авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


На правах рукописи

Туровский Егор Александрович

ИССЛЕДОВАНИЕ КАЛЬЦИЕВОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

БЕЛЫХ АДИПОЦИТОВ. КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ,

СОПРЯЖЕННЫХ С IP3- И РИАНОДИНОВЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ

03.01.02 – Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино – 2012 -1

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук.

Пущинском Государственном естественно-научном институте

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Долгачева Людмила Петровна

Официальные оппоненты:

Новоселов Владимир Иванович – доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки РАН, главный научный сотрудник лаборатории механизмов рецепции Гончаров Николай Васильевич – доктор биологических наук, НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА России, ведущий научный сотрудник лаборатории аналитической токсикологии.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук.

Защита диссертации состоится «15» ноября 2012 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан «» октября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Смолихина Татьяна Ивановна

-2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ожирение рассматривается как один из основных факторов высокой смертности населения вследствие развития неалкогольного стеатогепатита, диабета 2-го типа и сердечно-сосудистых заболеваний (Асташкин и Глезер, 2008; Boguszewski et al., 2010). Развитие этих заболеваний при ожирении обусловлено «дислипидэмией» – избытком циркулирующих в крови токсинов – жирных кислот. Гипертрофия и дисфункция белой жировой ткани (WAT) несет в себе большой патогенный потенциал, ввиду ее неспособности эффективно устранять из крови жирные кислоты, а также за счет трансформации эндокринных и иммунных функций жировой ткани (Bays et al., 2008). Известно, что симпатическая нервная система и нейротрансмиттер норадреналин (НА) играют важную роль в процессе липолиза WAT (Tavernier et al., 2005). Модулирующий эффект норадреналина на функции жировой клетки является комплексным и вовлекает не только различные подтипы адренорецепторов, но и различные системы трансдукции сигналов. В ряде работ показано, что липолиз, стимулированный норадреналином, обеспечивается активацией -адренорецепторов, аденилатциклазы и синтезом сАМР, а также ключевых липаз HSL и ATGL и фосфорилированием перилипина.

Ингибирование этого процесса обеспечивается в результате активации 2адренорецепторов, гетеротримерного белка Gi, i-субъединицы, ингибирующей аденилатциклазу и синтез сАМР. Важную роль в процессах передачи сигналов от рецептора к мишеням играют и -субъединицы Gi-белков. В последние годы стало известно, что липолиз также может быть стимулирован предсердным натрийуретическим пептидом с последующим накоплением сGMP и активацией протеинкиназы G.

Что касается парасимпатической нервной системы и ее нейротрансмиттера ацетилхолина, то кроме ингибирования процесса липолиза, о его действии на жировые клетки ничего не известно.

Роль Ca2+ в регуляции липолиза и липогенеза белой жировой ткани практически не исследована, несмотря на то, что в роли вторичного мессенджера ионы кальция опосредуют действие более 100 нейротрансмиттеров и гормонов и регулирует многочисленные клеточные функции. Считается, что рост Ca2+ должен приводить к ингибированию липолиза протеинкиназой CaMKII и Ca2+-зависимыми фосфодиэстеразами (PDEIII, IV), снижению концентрации сAMР и cGMP и активности протеинкиназ A и G, соответственно.

Цель исследования. Целью данной работы является получение новых знаний о функционировании системы кальциевой сигнализации белых адипоцитов.

Основные задачи исследования.

1. Исследовать механизмы генерации кальциевых сигналов белыми адипоцитами в культуре в ответ на стимуляцию адренергических и холинергических рецепторов.

2. Изучить механизм действия L-аргинина на кальциевую сигнализацию мускариновых ацетилхолиновых рецепторов;

4. Изучить механизмы конвергенции сигнальных систем, сопряженных с IP3-зависимыми (IP3R) и рианодиновыми (RyR) рецепторами.

Научная новизна работы. В работе показано, что норадреналин, действуя на - и -адренергические рецепторы белых адипоцитов, вызывает 3 типа кальциевых ответов, отличающихся по амплитуде и длительности сигнала. Агонисты 1-адренорецепторов активируют фосфоинозитидный путь передачи сигналов, что приводит к генерации кальциевого ответа типа пик-плато. Для 2-адренергических рецепторов, помимо известного пути ингибирования аденилатциклазы, показано функционирование нового пути передачи сигнала за счет -субъединиц Gi-белков на рианодиновый рецептор эндоплазматического ретикулума, активация которого вызывает импульсное увеличение Са2+ в цитозоле.



Показан механизм возникновения и поддержания кальциевых колебаний, индуцируемых ацетилхолином, в котором ведущее значение имеет рианодиновый рецептор (RyR).

Продемонстрирована конвергенция сигнализации для рецепторов, сопряженных с IP3R и RyR, основанная на том, что гормоны, действуя через рецепторы, сопряженные с G-белком, включают общую схему сигнализации с участием -субъединиц для Gq, Gi и Gs белков, которые активируют одну общую мишень – фосфатидилинозитол 3-киназу (PI3K).

Научно-практическая ценность. Полученные результаты позволяют расширить понимание механизмов сигнализации белых адипоцитов. Исследованная трансдукция сигналов с М3-холинорецепторов и адренергических рецепторов способствует не только пониманию действия ацетилхолина и норадреналина на клетки белого жира, но и может быть использована как потенциальная фармакологическая цель для понимания механизмов возникновения ожирения и связанных с ним нарушений обмена веществ. В силу универсальности PI3K-PKG-RyR пути передачи сигнала и существования множества заболеваний, связанных с нарушениями этого пути, полученные результаты могут стать основой для нового направления фармакологической коррекции этих заболеваний.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация»

(Пущино, 2009, 2011), на конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2008), на школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, 2008), Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2012), IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), а также на Международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика '12» (Пущино, 2012).

работах, из них 5 статей в реферируемых журналах, 5 статей в сборниках и 5 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах с использованием 51 рисунка, 3 таблиц и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы содержит ссылки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПРЕАДИПОЦИТОВ БЕЛОЙ

ЖИРОВОЙ ТКАНИ. Все операции по выделению преадипоцитов из белой жировой ткани мышей линии NMRI (возраст 5–6 недель) производились в стерильных условиях на льду. Процедура выделения и культивирования клеток подробно описана в нашей работе (Туровский, 2011). Полученную суспензию преадипоцитов ресуспендировали в культуральной среде, включающей DMEM (Sigma), 10% FBS (Gibco), 4мМ L-Glutamine acid (Sigma), 4нм инсулина (Sigma), 0,004% гентамицина и 0,25мкг/мл аскорбата натрия (Sigma), и наносили на круглые покровные стекла диаметром 25мМ из расчета 30000 клеток на 1 стекло в объеме 100 мкл и помещали в 35мм чашки Петри. Культивировали во влажной атмосфере СО2-инкубатора (5% СО2 и 95% воздуха). Для ингибирования пролиферации фибробластов использовали 10нM цитозин-арабинозида. В экспериментах использовали культуру в возрасте 9 дней (9 DIV). Белые адипоциты в культуре идентифицировали по морфологическим признакам: форма клеток и наличие жировых включений в цитоплазме.

