авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Синтез адресных липоконъюгатов для изучения направленной доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени

На правах рукописи

Шмендель Елена Васильевна

СИНТЕЗ АДРЕСНЫХ ЛИПОКОНЪЮГАТОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ НАПРАВЛЕННОЙ

ДОСТАВКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В КЛЕТКИ-МИШЕНИ

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2013

Работа выполнена на кафедре химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А. Преображенского федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова"

Научный руководитель Доктор химических наук, доцент Маслов Михаил Александрович

Официальные оппоненты Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, Костров Сергей Викторович профессор, директор, заведующий Отделом молекулярных основ биотехнологии и белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН Кандидат химических наук, научный сотрудник Болдырев Иван Александрович лаборатории химии липидов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Институт органической химии

Ведущая организация им. Н.Д. Зелинского РАН

Защита диссертации состоится "23" декабря 2013 г. в 14.00 часов в аудитории М-119 на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий имени М. В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу:

119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

Автореферат разослан «22» ноября 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,  кандидат химических наук, старший научный сотрудник А.И. Лютик     ОБЩАЯ ХАРАКТИРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В последние десятилетия предложен новый подход к терапии наследственных и приобретенных заболеваний, который основан на коррекции генетических нарушений с помощью терапевтических нуклеиновых кислот (НК). По химической природе НК являются полианионами и не способны самостоятельно проникать через биологические мембраны в пораженные клетки (клетки-мишени). Для решения этой проблемы создаются системы доставки НК, которые можно подразделить на биологические (вирусы) и искусственные (липосомы, полимеры). Вирусные системы переносят НК с высокой эффективностью, реализуя заложенные в их природе механизмы. Однако для них характерны иммуногенность, онкогенность, способность переносить НК ограниченного размера и высокая стоимость. Искусственные системы доставки НК лишены этих недостатков, но к настоящему времени не создано еще ни одной системы, сравнимой по эффективности с вирусными векторами.

Одним из важных требований, которые предъявляют к современным невирусным системам доставки, является способность направленно переносить НК в специфические клетки-мишени, что позволяет, с одной стороны, повысить эффективность таких систем, а с другой - уменьшить их неспецифическое поглощение здоровыми клетками, что должно положительно отразиться на безопасности систем доставки.

Известно, что на мембранах клеток определенных органов и тканей экспонированы специфические рецепторы, которые селективно распознают, связывают и поглощают молекулы (лиганды) определенного строения. Так, асиалогликопротеиновые рецепторы гепатоцитов связывают молекулы с терминальными остатками D-галактозы и N-ацетил-D-галактозамина, рецепторы дендритных клеток распознают остатки D-маннозы. Кроме того, различные патологические состояния могут характеризоваться повышенной экспрессией рецепторов определенного типа. Например, на мембранах опухолевых клеток при раке яичников, матки, толстой кишки, молочной железы, легких и почек, так же как и при опухолях, метастазирующих в головной мозг, наблюдается гиперэкспрессия фолатных рецепторов, которые селективно связывают и поглощают молекулы фолиевой кислоты. Таким образом, модификация поверхности липосомальных систем доставки НК лигандами, которые узнаются и связываются рецепторами клеток-мишеней, позволяет осуществить направленную доставку НК к месту ее терапевтического воздействия с помощью механизма рецептор-опосредованного эндоцитоза.

Данная работа посвящена синтезу липоконъюгатов, содержащих в качестве адресных лигандов остатки фолиевой кислоты или углеводов, конструированию с их помощью     липосомальных систем доставки НК и исследованию их способности осуществлять направленный транспорт НК в клетки-мишени.

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре ХТБАС им. Н.А. Преображенского МИТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках тематического плана "Фундаментальные исследования в области синтеза, изучения свойств природных биологически активных соединений и их аналогов с целью создания лекарственных субстанций для лечения социально значимых заболеваний человека", а также в рамках ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" (госконтракт П715) и грантов РФФИ 09-03-00874-а, 10-03-00995-а и 13-04-40183-н комфи.

Целью работы является разработка подходов к синтезу липоконъюгатов, содержащих в качестве лигандов к специфическим рецепторам клеток-мишеней фолиевую кислоту, D-галактозу или D-маннозу, включение их в состав адресных липосомальных систем доставки НК и исследование их биологических свойств.



Научная новизна работы. Разработаны подходы и осуществлен синтез новых фолат- и углеводсодержащих липоконъюгатов, предназначенных для модификации катионных липосом с целью придания им направленности к определенным рецепторам клеток-мишеней.

Полученные липоконъюгаты, различающиеся типами лигандов, спейсерных и линкерных групп, использованы для создания адресных липосомальных систем доставки НК. Установлена зависимость трансфицирующей активности фолатсодержащих адресных липосом от структуры и количественного содержания в них адресных липоконъюгатов. Выявлены соотношения между количеством НК и адресных катионных липосом, необходимые для осуществления рецептор-опосредованного переноса НК. Показано, что липосомы, в состав которых входит 1.5% фолатсодержащего липоконъюгата с 20-звенным этиленгликольным спейсером, обеспечивают наиболее эффективную направленную доставку НК. С помощью маннозилсодержащих липосом осуществлена эффективная трансфекция незрелых дендритных клеток и их CD11c+ предшественников.

Практическая значимость. Предложены удобные подходы к получению фолат- и углеводсодержащих липоконъюгатов и получены 15 новых соединений в количествах, необходимых для проведения расширенных биологических испытаний. Разработана двухстадийная процедура, включающая твердофазную экстракцию и колоночную хроматографию на силикагеле, которая позволяет успешно выделять фолатсодержащие липоконъюгаты. На основе синтезированных липоконъюгатов созданы адресные липосомальные системы доставки НК к специфическим клеткам-мишеням, а исследование их трансфицирующей активности позволило выявить перспективные системы для дальнейшего осуществления направленной доставки НК в условиях in vivo.

    Основные положения, выносимые на защиту 1. Синтез новых липоконъюгатов, содержащих в качестве лиганда фолиевую кислоту, D-галактозу и D-маннозу.

