследование структуры С-терминального домена фактора терминации трансляции человека eRF1. Сборник тезисов XV конференции конференция студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов”, 8-11 Апреля, 2008, с. 281, Москва, Россия.

4. A.B.Mantsyzov, E.V.Ivanova, B.Birdsall, P.M.Kolosov, L.L.Kisselev and V.I.Polshakov, NMR assignments and structure investigation of the C-terminal domain of human polypeptide release factor eRF-1. The proceedings of international conference EUROMAR, 6-11 July, 2008, p. 118, St. Petersburg, Russia.

5. A.B.Mantsyzov, E.V.Ivanova, B.Birdsall, P.M.Kolosov, L.L.Kisselev and V.I.Polshakov, Structure determination of the C-terminal domain of human polypeptide release factor eRF-1 by NMR spectroscopy. The proceedings of international conference of the International Conference “Advances in NMR of protein and nucleic acid molecular recognition”, 16-18 October, 2008, p. 16, Murnau, Germany.

6. A.B.Mantsyzov, E.V.Ivanova, B.Birdsall, P.M.Kolosov, L.L.Kisselev and V.I.Polshakov, Structure determination of the C-terminal domain of human polypeptide release factor eRF-1 by NMR spectroscopy. The proceedings of international conference of the Joint NMR-Life and Extended-NMR Meeting “New approaches to biomolecular structure determination”, 27-29, October, 2008, p. 9, Berlin, Germany.

7. А.Б.Манцызов, Е.В.Иванова, Б.Бирдсалл, Л.Ю.Фролова, В.И.Польшаков.

ЯМР структура С-домена белка фактора терминации трансляции человека eRF-1 в растворе. Сборник тезисов XVI конференции конференция студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов”, 13-18 апреля, 2009, с. 21, Москва, Россия.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.