ИЗМЕРЕНИЯ УРОВНЯ ЦИТОЗОЛЬНОГО КАЛЬЦИЯ МЕТОДОМ

ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ. Эксперименты проводили с помощью флуоресцентной станции на базе инвертированного микроскопа Axiovert 200M, оснащенного монохромной CCD-камерой AxioCam HSM (Carl Zeiss, Германия) и системой высокоскоростной смены возбуждающих светофильтров Ludl MAC5000. В эксперименте получали серии изображений культуры белых адипоцитов с интервалом 3 секунды. При измерении уровня цитозольного кальция и NO использовались объектив Plan Neofluar 10/0,3 и 20/0,7. Для регистрации уровня цитозольного кальция использовали зонд Fura-2. Флуоресценцию Fura-2 в двух длинах волн возбуждали с помощью светофильтров BP 340/30 и BP 387/15.

Регистрацию проводили в диапазоне 465–555нм. После предварительного вычитания фонового сигнала рассчитывали отношение интенсивности флуоресценции Fura-2 при возбуждении в 340 и 380нм (Fura-2, 340/380).

ИЗМЕРЕНИЕ ПРОДУКЦИИ ОКСИДА АЗОТА (NO). Для регистрации продукции NO клеточную культуру белых адипоцитов нагружали 10мкМ DAF FM в течение 40мин при 37оС. Затем клетки дважды промывали HBSS и оставляли на 10мин. После этого вновь промывали HBSS и монтировали в специальную стадиях загрузки зондом и отмывки, а также при аппликации различных агонистов включала 200мкМ L-аргинина для поддержания NO-синтазы в активном состоянии.

Для возбуждения флуоресценции DAF-FM применяли светофильтр BP 475/40. Для регистрации флуоресценции использовали фильтр BP 530/50.

Изображения клеток регистрировали с интервалом в 20 сек. Полученные серии 8-битных изображений анализировали с помощью программы ImageJ.

СИСТЕМА АППЛИКАЦИИ И ОТМЫВКИ ВЕЩЕСТВ. Для аппликации веществ нами была разработана система смены раствора в экспериментальной ячейке. Эта система позволяет осуществлять перфузию со скоростью 10 мл/мин.

Разработанная система позволяет производить добавки известных концентраций агонистов и антагонистов рецепторов, а также растворов других соединений, и осуществлять полную их отмывку.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

УВЕЛИЧЕНИЕ [Ca2+]i ПОД ДЕЙСТВИЕМ НОРАДРЕНАЛИНА. Аппликации норадреналина (НА) к культивируемым белым адипоцитам (9 DIV) в диапазоне концентраций от 300нM до 30мкM инициирует Са2+-ответы (рис. 1А), которые можно разделить на три группы: 1) высокоамплитудный ответ типа пик-плато с полумаксимальной длительностью 27±15 секунд; 2) импульсный ответ с полумаксимальной длительностью 10±0,5 секунд; 3) медленный Са2+-ответ с лагпериодом 3-5 мин. Следует отметить, что каждый из трех типов ответов существенно отличается друг от друга и достоверно воспроизводится.

Известно, что норадреналин действует через различные типы - и адренорецепторов, сопряженных с различными системами трансдукции сигналов.





Для выяснения типа рецепторов, ответственных за формирование каждого из Са2+сигналов был проведен ингибиторный анализ. Преинкубирование адипоцитов с антагонистом 1-адренорецепторов празозином полностью подавляет Са2+-ответы 1го типа (пик-плато) (рис. 1В). Антагонист 2-адренорецепторов – раувольфин препятствует появлению импульсных Са2+-сигналов 2-го типа (рис. 1Г), а антагонист -адренорецепторов – пропранолол, ингибирует медленные ответы 3-го типа (рис. 1Д).

Второй путь доказательства наличия нескольких популяций клеток, отличающихся набором адренорецепторов, основывается на предположении, что каждый из этих рецепторов сопряжен со своей системой передачи сигналов.

Известно, что 1-адренорецепторы сопряжены с фосфоинозитидной системой передачи сигналов и IP3-зависимой мобилизацией Са2+. Ингибирование ключевых молекул этого пути (фосфолипазы С и IP3-рецептора) подавляет ответ 1-го типа (рис. 1Б), и не влияет на генерацию импульсных и медленных сигналов 2-го и 3-го типов.

анализ.

(А) – три типа Са2+-ответов белых адипоцитов на аппликацию норадреналина; (Б) – добавление 400 nM ксестоспонгина С – ингибитора IP3-рецепторов; (В) добавление 3мкM празозина – антагониста 1-адренорецепторов; (Г) – добавление 3мкM раувольфина – антагониста 2адренорецепторов; (Д) – добавление 5мкM пропранолола – антагониста -адренорецепторов;

Антагонисты добавляли за 5 минут до аппликации норадреналина. Эксперименты выполнены на (3-5)-ти клеточных культурах, с 5-ю повторами для каждой культуры.

КАЛЬЦИЕВЫЕ ОТВЕТЫ АДИПОЦИТОВ НА АГОНИСТЫ 1АДРЕНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ. ВКЛАД 1А-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ. Третий

путь доказательства наличия нескольких популяций клеток, отличающихся набором адренорецепторов, состоит в применении агонистов, селективных к отдельным типам адренорецепторов. Селективные активаторы 1-адренорецепторов – фенилэфрин, циразолин и А61603 (1А-адренорецепторы) дозозависимо вызывают кальциевые ответы типа пик-плато (рис. 2А), подобные 1-му типу сигналов при аппликации норадреналина.

свидетельствуют в пользу того, что 1-адренорепторы культивируемых белых адипоцитов инициируют Ca2+-ответы по классическому фосфоинозитидному пути.

Известно, что адипоциты WAT разных видов млекопитающих могут экспрессировать различные подтипы 1-адренорецепторов: 1А, 1B или 1D. Для исследования подтипа 1-адренергических рецепторов, ответственных за генерацию Ca2+-сигнала 1-го типа в белых адипоцитах мыши, нами были использованы селективный агонист 1А-подтипа адренорецепторов – А61603 и селективный антагонист – WB4101, который полностью предотвращает появление Са2+- ответов на аппликацию не только А61603, но и фенилэфрина, и циразолина (рис. 2Б).

Следовательно, 1А-адренорепторы белых адипоцитов мыши играют ведущую роль в реализации Ca2+-ответа по классическому фосфоинозитидному пути.

Рис. 2. Изменение [Ca2+]i при активации 1-адреноргических рецепторов, участие ключевых молекул.

(А) – типичные Са2+-ответы клеток при аппликации селективных агонистов 1-адренорецепторов:

кривая 1 – А61603 (активатор 1А-адренорецепторов), кривая 2 – фенилэфрин, кривая 3 – циразолин; (Б) – ингибиторный анализ: действие антагонистов и ингибиторов ключевых молекул фосфоинозитидного сигнального каскада на амплитуду кальциевого ответа (АКО) при аппликации активаторов 1-адренорецепторов. U73122 – ингибитор фосфолипазы C, фентоламин – антагонист 1,2-адренорецепторов, ксестоспонгин С (XeC) – ингибитор IP3-рецепторов, празозин – антагонист 1-адренорецепторов, BMY7378 – антагонист 1D-адренорецепторов, WB4101 – антагонист 1Аадренорецепторов. В процентах выражена доля клеток, в которых наблюдается подавление амплитуды Са2+-сигналов.