2. Создание на основе синтезированных липоконъюгатов адресных катионных липосом и изучение их цитотоксичности и трансфицирующей активности.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на III, IV и V молодежной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии»

(Москва, 2009, 2011, 2013), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), XIV Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии – 2012» (Тула, 2012).

Публикации. По результатам работы опубликовано 8 печатных работ, в том числе статьи в ведущих отечественных научных журналах.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы ( ссылок). Работа проиллюстрирована 24 рисунками и содержит 5 схем и 6 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Направленная доставка НК в клетки-мишени может быть реализована при использовании катионных липосом, в состав которых входит липидный конъюгат с лигандом, селективно распознающимся и связывающимся специфическими клеточными рецепторами.

Такой липоконъюгат состоит из гидрофобного домена, связанного спейсерной группой с терминальным адресным лигандом (рис. 1). В качестве гидрофобного домена, обеспечивающего встраивание конъюгата в липидный бислой, был использован остаток 1,2-ди O-тетрадецил-rac-глицерина, который ранее применялся в нашей лаборатории для синтеза компонентов липосомальных систем доставки НК. Известно, что длина и природа спейсерной группы определяют доступность лиганда для последующего взаимодействия с рецептором.

Поэтому получение липоконъюгатов с гидрофобными и гидрофильными спейсерами различной длины (рис. 1) позволит в дальнейшем изучить влияние данного структурного элемента на эффективность доставки НК. В качестве адресных лигандов нами были выбраны:

фолиевая кислота, проявляющая высокую специфичность к фолатным рецепторам опухолевых клеток, D-галактоза, селективно связывающаяся с асиалогликопротеиновыми рецепторами гепатоцитов, и D-манноза, которая является лигандом для рецепторов дендритных клеток.

Присоединение лиганда к гидрофобному домену может быть осуществлено с использованием различных химических методов. Однако наибольшее распространение     получил подход, основанный на создании биосовместимой амидной связи. Данный способ связывания предполагает наличие терминальной аминогруппы в составе одного из компонентов и карбоксильной группы в составе другого. Для упрощения синтеза мы стремились ограничиться минимумом ключевых предшественников (синтон А и Б, рис. 1).

Поскольку в молекуле фолиевой кислоты, выбранной в качестве лиганда, имеется карбоксильная функция, то для ее связывания с гидрофобным доменом необходимо предварительно получить синтон А с терминальной аминогруппой.

Рисунок 1. Подходы к синтезу адресных липоконъюгатов.

Связывание синтона А с функционализированным моносахаридом, содержащим первичную аминогруппу, можно осуществить с использованием диэтилового эфира квадратной кислоты. Синтон А возможно также трансформировать в синтон Б, который содержит терминальную карбоксильную группу. Последний, в свою очередь, полезен для получения гликоконъюгатов II типа путем создания амидной связи с аминосодержащими углеводными лигандами.

Таким образом, синтез целевых липоконъюгатов можно разделить на два основных этапа: присоединение спейсерной группы к гидрофобному домену и введение терминального адресного лиганда.

1. Синтез липоконъюгатов с адресными лигандами различных типов 1.1. Присоединение спейсерной группы к 1,2-ди-O-тетрадецил-rac-глицерину Получение ключевого синтона с терминальной аминогруппой (синтон А, рис. 1) осуществляли введением спейсерных групп различной длины и природы в молекулу                                                              Строение всех полученных впервые соединений однозначно подтверждено методами спектроскопии ЯМР 1H и 13С, а также масс-спектрометрии.





    диалкилглицерина 3. Для этого использовали два подхода: производное 1,2-ди-O-тетрадецил rac-глицерина 4, предварительно полученное обработкой соединения 4-нитрофенилхлорформиатом, вводили во взаимодействие с монозамещенными производными диаминов 2a-f или с незащищенными диаминами 1a-g (схема 1).

Схема Реагенты и условия: (а) CF3COOEt, -80 C или 0 C, 30 мин;

(b) Boc2O, Et3N, 0 C, 1 ч, а затем 24 С, ч или 8.5 ч;

(c) NaOH, 60 C или 24 C, 18 ч;

(d) 4-NO2C6H4OCOCl, Et3N, 24 °С;

(e) Et3N, 24–45 °С;

(f) 4 M HCl, диоксан, 0 °С, (g) NH2-X-NH2 (1a-g), Et3N, 24 °С, 1 ч;

(h) янтарный ангидрид, Et3N, CH2Cl2, 24 °C.

Для получения моно-Boc-защищенных диаминов 2 применяли известный метод, состоящий во взаимодействии диаминов с эквимольным количеством этилтрифторацетата с последующим блокированием оставшейся аминогруппы действием ди-трет-бутилдикарбоната и селективном удалении трифторацетильной защиты щелочным гидролизом. Соединения 2b,d были получены с выходом 32% по трем стадиям. Для увеличения выхода защищенных диаминов 2 нами были модифицированы условия реакции введения и удаления трифторацетильной защиты (изменена температура и использован больший избыток NaOH), и в результате были получены соединения 2a, 2c и 2e-f с выходами 40 - 69%.

Взаимодействие производного диглицерида 4 с моно-Boc-защищенными диаминами 2a-f протекало с образованием соединений 5a-f, удаление Boc-защитных групп в которых 4 М раствором HCl в диоксане приводило к синтонам 6a-f с терминальной аминогруппой с суммарными выходами 23 - 56%.

Другой подход к синтезу соединений 6a-g, основанный на взаимодействии производного диглицерида 4 с 2-кратным избытком незащищенных диаминов 1a-g (схема 1),     позволил получить синтоны 6a-g в одну стадию с выходами 57 - 73%. Таким образом, реализация данного подхода позволила сократить количество стадий синтеза, время и затраты на получение ключевых синтонов 6a-g, а также увеличить их выходы в 1.5 - 2 раза.

Для синтеза гликоконъюгатов II типа был получен синтон с терминальной карбоксильной группой (синтон Б, рис. 1), обработкой соединения 6b янтарным ангидридом с образованием карбоксилсодержащего производного 7 с выходом 97%.

Таким образом, на данном этапе в структуру 1,2-ди-O-тетрадецил-rac-глицерина были введены спейсерные группы различной длины и природы, что привело к синтонам 6a-g и 7 (А и Б, рис. 1), содержащим терминальные амино- и карбоксильную группы для дальнейшего присоединения по ним адресных лигандов.

1.2. Связывание адресных лигандов с функционализированными диглицеридами 1.2.1. Синтез фолатсодержащих липоконъюгатов Синтез фолатсодержащих липоконъюгатов осуществляли взаимодействием синтонов 6a-g с фолиевой кислотой (ФК) в присутствии N,N,N’,N’-тетраметил-O-(бензотриазол-1-ил)уроний тетрафторбората (TBTU) и диизопропилэтиламина (DIPEA) (схема 2). Поскольку полученные фолатные липоконъюгаты 8a-g обладают ярко выраженными амфифильными свойствами, процесс их очистки с использованием обычной колоночной хроматографии на силикагеле не позволяет выделить соединения в индивидуальном состоянии.

Схема Реагенты и условия: (a) ФК, TBTU, DIPEA, 45 C, 2 ч.

Нами была разработана двухстадийная процедура2 очистки соединений 8a-g, которая включает твердофазную экстракцию в градиентном режиме в системе растворителей CHCl3 MeOH-водный NH3 и колоночную хроматографию на силикагеле. Благодаря твердофазной экстракции из реакционной смеси удалялись ДМСО и избыток ФК, а колоночная хроматография позволила избавиться от TBTU и других продуктов реакции. В результате новые фолатсодержащие липоконъюгаты 8a-g были выделены с выходами 39 - 68%.

                                                             совместно с к.х.н., ст. преп. кафедры БТ и БНТ Ереминым С.В.

    1.2.2. Синтез гликоконъюгатов Для синтеза гликоконъюгатов со спейсерными группами различной длины и типа было разработано два подхода. Первый основан на использовании хемоселективного реагента диэтилскварата, который позволяет связать друг с другом две молекулы - синтон А и производные углевода с терминальными аминогруппами. Второй подход построен на взаимодействии синтона Б, содержащего терминальную карбоксильную группу, с аминопроизводными углеводов с образованием амидной связи.

Для осуществления этих подходов необходимо было предварительно модифицировать углеводы спейсерами с терминальной аминогруппой (схема 3).

Схема Реагенты и условия: (a) 2,3,4,6-тетра-О-ацетил--D-галактопиранозилбромид, CdCO3, C6H6, 80 °С или 2,3,4,6-тетра-О-ацетил--D-маннопиранозилбромид, Hg(CN)2, CH2Cl2, 24 °С;

(b) NaN3, DMF, 80 С;

(с) 4 М HCl, диоксан, 0 °С;

(d) 10% Pd/C, NH4+HCOO-, MeOH, TsOH, 65 С.

Для синтеза галактозида 11a в качестве исходного соединения использовали 6-(трет бутоксикарбониламино)гексанол (9a), который вводили во взаимодействие с 2,3,4,6-тетра-О ацетил--D-галактопиранозилбромидом в условиях модифицированного метода Кенигса– Кнорра (при использовании в качестве промотора CdCO3), получая -гликозид 10а с выходом 43%. Присутствие в спектре ЯМР 1H сигнала аномерного протона с химическим сдвигом H 4.37 м.д. и КССВ J1,2 = 7.9 Гц, а в спектре ЯМР 13C сигнала аномерного атома углерода с химическим сдвигом C 100.78 м.д. указывает на -конфигурацию гликозидной связи. После удаления трет-бутоксикарбонильной защитной группы действием 4 М раствора HCl в диоксане получили соединение 11a с выходом 97%.

В синтезе маннозида 11b был использован другой подход, основанный на гликозилировании 6-хлоргексанола (9b) 2,3,4,6-тетра-О-ацетил--D-маннопиранозилбромидом по методу Гельфериха в присутствии Hg(CN)2 в качестве промотора (схема 3). После колоночной хроматографии был получен -маннозид 10b с выходом 40%. -Конфигурация аномерного центра была подтверждена данными спектроскопии ЯМР. Так, в спектре ЯМР 1H присутствовал сигнал аномерного протона с химическим сдвигом H 4.73 м.д. и КССВ J1,2 =     1.8 Гц, а в спектре ЯМР 13C сигнал аномерного атома углерода имел химический сдвиг C 97. м.д., и КССВ 1JC-1,H-1 = 166 Гц.

Замена атома хлора в соединении 10b на азидную группу действием азида натрия и последующее восстановление азидной группы каталитическим гидрированием на 10% Pd/C в присутствии NH4+HCOO- и TsOH давало соединение 11b с выходом 34% по двум стадиям.

Связывание синтонов 6a-f с галактозидом 11a осуществляли путем последовательного замещения этоксигрупп в молекуле диэтилскварата (схема 4). Для этого сначала проводили взаимодействие аминов 6a-f с диэтилскваратом с образованием соединений 12a-f, которые затем реагировали с углеводной составляющей 11a, давая конъюгаты 13a-f с выходами 50-89%.

Нами было отмечено, что увеличение времени реакции и использование избытка галактозида 11a приводило к повышению выходов соединений 13a-f. Удаление ацетильных групп по методу Земплена действием 0.1 М раствора MeONa в MeOH давало целевые галактозилсодержащие конъюгаты 14a-f3 с высокими выходами.

Схема Реагенты и условия: (a) 3,4-диэтоксициклобут-3-ен-1,2-дион, Et3N, 24 °С;

(b) соединение 11a, Et3N, 24– 40 °С;

(f) 0.1 M MeONa/MeOH, 24 °С.

Маннозилсодержащий конъюгат 16 был получен связыванием гликозида 11b, содержащего при аномерном центре спейсер с терминальной аминогруппой, и синтона 12b с терминальным фрагментом этилскварата и с последующим деблокированием гидроксильных групп углеводного остатка (схема 5).