Са2+-ОТВЕТЫ БЕЛЫХ АДИПОЦИТОВ НА АГОНИСТЫ 2АДРЕНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ. ИССЛЕДОВАНИЕ ПУТИ ПЕРЕДАЧИ

СИГНАЛОВ. Более тридцати лет назад с помощью радиолигандных методов были идентифицированы 2-адренорецепторы в белой жировой ткани. Позже установлена их способность подавлять процесс липолиза. Для активации 2-адренорецепторов были использованы селективные агонисты – гуанабенц и UK-14,304 в присутствии физиологической концентрации (200мкМ) L-аргинина (рис. 3А). Са2+-ответы имеют вид быстрых одиночных импульсов, которые отличаются от ответов под действием амплитуды, что указывает на активацию выброса Са2+ из внутриклеточного депо.

Аналогичный Са2+-ответ регистрировали при аппликации норадреналина (2-й тип ответов). Во всех случаях Са2+-сигнал не зависит от присутствия антагонистов 1адренорецепторов и полностью подавляется антагонистами 2-адренорецепторов – раувольфином и иохимбином. Ингибиторы PLC и IP3R не влияли на генерацию Са2+-сигнала в адипоцитах. При этом инкубирование клеток с ингибитором рианодинового рецептора рианодином препятствует появлению кальциевых импульсов на аппликацию селективных 2-агонистов. Кроме этого, преинкубирование клеток с коклюшным токсином, который препятствует диссоциации G-субъединиц Gi-белков (Michal et al., 2007), также ингибирует появление импульсных сигналов. В виду того, что мобилизация Са2+ при активации 2-адренорецепторов происходит не за счет IP3-рецептора, а рианодинового рецептора, активатором которого (по литературным данным) является циклическая АДФ-рибоза, а рецепторы, связанные с активацией Gq-и Gi-белков за счет Gсубъединиц, могут участвовать в активации Akt/PKB (Joshi et al., 2007, McCarthy et al., 2003) мы предположили функционирование сигнального каскада:

Akt/PKBeNOSsGCPKGСD38RyRCa2+, приводящего к высвобождению Са2+ через RyR.

Ингибиторный анализ данного сигнального пути показал, что ингибиторы PI3K – LY294002 и вортманнин подавляли появление Са2+-ответов на активацию 2рецепторов селективными агонистами (рис. 3Б). Ингибиторы NO-синтазы – LNAME и 7NI, а также АДФ-рибозилциклазы (СD38) – никотинамид – препятствовали генерации Са2+-импульсов.

Рис. 3. Изменение [Ca2+]i в ответ на гуанабенц и UK-14,304, участие ключевых молекул.

(А) – генерация Са2+-импульсов при повторной аппликации селективных агонистов 2адренорецепторов не подавляется ингибиторами PLC (U73122) и IP3R (ксестоспонгин С, XeC). (Б) – подавление АКО (в %) на аппликацию 1мкM гуанабенца в присутствии: U73122 – ингибитор PLC, празозин – антагонист 1 –адренорецепторов, ксестоспонгин С (XeC) – ингибитор IP3Rрецепторов, рианодин (Rya)– ингибитор RyR, NAM – конкурентный ингибитор CD38, Wort и LY 294,002 – ингибиторы PI3K.

-9РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДОВАННОЕ ДЕЙСВИЕ L-АРГИНИНА НА БЕЛЫЕ

АДИПОЦИТЫ МЫШИ. В соответствии с литературными данными, L-аргинин оказывает многочисленные эффекты на клетки различных типов.

Продемонстрировано положительное воздействие аргинина на метаболизм животных, страдающих диабетом 2 типа (Fu et al., 2005). Кроме того, в экспериментах на кардиомиоцитах было показано, что наличие в средах выделения клеток небольших концентраций L-аргинина (200мкМ) способствует стабилизации получаемых ответов (Са2+-токов L-каналов) при действии норадреналина и ацетилхолина (Dynnik et al., 2005). Было также показано, что L-аргинин при добавлении в среду инкубации, участвует в регуляции L-токов, действуя через 2-адренорецепторы, PI3K, eNOS и PKG (Ненов и др., 2009).

Преинкубирование белых адипоцитов с 200мкМ L-аргинина в течение 10 и более минут с последующей кратковременной (30–40 сек.) аппликацией миллимолярных (1–10мМ) концентраций L-аргинина (pH=7,4), приводит к генерации кальциевого импульса. После отмывки аргинина и паузы, последующая добавка такой же концентрации L-аргинина приводит к повторному появлению кальциевого ответа, амплитуда которого в среднем может совпадать с первой амплитудой. По типу кальциевого ответа и амплитуде, увеличение [Ca2+]i на добавку L-аргинина крайне похоже на активациею 2-адренорецепторов селективными агонистами (рис. 4А – черная кривая). Ингибиторы PLC и IP3R не влияют на кальциевый ответ, вызываемый аппликацией 10мМ L-аргинина, но, как и в случае с селективными агонистами 2-рецепторов, подавляется селективными антагонистами.

Рис. 4. Импульсное увеличение [Са2+]i в белых адипоцитах мыши.

(А) – увеличение [Са2+]i в белых адипоцитах мыши под действием 1мкМ гуанабенца, 3мкМ UK-14,304 и 10мМ L-аргинина; (Б) – преинкубирование адипоцитов с ингибитором PKG – KT (5мкМ) в течение 5 мин. подавляет генерацию импульсных сигналов на добавку 10мМ Lаргинина. Представлены усредненные ответы клеток. В процентах выражена доля клеток, для которых характерен представленный Са2+-сигнал.

сигнального пути: Akt/PKBeNOSsGCPKGСD38RyRCa2+, что говорит о его действии через 2-адренергические рецепторы на мобилизацию Са2+ через рианодиновые рецепторы ЭПР белых адипоцитов. При этом, в случае инкубирования клеток с ингибитором PKG – KT5822, происходит подавление импульсных Са2+-сигналов на L-аргинин, однако, ответ клеток приобретает вид медленного увеличения [Са2+]i (рис. 4Б), что может быть обусловлено либо действием L-аргинина на аденилатциклазу и увеличение концентрации сАМР (Kersten, 2001), либо ингибированием АТФазы плазматической мембраны.

РОЛЬ -АДРЕНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ В КАЛЬЦИЕВОЙ

СИГНАЛИЗАЦИИ БЕЛЫХ АДИПОЦИТОВ. В культивируемых белых адипоцитах мыши, аппликация агониста -адренорецепторов – изопротеренола на фоне антагониста 1-, 2-адренорецепторов фентоламина приводит к появлению кальциевых ответов, схожих с 3-им типом сигналов при добавлении норадреналина (рис. 5А), к подобным эффектам приводит активация 2-адренорецепторов – добутамином и 3-адренорецепторов – BRL37344 и CGP12177. Пропранолол – антагонист -адренорецепторов приводит к полному подавлению такого типа Са2+-ответа адипоцитов (рис. 5Б).

Рис. 5. Увеличение [Ca2+]i в дифференцированных белых адипоцитах при активации -адренорецепторов и протеинкиназы А.

(А) – активация -адренорецепторов селективными агонистами – изопротеренол (1,2,3, кривая 1), BRL-37344 (3, кривая 2), аденилатциклазы (форсколин, кривая 3) и протеинкиназы А (8-BromocAMP, кривая 4) приводит к медленному увеличению [Ca2+]i;. (Б) – изопротеренол (1мкМ), добавленный на фоне антагониста -адренорецепторов – пропранолола (3мкМ) и антагониста адренорецепторов – фентоламина 5мкМ. Контроль – кривая 1, добавка изопротеренола (1мкМ).