Взаимодействие маннозида 11b с синтоном 7, содержащим терминальную карбоксильную группу, в присутствии конденсирующего агента O-(бензотриазол-1-ил) N,N,N',N'-тетраметилуроний гексафторфосфата (НВТU) приводило к соединению 17.

Последующее удаление ацетильных групп действием MeONa в MeOH давало целевой маннозилсодержащий конъюгат 18 с выходом 45% по двум стадиям.

                                                             Для подтверждения структуры соединений 14a-f и отнесения сигналов протонов углеводного остатка была использована двумерная гомоядерная корреляционная спектроскопия ЯМР (1H,1H-COSY).

    Схема Реагенты и условия: (a) соединение 12b, Et3N, CH2Cl2, 24 °C;

(b) 0.1 М MeONa/MeOH, 24 °C;

(c) соединение 7, HBTU, DIPEA, DMF, 24 °C.

Таким образом, в ходе данного этапа работы осуществлен синтез 15 новых липоконъюгатов, содержащих различные адресные лиганды (фолиевую кислоту, D-галактозу, D-маннозу) к рецепторам клеток-мишеней. Данные липоконъюгаты различаются длиной и природой спейсерных групп, разделяющих в пространстве гидрофобный домен и адресный лиганд. Полученные соединения предназначены для создания в дальнейшем адресных липосомальных систем доставки НК в эукариотические клетки.

2. Создание и исследование свойств адресных липосомальных систем доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени Создание новых адресных липосомальных систем доставки НК в эукариотические клетки предусматривает проведение комплекса биологических исследований, посвященных изучению их токсичности и трансфицирующей активности (эффективности транспорта НК).

Такие исследования позволяют выявить оптимальный состав и соотношение компонентов систем доставки, а также условия, обеспечивающие лиганд-опосредованный перенос НК.

В нашей работе в качестве основных компонентов липосомальной системы доставки НК были выбраны поликатионный амфифил 2X3, ранее синтезированный в нашей лаборатории, и цвиттер-ионный липид 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), взятые в мольном соотношении 1:2. Для придания липосомам направленности к клеткам-мишеням в их                                                              Эксперименты по исследованию биологических свойств адресных липосом выполнены автором в Лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ИХБФМ CO РАН под руководством д.б.н. проф.

Зенковой М.А.

    состав включали 0.5%, 1%, 1.5% фолат- (8a, 8d, 8e и 8g) и 2.5%, 5%, 10% маннозилсодержащих (16 и 18) липоконъюгатов5. Для приготовления катионных липосом (КЛ) использовали метод гидратации липидной пленки с последующим озвучиванием на ультразвуковой бане в течение 15 мин при 75 °С. Также нами были получены "обычные" катионные липосомы L, состоящие из 2X3 и DOPE в соотношении 1:2 и не содержащие адресных липоконъюгатов6.

Следует отметить, что липоконъюгаты фолиевой кислоты 8a, 8d, 8e и 8g и D-маннозы 16 и 18 содержат спейсерные группы различной природы и длины, что позволяет изучить влияние спейсера на эффективность доставки НК.

2.1. Определение цитотоксичности адресных катионных липосом Цитотоксичность липосом оценивали с помощью MTT-теста через 24 ч инкубации их с клетками эпидермиальной карциномы человека (KB-3-1) и почки эмбриона человека (НЕК 293). Как видно из приведенных данных (рис. 2) в случае клеток КВ-3-1 при концентрации липосом L-8a, L-8d, L-8e и L-8g 10 мкМ наблюдалось заметное уменьшение количества жизнеспособных клеток (до 65% по сравнению с контролем). Дальнейшее увеличение концентрации липосом приводило к постепенной гибели клеток. Однако значения                                                              Пример обозначения адресных липосом: L-8a/0.5, где L - липосома, 8a - номер адресной компоненты, 0.5 - количественное содержание адресной компоненты в %.

Образование липосом подтверждали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии.

    концентрации IC50, при который выживают 50% клеток, были достигнуты только для липосом L-8d/1.5 и L-8g/1.5 и соответствовали ~80 мкМ (табл. 1). Клетки НЕК 293 были менее чувствительны к воздействию липосом: их жизнеспособное количество составляло 60-100% в диапазоне концентраций от 1 до 80 мкМ (табл. 1). Следует отметить, что количество живых клеток KB-3-1 и НЕК 293 в области рабочих концентраций, при которых проводится изучение доставки НК (1-8 мкМ), оставалось на уровне 90%.

Таблица 1. Количество (в %) жизнеспособных клеток КВ-3-1 и HEK 293 через 24 ч после инкубации с липосомами (80 мкМ).

Катионные KB-3-1 HEK липосомы 86.0 ± 9.1 103.3 ± 2. L 68.1 ± 4.3 104.5 ± 2. L-8a/0. 75.1 ± 5.0 86.1 ± 11. L-8a/1. 67.1 ± 7.4 98.1 ± 7. L-8a/1. 64.0 ± 11.5 65.0 ± 5. L-8d/0. 66.5 ± 3.4 96.8 ± 4. L-8d/1. 52.5 ± 0.8 86.8 ± 6. L-8d/1. 76.0 ± 4.5 79.6 ± 8. L-8e/0. 82.2 ± 7.5 95.7 ± 9. L-8e/1. 63.5 ± 1.8 88.7 ± 6. L-8e/1. Рисунок 2. Цитотоксическое действие фолат 77.2 ± 6.0 79.2 ± 1. L-8g/0. содержащих липосом L-8a/1.5 (), L-8d/1.5 (), L 77.4 ± 3.7 79.1 ± 2. L-8g/1. 8e/1.5 () и L-8g/1.5 () на жизнеспособность 48.5 ± 3.5 86.9 ± 2. L-8g/1. клеток КВ-3-1.

- 88.0 ± 12. L-16/2. - 69.6 ± 9. L-16/ - 87.2 ± 11. L-16/ - 60.0 ± 4. L-18/2. - 105.1 ± 12. L-18/ - 112.0 ± 12. L-18/ Таким образом, липосомы, сформированные на основе катионного амфифила 2X3, цвиттер-ионного липида DOPE и содержащие от 0.5% до 10% адресных липоконъюгатов малотоксичны для эукариотических клеток различного происхождения и могут быть использованы в качестве систем доставки НК.

2.2. Изучение трансфицирующей активности адресных катионных липосом Для оценки трансфицирующей активности (ТА) адресных липосом в качестве объектов для доставки в клетки были использованы: короткий 25-звенный олигодезоксирибонуклеотид, меченный по 5’-концу флуоресцеином (FITC-ODN) и плазмидная ДНК pEGFP-C2 (4700 п.о.), кодирующая зеленый флуоресцентный белок (EGFP) Оценку ТА фолатсодержащих липосом проводили на двух клеточных линиях (КВ-3-1 и HEK 293), на поверхности которых, согласно литературным данным, повышенно     экспрессируются рецепторы ФК. Для культивирования7 клеток использовали среду RPMI, содержащую в своем составе минимальное количество свободной ФК.

Для изучения доставки НК в эукариотические клетки предварительно формировали комплексы НК с липосомами (липоплексы), используя различные количественные соотношения компонентов P/N (соотношение количества отрицательно заряженных фосфатных групп НК к количеству положительно заряженных атомов азота поликатионного амфифила 2Х3). Доставку НК в клетки регистрировали с помощью проточной цитометрии, определяя количество клеток, в которые проникла НК (процент трансфицированных клеток), и количество FITC-ODN, попавшего в клетки, или уровень экспрессии EGFP, которые оценивали по среднему значению интенсивности флуоресценции клеток в популяции. Трансфицирующую активность липосом сравнивали с активностью коммерческого препарата Lipofectamine (Lf 2000, Invitrogene Inc.), который является «золотым стандартом» среди трансфицирующих реагентов.

2.2.1. Изучение влияния соотношения компонентов липоплексов на адресную доставку НК в эукариотические клетки Увеличение количества катионных липосом в составе липоплексов приводит к росту их суммарного поверхностного заряда. Положительный заряд способствует эффективному взаимодействию липоплексов с отрицательно заряженными компонентами плазматической мембраны клеток и запуску процесса неспецифического эндоцитоза. Адресная доставка НК основана на механизме специфического рецептор-опосредованного эндоцитоза, вклад которого в проникновение НК может быть нивелирован электростатическим взаимодействием положительно заряженного липоплекса с мембраной. Поэтому на первом этапе предстояло определить соотношение P/N, при котором происходит адресная доставка НК в клетки мишени. Для проведения этих исследований были выбраны липосомы L-8g/1.5, в состав которых входит фолатсодержащий липоконъюгат 8g, и "обычные" катионные липосомы L.

В экспериментах по доставке FITC-ODN с помощью "обычных" (L) и адресных (L-8g/1.5) липосом (рис. 3) количество трансфицированных клеток практически не зависело от соотношения P/N и составляло 80-100% (рис. 3A), тогда как в экспериментах по доставке плазмидной ДНК (рис. 3В) увеличение количества липосом в составе комплекса приводило к увеличению эффективности ее транспорта в клетки. В обоих случаях с увеличением количества липосом в липоплексе возрастал уровень средней интенсивности флуоресценции клеток в популяции (рис. 3Б, Г).

                                                             Во всех экспериментах инкубацию клеток проводили при 37 °С, 5% CO2 и в присутствии 10% эмбриональной бычьей сыворотки.

    Рисунок 3. Доставка FITC-ODN (A, Б) и плазмидной ДНК pEGFP-C2 (В, Г) с помощью катионных липосом в клетки КВ-3-1 в присутствии 10% сыворотки в культуральной среде. Процент трансфицированных клеток (A, В) и уровень средней интенсивности флуоресценции клеток в популяции (Б, Г) измеряли с помощью проточной цитометрии через 4 ч (А, Б) или 48 ч (В, Г) после инкубации клеток с липоплексами. Стандартное отклонение не превышает 7%.

Особого внимания заслуживают результаты экспериментов, полученные при соотношении P/N = 1/2, при котором наблюдаются достоверные различия между липосомами L и L-8g/1.5 как по количеству трансфицированных клеток (только в случае доставки плазмидной ДНК), так и по значению интенсивности флуоресценции: адресные липосомы L-8g/1.5 в 5 раз эффективнее доставляли FITC-ODN и в 3 раза - плазмидную ДНК по сравнению с "обычными" липосомами L в клетки КВ-3-1 (рис. 3Б, Г). Аналогичные результаты были получены при трансфекции клеток НЕК 293 (данные не приведены).

С использованием метода динамического лазерного светорассеяния нами было установлено, что по мере увеличения количества липосом в липоплексе происходит уменьшение их размера и изменение значений -потенциала от отрицательных (P/N = 1/1) к положительным (P/N = 1/4) (табл. 2). Это коррелирует с увеличением значений интенсивности флуоресценции клеток при доставке FITC-ODN и и ростом количества ДНК     трансфицированных клеток при доставке ДНК как для "обычных", так и для адресных катионных липосом. Можно предположить, что в случае адресных липосом доставка FITC-ODN и ДНК в составе отрицательно заряженных комплексов (P/N = 1/1) происходит в основном по механизму рецептор-опосредованного эндоцитоза, однако этот процесс протекает недостаточно эффективно вследствие большого размера комплексов (рис. 3). Кроме того, как показали результаты электрофореза, формирование липоплексов при соотношении P/N = 1/ приводит к неполному включению НК (рис. 4), что также уменьшает эффективность трансфекции.

Таблица 2. Гидродинамический диаметр и -потенциал комплексов КЛ с НК.