добавлен в начале записи. Антагонисты адренорецепторов добавлены к клеткам за 5 минут до начала эксперимента, их концентрацию поддерживали в течение всего эксперимента.

клеток с проникающим аналогом сАМР (8-Bromo-cAMP) приводит к медленному росту [Ca2+]i (рис. 5А кривая 3 и 4 соответственно). Наблюдаемое увеличение [Ca2+]i происходит после 5 минутного лаг-периода в случае форсколина, а в случае 8-Bromo-cAMP – лаг-период составляет более 10 минут, что, по-видимому, связано с необходимостью проникновения соединения через плазматическую мембрану клеток до необходимой концентрации, активирующей PKA. Ингибитор протеинкиназы А (PKA) – Н-89, добавленный в концентрации 200нМ за 5 минут до аппликации агонистов 3-адренорецепторов, либо форсколина, предотвращает появление кальциевых ответов белых адипоцитов у 76% клеток, у остальных 24% адипоцитов АКО уменьшалась в 3–4 раза по сравнению с контролем.

Таким образом, в адипоцитах белой жировой ткани мыши, норадреналин, способен вызывать 3 типа кальциевых ответов, отличающихся по механизму формирования. Действуя через 1-адренорецепторы (1А), сопряженные с Gq белком и фосфоинозитидным сигнальным каскадом, НА приводит к мобилизации кальция через IP3-рецептор. Через 2-адренорецепторы норадреналин и L-аргинин Akt/PKBeNOSsGCPKGСD38RyRCa и интермедиатов (NO, cGMP, cADPR). Появление 3-го типа ответов (медленное увеличение [Ca2+]i) обусловлено действием норадреналина на -адренорецепторы и аденилатциклазный сигнальный каскад.

ХОЛИНЕРГИЧЕСКАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ БЕЛЫХ

АДИПОЦИТАХ МЫШИ. Са2+-СИГНАЛЫ, ГЕНЕРИРУЕМЫЕ БЕЛЫМИ

АДИПОЦИТАМИ В ОТВЕТ НА АЦЕТИЛХОЛИН. Помимо симпатической иннервации, белая жировая ткань также регулируется парасимпатической нервной системой и нейротрансмиттером ацетилхолином (ACh). Аппликация AСh к клеткам белого жира в концентрации от 0,1 до 10мкМ инициирует колебания цитозольного кальция (рис. 6) в 61–93% клеток. Сразу после аппликации AСh, наблюдается быстрый ответ клеток с увеличением [Са2+]i относительно исходного уровня в 2– раза. Затем происходят колебания, у которых максимумы и минимумы постепенно опускаются (дрейфуют) до некоторого окончательного положения. При этом амплитуда колебаний обычно растет, частота уменьшается за счет удлинения межспайкового интервала и достигает ~1мин-1. Между спайками [Са2+]i достоверно выше начального уровня. В целом, колебания у большинства (67–78%) клеток длятся менее 5 минут. У остальных 22–33% клеток колебания имеют те же характеристики, но могут длиться до 10 минут (рис. 6 серая кривая).

В процентах выражена доля клеток, для которых характерен данный тип кальциевого ответа.

Представлены типичные кальциевые ответы одиночных адипоцитов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЦЕПТОРА АЦЕТИЛХОЛИНА, УЧАСТВУЮЩЕГО В

ФОРМИРОВАНИИ Са2+-СИГНАЛА. Периодические режимы изменения [Са2+]i сохраняются в присутствии антагонистов M1- (телензепин) и M2- (methoctramine) холинорецепторов. Преинкубирование клеточной культуры белых адипоцитов мыши с антагонистом М3-холинорецепторов (p-Fluorohexahydro-sila-difenidol hydrochloride) в концентрациях от 1нМ до 100нМ всегда приводит к подавлению кальциевых ответов (в том числе периодических режимов) на ацетилхолин у 90% клеток. При этом 10% адипоцитов отвечают на агонист транзитным увеличением цитозольного кальция, который подавляется в присутствии антагониста М3-холинорецепторов совместно с ингибитором PLC (U73122).

ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ПУТИ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА С

М3-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРА АДИПОЦИТОВ. Чтобы исследовать роль входа Са2+ через плазматическую мембрану была использована среда, не содержащая кальция с добавлением 0,5мМ EGTA. Появление нескольких Са2+-спайков в бескальциевой среде говорит о том, что в механизме AСh-индуцируемых колебаний модуляция входящего потока внеклеточного кальция не играет принципиальной роли. В то же время затухание колебаний показывает необходимость входа Са2+ для их поддержания. Ответы [Са2+]i на AСh полностью предотвращаются преинкубацией клеток с 1мкМ тапсигаргина, ингибирующего Са2+-АТФазу эндоплазматического ретикулума.

Механизмы кальциевых колебаний могут быть разделены на два больших класса в зависимости от использования IP3R или RyR для мобилизации Са2+ из внутриклеточных структур (Thomas et al., 1996; Keizer and Levine, 1996). Чтобы различить возможные пути высвобождения Са2+, мы использовали ингибиторы PLC, IP3R и RyR. Инкубация белых адипоцитов с ингибиторами PLC (U73122) и IP3R – последующей добавке AСh, но и никак не влияет на их вид. Более того, эксперимент, представленный на рисунке 7А демонстрирует, что у адипоцитов с незатухающими в течение 10 минут колебаниями, последовательное добавление ксестоспонгина С и затем U73122, не подавляет периодические режимы на аппликацию AСh. Для определения роли RyR в колебаниях, перед стимуляцией ацетилхолином клетки инкубировали с рианодином, который блокирует RyR в состоянии малой проводимости при микромолярной концентрации и в закрытом состоянии при высоких дозах (около 100мкМ) (Dupont and Croisier, 2010). В диапазоне 100нМ – 10мкМ рианодин подавляет кальциевые колебания, вызванные 5мкМ ацетилхолина у 100% адипоцитов в поле зрения (рис. 7Б). Таким образом, механизм колебаний, индуцируемых в адипоцитах ацетилхолином, не зависит от PLC и IP3R, а включает высвобождение Са2+ через RyR из тапсигаргинчувствительного пула.

Рис. 7. Изменения [Са2+]i в белых адипоцитах под действием 5 мкМ ацетилхолина.

(А) – совместное действие ингибиторов PLC (U73122, 3мкМ) и IP3R (ксестоспонгин С, XeC), 500нМ) на ход кальциевых колебаний; (Б) – аппликация ацетилхолина на фоне ингибитора RyR – рианодина (1мкМ). В процентах выражена доля клеток с характерным типом ответа.

ВКЛАД NO-cGMP СИГНАЛЬНОГО ПУТИ В ПЕРЕДАЧУ СИГНАЛА С М3ХОЛИНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ. Рианодиновый рецептор (RyR) имеет множество регуляторов (Dupont and Croisier, 2010), которые могут опосредовать пути к нему от рецепторов AСh. Для исследования сигнального пути c М3-холинорецептора, направленного на мобилизацию Са2+ рианодиновым рецептором, нами были использованы ингибиторы соответствующих внутриклеточных ферментов. Результаты ингибиторного анализа представлены на рис. 8.

Преинкубирование белых адипоцитов с любым ингибитором NO-cGMP сигнального пути препятствует генерации Са2+-колебаний в большинстве клеток.

При этом клетки белого жира реагируют на аппликацию AСh кратковременным увеличением [Са2+]i.

сигнального пути.