Комплексы FITC-ODN/КЛ Комплексы ДНК/КЛ КЛ P/N Диаметр, ИП -потенциал, P/N Диаметр, ИП -потенциал, нм мВ нм мВ 1/1 188.9 0.198 -25.2 1/1 360.9 0.429 -17. 1/1.5 171.3 0.219 - 1/2 177.7 0.180 49. L 1/2 125.1 0.226 36. 1/4 141.5 0.220 46. 1/4 114.0 0.307 1/1 275.33 0.191 -38.2 1/1 169.8 0.277 -13. 1/1.5 250.97 0.272 -4.5 1/2 180.4 0.198 48. L-8g/1. 1/2 112.43 0.198 42. 1/4 127.0 0.280 44. 1/4 115.47 0.195 55. ИП -индекс полидисперсности А Б Рисунок 4. Электрофореграммы комплексов адресных липосом L-8g/1.5 с НК, сформированных при различных соотношениях P/N, в нативных условиях на ПААГ (12%) (А) в буфере ТВЕ (0.1 М трис бората, 0.1 М борной кислоты и 2 мМ EDTA, pH = 8.3), при напряженности электрического поля 30- В/см, 20 С или на агарозном геле (1%) в буфере ТВЕ при напряженности электрического поля 20 В/см, 20 С. Гель окрашивали бромистым этидием, фотографировали при визуализации в ультрафиолетовом свете.

При соотношении P/N = 1/2 нуклеиновая кислота полностью находится в составе небольших положительно заряженных комплексов (табл. 2, рис. 4), которые эффективно проникают в клетки с помощью фолат-опосредованного эндоцитоза (рис. 3). Для липоплексов, приготовленных при P/N = 1/4, избыточное электростатическое взаимодействие с клеточной поверхностью превалирует над лиганд-рецепторными взаимодействиями, что приводит к потере нацеливающего действия адресных катионных липосом.

    Таким образом, направленная доставка НК с помощью адресных катионных липосом происходит при соотношениях P/N = 2/1, 1/1 и 1/2, из которых оптимальным по эффективности трансфекции следует считать соотношение P/N = 1/2. Дальнейшее увеличение количества липосом в составе липоплекса приводит к потере их нацеливающего действия.

2.2.2. Скрининг адресных липосом с фолатсодержащими липоконъюгатами по трансфицирующей активности Для оценки влияния структуры фолатсодержащих липоконъюгатов, а именно природы и длины спейсерной группы, а также их количественного содержания в составе адресных липосом на эффективность доставки НК был проведен скрининг липосом L-8a, L-8d, L-8e и L-8g при соотношении P/N = 1/2, при котором наблюдался наиболее эффективный фолат опосредованный транспорт НК липосомами L-8g/1.5 (рис. 3).

Для всех липосом количество клеток КВ-3-1 и НЕК 293, трансфицированных комплексами FITC-ODN/липосомы, составляло 80-100% (данные не приведены), поэтому оценку ТА липосом проводили путем сравнения значений средней интенсивности флуоресценции клеток в популяциях (табл. 3). Анализ полученных данных позволяет заключить, что среди всех исследованных адресных липосом лучшую ТА проявляют липосомы L-8g, которые способны специфично доставлять FITC-ODN в эукариотические клетки при всех выбранных соотношениях P/N. Данные липосомы оказались эффективнее "обычных" липосом L и коммерческого реагента Lf 2000 (табл. 3).

Таблица 3. Накопление комплексов FITC-ODN/катионные липосомы в клетках КВ-3-1 и НЕК 293 при P/N = 1/2.

Средняя интенсивность Средняя интенсивность флуоресценции, отн. ед. флуоресценции, отн. ед.

КЛ КЛ КВ-3-1 НЕК 293 КВ-3-1 НЕК 26.9 21.9 26.6 19. L-8a/0.5 L-8e/0. 19.8 16.4 20.5 13. L-8a/1.0 L-8e/1. 24.1 16.4 29.1 21. L-8a/1.5 L-8e/1. 21.6 16.6 30.5 31. L-8d/0.5 L-8g/0. 13.3 10.4 33.9 25. L-8d/1.0 L-8g/1. 32.6 22.9 85.9 82. L-8d/1.5 L-8g/1. «Обычные» липосомы L: 17.1 отн. ед. для клеток КВ-3-1;

14.5 отн. ед. для клеток НЕК Lf 2000: 13.1 отн. ед. для клеток КВ-3-1;

27.2 отн. ед. для клеток НЕК 293.

Стандартное отклонение не превышает 7%.

Изучение доставки плазмидной ДНК pEGFP-C2 с помощью липосом L-8е и L-8g показало, что при увеличении доли адресного липоконъюгата в составе липосом происходит рост как количества трасфицированных клеток (рис. 5A и В), так и уровня экспрессии зеленого флуоресцентного белка (рис. 5Б и Г). Наибольшей ТА обладают липосомы с 1.5%-ным содержанием адресных липоконъюгатов 8e и 8g, которые существенно превосходят "обычные"     липосомы L по количеству трансфицированных клеток. Следует отметить, что при меньшем содержании адресного липоконъюгата (0.5% и 1%) ТА липосом L-8g была в 2-3 раза выше, чем активность липосом L-8e (рис. 5).

Рисунок 5. Доставка плазмидной ДНК pEGFP-C2 в клетки КВ-3-1 (A, Б) и HEK 293 (В, Г) с помощью липосом L-8e () и L-8g (), содержащих различное количество адресных липоконъюгатов в присутствии 10% сыворотки в клеточной среде. Комплексы плазмидная ДНК/КЛ формировали при соотношении P/N = 1/2. Процент трансфицированных клеток (A, Б) и уровень средней интенсивности флуоресценции в клеточных популяциях (В, Г) измеряли с помощью проточной цитометрии через 48 ч после инкубации клеток с липоплексами. Стандартное отклонение не превышает 9 %.

Отличительной особенностью соединения 8g является наличие 20-звенного этиленгликольного спейсера, соединяющего гидрофобный домен с остатком ФК. Возможно, такая длина спейсера обеспечивает необходимую удаленность остатка ФК от поверхности липосом или липоплекса и лучшее взаимодействие с фолатными рецепторами, расположенными на поверхности клеток. Кроме того, полиэтиленгликольный фрагмент может обеспечить защиту липоплекса от неспецифических взаимодействий с компонентами сыворотки крови, присутствующими в ростовой среде, и тем самым способствовать более высокой ТА. Таким образом, липосомы L-8g/1.5 обеспечивают наиболее эффективную адресную доставку НК и перспективны в качестве агентов трансфекции.