(А) – аппликация AСh на фоне ингибитора PI3K – AS605240; (Б) – аппликация ингибитора Akt/PKB (Akt1/2 kinase inhibitor) на фоне колебаний, индуцированных ACh; (В) – предварительное инкубирование клеток с ингибиторома NOS – L-NAME; (Г) – предварительное инкубирование адипоцитов с ингибитором протеинкиназы G – Rp-8-Br-cGMPS препятствует генерации колебаний в 92% адипоцитов. Представлены ответы одиночных клеток.

Исчезновение индуцируемых AСh колебаний после ингибирования NOсинтазы говорит о важной роли данного фермента в генерации периодических режимов в белых адипоцитах. Подтверждением этому является параллельное измерение продукции оксида азота (NO) и кальция во время Са2+-колебаний (рис. 9).

Под действием ацетилхолина, удалось установить, что индуцируя колебания цитозольного кальция, AСh вызывает увеличение продукции NO в 15 раз.

Ингибиторы NO-синтазы – 7NI и L-NAME, добавленные на фоне кальциевых колебаний приводят к подавлению продукции NO, при этом происходит уменьшение амплитуды кальциевых колебаний с дальнейшим прекращением.

адипоцитах сопряжены с периодическими изменениями скорости продукции NO (рис. 9, кривая 2). Фаза повышения уровня [Ca2+]i сопровождается увеличением продукции NO (рис 9, кривая 1), что, по-видимому, свидетельствует об активации eNOS посредством Ca2+.

Рис. 9. Параллельное измерение с помощью флуоресцентных зондов Fura-2 и DAF внутриклеточной концентрации ионов кальция [Са2+]i и оксида азота [NO] в белых адипоцитах мыши при аппликации 5мкМ ацетилхолина.

Уровень [Ca2+]i, выражен в единицах отношения флуоресценции Fura-2 при возбуждении в 340 и 380нм (кривая 3). Продукция NO выражена в относительных значениях флуоресценции DAF-FM во времени (кривая 1), где F = F - Fo (F – значение флуоресценции DAF-FM в данной точке, а Fо – уровень флуоресценции в начале эксперимента), а также флуоресценция DAF FM (кривая 2), представленная в виде производной. Стрелками показаны моменты аппликации AСh и ингибитора NO-синтазы – 7NI. Представлен ответ одиночной клетки.

Циклическая АDP-рибоза (cADPR), которая производится ферментом ADPрибозилциклазой (CD38) из NAD, является активатором рианодинового рецептора.

Преинкубирование белых адипоцитов с конкурентным ингибитором CD38 – никотинамидом, предотвращает появление Са2+-колебаний, а аппликация никотинамида на фоне ацетилхолина, прекращает колебания в течение нескольких секунд. Кроме того, активатор и субстрат для CD38 – NAD приводит к генерации колебаний, подобных индуцированным ацетилхолином.

Таким образом, при активации М3-холинорецептора происходит генерация устойчивых Са2+ колебаний при активации сигнального каскада, включающего - 16 активацию: PI3KAkteNOSNOcGMPPKGCD38RyRCa2+, за счет субъединиц Gq-белков, с которыми сопряжен ацетилхолиновый рецептор.

КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ, СОПРЯЖЕННЫХ С IP3 и

РИАНОДИНОВЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ В БЕЛЫХ АДИПОЦИТАХ МЫШИ. Ввиду

того, что норадреналин, L-аргинин и ацетилхолин вызывают различные Са2+-ответы у белых адипоцитов за счет активации различных рецепторов и сигнальных каскадов, а общим для этих агонистов является то, что они действуют через G-белок зависимые рецепторы, которые включают общую систему сигнализации с участием субъединиц Gq-белков от 1 и М3-рецепторов, а также Gi-белков 2-рецепторов.

Кроме того, эти рецепторы имеют собственные пути сигнализации с участием Gq белков на фосфолипазу С и IP3-рецепторы, а со стороны -адренорецепторов – Gsбелков на аденилатциклазу и протеинкиназу А. В таких условиях возможно существование конвергенции сигнализации и наличие различных нелинейных явлений, включая генерацию спайков и периодических процессов. Поэтому представляет интерес исследование взаимодействия адренергической и холинергической сигнальных систем белых адипоцитов.

При концентрации AСh 1–10нМ в среде, Са2+ ответы отсутствуют у 100% клеток. Последующая добавка 1мкМ НА приводит к генерации Са2+-колебаний в 40– 50% клеток (рис. 10Б). Как было показано выше, норадреналин, несмотря на активацию различных подтипов - и -адренорецепторов, не приводит к возникновению периодических колебаний в адипоцитах, что подтверждается нашими экспериментами, в которых на фоне концентраций норадреналина, вызывающих транзитное повышение [Ca2+]i, аппликация наномолярных доз AСh приводит к появлению периодических кальциевых сигналов в адипоцитах мыши (рис. 10В). При более высоких концентрациях AСh, вызывающих колебания [Ca2+]i, добавка микромолярных доз НА увеличивает частоту колебаний без изменения их амплитуды.

Таким образом, преинкубированием белых адипоцитов мыши с низкими дозами ацетилхолина приводит к преобразованию кальциевого ответа клеток на норадреналин, который из транзитного приобретает вид колебательного. В то же время, аппликация наномолярных концентраций ацетилхолина на фоне норадреналина, аппликация которого уже вызвала транзитное увеличение [Ca2+]i, приводит также к генерации кальциевых колебаний. Следовательно, в адипоцитах имеет место потенцирование эффекта AСh посредством норадреналина за счет конвергенции сигналов с М3-холинорецепторов и адренергических рецепторов.

Общая схема сигнализации с участием - и М3-рецепторов, и соответствующих сигнальных путей, а также различных регуляторных связей представлена на рисунке 10А. При достаточно высоких концентрациях AСh (5мкМ), действуя через М3-холинорецепторы и активируя PI3K с участием G белков, запускает периодический процесс. В этом случае НА, действуя через адренорецепторы, способен модулировать частоту колебаний. При слабой передаче сигнала со стороны AСh с участием G белков, когда AСh (10нМ) не способен запустить периодические процессы, добавка НА приводит к возникновению активации eNOS, находящейся в петле положительной обратной связи.

Рис. 10. Конвергенция сигналов с М3-холинорецепторов и адренергических рецепторов.

(А) – аппликация норадреналина (1мкМ) на фоне 10нМ ацетилхолина; (Б) – аппликация 10нМ ацетилхолина на фоне 5мкМ норадреналина; (В) – схема конвергенции сигнальных каскадов, активируемых 1-, 2-адренорецепторами и M3-холинорецепторами.

Обозначения: DAG – диацилглицерол, PIP2 – фосфатидилинозитол бисфосфат, PIP3 – фосфатидилинозитол трисфосфат, PI3K – фосфатидилинозитол-3-киназа, PLC – фосфолипаза С, eNOS – эндотелиальная NO-синтетаза, sGC – растворимая гуанилат-циклаза, Akt (PKB) и PKG – протеинкиназы B и G, CD38 – АДФ-рибозил циклаза, СаМКII – кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа 2, АМРК – АМФ-активируемая протеинкиназа, СаМКК – кальций/кальмодулинзависимая протеинкиназа киназа, IP3 – инозитолтрисфосфат, IP3R – рецептор IP3, cADPR – циклическая АДФ-рибоза, RyR – рианодиновый рецептор.

Таким образом, при наличии высокой суммарной концентрации G белков, активация PKG выполняет несколько функций: обеспечивает селективное выброса Са2+ из RyR-зависимых депо, за счет активации CD38 и накопления cADPR.

Для исследования возможных вариантов конвергенции сигнальных путей, активируемых различными типами рецепторов, нами использована инкубация клеток с малыми дозами AСh с последующей добавкой агонистов к различным рецепторам.

КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛИЗАЦИИ М3-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ И 1АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ. Активация 1-адренорецептора селективным агонистом – фенилэфрином способна вызвать только кратковременный (транзитный) Са2+-ответ у белых адипоцитов. Однако характер ответов на фенилэфрин радикальным образом изменяется в присутствии малых концентраций AСh в среде инкубации клеток. В разных клетках регистрируются динамические режимы двух типов:

высокочастотные с высоким уровнем базального [Ca2+]i (рис. 11А – черная кривая) или низкочастотные, происходящие без повышения базальной концентрации [Ca2+]i (рис. 11А – серая кривая), но с большими амплитудами. Подобное изменение кальциевых ответов происходит при активации 1-адренорецепторов циразолином и А61603. Общей характеристикой Са2+-ответов, вызываемых агонистами 1-адренорецепторов на фоне малой концентрации ацетилхолина является транзитное увеличение [Ca2+]i при аппликации агониста, после чего происходят кальциевые колебания, различающиеся частотой и амплитудой у одиночных клеток.

В отличие от колебаний, индуцируемых микромолярными дозами ацетилхолина, данные периодические режимы не прекращаются в течение времени регистрации (15 минут) у всех отвечающих клеток.

КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛИЗАЦИИ М3-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ И

2-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ. Селективные агонисты 2-адренорецепторов – UK14,304, гуанабенц, а также миллимолярные концентрации L-аргинина, приводят в комбинации с низкими дозами AСh к генерации кальциевых колебаний (рис. 11Б).

Общей чертой таких колебаний является отсутствие базального увеличения [Ca2+]i во всех клетках.

адренергических рецепторов (1, 2, 3).

(А) – аппликация 1мкМ фенилэфрина на фоне 2нМ ацетилхолина; (Б) – аппликация 3мкМ UKна фоне 1нМ ацетилхолина; (В) – аппликация 3-селективного CGP12177 (10мкМ) на фоне 1нМ ацетилхолина; (Г) – аппликация 5мкМ активатора аденилатциклазы – форсколина на фоне 1нМ ацетилхолина. В процентах выражена доля адипоцитов с представленными типами Са2+сигналов.

КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛИЗАЦИИ М3-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ И

1,3-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ. Аппликация агонистов -адренорецепторов (изопротеренол, CGP12177, добутамин) на фоне низких концентраций AСh вызывает появление кальциевых колебаний в культивируемых белых адипоцитах.

Колебания, в отличие от активации -адренорецепторов, сопровождаются ростом базального уровня Са2+ в клетках и наличием лаг-периода (рис. 11В) перед началом колебаний, продолжительность которого различается у отдельных адипоцитов и наблюдается при любой концентрации агониста..

Активация -адренорецепторов связана с последующей активацией Gs белков и действием cAMP и РКА на различные ферменты и каналы в клетке, включая фосфорилирование и активацию IP3R, RyR и Са2+-АТФазы ретикулума (SERCA), что накладывается на регуляцию этих и других клеточных мишеней с участием NO, cGMP, cADPR и PKG. Подтверждением этому являются эффекты, вызванные активатором аденилатциклазы – форсколином. Видно, что форсколин, который приводит к накоплению сАМР и последующей активации РКА, в присутствии малых концентраций ацетилхолина, вызывает генерацию Са2+-колебаний (рис. 11Г), - 20 также сопровождающихся увеличением базального уровня [Ca2+]i и наличием лагпериода у большинства адипоцитов.

Это свидетельствует об известной по литературным данным активации Са2+каналов ретикулума и Са2+-АТФаз с участием РКА.

Таким образом, в белых адипоцитах имеет место конвергенция сигнализации для всех перечисленных агонистов, основанная на том, что данные гормоны, действуя через G белок зависимые рецепторы:

– включают общую систему сигнализации с участием субъединиц (G) для Gq, Gi и Gs белков, и имеющих одну общую мишень – фосфоинозитидкиназу PI3K:

GPIP3KAkt/PKBeNOSNOsGCcGMPPKGCD38cADPRRyRСа2+ – имеют классические пути сигнализации с участием Gq белков (PLC, IP3) и Gs белков (сАМР, РКА).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Фундаментальные механизмы регуляции сигнальных систем жировых клеток изучены недостаточно. Практически не исследованы и не принимаются во внимание механизмы конвергенции различных сигнальных систем, как на уровне входов – рецепторов для различных гормонов и трансмиттеров, так и на уровне вторичных мессенджеров – сАМР, сGМР, Са2+, NO, IP3, cADP.

В представленном исследовании показано, что белые адипоциты при воздействии естественного гормона – норадреналина, способны генерировать различные кальциевые сигналы. Причиной данного различия кальциевых ответов является не только экспрессия нескольких типов адренергических рецепторов, но и активация разных сигнальных каскадов. Первый тип кальциевых ответов характеризуется быстрым транзитным кальциевым ответом, являющимся результатом активации через 1-адренорецептор фосфоинозитидного сигнального каскада и мобилизацией кальция из ЭПР. Второй тип ответов белых адипоцитов характеризуется быстрым кратковременным одиночным импульсом, по кинетике и механизму формирования отличающемуся от первого типа. В основе этого (впервые показанного для адипоцитов) механизма лежит активация сигнального пути PI3KAkt/PKBeNOSsGCPKGCD38RyR при действии норадреналина на 2-адренорецептор через G-субъединицы Gi-белков. Третий тип ответов представляет собой медленное высокоамплитудное увеличение Са2+ в цитозоле, связанное с активацией аденилатциклазного сигнального каскада при действии норадреналина на -адренорецепторы.

Впервые показано действие ацетилхолина на клетки белой жировой ткани. С помощью ингибиторного анализа продемонстрирована экспрессия функционального М3-холинорецептора, активация которого приводит к возникновению колебаний Са2+ через активацию рианодинового рецептора. В поддержании таких кальциевых колебаний ключевую роль играет NO-синтаза и оксид азота, продукция которого возрастает под действием ацетилхолина, а ингибирование фермента предотвращает генерацию периодических режимов в цитоплазме белых адипоцитов мыши.

В работе продемонстрирована конвергенция сигнализации с рецепторов, запускающих сигнальные каскады, сопряженные с активацией IP3R и RyR за счет -субъединиц на одну общую мишень – фосфоинозитидкиназу (PI3K).

ВЫВОДЫ

В клетках белого жира мыши экспрессируются 1А-, 2- и 1,3адренергические рецепторы, активация которых норадреналином способна вызывать различные по типу и механизму формирования кальциевые ответы.

При действии норадреналина и селективных агонистов на 1А-адренорецепторы в белых адипоцитах наблюдается типичное для невозбудимых клеток транзитное увеличение [Ca2+]i за счет активации фосфоинозитидного пути передачи внутриклеточных сигналов.

При активации 2-адренорецепторов норадреналином, L-аргинином и селективными агонистами может активироваться сигнальный путь с участием PI3KAkteNOSNOsGCcGMPPKGCD38RyR, что приводит к импульсному выбросу ионов кальция из эндоплазматического ретикулума.