    2.2.3. Оценка способности адресных липосом направленно доставлять НК в клетки, экспрессирующие фолатные рецепторы С целью изучения способности адресных липосом селективно доставлять плазмидную ДНК в клетки-мишени была проведена сравнительная оценка трансфекции клеточных линий, содержащих (КВ-3-1 и НЕК 239) и не содержащих рецепторы ФК (линия карциномы легкого человека А549 и фибробласты десны человека OMF). В качестве объектов исследования были выбраны липосомы L-8е/1.5 и L-8g/1.5, обладающие максимальной ТА при доставке НК.

Отрицательным контролем служили липосомы L-8е/0.5, показавшие наименьшую активность, а также липосомы L-18/2.5, содержащие адресный липоконъюгат с остатком D-маннозы.

При трансфекции клеток КВ-3-1 (рис. 6) адресные липосомы L-8е/1.5 и L-8g/1.5 в 1.5- раза превосходили по эффективности "обычные" липосомы L и коммерческий препарат Lf 2000 как по числу трансфицированных клеток, так и по значениям средней интенсивности флуоресценции. Трансфицирующая активность липосом L-8e/0.5 и L18/2.5, выбранных в качестве отрицательного контроля, была сравнима или ниже активности "обычных" липосом L, что указывает на отсутствие фолат-опосредованного переноса ДНК контрольными липосомами. Аналогичные зависимости были выявлены при анализе результатов трансфекции клеток НЕК 293. Так, адресные липосомы L-8е/1.5 и L-8g/1.5 были в 1.5-2.5 раза эффективнее "обычных" липосом L.

Рисунок 6. Доставка плазмидной ДНК pEGFP-C2 в клетки КВ-3-1, HEK 293, А549, OMF с помощью КЛ в присутствии 10% сыворотки в клеточной среде. Комплексы плазмидная ДНК/КЛ формировали при соотношении P/N = 1/2 в среде Opti-MEM. Процент трансфицированных клеток (A) и уровень средней интенсивности флуоресценции в клеточных популяциях (Б) измеряли с помощью проточной цитометрии через 48 ч после инкубации клеток с комплексами. Стандартное отклонение не превышает 8 %.

Иная картина наблюдается при трансфекции клеток, не экспрессирующих рецепторы ФК. Так, все исследуемые липосомы, в том числе коммерческий реагент Lf 2000, проявляли     небольшую ТА в экспериментах по доставке плазмидной ДНК в здоровые клетки OMF, что может быть связано с низкой эффективностью процесса эндоцитоза в этих клетках. При трансфекции клеточной линии А549 "обычные" и адресные липосомы (за исключением липосом L-8g/1.5) опосредовали доставку ДНК с одинаковой эффективностью: количество трансфицированных клеток составляло 6-11%, а средняя интенсивность флуоресценции в клеточной популяции находилась на уровне 0.5 отн. ед. Комплексы адресных липосом L-8g/1. с ДНК хорошо проникают в клетки А549 (рис. 6А), однако эффективность наблюдаемой экспрессии трансгена была в 1.5-3 раза ниже, чем в случае клеток КВ-3-1 и НЕК 293 (рис. 6Б).

Возможно, столь высокий уровень доставки ДНК этими липосомами связан с присутствием в структуре адресного липоконъюгата 8g полиэтиленгликольного спейсера, который может защищать липоплексы от нежелательного взаимодействия с компонентами сывороткой крови, приводя к лучшему проникновению ДНК клетки КВ-3-1, НЕК 293 и A549.

Таким образом, адресные липосомы обеспечивают рецептор-опосредованную доставку плазмидной ДНК pEGFP-C2 в клетки, на поверхности которых экспрессируются рецепторы ФК, а наибольшей ТА обладают липосомы L-8g/1.5, содержащие адресный липоконъюгат с полиэтиленгликольным спейсером.

2.2.4. Доставка плазмидной ДНК в дендритные клетки с помощью маннозилсодержащих адресных липосом Генная иммунизация заключается в индукции иммунного ответа при введении ДНК, кодирующей белок-антиген, и позволяет выработать полный иммунный ответ в виде специфических антител (гуморальный ответ) и цитотоксичных Т-лимфоцитов (клеточный ответ). В ходе вакцинации введенная ДНК поглощается антигенпредставляющими клетками (макрофаги, дендритные клетки и B-лимфоциты), которые способны представлять его в иммуногенной форме на своей поверхности для последующего распознавания T-лимфоцитами.

Иммунизация организма дендритными клетками (ДК), трансфицироваными опухоль связанной ДНК, представляет собой перспективный подход в создании онковакцин, способных уничтожать опухолевые клетки собственной иммунной системой организма. ДК являются непростыми объектами для трансфекции, так как при созревании у них изменяется способность захватывать антигены. Известно, что на поверхности ДК присутствуют рецепторы, узнающие и связывающие молекулы с терминальными остатками D-маннозы.

Поэтому включение в состав катионных липосом маннозилсодержащих липоконъюгатов может привести к увеличению эффективности переноса ДНК в эти клетки.

С целью разработки новых эффективных систем трансфекции ДК были получены липосомы, содержащие липоконъюгаты 16 и 18 с остатком D-маннозы в количестве 2.5, 5 и     10%, и с их помощью изучена доставка плазмиды pEGFP-C2 в CD11c+ предшественники ДК и незрелые ДК8.

При трансфекции CD11c+ предшественников ДК изменение соотношения P/N от 1/1 до 1/10 приводило к увеличению количества трансфицированных клеток (рис. 7A), а наиболее эффективными системами доставки оказались адресные липосомы с маннозилсодержащим липоконъюгатом 16. При соотношении P/N = 1/4 маннозилсодержащие липосомы в наибольшей степени превосходили "обычные" липосомы L, поэтому данное соотношение было использовано для дальнейшего изучения адресной доставки трансгена в незрелые ДК. Также следует отметить, что все исследованные липосомы были эффективнее коммерческого реагента Lf 2000.