Ацетилхолин вызывает колебания кальция в адипоцитах, которые обусловлены его взаимодействием с М3-холинорецепторами и селективной PI3KAkteNOSNOsGCcGMPPKGCD38RyR.

В белых адипоцитах имеет место взаимодействие адренергической и холинергической сигнальных систем, выраженное в конвергенции сигналов от 1, 2-адренорецепторов и М3-холинорецепторов на одну общую мишень – PI3K, за счет ее активации -субъединицами соответствующих G-белков.

Конвергенция сигналов с М3-холинорецепторов и -адренергических рецепторов происходит за счет активации PI3K с помощью -субъединиц Gs- и Gqбелков, а также за счет активации PKA, которая приводит к фосфорелированию каналов эндоплазматического ретикулума и Са2+-АТФаз плазматической мембраны.

- 22

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах1. Туровский Е.А., Туровская М.В., Бережнов А.В., Толмачева А.В., Каймачников Н.П., Долгачева Л.П., Зинченко В.П., Маевский Е.И., Дынник В.В.

Конвергенция Са2+-сигнальных путей в адипоцитах. Роль L-аргинина и протеинкиназы G в генерации импульсных и периодических Са2+ сигналов.

Биологические мембраны, 2011. Т.28(6): 1-11.

2. Туровский Е.А., Каймачников Н.П., Туровская М.В., Бережнов А.В., Дынник В.В., Зинченко В.П. Два механизма кальциевых колебаний в адипоцитах.

Биологические мембраны, 2011. Т.28(6):463-72.

3. Туровский Е.А., Конаков М.В., Бережнов А.В., Зинченко В.П., Бронников Г.Е., Долгачева Л.П. Изменение Са2+-ответов культивируемых бурых адипоцитов при адренергической активации. Цитология, 2011. Т.53(6): 466-73.

4. Конаков М.В., Долгачева Л.П., Туровский Е.А., Бронников Г.Е. Изменение концентрации ионов кальция в цитоплазме бурых преадипоцитов при адренергической стимуляции. Биологические мембраны 2010, Т27(1): 77-83.

5. Долгачева Л.П., Туровский Е.А., Туровская М.В., Зинченко В.П., Дынник В.В. адренергический контроль двух Са2+-сигнальных путей адипоцитов.

Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2012 (в печати) Статьи в сборниках 1. Туровский Е.А., Туровская М.В., Бережнов А.В., Толмачева А.В., Ненов М.Н., Долгачева Л.П., Зинченко В.П., Маевский Е.И., Дынник В.В. Регуляция уровня [Ca2+]i в адипоцитах мыши норадреналином, аргинином и ацетилхолином.

Конвергенция сигнализации 1, 2 и m3 рецепторов. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (24мая) 1, стр. 57-63.

2. Туровский Е.А., Туровская М.В., Бережнов А.В., Долгачева Л.П., Зинченко В.П., Маевский Е.И., Дынник В.В. Регуляция уровня Ca2+ в адипоцитах ацетилхолином. Роль m3-холинорецепторов и PKG. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (24мая) 1, стр. 64-70.

3. Конаков М.В., Туровский Е.А., Туровская М.В., Бережнов А.В., Зинченко В.П., Долгачева Л.П. Развитие кальциевого ответа и ретикулума в процессе дифференцировки адипоцитов в культуре. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (24-26 мая) 1, стр.

4. Туровский Е.А., Каймачников Н.П., Туровская М.В., Бережнов А.В., Дынник В.В., Зинченко В.П. Два механизма кальциевых колебаний в адипоцитах.

Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация».

Пущино 2011. (24-26 мая) 1, стр. 391-96.

5. Конаков М.В., Долгачева Л.П., Туровский Е.А., Агафонова Т.А., Бронников Г.Е.

Сравнение Са2+-ответов преадипоцитов мышей и сусликов (SPERMOPHILIS UNDULATUS) июня) 1, стр. 278-82.

Тезисы докладов 1. Дынник В.В., Туровский Е.А., Туровская М.В., Толмачева А.В., Долгачева Л.П., Зинченко В.П. Активация М3-мускариновых рецепторов вызывает колебания Са NOcGMPcADP-riboseCa обратную связь. IV съезд биофизиков России. Нижний Новгород 2012 год.

2. Дынник В.В., Туровский Е.А., Долгачева Л.П., Зинченко В.П. Ожирение, диабет 2-го типа и дисфункция жировой ткани. Международная научная конференция «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем», Минск 2012. стр. 126.

3. Туровский Е.А., Конаков М.В. Суслики (SPERMOPHILIS UNDULATUS) и мыши скорее всего имеют разные механизмы индукции гиперплазии бурой жировой ткани. Школа-конференция для молодых ученых «Методы культивирования клеток», Санкт-Петербург 2008 год, стр.827.

4. Конаков М.В., Туровский Е.А. Суслики (SPERMOPHILIS UNDULATUS) и мыши имеют разные механизмы индукции гиперплазии бурой жировой ткани.

Всероссийская медико-биологическая научная конференция молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (XI Всероссийская конференция «Человек и его здоровье»), Санкт-Петербург 2008 год, стр.162.

5. Туровский Е.А., Долгачева Л.П., Туровская М.В., Дынник В.В., Зинченко В.П. адренергический контроль двух Cа2+-сигнальных путей белых адипоцитов.

Международная конференция молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика '12», Пущино, 2012 год, стр. 52-53.




Похожие работы:


Похожие работы:

«СТОТЛАНД Ирина Аркадьевна МЕТОДИКА КОМПЛЕКСНОЙ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ВЕРИФИКАЦИИ МОДУ ЛЕЙ СИСТЕМНОГО ОБМЕНА МИКРОПРОЦЕССОРНЫХ ВЫЧ ИСЛИТЕЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ Специальность 05.13.15 Вычислительные машины, комплексы и компьютерные сети АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва 2012 Работа выполнена на кафедре Вычислительная техника Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования...»

«Комиссаров Артем Александрович ФОРМИРОВАНИЕ ОБЛИКА РАЗВЕДЫВАТЕЛЬНОГО БЕСПИЛОТНОГО ЛЕТАТЕЛЬНОГО АППАРАТА В УСЛОВИЯХ ЗАДАННЫХ СТОИМОСТНЫХ ОГРАНИЧЕНИЙ 05.13.01 – Системный анализ, управление и обработка информации (Авиационная и ракетно-космическая техника) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата технических наук Москва – 2012 Работа выполнена на кафедре 704 Информационно-управляющие комплексы Московского авиационного института (национального...»

«Семкин Дмитрий Сергеевич ОБОСНОВАНИЕ РАЦИОНАЛЬНЫХ ПАРАМЕТРОВ И РЕЖИМОВ РАБОТЫ ОБОРУДОВАНИЯ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ГРУНТА ПОД МАГИСТРАЛЬНЫМ ТРУБОПРОВОДОМ Специальность 05.05.04 – Дорожные, строительные и подъемно-транспортные машины АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Омск – 2012 19 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Сибирская государственная...»

«МАКАРОВА Ирина Сакибжановна РАДИАЦИОННАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ: ИСТОРИКО–ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВАНИЯ И ПУТИ РАЗВИТИЯ 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Владимир – 2012 Работа выполнена на кафедре экологии в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Владимирский государственный университет имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых...»