Рисунок 7. Доставка плазмидной ДНК pEGFP в CD11c+ предшественники ДК (А) и незрелые ДК (Б).

Трансфекция CD11c+ предшественников проводилась комплексами pEGFP/КЛ, сформированными при различных соотношениях P/N. Трансфекцию незрелых ДК проводили при P/N = 1/4. Число трансфицированных клеток измеряли с помощью проточной цитометрии через 48 ч после инкубации клеток с липоплексами. Стандартное отклонение не превышает 8%.

Трансфекцию незрелых ДК проводили при P/N = 1/4, используя липосомы L-16, показавшие наибольшую эффективность при трансфекции CD11c+ предшественников ДК, а также "обычные" (L) и липосомы L-18/2.5, сравнимые по активности с липосомами L (рис. 7Б).

Все маннозилсодержащие липосомы обладали более высокой ТА по сравнению с "обычными" липосомами L и Lf 2000, что может быть связано с наличием на поверхности незрелых ДК рецепторов маннозы, опосредующих перенос ДНК в клетки при использовании липосом L-16 и L-18. Кроме того, высокая эндоцитарная/фагоцитарная активность незрелых ДК приводит к большему поглощению липоплексов и, следовательно, более высокому проценту трансфицированных клеток по сравнению с CD11c+ предшественниками ДК (рис. 7 А, Б).

                                                             Эксперименты выполнены совместно с сотрудниками лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН м.н.с. О.В. Марковым и к.б.н., с.н.с. Н.Л. Мироновой.

    Следует отметить, что липосомы L-18/2.5, проявившие при P/N = 1/4 невысокую эффективность доставки ДНК в CD11c+ предшественники, по эффективности трансфекции незрелых ДК сравнимы с липосомами L-16 (рис. 7Б).

Таким образом, маннозилсодержащие адресные катионные липосомы по эффективности доставки плазмидной ДНК в дендритные клетки превосходят "обычные" катионные липосомы и коммерческий препарат Lf 2000. Наибольшей трансфицирующей активностью обладают липосомы с липоконъюгатом 16, в котором гидрофобный домен связан с адресным лигандом с помощью диэтилскварата.

ВЫВОДЫ 1. Разработаны подходы к синтезу и получены 15 новых фолат- и углеводсодержащих липоконъюгатов, отличающихся адресными лигандами и спейсерами.

2. Предложена двухстадийная процедура выделения фолатсодержащих липоконъюгатов, которая включает твердофазную экстракцию в градиентном режиме и последующую колоночную хроматографию на силикагеле.

3. Созданы новые адресные липосомальные системы доставки НК в опухолевые клетки, на поверхности которых гиперэкспрессированы фолатные рецепторы, и в дендритные клетки.

4. Для липосом, в состав которых входит фолатсодержащий липоконъюгат, определено оптимальное соотношение P/N = 1/2, при котором направленная доставка НК в клетки за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза превалирует над неспецифической доставкой.

5. Показано, что наиболее перспективными среди фолатсодержащих липосом являются липосомы, включающие 1.5% адресного липоконъюгата 8g с полиэтиленгликольным спейсером, что позволяет их рекомендовать для дальнейших исследований in vivo.

6. Показано, что адресные маннозилсодержащие катионные липосомы по эффективности доставки плазмидной ДНК в CD11c+ предшественники и незрелые дендритные клетки превосходят катионные липосомы, не содержащие адресных липоконъюгатов, и коммерческий трансфицирующий реагент Lipofectamine 2000.

    Список публикаций по теме диссертации:

1. Шмендель Е.В., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. Синтез неогликолипоконъюгатов для применения в невирусных системах доставки генетического материала // Изв. АН. Сер. хим. - 2010. - № 12. - С. 2225-2233.

2. Шмендель Е.В., Тимакова А.А., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Чупин В.В. Синтез маннозилсодержащего неогликолипоконъюгата как компонента адресных систем доставки нуклеиновых кислот в антигенпредставляющие клетки // Изв. АН. Сер. хим. - 2012. - № 7. - С.

1480-1484.

3. Шмендель Е.В., Еремин С.В., Морозова Н.Г., Маслов М.А. Синтез фолатсодержащих липоконъюгатов с гидрофобными спейсерными группами // Вестник МИТХТ. - 2013. - №6. - С.

121-122.

4. Шмендель Е.В., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. Синтез амфифильных производных фолиевой кислоты // III Молодежная научно-техническая конференция "Наукоемкие химические технологии-2009". - Москва. - 2009. - С. 55.

5. Шмендель Е.В., Маслов М.А., Морозова Н.Г. Разработка галактозилсодержащих амфифилов для липоконъюгатных систем доставки генетического материала // IV Молодежная научно-техническая конференция "Наукоемкие химические технологии-2011". - Москва. 2011. - С. 75.

6. Шмендель Е.В., Тимакова А.А., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А.

Синтез маннозилсодержащего адресного модуля как этап в разработке противоопухолевых вакцин на основе дендритных клеток // XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. - Волгоград. - 2011. - С. 442.

7. Шмендель Е.В., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Еремин С.В., Чупин В.В. Оптимизация липосомальных систем доставки противоопухолевых препаратов в раковые клетки с использованием фолатсодержащих адресных компонент // XIV Международная научно техническая конференция "Наукоемкие химические технологии – 2012". - Тула. - С. 258.

8. Шмендель Е.В., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Зенкова М.А. Создание липосом для адресной доставки олигонуклеотидов // V Молодежная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии-2013». - Москва. - 2013. – С. 84.

    Шмендель Е.В.

Синтез адресных липоконъюгатов для изучения направленной доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени Формат 6090/16 Тираж 100 экз.

Подписано в печать 21.11.2013. Заказ № Типография ООО «Генезис» 8 (495) 434-83- 119571, г. Москва, пр-т Вернадского,    

 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.