«Смирнова Марина Адилевна ТЕХНОЛОГИЯ ФОРМИРОВАНИЯ ДОВЕРИЯ НАСЕЛЕНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫМ МЕДИЦИНСКИМ УЧРЕЖДЕНИЯМ 22.00.08 – Социология управления Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата социологических наук Москва 2012 Работа выполнена на кафедре социальной антропологии и социологии социальной сферы ФГБОУ ВПО Российский государственный социальный университет. Научный руководитель : доктор социологических наук, доцент Лескова Ирина Валерьевна Официальные...»

«Ахматов Станислав Владимирович ГЕОЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА РЕКРЕАЦИОННОГО ПОТЕНЦИАЛА ОЗЕР БАССЕЙНА РЕКИ ЧУЯ (ГОРНЫЙ АЛТАЙ) Специальность: 25.00.36. – геоэкология (наук и о Земле) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата географических наук Томск – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Национальный исследовательский Томский государственный университет, на кафедре...»

«Куликов Сергей Борисович ТРАНСФОРМАЦИЯ ФИЛОСОФСКИХ ОБРАЗОВ НАУКИ Специальность 09.00.08 Философия наук и и техники Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора философских наук Томск 2012 Работа выполнена на кафедре истории и философии науки Института теории образования Федерального государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования Томский государственный педагогический университет Научный консультант Мелик-Гайказян Ирина Вигеновна...»

«РАБАЕВ РУСЛАН УРАЛОВИЧ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СОСТАВА И ТЕХНОЛОГИЙ ИЗГОТОВЛЕНИЯ КОМПОЗИЦИОННОЙ АНОДНОЙ МАССЫ НА ОСНОВЕ ОСТАТКОВ ВТОРИЧНЫХ ПРОДУКТОВ НЕФТЕХИМИИ И НЕФТЕПЕРЕРАБОТКИ Специальности: 07.00.10 – История наук и и техники 02.00.13 – Нефтехимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Уфа - 2012 2 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Уфимский государственный нефтяной технический университет Научный руководитель доктор технических наук, профессор...»

«ГУНИН Антон Борисович МОДЕЛИ УПРАВЛЕНИЯ ЦЕПЯМИ ПОСТАВОК НЕГАБАРИТНЫХ ГРУЗОВ Специальность 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством: логистика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата экономических наук Санкт-Петербург 2012 Работа выполнена на кафедре логистики и организации перевозок ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный инженерноэкономический университет Научный руководитель : доктор экономических наук, доцент Малевич Юлия Валерьевна...»

«Пашкус Вадим Юрьевич Конкурентоспособность учреждений общественного сектора в новых экономических условиях (на примере вузов) Специальность: 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством (экономика, организация и управление предприятиями, отраслями, комплексами: сфера услуг) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора экономических наук Санкт-Петербург 2012 Работа выполнена на кафедре экономической теории...»

«НИКИФОРОВА АННА ПЛАТОНОВНА РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ВАРЕНО-КОПЧЕНЫХ ПРОДУКТОВ ИЗ ГОВЯДИНЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ Специальность: 05.18.04 – Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Улан-Удэ – 2012 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления (ВСГУТУ) Научный руководитель : доктор технических наук,...»

«МАТАНЕНКОВА Татьяна Александровна ПОЭТИЧЕСКИЙ МИР ТАТЬЯНЫ БЕК Специальность 10.01.01 – русская литература АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата филологических наук Смоленск – 2012 Работа выполнена на кафедре литературы и методики ее преподавания ФГБОУ ВПО Смоленский государственный университет доктор филологических наук, доцент Научный руководитель : Ирина Викторовна Романова доктор филологических наук, доцент Официальные оппоненты : Юрий Борисович...»

«МАЗЫРИН Владимир Моисеевич ТРАНСФОРМАЦИЯ ВЬЕТНАМСКОЙ ЭКОНОМИКИ В 1986-2010 гг.: ПРОБЛЕМЫ И ПУТИ ИХ РЕШЕНИЯ Специальность 08.00.14 – Мировая экономика Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора экономических наук Москва – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук Институт Дальнего Востока. доктор экономических наук, профессор Официальные оппоненты : АНОСОВА Людмила Александровна доктор экономических наук, профессор АВДОКУШИН Евгений Федорович...»

«ФЕДОТОВСКАЯ ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ AMPD1, CKMM, G6PC2 И MCT1 ЧЕЛОВЕКА С МЫШЕЧНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬЮ РАЗЛИЧНОЙ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ НАПРАВЛЕННОСТИ 14.03.11 – Восстановительная медицина, спортивная медицина, лечебная физкультура, курортология и физиотерапия 03.02.07 – Генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в секторе биохимии спорта Федерального государственного бюджетного учреждения...»

«КОЧЕТКОВ Иван Александрович СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЭКОНОМИЧЕСКОГО МЕХАНИЗМА ГОСУДАРСТВЕННОГО РЕГУЛИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЙ БАЗЫ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ОРГАНИЗАЦИЙ (на примере Костромской области) Специальность 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством (экономика, организация и управление предприятиями, отраслями и комплексами: АПК и сельское хозяйство) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата экономических наук Москва - Работа...»

«ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Решение проблемы продления срока службы дорожных покрытий неразрывно связано с задачей получения материалов, надежно работающих в условиях знакопеременных температур под воздействием интенсивного автомобильного движения. Современные дорожные покрытия должны обеспечивать повышенную сдвигоустойчивость при высоких летних температурах, трещиностойкость при пониженных температурах, характеризоваться высокой коррозионной стойкостью под влиянием...»

«Богданов Роман Иванович ЗАКОНОМЕРНОСТИ КОРРОЗИОННОГО РАСТРЕСКИВАНИЯ ПОД НАПРЯЖЕНИЕМ ТРУБНОЙ СТАЛИ Х70 В ГРУНТОВЫХ ЭЛЕКТРОЛИТАХ С pH БЛИЗКИМ К НЕЙТРАЛЬНОМУ специальность 05.17.03 - Технология электрохимических процессов и защита от коррозии Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2012 Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении Науки Институте физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН Научный...»

«АМИНИ Резо Наджафободи ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЦИНК-АЛЮМИНИЕВЫХ СПЛАВОВ, ЛЕГИРОВАННЫХ БЕРИЛЛИЕМ И МАГНИЕМ 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Душанбе – 2012 Работа выполнена в лаборатории Коррозионностойкие материалы Института химии им. В.И. Никитина АН Республики Таджикистан. Научный руководитель : доктор химических наук, академик АН Республики Таджикистан, профессор Ганиев Изатулло Наврузович...»

«БУДАЕВА ДАРИМА ГАРМАЕВНА НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ОРГАНИЗАЦИИ РЕКРЕАЦИОННЫХ ТЕРРИТОРИЙ В РЕСПУБЛИКЕ БУРЯТИЯ НА ОСНОВЕ ГИС-ТЕХНОЛОГИИ 25.00.24 – Экономическая, социальная, политическая и рекреационная география АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата географических наук Улан-Удэ – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Байкальский институт природопользования Сибирского отделения РАН. Научный руководитель...»

«Солдатов Виктор Геннадьевич РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСА ДЛЯ ИСПЫТАНИЙ МАНИПУЛЯТОРОВ ДОЕНИЯ 05.20.01 – Технологии и средства механизации сельского хозяйства АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Оренбург – 2012 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Оренбургский государственный аграрный университет на кафедре механизация технологических процессов в АПК Научный руководитель заслуженный деятель науки РФ, доктор технических наук, профессор Соловьев Сергей...»

 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.